CN114980939A - 一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤及其制造方法。根据本发明，含基底膜层的脱细胞真皮在其结构内含有容易附着皮肤源细胞的基底膜层，还保存了真皮层的结构。因此，不需要额外的动物源性细胞外基质的涂层，在无饲养细胞(feder cell free)、无外源物质(xeno free)和无血清(serum‑free)的培养要素中，可以适用和培养/分化皮肤源细胞，在临床上也可以赋予安全性。另外，在上述人工皮肤支撑体上培养皮肤源细胞制成的人工皮肤，移植到皮肤缺损处时，其组织能够安全且有效地再生。

Description

一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤及其制造方法。
更详细地说，本发明涉及一种将表皮及真皮层的细胞及免疫反应诱发因子的残余最小化的同时，保存基底膜层而可用作人工皮肤的含基底膜层的脱细胞真皮，以及在上述脱细胞真皮上培养皮肤源细胞而制造的人工皮肤。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，在抵御外界刺激和感染风险方面起着主要作用。皮肤由表皮(epidermis)、真皮(dermis)和皮下组织(hypodermis)三层组成，并有毛囊、毛发、汗腺和皮脂腺等附属器官，所以是具有保护膜功能以外，还执行皮肤弹性和体温控制等各种功能的重要复合器官。
由于大面积烧伤、糖尿病等引起的皮肤溃疡或皮肤损伤、意外事故、创伤、老化等引起的皮肤组织的塌陷等原因，在美容整形和重建整形领域里，皮肤替代材料的需求逐渐增加，可替代皮肤的生物材料和人工皮肤的开发正在迅速进行。近年来，除此之外，其应用扩大到化妆品开发中的动物实验的替代试验或新药开发中使用的化合物毒性试验。
人工皮肤是对真皮替代物和其上角质层进行分化的形态，真皮和角质层之间的基底膜层不仅是两层之间的物理屏障，而且是容易实施表皮细胞的附着，从而起到支撑体的作用，调节表皮的形成，参与伤口愈合。因此，具有基底膜层的人工皮肤对于皮肤再生和使用人工皮肤的替代试验中是必不可少的。
就目前适用的皮肤替代物而言，或者是直接适用捐赠的脱表皮的真皮、胶原蛋白、明胶和小粘膜组织等生物源性可降解涂覆材料和如PLGA的生物亲和性合成高分子的形态，或者是在胶原蛋白或高分子海绵上培养皮肤源细胞的形态。
胶原蛋白是一种蛋白质，占皮肤真皮层的大部分，市售有各种形态的产品，但由于制造过程困难，因此价格比较高，特别是当胶原蛋白被用作人工皮肤支撑物时，具有与细胞混合后收缩的缺点和无法以原样体现真皮层的缺点。
此外，在制造培养有皮肤源细胞的替代材料或人工皮肤时，为了基底膜层的形成及细胞附着，涂覆动物源性细胞外基质，或者使用包含动物源性成分(饲养细胞、牛血清、猪胰蛋白酶等)的培养基来培养细胞，从而存在外来病毒和支原体污染等安全问题。
为了解决上述现有材料的局限性，在本发明中，从捐赠得到的皮肤中，保留了包含促进角质形成细胞的附着的基底膜层和细胞外基质的真皮层的结构，去除了引起免疫反应的细胞等，从而制造了含基底膜层的脱细胞真皮。此外，将皮肤源细胞适用于上述含基底膜层的脱细胞真皮，以提供同时存在真皮和表皮的全层人工皮肤。
现有技术
专利文献
1.韩国授权专利第10-0791502号
发明内容
技术目的
本发明的目的在于提供一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤及其制造方法。
更具体地说，本发明的目的在于将表皮及真皮层的细胞及免疫反应诱发因子的残余最小化的同时，保存基底膜层而可用作人工皮肤的含基底膜层的脱细胞真皮及其制造方法。
另外，本发明的目的是提供一种人工皮肤及其制造方法，其中，在含有上述冻干基底膜层的脱细胞真皮上，不涂覆其他动物源性细胞外基质，而在无饲养细胞(feeder cellfree)、无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养要素中适用皮肤源细胞来制造人工皮肤。
用于解决的技术方案
本发明是提供一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，包括以下步骤：在含基底膜层的脱细胞真皮的真皮方向上接种成纤维细胞后培养的步骤；在含基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上接种角质形成细胞后培养及分化的步骤。
此外，本发明提供通过所述的人工皮肤制造方法制造得到的、基于含基底膜层的真皮的人工皮肤，其包括脱细胞真皮支撑体及表皮，其中所述脱细胞真皮支撑体包含基底膜层，且基底膜层包含成纤维细胞；所述表皮在上述含有上述基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上形成，且培养及分化有角质形成细胞。
发明效果
根据本发明，含基底膜层的脱细胞真皮在其结构内含有促进皮肤源细胞的附着的基底膜层，还保存了真皮层的结构。因此，不需要额外的动物源性细胞外基质的涂覆，可以在无饲养细胞(feder cell free)、无外源物质(xeno free)和无血清(serum-free)的培养要素中，适用和培养/分化皮肤源细胞，也可以赋予临床上的安全性。
另外，在上述人工皮肤支撑体上培养皮肤源细胞制成的人工皮肤，移植到皮肤缺损处时，其组织能够安全且有效地再生。
附图说明
图1表示制造含有薄层基底膜层的脱细胞真皮的工艺。
图2表示通过在含有不同厚度基底膜层的脱细胞真皮中培养人源性成纤维细胞(HDF)来确认细胞增殖的结果。
图3a表示在含基底膜层和不含基底膜层的脱细胞真皮上培养成纤维细胞，确认细胞增殖的结果。
图3b和图3c表示在含基底膜层的脱细胞真皮(B)和不含基底膜层的脱细胞真皮(C)上培养成纤维细胞，确认不同时间段的细胞存活的结果。
图4a表示在含基底膜层的脱细胞真皮和不含基底膜层的脱细胞真皮上培养角质形成细胞(HEK)来确认细胞增殖的结果。
图4b表示在含基底膜层的脱细胞真皮上涂覆CTS和胶原蛋白后，培养角质形成细胞，以确定不同时间段的细胞存活结果。
图4c表示在含基底膜层的脱细胞真皮上接种不同数量的角质形成细胞后实施培养，以确定不同时间段的细胞存活结果。
图5表示在含基底膜层的脱细胞真皮上共同培养人皮肤源角质形成细胞和成纤维细胞后进行皮肤分化的结果，图6表示通过组织学分析的分化结果。
具体实施方式
本发明涉及一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，包括以下步骤：
A)在含基底膜层的脱细胞真皮的真皮方向上接种成纤维细胞后培养的步骤；
B)在含基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上接种角质形成细胞后培养及分化的步骤。
根据本发明的实施例中，通过本发明的制造方法制造的含基底膜层的脱细胞真皮上，不涂覆其他动物源性细胞外基质，而在无饲养细胞(feeder cell free)、无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养基中接种作为皮肤源细胞的成纤维细胞和/或角质形成细胞并培养，由此确认了上述含基底膜层的脱细胞真皮与皮肤源细胞之间具有相容性和亲和性，因此适合用作人工皮肤。
以下，详细说明本发明的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤(以下简称人工皮肤)的制造方法。
在本发明中，步骤A)和步骤B)的执行顺序是不受限制的，并且步骤A)和B)可以依次执行，或者步骤B)和A)可以依次执行，并且步骤A)和B)可以同时执行。
在本发明中，可以通过在含基底膜层的脱细胞真皮上培养和/或分化皮肤源细胞来制造人工皮肤。
在本发明中，含基底膜层的脱细胞真皮为，通过对含基底膜层的真皮实施脱脂质化及脱细胞化而制造得到的，是脱细胞真皮(Acellular Dermal Matrix，ADM)。
上述含基底膜层的脱细胞真皮可应用于与正常脱细胞真皮相同的领域，在本发明中，可适用于作为皮肤替代材料的人工皮肤。具体而言，含基底膜层的脱细胞真皮起到人工皮肤中的真皮的作用，并且可以充当用于皮肤源细胞的培养和/或分化的支撑体的作用。
这种含基底膜层的脱细胞真皮通过以下方法制备：
a)制造真皮的步骤，去除皮肤组织的表皮，制造厚度为100～300μm的含基底膜层的真皮；
b)去除脂质成分的步骤，在上述含基底膜层的真皮中去除脂质成分；
c)去除细胞的步骤，上述已去除脂质成分且含基底膜层的真皮中去除细胞的步骤。
在本发明中，皮肤组织可能是同种或异种皮肤组织。上述同种是指人类，异种是指人类以外的动物，即猪、牛、马等哺乳类。
也就是说，在本发明中，通过使用同种或异种皮肤组织，按照本发明的制造方法制造含基底膜层的脱细胞真皮。
在本发明中，步骤a)是，从皮肤组织去除表皮，制造厚度为100～300μm的含基底膜层的真皮的步骤。
在一具体例中，上述步骤使用取皮机(dermatome)将包含表皮层的皮肤切成所需的厚度，尤其是切成薄至300um以下的厚度。此外，所获得薄的、含表皮层的皮肤的状态下，仅去除表皮层而容易获得更薄的真皮。
在一具体例中，含基底膜层的真皮厚度在100-300μm之间。在上述厚度范围内，包括基底膜层的人工皮肤支撑体的细胞相容性是极好的。当厚度超过300μm，则就有细胞相容性变差的顾虑，当厚度过薄，则也不适合作为人工皮肤使用，所以需要将厚度调整到上述范围。
本发明中，真皮含有基底膜层，可提高皮肤源细胞的附着率，以便于人工皮肤的制作。
在本发明中，步骤b)是，从步骤a)中制造的含基底膜层的真皮中去除脂质成分的步骤，其可以使含基底膜层的真皮脱脂肪化。上述脱脂肪化(delipidation)是指，从含基底膜层的真皮中去除脂质成分。
在一具体例中，可使用脱脂溶液来实施脱脂肪化。上述脱脂溶液可含有极性溶剂、非极性溶剂或它们的混合溶剂。上述极性溶剂可为水、醇或它们的混合溶液，作为醇类，可使用甲醇、乙醇或异丙醇。此外，非极性溶剂也可使用己烷、庚烷、辛烷或它们的混合溶液。具体而言，在本发明中，异丙醇(IPA)和己烷的混合溶液可用作脱脂溶液。此时，异丙醇与己烷的混合比可为20:80至80:20。
上述脱脂溶液的处理时间可以为1至8小时。
在本发明中，步骤c)是从通过步骤b)已去除脂质成分的含基底膜层的真皮中去除细胞的步骤，可以对含基底层的真皮进行脱细胞化。脱细胞化(decellularization)是指，从含基底膜层的真皮中去除细胞外基质以外的其他细胞成分，例如细胞核、细胞膜和核酸等。在本发明中，经过脱脂肪化和脱脂质化的含基底膜层的真皮表示为含基底膜层的脱细胞真皮。
在一具体例子中，脱细胞化可以使用脱细胞溶液进行，上述脱细胞溶液可以使用碱性溶液，具体而言，可以使用选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钙、氢氧化镁、氢氧化钙和氨组成的组中的一个以上。本发明中，作为脱细胞溶液可使用氢氧化钠(NaOH)。现有技术中，使用表面活性剂或酶进行脱细胞。然而，当使用酶时，会对真皮本身造成损伤，如果酶残留并移植到体内时，对患者原有组织造成损伤，严重时还会引起免疫反应。此外，当使用表面活性剂时，需要进行清洗操作，以尽量减少残留的表面活性剂，而表面活性剂的残留可能会导致人体内的细胞和组织毒性。因此，在本发明中，脱细胞时使用脱细胞溶液来解决上述问题，并且，其还具有无细胞毒性的优点。
在一具体例中，脱细胞溶液的浓度为0.05M至0.5M的范围。在上述浓度范围内容易去除细胞。
此外，在一具体实例中，脱细胞化步骤可执行30分钟至10小时。在上述时间范围内容易去除细胞。
此外，在本发明中，可进一步实施对含基底膜层的脱细胞真皮冷冻干燥的步骤。通过上述冷冻干燥去除含基底膜层的脱细胞真皮中的水分，从而提高上述脱细胞真皮上的细胞附着率。
在一具体例中，冷冻干燥可在-60℃至90℃下实施2天到4天。
此外，在本发明中，可对含基底膜层的脱细胞真皮进一步进行灭菌的步骤。
在一具体例中，可以通过照射放射线或电子束来实施灭菌，并且照射范围可以是10kGy到30kGy。
通过上述制造方法制造含基底膜层的脱细胞真皮，上述含基底膜层的脱细胞真皮由基底膜层及真皮构成。上述含基底膜层的脱细胞真皮，最大限度地减少了免疫反应诱发因子的残留，同时保存了基底膜层，使其适合作为人工皮肤使用。
本发明使用通过上述制造方法制造的含基底膜层的脱细胞真皮来制造人工皮肤。
制作含有细胞的替代材料或人工皮肤模型时，传统上利用含有动物源性成分的培养要素培养细胞，或者涂覆动物源性细胞外基质来制作，如果没有动物源性成分，就不会发生细胞附着和分化(Lamb R，Ambler CA(2013)Keratinocytes Propagated in Serum-Free,Feeder-Free Culture Conditions Fail to Form Stratified Epidermis in aReconstituted Skin Model.PLoS ONE 8(1):e52494.doi:10.1371/journal.pone.0052494)。但是，使用这种动物源性成分，会引起动物源性病毒或支原体等污染，因此，在安全性上可能会出现问题。
皮肤的基底膜层由胶原蛋白(Collagen)、层粘连蛋白(laminine)、蛋白多糖(proteoglycan)、纤维连接蛋白(fibronectin)等成分组成，起到使上皮细胞牢固地附着在其下方的组织上的作用。
因此，在本发明中，使用含基底膜层的脱细胞真皮，其结构内部含有能够促进皮肤源细胞的附着的基底膜层，并且保持有真皮结构，从而无需进行动物源性细胞外基质的涂覆。通过这种方法，在含基底膜层的脱细胞真皮上可以培养皮肤源细胞并使其分化，从而在临床上是安全的。
另外，本发明的含基底膜层的脱细胞真皮，其厚度薄至100-300μm的范围。因此，能进一步提高皮肤源细胞的附着和培养效率，当移植到皮肤缺损处时能安全有效地再生组织。
在本发明中，步骤A)和步骤B)可将皮肤源细胞接种在含基底膜层的脱细胞真皮上，而无需动物源性细胞外基质的涂覆。
另外，本发明中，步骤A)和步骤B)可以在无饲养细胞(feeder cell free)、无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养要素(环境)中实施。上述无饲养细胞(feeder cell free)、无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养要素是指，在不包括饲养细胞、牛血清、猪胰蛋白酶等动物源性成分的培养基内培养和/或分化。因此，可以解决外来动物源性物质的污染问题，制造出安全性的人工皮肤。
在本发明中，步骤A)是在含基底膜层的脱细胞真皮的真皮方向上接种成纤维细胞后培养的步骤。
本发明中，含基底膜层的脱细胞真皮的真皮方向是指未形成基底膜层的真皮方向的面，可以称为真皮层。
在本发明中，成纤维细胞是真皮的主要组成细胞，分泌细胞外基质和生长因子，使真皮组织更加牢固。
在一具体例中，接种的纤维细胞的数量为1×104/cm2到1×106/cm2。
在一具体例中，可使用基于生长因子的培养基进行成纤维细胞的培养，具体而言，培养基可以是无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养基，可进行1至21天的培养。
在本发明中，步骤B)是在含基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上接种角质形成细胞后培养和分化的步骤。
上述皮肤角质形成细胞在含基底膜层的脱细胞真皮上附着、培养和分化，起到表皮的作用。也就是说，本发明可以制造真皮和表皮都存在的全层人工皮肤。
在一具体例中，所接种的角质形成细胞的数可为5×104/cm2至1×106/cm2。
在一具体例中，角质形成细胞的培养可使用本领域常用的角质形成细胞培养基来实施，具体而言，培养基可以是基于生长因子的无饲养细胞(feeder cell free)、无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养基。可进行1至7天的培养。
此外，在本发明中，角质形成细胞培养后可分化7至21天。
此时，可以使用本领域常用的角质形成细胞分化培养基进行分化，具体来说，分化培养基可以是无外源物质(xeno free)及无血清(serum-free)的培养基。
此外，本发明涉及基于含基底膜层的真皮的人工皮肤，是通过基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法制造得到。
本发明所述的人工皮肤，包括脱细胞真皮及表皮。
所述脱细胞真皮包含基底膜层，该基底膜层包含成纤维细胞。
所述表皮在上述含基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上形成，且培养及分化有角质形成细胞。
根据本发明，人工皮肤可用作皮肤替代材料，具体而言，大面积烧伤、糖尿病等引起的皮肤溃疡或皮肤损伤、意外事故、创伤、老化等引起的皮肤组织的凹陷等原因，在美容整形和重建整形领域里，皮肤替代材料使用。
通过下述实施例，更具体地说明本发明。但是，本领域技术人员应该理解，本发明的范畴不限于下述实施例，在不脱离所附的权利要求范围内的事项导出的技术事项的范围内，可以进行多种变形、修改或应用。
本发明的实施方式
实施例
实施例1.含基底膜层的人工皮肤制作
(1)含基底膜层的脱细胞真皮的制造
准备皮肤组织(为了非营利为目的的患者治疗而从组织库受捐的尸体中采集)。
使用取皮机(dermatoms)切除100到300μm厚(包含表皮)，来获得含基底膜层的真皮。之后，用无菌蒸馏水清洗数次。
经切除的含基底膜层的真皮中，使用含有乙醇(IPA)和己烷的混合溶液处理，以去除脂肪，为了去除表皮和真皮中的细胞，使用氢氧化钠(NaOH)处理(制造含基底膜层的脱细胞真皮)。
在含基底膜层的脱细胞真皮上使用过氧化氢(H2O2)去除皮肤上的尸斑，进行病毒的灭活。对清洗过的皮肤组织进行冷冻干燥，去除水分，灭菌。
(2)人工皮肤的制造
将含基底膜层的真皮置于培养容器中，使真皮层位于上方，将悬浮于培养液中的成纤维细胞在真皮层方向接种后培养，诱导上述成纤维细胞在真皮层内固定并增殖。
培养1～21天后，翻转培养有成纤维细胞的脱细胞真皮的基底膜层使其朝上，在基底膜层方向上接种角质形成细胞后培养1～7天。后续14天期间，通过维持角质形成细胞分化培养基和气液界面(ALI，Air-liquid interface)的状态，诱导分化生成人工皮肤。
比较例1.不含基底膜层的人工皮肤的制造
(1)制造不含基底膜层的脱细胞真皮
在实施例1的(1)中，切除表皮和基底膜层后再向下切除100到300μm，制造了不含基底膜层的真皮，除此之外，按照实施例方法制造不含基底膜层的脱细胞真皮。
(2)人工皮肤制造
按照实施例1的(2)，制造了人工皮肤。
在本发明中，图1表示制作薄形的含基底膜层的脱细胞真皮和不含基底膜层的脱细胞真皮的工程。
如图1所示，，使用由取皮机从捐赠的皮肤中切除了100到300μm厚度(含表皮)的含基底膜层的真皮(实施例1)，并使用由取皮机(dermatoms)切除了表皮和基底膜层后切除下方的100到300μm厚的不含基底膜层的真皮(比较例1)，通过去除脂肪、脱细胞化及灭菌等工艺，制造了含基底膜层的脱细胞真皮和不含基底膜层的脱细胞真皮。
以下，在附图中，包含基底膜的真皮表示使用含基底膜层的脱细胞真皮的情况，不包含基底膜的真皮表示使用不含基底膜层的脱细胞真皮的情况。
实验例1.根据脱细胞真皮厚度的细胞相容性分析
确认了含基底膜层的脱细胞真皮厚度有关的细胞附着及增殖。
以水合态(hydration)和冷冻干燥的冻干态，准备厚度为1mm以下和2～3mm的、清洗结束的含基底膜层的脱细胞真皮。在这里所使用的含基底膜层脱细胞真皮是，除了厚度不同之外，按照实施例1的(1)方法相同的方法制造的。
在上述含基底膜层的脱细胞真皮上，喷射2×104/cm2的人皮肤源纤维细胞(humandermal fibroblast，HDF)后进行培养。为了确认细胞附着及存活，在培养7日后通过CCK-8试剂盒测定吸光度，来确认细胞增殖程度。
其结果示于图2中。
图2是在包含不同厚度的基底膜层的脱细胞真皮中培养皮肤源纤维细胞，来确认细胞增殖的结果的图表。如上述图2所示，在具有1mm以下的厚度且冷冻干燥的剂型(干燥状态)中，细胞附着和细胞增殖非常优秀。
实验例2.根据是否包含基底膜层，分析人皮肤源纤维细胞的相容性
(1)细胞相容性分析
对实施例1的(1)中制造的含基底膜层的脱细胞真皮(含基底膜层的真皮)和比较例1的(1)中制造的不含基底膜层的脱细胞真皮(未含基底膜层的真皮)，确认细胞相容性。在真皮上培养人皮肤成纤维细胞并确认了上述细胞相容性。本发明中所使用的所有细胞均在去除了动物源性成分的条件下维持并培养。
具体而言，使用在实施例1中制造的含基底膜层的真皮和比较例1中制造的不含基底膜层的真皮，在涂覆细胞外基质成分(CTS、胶原蛋白)的状态和没有涂覆的状态下，喷射含1×105/cm2的人皮肤源纤维细胞的细胞悬液进行培养。为了确认真皮表面的细胞附着及增殖，在细胞培养基中培养1天、4天、7天、14天、21天。
细胞相容性分析进行如下。在第1天、第4天、第7天、第14天、第21天通过CCK-8试剂盒测定吸光度，确认细胞增殖程度。
细胞相容性分析结果显示在图3a上。
图3a表示根据是否有基底膜层，在含基底膜层/未含基底膜层的真皮中，确认成纤维细胞增殖程度的结果。在上述图中，无涂层(Non coating)是指，未涂层的含/不含基底膜层的真皮；CTS是指，涂覆细胞外基质成分CTS的含/不含基底膜层的真皮；胶原蛋白(Collagen)是指，涂覆胶原蛋白(细胞外基质成分)的含/不含基底膜层的真皮，从而示出了上述真皮中测定吸光度的结果。
如图3a所示，可以看出在培养期间，各组均可见成纤维细胞的增殖，含基底膜层的真皮比不含基底膜层的真皮有更优异的细胞结合性。
(2)细胞附着与细胞存活分析
此外，在实施例1的(1)中制造的含基底膜层的真皮、和比较例1的(1)中制造的不含基底膜层的真皮中培养人皮肤源成纤维细胞，培养1天、4天、7天、14天、21天期间，利用活/死细胞活力测定(Lifetime Technology，USA)，共聚焦显微镜(LSM 700，卡尔蔡司，德国)确认细胞附着和存活。
细胞附着及细胞存活表现在图3b和图3c上。
图3b和图3c示出了在含基底膜层的真皮(B)和不含基底膜层的真皮(C)中培养成纤维细胞，确认不同时间段的细胞存活(具体地，细胞附着及细胞增殖)的结果。7日以后，观察了接种的面和相反的一面，绿色表示存活的细胞，红色表示死亡的细胞。
如上图3b所示，含基底膜层的真皮和不含基底膜层的真皮细胞增殖活跃。尤其是含基底膜层的真皮，在从第7天往后，可以看到细胞在喷射细胞的相反方向也有增殖。
实验例3.根据是否含基底膜层，分析人皮肤源角质形成细胞的相容性
(1)细胞相容性分析
确认实施例1的(1)中制造的含基底膜层的真皮的细胞相容性和比较例1的(1)中制造的未含基底膜层的真皮的细胞相容性。上述细胞相容性是通过在含基底膜层/不含基底膜层的真皮上培养人皮肤源角质形成细胞(human keratinocytes，HEK)来确认的。
具体来说，使用含基底膜层的真皮和不含基底膜层的真皮，在涂覆细胞外基质成分(CTS、胶原蛋白)的状态和没有涂覆的状态下，喷射含1×105/cm2角质形成细胞的细胞悬液进行培养。为了确认真皮表面的细胞附着及增殖，在细胞培养基中培养了一段时间。
细胞相容性分析如下。在第1天、第3天和第7天，用CCK-8试剂盒(CCK-8kit)测量吸光度以确定细胞增殖程度。
细胞相容性分析的结果也显示在4a中。
图4a显示了在根据有或无基底膜层而区分成含/不含基底膜层的真皮中确认角质形成细胞的增殖程度的结果。在所述附图中，无涂层是指，对含基底膜层/不含基底膜层的真皮不涂覆的状态，CTS是指，涂覆细胞外基质成分CTS的状态；胶原蛋白(Collagen)是指，涂覆胶原蛋白(细胞外基质成分)的状态，由此示出上述状态下测定的吸光度结果。
如图4a所示，在培养期间，含基底膜层的真皮无论是否有涂覆，细胞均有增殖，但不含基底膜层的真皮随着时间的推移，吸光度减少，可以确认到细胞死亡。
(2)细胞附着与细胞存活分析
此外，实施例1中制造的含基底膜层的真皮上培养角质形成细胞，并且在培养的第1天、第4天和第7天，利用活/死细胞活力测定(Life Technology,USA)，使用共聚焦显微镜(LSM 700，卡尔蔡司，德国)测定细胞附着和存活。
在本实验例中，不对含基底膜层的真皮进行涂覆，或者用细胞外基质(CTS、胶原蛋白)涂覆后使用。
图4b示出细胞附着和细胞存活。
图4b显示通过在含基底膜层的真皮上培养角质形成细胞，确认不同时间段的细胞存活(具体而言，细胞附着和细胞增殖)的结果。在图4b中，绿色代表存活的细胞，红色代表死细胞。
如图4b所示，未涂层的含基底膜层的真皮上喷射的角质形成细胞，其随时间的增殖率优于有涂层的人工皮肤支撑体。
(3)根据角质形成细胞数量分析细胞附着和增殖的差异
此外，为了确认不同数量的角质形成细胞的细胞附着和增殖的差异，将含有1×105/cm2到3×105/cm2角质形成细胞的细胞悬液喷射到实施例1的(1)制备的含基底膜层的真皮上进行培养。在培养1天和3天后，通过共聚焦显微镜(LSM 700，Carl Zeiss，德国)使用活/死细胞活力测定(Life Technology，美国)确认细胞附着和存活。
如图4c示出，根据角质形成细胞的数量变化的细胞附着和增殖结果。
图4c显示含基底膜层的真皮中，接种不同数量的角质形成细胞后培养，并确认不同时间段细胞的存活的结果。这里，绿色代表存活细胞，红色代表死细胞。
如图4c所示，含基底膜层的真皮上，角质形成细胞根据细胞的数量增殖。
通过上述图3和图4，可以确认含基底膜层的真皮与皮肤源细胞有相容性和亲和性。
实验例4.含基底膜层真皮作为人工皮肤的相容性分析
使用实施例1的(1)制造的含基底膜层的真皮，在真皮方向上接种显示绿色的DiO标记的成纤维细胞后培养，在基底膜层中接种显示红色的DiI标记的角质形成细胞后培养，并且在培养一天后确认细胞附着和形态。
在图5中表示了确认细胞附着及形态的结果。
如图5所示，角质形成细胞和成纤维细胞都附着在含基底膜层的真皮层上，并且确认到增殖。
另外，角质形成细胞部分通过ALI(air liquid interface)诱导分化。
具体而言，含基底膜层的真皮的真皮层上培养成纤维细胞，然后将角质形成细胞在基底膜层方向上接种后培养，14天期间角质形成细胞分化培养及维持ALI(Air-liquidinterface)状态，诱导分化。由此制造了人工皮肤。
图6是通过组织学分析得出的分化结果。对接种皮肤源细胞后增殖分化诱导14天的人工皮肤，使用中性福尔马林固定后实施冷冻切片(cryosection)，用苏木精&伊红(Hematoxylin&Eosin，H&E)染色观察标本整体。
通过图6，确认了角质形成细胞在含基底膜层的真皮中分化的人工皮肤。
工业利用性
在人工皮肤支撑体上培养皮肤源细胞制成的人工皮肤，移植到皮肤缺损处时，其组织能安全有效地再生。

Claims (11)

1.一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于包括以下步骤：
在含基底膜层的脱细胞真皮的真皮方向上接种成纤维细胞后培养的步骤；
在含基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上接种角质形成细胞后培养及分化的步骤。
2.根据权利要求1所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，含基底膜层的脱细胞真皮通过以下方法制备：
a)制造真皮的步骤，去除皮肤组织的表皮，制造厚度为100～300μm的含基底膜层的真皮；
b)去除脂质成分的步骤，在上述含基底膜层的真皮中去除脂质成分；
c)去除细胞的步骤，已去除上述脂质成分且含基底膜层的真皮中去除细胞的步骤。
3.根据权利要求2所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，皮肤组织为同种或异种皮肤组织。
4.根据权利要求2所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
步骤b)中使用脱脂溶液实施；
上述脱脂溶液含有极性溶剂、非极性溶剂或它们的混合溶剂。
5.根据权利要求2所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
步骤c)使用脱细胞溶液实施，上述脱细胞溶液选自由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钙、氢氧化镁、氢氧化钙和氨组成的组中一个以上。
6.根据权利要求2所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
进一步包括将含基底膜层的真皮实施冷冻干燥及灭菌的步骤。
7.根据权利要求1所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
在含基底膜层的真皮上不涂覆动物源性细胞外基质，且接种成纤维细胞及角质形成细胞。
8.根据权利要求1所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
成纤维细胞的培养及角质形成细胞的培养及分化分别在无饲养细胞、无外源物质及无血清的培养要素中实施。
9.根据权利要求1所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
所接种的成纤维细胞数为1×104/cm2～1×106/cm2，上述成纤维细胞培养1～21天。
10.根据权利要求1所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法，其特征在于，
所接种的角质形成细胞数为5×104/cm2～1×106/cm2，角质形成细胞培养1～7天，分化7～21天。
11.一种基于含基底膜层的真皮的人工皮肤，通过权利要求1所述的基于含基底膜层的真皮的人工皮肤制造方法制造得到，上述基于含基底膜层的真皮的人工皮肤包括脱细胞真皮及表皮，
上述脱细胞真皮含基底膜层，上述基底膜层包含成纤维细胞；
上述表皮在上述含基底膜层的脱细胞真皮的基底膜层上形成，且培养及分化有角质形成细胞。
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