CN115990290A - 鸡冠油组织脱细胞基质材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鸡冠油组织脱细胞基质材料及其制备方法。鸡冠油组织脱细胞基质材料的制备方法包括：剥离鸡冠油组织表面脂质体，PBS漂洗后，获得鸡冠油组织膜片；用酶溶液浸泡膜片，PBS漂洗；用脱细胞液浸泡膜片，PBS漂洗，然后冻干，获得冻干膜片；用交联剂对膜片进行交联，PBS漂洗；灭菌即得鸡冠油组织脱细胞基质。本发明在一定程度上丰富了脱细胞材料的种类，填补了鸡冠油组织脱细胞支架领域研究的空白，所制备的脱细胞基质材料可用于软组织缺损修复，具有良好的修复效果。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程及材料科学，具体地说，涉及一种鸡冠油组织脱细胞基质材料及其制备方法。
背景技术
组织工程技术作为一门多科学技术，结合最新的细胞分子生物学、材料学、工程学、化学及医学技术，利用自然信号通路及有机成分，致力于修复组织和器官的功能。组织工程研究着眼于支架材料、种子细胞及细胞因子三大方面。支架材料具有连接和支持细胞、组织的作用，而且还影响细胞的形态、表型，控制细胞的增殖、分化，调节细胞的运动等功能，具备优良的细胞亲和力和组织再生的支架材料构建研究是目前组织工程研究的重点之一。
合成材料及天然材料均可用作组织工程支架材料，而天然材料中又以生物来源材料为主要来源。虽然目前尚无公认的理想支架材料，但是生物来源细胞基质材料与生物合成材料相比较更具备细胞亲和力好的细胞外基质和信号传导有利于细胞黏附及分化。因为脱细胞去除了异种或异体细胞抗原而保留了细胞外基质的结构和功能蛋白，并且大块脱细胞基质材料还保持组织大的生理结构，生物来源的脱细胞支架材料被成功应用于组织工程。目前许多脱细胞材料包括血管、神经、骨骼肌、肌腱、韧带、皮肤、SIS、心脏瓣膜、松质骨及膀胱均经过组织工程研究及再生医学应用，部分甚至经批准已经应用于临床。
鸡冠油是包裹在猪肺外面一层薄薄的脂肪组织，形状类似鸡冠，有特殊香味。目前关于鸡冠油组织脱细胞支架材料的制作鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡冠油组织脱细胞基质材料及其制备方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种鸡冠油组织脱细胞基质材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）剥离鸡冠油组织表面脂质体，得到去脂鸡冠油组织膜片，用PBS漂洗；
（2）步骤（1）中鸡冠油组织膜片用酶溶液浸泡，用PBS漂洗；
其中，所述酶溶液可以是胰蛋白酶-EDTA溶液和/或胰蛋白酶-Tris-HCl溶液；
（3）步骤（2）中鸡冠油组织膜片用脱细胞液浸泡，用PBS漂洗，冻干，得到鸡冠油组织脱细胞膜片；
其中，所述脱细胞液可以是TritonX-100、SDS、脱氧胆酸盐、TritonX-200、Chaps、SB-10、SB-16、TBP、EGTA等中的一种或多种组合；
（4）将步骤（3）中冻干的鸡冠油组织脱细胞膜片置于交联剂中进行交联，用PBS漂洗，最后灭菌，得到鸡冠油组织脱细胞基质材料；
其中，所述交联剂可以是EDC、京尼平、戊二醛、己异二氰酸酯、叠氮二苯基磷等中的一种或多种组合。
优选地，步骤（2）所述酶溶液为胰蛋白酶-EDTA溶液，其中胰蛋白酶浓度为0.5%，EDTA浓度为0.01%-0.05%。
优选地，步骤（3）所述脱细胞液为0.1-10g/L TritonX-100。
优选地，步骤（3）冻干方式为真空冷冻干燥。
其中，真空冷冻干燥的条件为：-30℃--40℃预冻6-10h；第一次干燥，-10℃-0℃，12-24h；第二次干燥，20℃-40℃，5-12h。优选地，真空冷冻干燥的条件为：-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h。
优选地，步骤（4）所述交联剂为0.1%-5%戊二醛。
进一步地，步骤（4）灭菌方式可以是Co60辐照、电子束、环氧乙烷等中的一种或多种组合；优选Co60辐照，更优选辐照剂量为1-50KGy。
在本发明的一个具体实施方式中，鸡冠油组织脱细胞基质材料的制备方法包括：
S1、用物理方法剥离鸡冠油组织表面脂质体，得到去脂鸡冠油组织膜片，用PBS漂洗；
S2、将步骤S1获得的鸡冠油组织膜片用酶溶液于37℃浸泡12h，然后用PBS漂洗；
其中，所述酶溶液为胰蛋白酶-EDTA溶液，其中胰蛋白酶浓度为0.5%，EDTA浓度为0.01%-0.05%；
S3、将步骤S2获得的鸡冠油组织膜片用脱细胞液于4℃-37℃浸泡4-12h，用PBS漂洗后，冻干，得到鸡冠油组织脱细胞膜片；
其中，所述脱细胞液为0.1-10g/L TritonX-100；
S4、将步骤S3获得的鸡冠油组织脱细胞膜片置于交联剂中，于4℃-37℃交联2-12h，用PBS漂洗后，进行Co60辐照灭菌，辐照灭菌剂量为1-50KGy，得到鸡冠油组织脱细胞基质材料。
其中，所述交联剂为0.1%-5%戊二醛。
第二方面，本发明提供按照所述方法制备得到的鸡冠油组织脱细胞基质材料，其拉伸强度为1-15N/cm，孔径100-200mm，孔隙率为50-98%，DNA残留2-20mg/g。
本发明中，鸡冠油组织可以来自于猪品种宁乡猪、太湖猪、香猪、东北民猪等。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明在一定程度上丰富了脱细胞材料的种类，填补了鸡冠油组织脱细胞支架领域研究的空白。本发明制备的鸡冠油组织脱细胞基质材料至少具有以下优点：
（一）良好的生物力学性能，符合软组织缺损部位力学性能要求，在一定时间内可保持软组织原有形态；
（二）良好的生物相容性，为细胞提供良好的生存结构和成分微环境；
（三）具有良好的三维多孔结构，相互贯穿，有利于细胞生存、黏附、迁移、以及营养物质输送和代谢废物排除；
（四）具有可降解性，可随着组织再生过程逐渐降解吸收；
（五）本发明制备的脱细胞基质材料可用于软组织缺损修复，具有良好的修复效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的鸡冠油组织来自于宁乡猪。
本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，先用0.5%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为10N/cm，孔径167mm，孔隙率为75%，DNA残留5mg/g。
实施例2
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，先用0.25%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用0.5% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为11N/cm，孔径158mm，孔隙率为60%，DNA残留14mg/g。
实施例3
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.25%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为6N/cm，孔径187mm，孔隙率为55%，DNA残留8mg/g。
实施例4
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.5%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用0.5% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用1%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为5N/cm，孔径174mm，孔隙率为65%，DNA残留13mg/g。
实施例5
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.25%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用0.5% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用1.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为6.5N/cm，孔径188mm，孔隙率为50%，DNA残留15mg/g。
本发明制备的脱细胞基质材料可用于软组织缺损修复，具有良好的修复效果。
对比例1
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.25%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为6.5N/cm，孔径188mm，孔隙率为60%，DNA残留5mg/g。
对比例2
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.5%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为10N/cm，孔径167mm，孔隙率为75%，DNA残留5mg/g。
对比例3
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用1%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为7N/cm，孔径158mm，孔隙率为75%，DNA残留3.5mg/g。
对比例4
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.5%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用0.5% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为9.8N/cm，孔径165mm，孔隙率为70%，DNA残留8mg/g。
对比例5
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用1.5%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用2.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为9.5N/cm，孔径170mm，孔隙率为78%，DNA残留4mg/g。
对比例6
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.25%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用1.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为5N/cm，孔径153mm，孔隙率为78%，DNA残留4mg/g。
对比例7
称取新鲜鸡冠油组织200g，用物理方法剥离鸡冠油表面脂质体，首先用0.25%胰蛋白酶-0.05% EDTA溶液4℃浸泡4h，PBS清洗3次，然后用1% TritonX-100的溶液4℃处理12h，PBS清洗3次，冻干（-40℃预冻6h；第一次干燥，0℃，12h；第二次干燥，30℃，5h），最后用3.5%戊二醛溶液4℃交联8h，经PBS漂洗后，Co60辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，即得鸡冠油组织脱细胞基质材料，拉伸强度为12N/cm，孔径173mm，孔隙率为60%，DNA残留4.3mg/g。
从以上实施例和对比例可以看出，通过控制胰蛋白酶浓度、TritonX-100浓度、戊二醛浓度，可以显著提升鸡冠油组织脱细胞基质材料的孔隙率和生物力学性能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.鸡冠油组织脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）剥离鸡冠油组织表面脂质体，得到去脂鸡冠油组织膜片，用PBS漂洗；
（2）步骤（1）中鸡冠油组织膜片用酶溶液浸泡，用PBS漂洗；
其中，所述酶溶液为胰蛋白酶-EDTA溶液和/或胰蛋白酶-Tris-HCl溶液；
（3）步骤（2）中鸡冠油组织膜片用脱细胞液浸泡，用PBS漂洗，冻干，得到鸡冠油组织脱细胞膜片；
其中，所述脱细胞液为TritonX-100、SDS、脱氧胆酸盐、TritonX-200、Chaps、SB-10、SB-16、TBP、EGTA中的一种或多种组合；
（4）将步骤（3）中冻干的鸡冠油组织脱细胞膜片置于交联剂中进行交联，用PBS漂洗，最后灭菌，得到鸡冠油组织脱细胞基质材料；
其中，所述交联剂为EDC、京尼平、戊二醛、己异二氰酸酯、叠氮二苯基磷中的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述酶溶液为胰蛋白酶-EDTA溶液，其中胰蛋白酶浓度为0.5%，EDTA浓度为0.01%-0.05%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述脱细胞液为0.1-10g/LTritonX-100。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）冻干方式为真空冷冻干燥；
其中，真空冷冻干燥的条件为：-30℃--40℃预冻6-10h；第一次干燥，-10℃-0℃，12-24h；第二次干燥，20℃-40℃，5-12h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述交联剂为0.1%-5%戊二醛。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）灭菌方式为Co60辐照、电子束、环氧乙烷中的一种或多种组合。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，灭菌方式为Co60辐照，辐照剂量为1-50KGy。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、用物理方法剥离鸡冠油组织表面脂质体，得到去脂鸡冠油组织膜片，用PBS漂洗；
S2、将步骤S1获得的鸡冠油组织膜片用酶溶液于37℃浸泡12h，然后用PBS漂洗；
其中，所述酶溶液为胰蛋白酶-EDTA溶液，其中胰蛋白酶浓度为0.5%，EDTA浓度为0.01%-0.05%；
S3、将步骤S2获得的鸡冠油组织膜片用脱细胞液于4℃-37℃浸泡4-12h，用PBS漂洗后，冻干，得到鸡冠油组织脱细胞膜片；
其中，所述脱细胞液为0.1-10g/L TritonX-100；
S4、将步骤S3获得的鸡冠油组织脱细胞膜片置于交联剂中，于4℃-37℃交联2-12h，用PBS漂洗后，进行Co60辐照灭菌，辐照灭菌剂量为1-50KGy，得到鸡冠油组织脱细胞基质材料；
其中，所述交联剂为0.1%-5%戊二醛。
9.按照权利要求1-8任一项所述方法制备得到的鸡冠油组织脱细胞基质材料。
10.根据权利要求9所述的鸡冠油组织脱细胞基质材料，其特征在于，拉伸强度为1-15N/cm，孔径100-200mm，孔隙率为50-98%，DNA残留2-20mg/g。
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