人工皮肤移植物及其制备方法
技术领域
本发明是有关供用作为受伤皮肤(wounded skin)的暂时性及永久性覆盖物(temporary and permanent coverage)的人工皮肤移植物(artificialskin graft)及其制备方法,其中该人工皮肤移植物是通过一片无细胞哺乳动物真皮(a sheet of acellular mammalian dermis)与一诸如硅胶片的压平组件(flattening element)的交联(cross-linking)而被制造出。
背景技术
动物皮肤具有抵抗外来污染物、减低紫外线伤害、吸收作用和呼吸作用、调节体温、调节水分以避免脱水、感觉等功能。动物皮肤的构造复杂,基本上可分为三层:
(1)表皮层(epidermis),其为皮肤的最外层,内含五层排列整齐的细胞,由最表层至最底层分别为角质层(cuticle)、透明层、颗粒层、有棘层和基底膜(basement membrane,BM);
(2)真皮层(dermis),其紧连着表皮层的基底膜,而且表皮层与真皮层的交接呈脊状(ridge)交错。真皮层由外而内分为乳突层与网状层。真皮层富含胶原纤维、弹性纤维、基底质等,并提供皮肤的弹性与延展性。真皮层若受损,非常容易有疤痕产生;以及
(3)皮下组织层(subcutis),其相连于真皮层的网状层,并由疏松的纤维网和脂肪细胞所构成,且具有汗腺、毛球、血管、淋巴管及神经等。皮下组织层内的脂肪细胞可储存能量以及作为缓冲垫,也是吸收外来药物的大仓库。
动物若发生有皮肤受伤,会造成其身体功能失去平衡,进而使脏器严重失调,甚至导致死亡。烧伤(burn)与外伤(trauma)会损害到皮肤的表皮层与真皮层,甚至造成全层(full thickness)皮肤伤害。
当治疗无法愈合的伤口时,常需通过自体皮肤移植来永久封闭伤口。对于开放性的感染性伤口,利用薄裂层皮肤移植物(thin split-thicknessskin graft,thin STSG)来作皮肤移植治疗的成功率很高。但是,由于薄裂层皮肤移植物的真皮层较薄,伤口终究会形成增生或收缩的瘢痕(hypertrophic or contraction scar),而造成不美观的愈合,甚至形成孪缩现象(contracture)而影响重建后皮肤的功能。
另外,对于大面积的烧伤伤口而言,可供取皮的部位有限。或者,有的病人的伤口再生能力较弱(例如,罹患静脉溃疡、褥疮的病人以及脚部溃疡的糖尿病者),欲从此类病人身上取皮来供自体皮肤移植之用,更形困难。
因为自体皮肤移植在这些方面所受到的限制,各种不同的生物敷料(biological dressing)被提出,并被显示可作为裂层皮肤移植物(split-thickness skin graft,STSG)的完全的(表皮与真皮)或部分的(表皮或真皮)暂时性及永久性替代物。
所谓的“生物敷料”是指含有生物特性的敷料,而该“生物特性”泛指该敷料与伤口接触的那一个表面部分内含有胶原蛋白(collagen)而言。生物敷料不同于其它合成敷料(synthetic dressing)之处在于:它利用伤口的血纤维蛋白与生物敷料的弹性蛋白的结合力(fibrin-elastin bindingpower,FEBP)所形成的绝佳的融合现象(incorporation),而藉此达成下列功用:减少水分及蛋白质的流失与热能的蒸发、保持伤口的湿度及温度、减轻伤口的疼痛、促进伤口正常肉芽组织的增生、抑制伤口细菌的繁殖、促进浅二度伤口的愈合、促使伤口平整并暂时敷盖裸露的重要组织(例如神经、血管、肌腱等),以及敷盖于自体皮肤移植物的外表面上,俾以提高移植成功率等。
生物敷料的特性以及必备条件包括:能对伤口产生一快速并且持久的黏附性(adherence),能使生物敷料内的胶原蛋白与伤口形成一紧密的融合作用而达成伤口的暂时性封闭;无抗原性(non-antigenic);无毒性(nontoxic),对动物体或人体不致产生毒性反应而使伤口坏死;无菌的(sterile),不会使动物体或人体遭致严重感染而危及生命;具有活性(viability),有活性的生物敷料与伤口组织具有较佳的黏性,尤其是当伤口需要一长时期的覆盖时。例如,一皮肤移植物若具有活性,它可从伤口获取血流营养,因而能在伤口上维持一较长久的存活与覆盖。上述这些特性决定了伤口对皮肤移植物的接受程度。另外一提的是,基本上“具有活性”与“无菌”是相冲突的,但是具有活性的敷料的处理方法涉及先以表面清洁剂或杀菌剂来作表面消毒,并经一般细菌及霉菌培养,而经72小时无菌生长的产品才能供临床使用。
自1966年起,利用猪皮作为生物敷料已成为治疗伤口的常用模式。猪皮在解剖构造上与人皮相似、来源取之不尽,在同种异体移植物皮肤(allograft skin)不易获得的地区,猪皮为被广泛采用的暂时性敷料。猪皮生物敷料的制造方法包括:将要取皮的部位剃毛并依照外科手术原则予以消毒,从该经消毒的部位切取出至少0.008-0.030英时(即0.20mm-0.76mm)厚的猪皮并置入次氯酸钠溶液(sodium hypochloride solution)内消毒,继而予以密封于一无菌包装袋内保存。封装前的猪皮均切取出一小片作为测试样品,并送至一般细菌及霉菌培养,而经72小时无菌生长的测试样品的对应封装产品才能供临床上作为伤口的暂时敷盖物之用。
猪皮的缺点是:在除去细胞后,需要进行费用高昂的放射线消毒以及冷冻干燥处理,以便能降低其抗原性并同时抑制细菌生长。再者,由于猪与人类的种属不同,属于异种异体移植物(xenograft)的猪皮只能暂时敷盖于伤口上,在大约一周后将因形成排斥现象而逐渐坏死(具有大面积烧伤的病人的排斥现象可因免疫机能受到抑制而被延迟),必须予以切除然后更换另一猪皮,俾以继续保护伤口。
博爱布润(Biobrane)是一种合成生物敷料,它的外层是由尼龙及硅胶聚合而成,而内层包含萃取自猪皮的胶原蛋白。Biobrane内层的胶原蛋白会融合至伤口,而外层的尼龙-硅胶聚合物可将伤口与外界隔绝。Biobrane具有延展性、柔软性、无毒性以及无菌等特性。在我们的先前实验中发现,当Biobrane被敷盖于大白鼠经清洁的背部伤口历时3周之后,仍维持有一为207gm/cm2的黏附性,而且在这段实验期间并未产生伤口感染或抗原-抗体反应(H.J.Wang et al.(1992),J.Plast.Reconstr.Surg.Assoc.,ROC,1:1,48-51)。
基于取得大面积的移植用皮肤的需要,在1970年的末期,通过正常人类表皮角质细胞(keratinocytes)的组织培养而从一小片切取出的表皮来制造出一大量的培养表皮的技术被成功地发展出,而且经培养的表皮自体移植物(cultured epidermal autograft,CEA)已被成功地使用于烧伤伤口上来作为一薄表皮覆盖物,以重建大范围的皮肤缺损(J.G.Rheinwald,H.Green(1975),Cell,6:331;H.Green et al.(1979),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5665-5668;G.G.III Gallico et al.(1984),N.Engl.J.Med.,311:448-454)。
但是,在后续的研究中发现,由一不存在有网状脊(rete ridges)的平坦的真皮-表皮接合(dermal-epidermal conjunction)所生成的表皮表面是脆弱的并且会持续地起水泡,因此经培养的表皮自体移植物(CEA)对于全层伤口的黏附性很差,CEA的“接受率”因而并不佳,它只有在被移植于含有基底膜的结缔组织上才得以形成网状脊的结构,如此才能牢附于伤口上(D.T.Woodley et al.(1988),JAMA,259:2566-2571;S.R.Herzog etal.(1988),J.Trauma,28:195-198;N.Carver et al.(1993),Br.J.Plast.Surg.,46:384-392)。此外,由于薄皮移植物的真皮层较薄,伤口终究会形成增生或收缩的瘢痕(hypertrophic or contraction scar),而造成不美观的愈合,甚至形成孪缩现象(contracture)而影响重建后皮肤的功能。
因此,这些年来科学家与皮肤重建治疗医师尝试设计一种使用一含有基底膜(BM)的真皮模板(dermal template)的皮肤移植模式,也就是在移植经培养的表皮自体移植物(CEA)之前,先行或同时移植一含有基底膜(BM)的人造、合成、同种或异种的真皮,以便让CEA能够顺利生长,而且除了促进伤口愈合外,可减少伤口孪缩或增生的现象,进而达成无瘢痕的伤口愈合的最佳成效。
近年来有几种可以支持薄裂层皮肤移植物与CEA的真皮替代物(dermalsubstitute)被提出,包括:胶原蛋白-葡糖胺聚糖(collagen-glycosaminoglycan)真皮膜(S.T.Boyce,J.F.Hansbrough(1988),Surgery,103:421-431;S.T.Boyce et al.(1988),J.Biomed.Mater.Res.,22:939-957;J.F.Hansbrough et al.(1989),JAMA,262:2125-2130;以及S.T.Boyce et al.(1990),Skin Pharmacol.,3:136)、血纤维蛋白(fibrin)(V.Ronfard et al.(1991),Burns,17:181-184;B.Hafemann(1994),Burns,20:168-172;以及A.D.Jr.Jabs et al.(1992),Plast.Reconstr.Surg.,89:268-271)、同种异体真皮(allodermis)(C.B.Cuono et al.(1986),Lancet,1:1123-1124;C.B.Cuono et al.(1987),Plast.Reconstr.Surg.,80:626-635;R.C.Langdon et al.(1988),J.Invest.Dermatol.,91:478-485;I.Mckay et al.(1994),Burns,20:S19-S22;W.L.Hickerson et al.(1994),Burns,20:S52-S56;以及W.A.Schiozer et al.(1994),Burns,20:503-507)、自体真皮(autodermis)(H.A.Navsaria et al.(1994),Burns,20:S57-S06)以及异种异体真皮(xenodermis)(B.Hafemann(1994),Burns,20:168-172)等。
于1981年,Burke及Yannas等人发明了一种具有表皮与真皮的双层人工皮肤,其被称为“Integra”(J.F.Burke et al.(1981),Ann.Surg.,194:413;D.M.Heimbach et al.(1988),Ann.Surg.,208:313;R.L.Sheridan et al.(1994),Eur.J.Plast.Surg.,17:91;以及J.F.Burke(1987),Japanese Journal of Surgery,17(6):431-438),其中作为表皮的是一硅胶片,而作为真皮的是一具有一高多孔性的结构并且是由牛胶原蛋白(bovine collagen)以及自鲨鱼软骨(shark cartilage)衍生出的葡糖胺聚糖(软骨素-6-硫酸盐)[glycosaminoglycan(chondroitin-6-sulfate)]所交联萃取之物所组成(T.D.Chou et al.(2001),Plast Reconstr.Surg.,108(2):378-384)。
经发明10年后,由Dr.Heimback进行美国多家医学中心的共同研究及人体实验,证明“Integra”人工皮肤的真皮可以经由生物降解(Biodegradation)的过程而被转变为接受者的真皮。“Integra”人工皮肤的临床使用方法为:将之移植于伤口上,待真皮与伤口结合并愈合后,将硅胶片撕去,并于其真皮上施行自体皮肤移植(T.D.Chou et al.(2001),Plast Reconstr.Surg.,108(2):378-384;J.Kopp et al.(2003),Dermatologic Surgery,29(6):653-657;以及C.S.Chu et al.(2002),Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care,52(1):122-129)。Integra人工皮肤的开发提供医师在治疗病人伤口时有了新的选择。但由于此成品的开发期间过长,它的售价昂贵,一面积为30x10平方公分的Integra人工皮肤在台湾境内的售价为NT$60,000,这高昂的费用不是一般烧伤病患所能负担的。此外,由于Integra人工皮肤并不具有基底模(basement membrane,BM),当将CEA移植于其上时,CEA有成功地牢固生长的案例并不多见。
EP 1375647 A1揭示一种由血浆所制成的人工真皮,该血浆是在血小板存在的状况下通过加入钙所凝结而成,并且纤维母细胞或其它真皮细胞被包埋于该人工真皮中。进一步,角质细胞可被播种于该人工真皮的表面上,而使得该人工真皮特别地适用于大面积烧伤、慢性皮肤溃疡的治疗;或者,透过使用遗传改变的细胞,该人工真皮可作为一基因疗法的工具。
同种异体皮肤移植物的来源包括人类尸体或胎儿羊膜。使用来自人体的异体移植用皮肤的缺点在于受限制的取得(limited availability)、费用高昂、有感染疾病的风险与免疫排斥的问题(M.Loss et al.(2000),Burns,26(7):644-52)。这种排斥作用是由内皮细胞、纤维母细胞、具有高度分裂能力的角质细胞与Langerhans细胞所引发。Cuono等人描述一种二阶段的合并同种异体移植物的真皮与CEA的技术。一开始,他们移植同种异体皮肤至经切除的烧伤伤口,经过四周后他们移除同种异体皮肤的表皮,并且移植CEA至真皮床上,此方法可改善“接受率”至80-85%(C.B.Cuonoet al.(1986),Lancet,1:1123-1124;C.B.Cuono et al.(1987),Plast.Reconstr.Surg.,80:626-635;以及R.C.Langdon et al.(1988),J.Invest.Dermatol.,91:478-485)。
迄今所生产的最被人所接受的替代物似乎是一种无细胞真皮基质(acellular dermal matrix),透过去细胞化技术(acellularizationtechnique)来移除同种异体皮肤移植物内涉及免疫反应的细胞,该无细胞同种异体真皮移植物(acellular allodermal graft)可用来支持自体裂层皮肤(autologous split-thickness skin,ASTS)移植物的生长,而且组织学分析显示会有纤维母细胞的浸润、新血管形成、新表皮形成并且没有排斥现象的发生(D.Wainwright et al.(1994),J.Burn Care Rehab.,17:124-136;以及S.A.Livesey et al.(1995),Transplantation,60:1-9)。
Kangesu等人的研究显示:一去表皮化的自体真皮(de-epidermalisedautodermis)可显著地改善经培养的角质细胞的生长状况(T.Kangesu etal.(1993),Br.J.Plast.Surg.,46:401-409)。另外,Chu等人的研究发现:银-尼龙敷料(silver-nylon dressing)与直流电(direct current)可以避免伤口的感染、增进网状的自体表皮同种异体真皮复合皮肤移植物(autoepidermal-allodermal composite graft)的生长,并且减少伤口的孪缩现象(C.S.Chu et al.(1995),J.Trauma,39:273-278)。
但是,以上所提到的文献或专利案均未提及使用该等移植物是否完全不会引起伤口孪缩或增生,因而达成一平滑且无瘢痕的伤口愈合。
在我们的先前研究中发现:当伤口经彻底清洁以减低感染时,猪皮与伤口形成的融合现象(incorporation)可超过14天。另外,经过多次的病理检查研究发现,猪皮表皮层的表皮细胞被排斥后,所残余的低排斥性真皮层可以经生物降解(biodegradation)而被人体接受并存留。利用此一经验与假说,在我们的1997年论文内曾报导:经去除角质细胞的猪真皮可被用来促进大鼠的经扩张并经网状切割的自体裂层皮肤移植物(autologoussplit-thickness skin graft,ASTS)的生长。该无细胞异种真皮移植物(acellular xenodermal graft)显示出相似于无细胞同种异体真皮移植物(acellular allodermal graft)的皮肤愈合效果,两者均可增进自体裂层皮肤的生长并且延迟伤口的孪缩。组织切片的结果显示猪异种真皮胶原蛋白透过纤维化(fibrosis)或生物降解(biodegradation)而被大鼠的胶原蛋白所取代(H.J.Wang et al.(1997),Journal of Trauma-In jury Infection& Critical Care,42(2):177-182)。但是,在这篇论文研究中所使用的是经网状切割的自体裂层皮肤移植物,其虽可降低伤口孪缩的比率,在经愈合的伤口处会留有不美观的网状增生性瘢痕。
因此,在本技艺中,对于一可以促进CEA的稳定生长、可促进伤口愈合并减少伤口孪缩或增生的现象的人工皮肤移植物,以达成无瘢痕的伤口愈合,仍存在有一迫切的需要。
发明内容
于是,在第一个方面,本发明提供一种人工皮肤移植物(artificialskin graft),其包含有:
(a)一具有一预定厚度的无细胞哺乳动物真皮(acellular mammaliandermis),其具有一第一表面与一第二表面,其中当该人工皮肤移植物被置放至一个体的一待处理的受损皮肤区域内时,该第一表面与该受损皮肤区域接触;以及
(b)一与该无细胞哺乳动物真皮的第二表面相交联的压平组件(flattening element)。
依据本发明的人工皮肤移植物可被封装于一含有一保存剂的保存袋内,以形成一供皮肤移植用的无菌包装品。
在第二个方面,本发明提供一种用以制造一人工皮肤移植物的方法,其包括下列步骤:
(i)将一片取自于哺乳动物的含有表皮层与真皮层的哺乳动物皮肤冻存一段时间;
(ii)将步骤(i)的哺乳动物皮肤解冻;
(iii)以一去细胞技术(acellularization technique)来移除该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层,由此,一实质上不含有上皮巢的哺乳动物真皮被形成;
(iv)将步骤(iii)所得到的哺乳动物真皮冷冻干燥;以及
(v)令一压平组件与步骤(iv)所得到的经冷冻干燥的哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面相交联。
本发明提供一种人工皮肤移植物,所述人工皮肤移植物包含有:
(a)一具有一预定厚度的无细胞哺乳动物真皮,其具有一第一表面与一第二表面,其中当该人工皮肤移植物被置放至一个体的一待处理的受损皮肤区域内时,该第一表面与该受损皮肤区域接触;以及
(b)一与该无细胞哺乳动物真皮的第二表面相交联的压平组件。
本发明提供的无细胞哺乳动物真皮具有一为0.008-0.030英时的预定厚度。
本发明提供的无细胞哺乳动物真皮是来自于人类、猪、牛、马或羊的皮肤。
本发明提供的无细胞哺乳动物真皮是来自于人类、猪。
本发明提供的人工皮肤移植物中待处理的受损皮肤区域是一全层皮肤伤口或一分层皮肤伤口。
本发明提供的无细胞哺乳动物真皮实质上不含有上皮巢,并且于该第二表面处包含有基底膜。
本发明提供的无细胞哺乳动物真皮是通过下列步骤而被制得:
(i)将一取自于哺乳动物的含有表皮层与真皮层的哺乳动物皮肤冻存一段时间;
(ii)将步骤(i)的哺乳动物皮肤解冻;
(iii)以一去细胞技术来移除该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层,藉此,一实质上不含有上皮巢的哺乳动物真皮被形成,该哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面即为该第二表面;以及
(iv)将步骤(iii)所得到的哺乳动物真皮冷冻干燥。
上述人工皮肤移植物被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于人类、猪、牛、马或羊的皮肤。
上述人工皮肤移植物被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于人类的皮肤。
上述人工皮肤移植物被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于猪的皮肤。
上述人工皮肤移植物被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤有经过去毛与消毒。
上述人工皮肤移植物被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤曾经用次氯酸钠溶液予以消毒历时一段时间。
上述人工皮肤移植物在被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(iii)中,一含有蛋白质分解酶的溶液被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤,藉此,该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层被几乎完全地移除。
上述人工皮肤移植物在被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(iii)中,被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤的溶液含有一选自于下列群组中的蛋白质水解酶:胰蛋白酶、胃蛋白酶、分散酶,以及前述物质的任一种组合。
上述人工皮肤移植物在被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(iii)中,一含有胰蛋白酶的溶液被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤。
本发明人工皮肤移植物的压平组件是经由一选自于下列群组中的处理方式而被交联至该无细胞哺乳动物真皮的第二表面:加热处理、化学交联剂处理,以及前述物质的任一种组合。
上述压平组件是经由使用一加热处理而被交联至该无细胞哺乳动物真皮的第二表面。
上述压平组件是经由一使用选自于下列群组中的化学交联剂而被交联至该无细胞哺乳动物真皮的第二表面:戊二醛,以及碳化二亚胺。
上述压平组件是一硅胶膜、聚氨酯(PU)膜、胶原蛋白膜、甲壳素膜、玻璃酸膜或明胶膜。
本发明人工皮肤移植物进一步被无菌处理,然后被封装于一保存袋内。
上述保存袋内进一步包含一保存剂。
上述保存剂是选自于下列所构成的群组:乙醇、甘油,以及前述物质的任一种组合。
上述保存剂为乙醇。甘油。或由乙醇与甘油所构成的混合物。乙醇与甘油的混合比例落在10∶0至0∶10的范围内。
本发明还提供一种用以制造一人工皮肤移植物的方法,该方法包括下列步骤:
(i)将一片取自于哺乳动物的含有表皮层与真皮层的哺乳动物皮肤冻存一段时间;
(ii)将步骤(i)的哺乳动物皮肤解冻;
(iii)以一去细胞技术(acellularization technique)来移除该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层,藉此,一实质上不含有上皮巢的哺乳动物真皮被形成;
(iv)将步骤(iii)所得到的哺乳动物真皮冷冻干燥;以及
(v)令一压平组件与步骤(iv)所得到的经冷冻干燥的哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面相交联。
上述方法被使用于步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于人类、猪、牛、马或羊的皮肤。
上述方法被使用于步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于人类的皮肤。
上述方法被使用于步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于猪的皮肤。
上述方法被使用于步骤(i)中的哺乳动物皮肤有经过去毛与消毒。
上述方法被使用于步骤(i)中的哺乳动物皮肤曾经用次氯酸钠溶液予以消毒历时一段时间。
上述方法在步骤(iii)中,一含有蛋白质分解酶的溶液被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤,藉此,该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层被几乎完全地移除。
上述方法中蛋白质水解酶是选自于下列所构成的群组:胰蛋白酶、胃蛋白酶、分散酶,以及前述物质的任一种组合。
上述方法中含有胰蛋白酶的溶液被使用于步骤(iii)中。
上述方法中于步骤(iii)被形成的哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面处含有基底膜。
上述方法步骤(v)的交联是通过一选自下列的方式来进行:加热处理、化学交联剂处理,以及前述物质的任一种组合。
上述方法在步骤(v)中,该压平组件是经由一加热处理而被交联至该经冷冻干燥的哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面。
上述方法在步骤(v)中,该压平组件是经由使用一选自于下列群组中的化学交联剂而被交联至该经冷冻干燥的哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面:戊二醛,以及碳化二亚胺。
上述方法被使用于步骤(v)中的该压平组件是一硅胶膜、聚氨酯(PU)膜、胶原蛋白膜、甲壳素膜、玻璃酸膜或明胶(gelatin)膜。
上述方法于步骤(v)所形成的与压平组件相交联的哺乳动物真皮被进一步地无菌保存于一含有一保存剂的保存袋内。
上述方法的保存剂是选自于下列所构成的群组:乙醇、甘油,以及前述物质的任一种组合。
上述方法的保存剂为乙醇、甘油或是一由乙醇与甘油所构成的混合物。乙醇与甘油的混合比例落在10∶0至0∶10的范围内。
本发明还提供一种供皮肤移植用的无菌包装品,该无菌包装品包含有:
(a)一用于容纳一人工皮肤移植物的保存袋;
(b)一如权利要求1至27中任一项的人工皮肤移植物,或一通过一如权利要求28至47中任一项的方法而被制得的人工皮肤移植物;
(c)以及一保存剂。
上述无菌包装品的保存剂是选自于下列所构成的群组:乙醇、甘油,以及前述物质的任一种组合。
上述无菌包装品的保存剂为乙醇、甘油或是一由乙醇与甘油所构成的混合物。乙醇与甘油的混合比例落在10∶0至0∶10的范围内。
将诸如硅胶片的压平组件与无细胞哺乳动物真皮交联,如此所形成的人工皮肤移植物可促进CEA的稳定生长、促进伤口愈合以及减少伤口孪缩或增生的现象,进而可以达成无瘢痕的伤口愈合等技术效果。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明,所以本发明在上述以及其它目的与特征,可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显,附图中:
图1是一依据本发明的硅胶-无细胞猪真皮(silicon-acellularporcine dermis,SAPD);
图2显示在移植后的第一周(左方)及第二周(右方)时,SAPD组的伤口状况;
图3显示在移植的第一周(上方,放大倍率100X)与第二周(下方,放大倍率400X)时,SAPD组的伤口切片进行HE染色的病理研究结果;
图4显示SAPD组大鼠的伤口组织于第五周时进行Masson’s染色的结果(放大倍率100X);
图5是一显示在移植后的六周期间当中,SAPD组与Biobrane组的伤口孪缩的比较图,其中p<0.05表示有显著性;
图6显示经自体薄皮移植一周后的大鼠伤口的生长情形;
图7显示经自体薄皮移植六周后,位于大鼠伤口内的自体移植鼠皮存活良好;
图8显示一经进行自体薄皮移植六周后的自体移植皮肤的Masson′s染色病理切片图;
图9显示一经进行自体薄皮移植的大鼠伤口在第7周(左方)与第9周(右方)时的伤口愈合情形;
图10显示一经进行自体薄皮移植的大鼠伤口在第11周时的伤口愈合情形;
图11显示一从台湾动物研究所取得的经培养的人类上皮细胞片(asheet of cultured human epithelial cells);
图12显示一于背部上被切出一为2x2cm2伤口的裸鼠;
图13显示一接受硅胶-无细胞猪真皮移植物(SAPD)的裸鼠伤口在移植后第14天的情形;
图14显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第14天后,被移植于SAPD裸鼠伤口上的经培养细胞的生长情形;
图15显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第28天后,被移植于SAPD组伤口上的经培养细胞的生长情形;
图16显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第28天,以小鼠抗人类细胞角质蛋白抗体来进行SAPD组伤口的组织切片染色所观察到的结果,其中箭头所指的地方是网状脊(rete ridges);
图17显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第42天后,SAPD组伤口上的CEX生长情形;
图18显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第42天后,以抗第4型胶原蛋白抗体来进行SAPD组的免疫组织化学染色所观察到的结果,其中上方放大倍率为100X,而下方放大倍率为400X,而箭头所指的地方是基底膜;
图19显示Integra组裸鼠在移植后第1天的伤口情形;
图20显示Integra组裸鼠在移植后第14天,伤口经透明的硅胶膜所观察到的Integra真皮模板的情形;
图21显示Integra组裸鼠在移植后第14天,将硅胶膜撕去后所露出的真皮外观;
图22显示Integra组裸鼠在被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第14天的伤口情形;
图23显示Integra组裸鼠在被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第28天的伤口情形;
图24显示Integra组裸鼠在被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第42天的伤口情形,其中箭头所指的地方是伤口愈合处;
图25显示Integra组裸鼠在被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第42天,取伤口的组织切片来进行H.E.染色所观察到的结果,其中箭头A所指的地方是经由二期愈合的伤口(wound healed by second intention),而箭头B所指的地方出现有异种异体上皮细胞移植物(CEX)脱落(slough)与伤口坏死(necrosis);以及
图26显示Integra组裸鼠在被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第42天,取伤口的组织切片并以抗第4型胶原蛋白抗体来进行染色所观察到的的结果,其中箭头A所指的地方是经由二期愈合的伤口,而箭头B所指的地方出现有异种异体上皮细胞移植物(CEX)脱落与伤口坏死。
具体实施方式
为供用于治疗大面积的严重受损皮肤伤口,我们尝试研发含有基底膜(basement membrane,BM)的哺乳动物真皮模板(porcine dermis template)来供作为预先组合的移植物(prefabricated graft),其能促进经培养的自体上皮细胞移植物(cultured epidermal autograft,CEA)的生长,俾以挽救皮肤严重受损的病患的生命以及提供高品质的伤口愈合。
以我们先前对于猪真皮的研究结果为基础,我们发现,若将一诸如硅胶片的压平组件与无细胞哺乳动物真皮交联,如此所形成的人工皮肤移植物可促进CEA的稳定生长、促进伤口愈合以及减少伤口孪缩或增生的现象,进而可以达成无瘢痕的伤口愈合。
于是,本发明提供一种人工皮肤移植物,其包含有:
(a)一具有一预定厚度的无细胞哺乳动物真皮,其具有一第一表面与一第二表面,其中当该人工皮肤移植物被置放至一个体的一待处理的受损皮肤区域内时,该第一表面与该受损皮肤区域接触;以及
(b)一与该无细胞哺乳动物真皮的第二表面相交联的压平组件(flattening element)。
依据本发明的人工皮肤移植物可被应用于真皮层受损的皮肤伤口,例如一全层皮肤伤口(full thickness skin wound)或一分层皮肤伤口(partial-thickness skin wound)。
依据本发明,该无细胞哺乳动物真皮是来自于人类、猪、牛、马、羊等的皮肤。较佳地,该无细胞哺乳动物真皮是来自于人类皮肤或猪皮。
较佳地,依据本发明的人工皮肤移植物所包含的该无细胞哺乳动物真皮具有一为0.008-0.030英时(即0.20mm-0.76mm)的预定厚度。
较佳地,被用来制备本发明的人工皮肤移植物的该无细胞哺乳动物真皮实质上不含有上皮巢。关于所谓的“实质上不含有上皮巢”,依据本发明,该无细胞哺乳动物真皮可被定义为:当一哺乳动物真皮片以显微镜来作20个高倍视野(放大倍率为40X)的检视,而被确认是具有少于1个上皮巢(epidermal nest)时,该哺乳动物真皮片即被认定是一适用于本发明的无细胞哺乳动物真皮。
较佳地,依据本发明的人工皮肤移植物所包含的该无细胞哺乳动物真皮在其第二表面处包含有基底膜。
较佳地,依据本发明的人工皮肤移植物所包含的该无细胞哺乳动物真皮是通过下列步骤而被制得:
(i)将一取自于哺乳动物的含有表皮层与真皮层的哺乳动物皮肤冻存一段时间;
(ii)将步骤(i)的哺乳动物皮肤解冻;
(iii)以一去细胞技术(acellularization technique)来移除该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层,藉此,一实质上不含有上皮巢的哺乳动物真皮被形成,该哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面即为该第二表面;以及
(iv)将步骤(iii)所得到的哺乳动物真皮冷冻干燥。
在本发明的一个较佳具体例中,被使用于制备该无细胞动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于人类、猪、牛、马、羊等。
在本发明的一个更佳具体例中,被使用于制备该无细胞动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于人类。
在本发明的另一个更佳具体例中,被使用于制备该无细胞动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤是来自于猪。
在本发明的一个较佳具体例中,被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤有经过去毛与消毒。
在本发明的一个更佳具体例中,被使用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(i)中的哺乳动物皮肤曾经用次氯酸钠溶液予以消毒历时一段时间。
在本发明的一个较佳具体例中,在被用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(iii)中,一含有蛋白质分解酶(proteolytic enzyme)的溶液被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤,藉此,该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层被几乎完全地移除。
在本发明的一个更佳具体例中,在被用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(iii)中,被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤的溶液含有一选自于下列群组中的蛋白质水解酶:胰蛋白酶(tripsin)、胃蛋白酶(pepsin)、分散酶(Dispase),以及前述物质的任一种组合。
在一又更佳的具体例中,在被用于制备该无细胞哺乳动物真皮的步骤(iii)中,一含有胰蛋白酶的溶液被用来处理该经解冻的哺乳动物皮肤。
在本发明的一个较佳具体例中,该压平组件经由一选自于下列群组中的方式而被交联至该无细胞哺乳动物真皮的第二表面:加热处理、使用化学交联剂[例如,戊二醛(glutaraldehyde)、碳化二亚胺(carbodiimide)等等]的处理。
在本发明的一个更佳具体例中,该压平组件是通过加热而被交联至该无细胞哺乳动物真皮的第二表面。较佳地,该交联是在一为25至180℃的热交联温度范围下被完成。
依据本发明,该压平组件是一硅胶膜、聚氨酯(PU)膜、胶原蛋白膜、甲壳素(chitosan)膜、玻璃酸(hyaluronic acid)膜、明胶(gelatin)膜。在本发明的一个较佳具体例中,该压平组件是一硅胶膜。
本发明也提供一种用以制造一人工皮肤移植物的方法,其包括下列步骤:
(i)将一片取自于哺乳动物的含有表皮层与真皮层的哺乳动物皮肤冻存一段时间;
(ii)将步骤(i)的哺乳动物皮肤解冻;
(iii)以一去细胞技术(acellularization technique)来移除该经解冻的哺乳动物皮肤的表皮层,藉此,一实质上不含有上皮巢的哺乳动物皮肤真皮被形成;
(iv)将步骤(iii)所得到的哺乳动物真皮冷冻干燥;以及
(v)令一压平组件与步骤(iv)所得到的经冷冻干燥的哺乳动物真皮的一面向表皮层的表面相交联。
在依据本发明的方法中所使用到的材料以及操作步骤具有至少如前面所提及的技术特征。
另外,依据本发明的人工皮肤移植物可被封装于一含有一保存剂的保存袋内,以形成一供皮肤移植用的无菌包装品。因此,本发明也提供一种供皮肤移植用的无菌包装品,其包含有:
(a)一用于容纳一人工皮肤移植物的保存袋;
(b)一如上所述的人工皮肤移植物,或一通过如上所述的方法而被制得的人工皮肤移植物;
(c)以及一保存剂。
在本发明的一个较佳具体例中,该无菌包装品包含有一选自于下列群组中的保存剂:乙醇、甘油,以及前述物质的任一种组合。
在本发明的一更较佳具体例中,该保存剂为乙醇。在本发明的另一更较佳具体例中,该保存剂为甘油。在本发明的又另一更较佳具体例中,该保存剂为一由乙醇与甘油所构成的混合物。较佳地,乙醇与甘油的混合比例落在10∶0至0∶10的范围内。
本发明将就下面实验例来作进一步说明,但应了解的是,该等实验例仅为例示说明之用,而不应被解释为本发明实施上的限制。
为方便于说明本发明的实施,在下面的实施例中是使用猪皮来进行无细胞猪真皮的制备,而对于需要接受皮肤移植手术的病人而言,得自于合法来源的人类皮肤会是一更为适合的生物材料。
实施例
实施例1.无细胞猪真皮(acellular porcine dermis,APD)的制备
1.1.新鲜冷冻猪皮的制备(Preparation of fresh frozen porcineskin):
选购健康猪只,并以克他命(ketamine,5mg/kg)与喷妥撒钠(pentothal sodium,10mg/kg)将猪只麻醉。之后,将猪的背部剪毛,并以汽油洗刷背部皮肤以去除油渍,继而以普维酮-碘(povidone-iodine)以汽油洗刷背部皮肤以去除油渍,继而以普维酮-碘(povidone-iodine)予以洗刷清洁两次,最后以酒精清洗背部皮肤。
以电取皮机(Electric Dermatome,Padget)取得一厚度为0.012英时(0.3mm)的猪皮薄片。将该被切削出的薄猪皮片置入一含青霉素(penicillin)的生理食盐水(106单位的青霉素/500ml生理食盐水)中浸泡历时15分钟,之后以生理食盐水洗清,然后再将该猪皮浸泡于一含0.05%次氯酸钠(sodium hypochloride)的水溶液中历时5分钟,继而在无菌条件下以食盐水冲洗三次。
以下的处理过程是在无菌条件下,于一个层流通风橱(laminar flowhood,100级)内进行。
于一个层流通风橱的操作台上,将上述处理过的猪皮铺开于一含青霉素(106单位/500ml生理食盐水)及15%甘油的4英时(10.16cm)宽纱绷上,然后将纱绷卷成卷状以将猪皮包在内。将经纱绷包卷的猪皮置于一无菌抗冻(-70℃)塑料盒内,并在旋紧盖子后将该塑料盒放入至一无菌抗冻(-70℃)塑料袋内,再将塑料袋热融封口。之后,将该塑料袋置于一为-4℃的冰柜内过夜,继而予以移放至一为-70℃的冰柜内保存备用。
被处理至此阶段的猪皮可供用于一般伤口的敷盖,或是供用于制备猪真皮。在每次作业时,取出代表性猪皮片来进行一般微生物(细菌、病毒及霉菌)测试,靠此方式来确认同一批制备的其它猪皮片不带有致病性细菌与霉菌。
1.2.无细胞猪真皮的制备(Preparation of acellular porcinedermis):
无细胞猪真皮的制备可参考H.J.Wang et al.(1997),Journal ofTrauma-Injury Infection & Critical Care,42(2):177-82中所描述的方法来进行。
在一层流通风橱的无菌操作台上,于室温下以无菌技术取出程序1.1中所制得的冷冻猪皮片,并在解冻之后将该猪皮片置入一含2.5%胰蛋白酶(trypsin)(Life TechnologiesTM,USA)的溶液内历时大约1至2小时,然后在观察到猪皮片出现有表皮松解的现象时,用镊子撕去表皮。继续将猪皮片浸泡在含1%胰蛋白的溶液内并轻轻搓揉历时30分钟。之后,将猪皮片取出,以一含青霉素的生理食盐水溶液(106单位的青霉素/500ml食盐水)冲洗3次,藉此,一无细胞猪真皮被制成。
猪真皮的完整状态是通过电子显微镜以及多种组织染色方法的显微镜检查等来作评估,以证实基底膜复合物、正常的胶原束与条纹模式的保持,以及表皮层的细胞组成物质的移除。
如前面已提及的,无细胞猪真皮在此被定义为:当以显微镜来作20个高倍视野(放大倍率为40X)的检视,一被确认是具有少于1个上皮巢(epidermal nest)的猪真皮。
依照前述程序1.1中所描述的方式,将如此所制得的无细胞猪真皮片保存于一为-4℃的冰柜内备用。
在每次作业时,取出代表性猪皮片来进行一般微生物(细菌、病毒及霉菌)测试,靠此方式来确认同一批制备的其它猪真皮片不带有致病性细菌与霉菌。
实施例2.硅胶-无细胞猪真皮(Silicon-acellular porcine dermis,SAPD)的制备
2.1.无细胞猪真皮的冷冻干燥处理:
将实施例1所制备并被冷藏的无细胞猪真皮片浸泡于无菌去离子水中历时30分钟,继而以无菌去离子水洗涤三次。之后,将该无细胞猪真皮片平铺于一不锈钢盘内,然后置放于一冷冻干燥机(Freezone 12,Labconco,USA)内进行冷冻干燥处理历时36小时,然后将经冷冻干燥的无细胞猪真皮片存放于一干燥箱(收藏家,台制)中备用。
2.2.硅胶薄膜的制备:
医用硅胶(MDX-4210A/B,Dow corning,USA)以A/B=95/5的比例被混合均匀,所形成的混合物接而被置于一干燥箱中予以减压去气泡历时15至20分钟。将由此所得到的无气泡医用硅胶置于一铁氟龙模板上,调整制膜器(Braive,Belgium)的厚度以推展制膜,然后于一为90℃的烘箱(oven,台制)内烘干该无气泡医用硅胶历时3小时,藉此而得到一透明薄膜状的硅胶薄膜。在脱膜后,以一螺旋测微器(Mitutoyo,Japan)量测到该硅胶薄膜具有一厚度为大约0.3至0.5mm。将由此所得到的硅胶薄膜保存于一干燥箱备用。
2.3.硅胶/无细胞猪真皮的制备:
医用硅胶以A/B=9/1的比例被混合均匀,所形成的混合物接而被置于一干燥箱中予以减压去气泡历时15至20分钟。将前述程序2.2中所制得的透明硅胶薄膜置于一铁氟龙平板上,然后以毛刷沾取适量的该硅胶混合物并予以均匀地涂抹在该透明硅胶薄膜上。接着将前述程序2.2中所制得的冷冻干燥无细胞猪真皮片的一面向表皮层的表面贴附至该硅胶薄膜,然后在该无细胞猪真皮上置放一不锈钢板来加压。在37℃下进行热交联历时4小时之后,所形成的硅胶-无细胞猪真皮被移至一层流通风橱内,并于室温下予以抽气干燥历时60小时,藉此而获得一双层型硅胶-无细胞猪真皮敷料(参见图1)。
2.4.硅胶/无细胞猪真皮的保存:
a.液态保存法
以乙醇(95%EtOH,Merck,USA)及无菌去离子水来配制一75%(v/v)乙醇溶液,再以75%乙醇∶甘油(Calbiochem,USA)=9∶1(v/v)的比例来配制一保存液。
将前述程序2.3所制得的硅胶-无细胞猪真皮片置于一铝箔袋中,然后加入适量的上述保存液以使硅胶-无细胞猪真皮片浸泡于内。在经加热封口后,该装有硅胶/无细胞猪真皮与保存液的铝箔袋被封装于一灭菌管袋中,并被保存于一为5℃的冰箱中备用。
在每次作业时,取出代表性猪皮片来进行一般微生物(细菌、病毒及霉菌)测试,靠此方式来确认同一批制备的其它猪真皮片不带有致病性细菌与霉菌。
b.γ-射线照射(γ-ray irradiation)保存法
将前述程序2.3所制得的硅胶-无细胞猪真皮片置于一灭菌管袋中封装,然后送往原子能所进行钴-60照射,照射强度为25M Ray。在照射5小时之后,取出该灭菌管袋并移放至一置干燥箱中,于室温下保存。
在每次作业时,取出代表性猪皮片来进行一般微生物(细菌、病毒及霉菌)测试,靠此方式来确认同一批制备的其它猪真皮片不带有致病性细菌与霉菌。
实施例3.硅胶-无细胞猪真皮与Biobrane的比较(Comparison ofsilicon-acellular porcine dermis with Biobrane)
为了评估依据本发明的硅胶-无细胞猪真皮与商业化生物敷料Biobrane对于全层伤口(full-thickness wound)的愈合效用,动物实验被进行。
本实施例中所使用的Biobrane是购自于Bertek Pharmaceuticals INC,WV USA。
36只雄性Sprague-Dawley大鼠[350g重,得自国防医学院实验动物中心(National Defense Medical Center)]经由腹膜内施予喷妥撒(pentothal,30mg/kg)而被麻醉。手术与移植操作均在层流通风橱内进行。
于大鼠的背部切出一为大约4x5cm2的全层皮肤伤口。大鼠被随机地分成两组(每组n=18)。第1组大鼠接受依据本发明的硅胶-无细胞猪真皮(SAPD)移植物,而第2组大鼠接受Biobrane移植物。以对称线绑法(tie-over)将植皮伤口固定好,再以熟石膏包住外围来加强固定。在移植后的第1、2、3、4、5与6周时检视每只大鼠身上的移植物。
用来作为评定的参数包括:血管形成(均一的粉红色与施压时变白)、有伤口孪缩的形迹(evidence of contraction)(伤口大小)以及对伤口床的强黏附性。为检查实验组间的差异,伤口的尺寸以Student-t试验来评估。
结果:
以SAPD处理的所有大鼠的伤口可经由透明的硅胶膜而观察到呈现出粉红色的移植真皮。SAPD与Biobrane移植物均有黏附至伤口床。
图2显示在移植后的第一周(左方)及第二周(右方)时,SAPD组的伤口状况,经由透明的硅胶膜可看到伤口内呈现有粉红色的移植真皮。
图3显示在移植的第一周(上方,放大倍率100X)与第二周(下方,放大倍率400X)时,以SAPD组的伤口组织切片来进行HE染色的病理研究结果,其中最表浅的深红色锯断状之物为硅胶膜,它与下方排列整齐的猪真皮黏附良好,而且SAPD与伤口的融合现象(incorporation)良好,真皮内没有出现明显的细胞浸润的发炎与排斥现象。由此可见,SAPD已为大白鼠所接受。
图4为SAPD组大鼠于移植后第5周时进行Masson’s染色的结果(放大倍率100X),其中伤口上的硅胶膜与猪真皮的黏附良好,伤口的胶原纤维呈现蓝色染色、排列整齐,并且没有明显的发炎与排斥现象。由此可见,SAPD已为大白鼠所接受。
伤口大小的比较结果被示于图5中。在移植后的第6周,SAPD组的愈合伤口显现出轻度的孪缩(约35%);然而,Biobrane组的伤口显现出中度至严重的孪缩(约95%)。在移植后的第4周时,Biobrane组的伤口显现出感染及坏死的征兆;然而,SAPD组的伤口没有显现出排斥现象。在移植后的第6周,SAPD组的部分伤口感染经由硅胶膜的移位而被引发。
从以上所得结果来看,就作为伤口的一个长期暂时性覆盖物而言,SAPD显现出比Biobrane更持久、优良并且不产生排斥现象的效果。因此,SAPD是一可用来长期暂时性覆盖伤口的优异伤口敷料。
实施例4.硅胶-无细胞猪真皮(SAPD)作为一自体薄皮移植物的模板的效用
实验动物的麻醉与手术操作均参照实施例3中所述方式来进行。
将SAPD移植于大鼠(12只)的背部伤口(4x5cm2)后,于第二周时将SAPD的硅胶膜撕除,并予以放入一块自大鼠腹部切取出的皮肤来作为自体薄皮移植物(厚度10/1000英时),然后以对称线绑法(tie-over)将植皮伤口固定好,再以熟石膏包住外围来加强固定。于移植后的第一周之时,将熟石膏与缝线拆除,结果发现伤口的生长情形良好(图6)。在移植后的第6周所进行的伤口检查发现被自体移植的鼠皮存活良好(图7),且该皮肤附属的毛囊、汗腺均已生长,而其下方的猪真皮生长稳定亦无出现有排斥的发炎现象(图8)。在移植后的第7、9、11周观察到伤口不再有孪缩现象,可保持其
由此显见,SAPD是一优异的伤口重建用移植物,它所包含的无细胞猪真皮可作为一用以重建伤口并减低伤口的瘢痕收缩的真皮模板(dermaltemplate)。
实施例5.以硅胶-无细胞猪真皮(SAPD)与Integra移植物作为异种异体上皮细胞移植物的模板的效用比较
为了评估依据本发明的硅胶-无细胞猪真皮(SAPD)与商业化产品Integra对于全层伤口(full-thickness wound)愈合的效用,进行本项动物实验。
5.1.手术方法:
本实施例中所使用的实验动物为24只裸鼠[BALB/cAnNCr1-Foxnlnu品系,其为无胸腺裸鼠(athymic nude mice),体重为大约12g]是得自于国防医学院实验动物中心,Integra移植物是购自于Integra LifeSciencesCorp USA,而经培养的人类异体上皮细胞移植物(cultured epidermalxenograft,CEX)(图11)是得自于台湾动物科技研究所。
小鼠经由腹膜内施予喷妥撒(pentothal,30mg/kg)而被麻醉,以10%优碘溶液(aqueous betadine)来消毒裸鼠的背侧表面,然后于小鼠的背部切出一为大约2x2cm2的全层皮肤伤口(图12)。小鼠被随机地分成两组(每组n=12)。第1组小鼠接受依据本发明的硅胶-无细胞猪真皮(SAPD)移植物,而第2组小鼠接受Integra移植物。
所有的移植物均以对称线绑法(tie-over)将植皮伤口固定好,再以熟石膏包住外围来加强固定,并用圆形的塑料箍框架固定来防止皮肤自伤口周边长入而影响判读。手术与移植均在一无菌的层流通风橱内进行。
在移植后的第7、14、21、28、35与42天检视移植物。用来作为评定的参数包括:血管形成(均一的粉红色与施压时变白)、有伤口孪缩的形迹(evidence of contraction)(伤口大小)以及对伤口床的强黏附性。为检查实验组间的差异,伤口的尺寸以Student-t试验来评估。本项研究可参考H.J.Wang et al.(1997),Journal of Trauma-Injury Infection & CriticalCare,42(2):177-82内的叙述。
Care,42(2):177-82内的叙述。
在移植后的第14天,从SAPD或Integra移植物上将硅胶片移除。之后,一经培养的人类上皮细胞片(cultured human epithelium sheet),其为一种经培养的异种异体上皮移植物(cultured epithelium xenograft,CEX)被移植至SAPD组或Integra组的真皮模板上,并以对称线绑法(tie-over)将植皮伤口固定好,再以熟石膏包住外围来加强固定。被移植的CEX在伤口处的存活率以及挛缩率以7天为基础来作纪录。伤口大小的比较结果以图来表示。
结果:
图13显示一个接受硅胶-无细胞猪真皮移植物(SAPD)的裸鼠伤口在移植后第14天的情形,经由硅胶膜可以看到位于下方的猪真皮呈现粉红色存活现象。由于实验有用圆形框架固定,这可防止皮肤自伤口周边长入而影响判读。
图14显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第14天后,被移植于SAPD裸鼠伤口上的经培养细胞的生长情形,由该图可看到经培养的细胞生长良好。
图15显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第28天后,被移植于SAPD组伤口上的经培养细胞的生长情形,由该图可看到经培养的细胞生长良好。
图16显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)后第28天,以小鼠抗人类细胞角质蛋白抗体来进行SAPD组伤口的组织切片染色所观察到的结果,其中箭头所指处为网状脊(rete ridges)。由该图可见,生长于SAPD上者为人类上皮细胞,而不是裸鼠上皮细胞,并发现有网状脊(rete ridges)的生长情形,这显示CEX可牢固生长于猪真皮的胶原纤维上。
图17显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第42天后,SAPD组伤口上的CEX生长情形。由该图可看到CEX生长良好,伤口呈孪缩现象,只保有原伤口的42%,但已有角质层形成。
图18显示当被移植以一异种异体上皮细胞移植物(CEX)第42天后,以抗第4型胶原蛋白抗体来进行SAPD组的免疫组织化学染色所观察到的结果,其中上方放大倍率为100X,而下方放大倍率为400X,而箭头所指的地方是基底膜。由该图可看到CEX与SAPD之间存在有基底膜(箭头所指之处),因而可稳定CEX的生长。
关于Integra组裸鼠的伤口情况,于移植后第1天,Integra移植物的真皮胶原呈现红色的血球浸润情形(图19)。在移植后第14天,经由透明的硅胶片来观察Integra移植物的真皮模板(由鲨鱼软骨与牛真皮交联组成),均呈现出微粉红色的外观,这表示生长情形良好(图20);而当撕去Integra移植物的硅胶片后,同样显示出真皮胶原呈现粉红色的存活态(图21)。
当Integra组裸鼠被移植以一异体上皮细胞移植(CEX)后第14天,伤口显示出CEX已坏死而无法生长于Integra移植物的真皮模板层上,因而形成伤口溃疡(图22)。而Integra组裸鼠在被移植以一异体上皮细胞移植(CEX)后第28天的伤口情形,亦显示出CEX已坏死而无法生长于Integra移植物的真皮层上,因而形成伤口溃疡(图23)。
在移植CEX后的第42天,Integra组裸鼠的伤口显示出CEX无法生长于Integra移植物的真皮层上,而伤口是经由裸鼠的上皮自行愈合(图24)。于此时所进行的伤口组织切片H.E.染色结果显示,被移植于伤口上的CEX呈现脱落坏死现象,大部分伤口经由周边正常皮肤以表皮化作用(epithelialization)及挛缩(contraction)的方式而形成经二期愈合的伤口(wound healed by second intention)(图25)。在CEX移植后第42天,伤口组织切片以抗第4型胶原蛋白抗体来进行染色,结果显示Integra组的基底膜仅有极微弱的第4型胶原蛋白表现,并且无新生的网状脊被形成(图26)。
于本说明书中被引述的所有文献数据与专利案以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时,本案的详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述,明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此本发明仅受如的权利要求书所示者的限制。