CN112957534A - 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，属于生物材料制备技术领域，本发明利用生产加工的废弃物猪皮，经过脱细胞处理，制备出可以具有良好的稳定性和生物相容性的脱细胞真皮基质材料。本发明所制备的猪ADM材料呈现蜂窝状的多孔结构并且很好地保留了猪皮胶原的主要成分；所得到的猪ADM材料拉伸强度可达到2.06±0.48MPa，明显优于前人的研究数值0.28MPa，能够满足实际使用的更多需求；所制备的猪ADM材料无细胞毒性且具有较高的孔隙率，有利于细胞黏附和营养的交换，对细胞的增长繁殖表现出明显的促进效果。

Description

一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种脱细胞真皮基质材料的制备方法。
背景技术
在过去的30年中，全球已经开发了许多先进的伤口敷料，尤其是对天然聚合物(包括橡胶，纤维素和胶原蛋白)的使用进行了广泛的研究，这些天然聚合物具有良好的生物相容性、可降解性和保水性等功能。其中胶原蛋白是最丰富的动物蛋白，它为生物组织提供机械强度，加速细胞增殖。目前商用型的胶原敷料大多由牛和猪的组织制备，胶原支架的制备可以通过脱细胞进行，通常称为脱细胞真皮基质。脱细胞真皮基质是一种特殊类型的生物材料，其中来自皮肤组织的高免疫原性细胞成分已被去除，同时还保留了细胞外基质和基底膜，以及真皮组织的完整三维空间结构。Wainwright和Livesey等人率先开展了关于脱细胞真皮基质方面的研究，研究发现脱细胞真皮基质材料治疗深度烧伤引起的伤口时会表现出低免疫原性，并可诱导宿主细胞成纤维细胞的浸润、新血管的形成和上皮组织的形成。随后的研究表明，脱细胞真皮基质材料表现出良好的组织相容性；这是因为这种材料不包含通常引起移植免疫排斥的细胞成分和抗原成分(主要组织相容性复合体1类和2类)。此外，由于保留了真皮组织的三维结构(主要包含I型胶原)，脱细胞真皮基质材料可作为优良的组织支架促进宿主细胞植入和新生血管形成。得益于独特的材料结构和优异的生物学特性，通常用于修复组织缺损。同时，脱细胞真皮基质材料具有一定耐受感染能力，这也有利于组织的修复。
猪脱细胞真皮基质(猪ADM)是将猪皮经过脱细胞等工艺处理除去免疫成分后，保留细胞外基质的主要成分及低免疫原性的一种潜在的重要生物医用材料。目前常用的脱细胞方法有物理法、化学法、酶法、有机溶剂这四种方法，在处理过程中都会造成真皮基质结构不同程度的损伤、降解基质中的活性因子，导致材料机械强度差、热稳定性不足、生物相容性差，因此，最大程度的维持真皮基质三维结构稳定性和保留蛋白聚糖、生长因子等生物活性成分的脱细胞方法是目前研究的热点和难点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种脱细胞真皮基质材料的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，它包括以下步骤：
S1.去皮：取猪皮，刮去表面的毛发，切取具有一定厚度且含表皮的真皮基质，同时去除脂肪组织；
S2.浸泡：将去皮后的真皮基质浸泡在含有氨基酸的乙醛溶液中1-2h，所述溶液体积与真皮基质质量的比值为2:1；
S3.脱细胞：将浸泡后的真皮基质置于洗脱液中进行洗脱，所述洗脱的温度为37℃，洗脱时间为4h，洗脱次数为4次；所述洗脱液为NaOH、TritonX-100与SDS的混合物；
S4.后处理：将脱细胞真皮基质进行干燥和灭菌。
进一步地，步骤S1中所述真皮基质的厚度为0.1-3mm。
进一步地，步骤S2中所述的氨基酸为甘氨酸，甘氨酸的质量百分比浓度为4-5％。
进一步地，步骤S3中所述洗脱液与真皮基质的料液比为10mg:1mL。
进一步地，步骤S3中所述NaOH的质量百分比浓度为2％，TritonX-100的质量百分比浓度为2％，SDS的质量百分比浓度为0.5％。
本发明具有以下优点：本发明公开了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，本发明利用生产加工的废弃物猪皮，经过脱细胞处理制备出可以具有良好的稳定性和生物相容性的脱细胞真皮基质材料。通过浸泡使增加了基质中的蛋白分子的化学势进而提高了结构的稳定性。本发明选出具有低免疫原性和良好生物相容性结果的工艺参数，并对所制备材料的结构与性能进行了研究，研究结果表明本发明所制备的猪ADM材料呈现蜂窝状的多孔结构并且很好地保留了猪皮胶原的主要成分。此外，所得到的猪ADM材料拉伸强度可达到2.06±0.48MPa，明显优于前人的研究数值0.28MPa，能够满足实际使用的更多需求。所制备的猪ADM材料无细胞毒性且具有较高的孔隙率，有利于细胞黏附和营养的交换，对细胞的增长繁殖表现出明显的促进效果。
附图说明
图1为本发明制备的猪脱细胞真皮基质的不同放大倍数SEM图像；
图2为本发明制备的猪脱细胞在猪ADM材料上随时间的增殖情况。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：制备脱细胞真皮基质材料
一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，它包括以下步骤：
S1.去皮：取废弃的猪皮，刮去表面的毛发，切取厚度为0.1-3mm且含表皮的真皮基质，同时去除脂肪组织；
S2.浸泡：将去皮后的真皮基质浸泡在含有甘氨酸的乙醛溶液中1-2h，甘氨酸的质量百分比浓度为4-5％，所述溶液体积与真皮基质质量的比值为2:1；
S3.脱细胞：将浸泡后的真皮基质置于洗脱液中进行洗脱，所述洗脱液与真皮基质的料液比为10mg:1mL，NaOH的质量百分比浓度为2％，TritonX-100的质量百分比浓度为2％，SDS的质量百分比浓度为0.5％，所述洗脱的温度为37℃，洗脱时间为4h，洗脱次数为4次；所述洗脱液为NaOH、TritonX-100与SDS的混合物；
S4.后处理：将脱细胞真皮基质进行干燥和灭菌。
实施例2：扫描电镜观察(SEM)
(1)方法：将实施例1制备的脱细胞真皮基质材料切成5×5mm2大小，用镊子将支架样品放置在带有导电胶的载物台上，轻轻按压并用吹尘球吹打固定；对支架样品进行喷金；喷金完成后将带有样品的载物台放入扫描电子显微镜中。以5.0KeV的电压和10mA的电流对样品进行结构观察。
(2)结果：结果如图1所示，通过SEM观察，猪脱细胞真皮基质材料经冻干机冻干后，内部呈蜂窝状的多孔网络结构，孔与孔之间连通性较好，基质中纤维聚集成簇，说明材料在制备过程中胶原纤维结构没有受到破坏，保存完好，这种多孔结构有利于细胞的黏附增殖以及材料在应用中的营养交换过程。
实施例3：细胞增殖实验：
(1)方法：将实施例1制备的猪脱细胞真皮基质材料切成小块，并放入24孔板中。将样品浸入培养液中2h。在培养瓶中用0.25％胰蛋白酶对L929细胞进行胰酶消化，并制备细胞悬液，浓度为1×105/mL。小心吸出100μL等分试样的细胞悬液，并将其均匀地添加到样品的表面，然后放入恒温培养箱中4h。随后，将900μL培养基添加到每个孔中继续培养，每3天更换一次DMEM培养基。在第1、3、5、7和9天吸出培养液。添加相同量的新鲜DMEM培养基，接着向每个孔中添加50μL CCK-8试剂，并置于37℃的CO2培养箱中再缓慢摇动4h。从每个孔中取出200μL等分试样，然后转移到96孔板中。用酶标仪读取450nm处的吸光度。
(2)结果：将L929细胞接种在猪脱细胞真皮基质材料上，培养一段时间后用CCK-8法测得细胞增殖的结果。分别在第1，3，5，7，9天测定吸光度。如图2所示，细胞在所制备猪ADM材料上随着培养时间的延长，吸光度明显增加。表明细胞在此材料上可以快速生长繁殖，此材料具有良好的生物相容性。
实施例4：拉伸强度
(1)方法：将实施例1制备的猪ADM材料的力学性能通过测试抗拉伸强度来检测。将各组材料的样品剪成50×10mm大小的长条形，并用厚度测试仪测量其厚度，支架材料样品的两端用质构仪的夹子固定，控制质构仪以1mm/min的拉伸速率检测支架材料的抗拉伸强度。每组支架材料3个样品，取平均值。
计算公式为:TS＝F/S
其中Ts为拉伸强度；F为支架材料样品在断裂时所受到的最大拉力，N；S为支架材料样品断裂截面的面积，mm2。
(2)结果：力学性能是评价支架材料的重要参数之一。该工作通过质构仪测试材料的拉伸强度，测试结果表明猪ADM材料的拉伸强度为2.06±0.48MPa，明显优于前人的研究结果028MPa。
另外，如未有特殊说明，以下采用的材料和方法均为本领域常规选择及常规技术手段。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1.去皮：取猪皮，刮去表面的毛发，切取具有一定厚度且含表皮的真皮基质，同时去除脂肪组织；
S2.浸泡：将去皮后的真皮基质浸泡在含有氨基酸的乙醛溶液中1-2h，所述溶液体积与真皮基质质量的比值为2:1；
S3.脱细胞：将浸泡后的真皮基质置于洗脱液中进行洗脱，所述洗脱的温度为37℃，洗脱时间为4h，洗脱次数为4次；所述洗脱液为NaOH、TritonX-100与SDS的混合物；
S4.后处理：将脱细胞真皮基质进行干燥和灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述真皮基质的厚度为0.1-3mm。
3.根据权利要求1所述的一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的氨基酸为甘氨酸，甘氨酸的质量百分比浓度为4-5％。
4.根据权利要求1所述的一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述洗脱液与真皮基质的料液比为10mg:1mL。
5.根据权利要求1所述的一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述NaOH的质量百分比浓度为2％，TritonX-100的质量百分比浓度为2％，SDS的质量百分比浓度为0.5％。
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