KR20190143703A

KR20190143703A - 침샘 조직의 탈세포화 세포외기질-하이드로겔 및 침샘 오거나이드를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20190143703A
Application number: KR1020180071551A
Authority: KR
Inventors: 권희충; 신경신; 구경희
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2019-12-31
Also published as: KR102103783B1

Abstract

개체로부터 분리된 침샘 조직을 이용하여 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)-하이드로겔을 제조하는 방법을 제공한다. 이에 따른 dECM-하이드로겔을 이용하면 침샘 줄기세포의 3D 배양을 통해 침샘 오가노이드를 효과적으로 제조할 수 있으며, 이를 구강 건조증의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

침샘 조직의 탈세포화 세포외기질-하이드로겔 및 침샘 오거나이드를 제조하는 방법{Method for producing decellularized extra cellular matrix-hydrogel of salivary gland tissue and salivary gland organoid}

침샘 조직의 탈세포화 세포외기질-하이드로겔을 제조하는 방법 및 이를 이용한 침샘 오거나이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

구강 건조증(Xerostomia)은 충분한 양의 침이 나오지 않아 입안에 건조함을 느끼고, 목이 아프거나 음식을 씹고 삼킬 때 통증을 느끼는 증상을 나타낸다. 구강 건조증은 노화로 인한 침샘 기능 저하, 타액분비에 영향을 주는 약물의 복용 등으로 발병할 수 있는데, 특히 두경부에 방사선 치료를 받는 경우 침샘 세포(선방/관 세포)의 괴사(necrosis), 위축(atrophy) 및 섬유화(fibrosis)로 인한 침샘 손상으로 유발될 수 있다. 두경부 방사선 치료를 받는 거의 모든 환자들이 입마름을 호소하며, 정도의 차이는 있지만 침샘 손상으로 인해 평생 지속적으로 구강 건조증의 부작용이 남게 된다. 따라서, 두경부 방사선 치료에 대한 침샘 치료 기술 및 구강 건조증 치료약 개발이 매우 시급하다. 현재 구강 건조증(Xerostomia)에 대한 치료법 및 약물로 타액촉진제 필로카르핀(pilocarpin) 또는 Ethyol®(amifostine)이 방사선 보호제로서 개발되었으나, 이 또한 여러 부작용으로 인해 아주 제한적으로 사용되고 있으며, 대체 의약품 부재로 사탕(candy) 요법만이 존재한다. 특히 침샘 세포가 손상 및 파괴된 경우에는 재생력이 매우 낮기 때문에 현재 이용되는 재생 치료 요법이 전무하다.

한편, 오가노이드(organoid)는 1차 조직(primary tissue, 조직 하위단위 또는 단일세포), 배아 줄기세포(ESC) 및 유도만능줄기세포(iPSC), 세포주(cell line), 그리고 여러 조직 유형들로 구성된 장기 외식편(explant)과 같은 전체 또는 분절된 기관에서 비롯된 모든 3차원 기관형 배양체(organotypic culture)를 포함하여 일컫는 용어이다. 오가노이드가 포함하고 있는 줄기세포는 유전적으로 안정하고 자가 재생이 가능하며, 실제 조직의 줄기세포와 유사한 횟수로 분화할 수 있다.

아울러, 탈세포화 기술은 조직으로부터 세포를 제거한 후 남아있는 조직의 매트릭스(acellular matrix)를 지지체로 하여 세포를 재배양하는 기술이다. 탈세포화된 생체지지체(decellularized extra cellular matrix, dECM)는 각 조직 특이적 생체 미세 환경을 모사(microenvironment mimic)하여 세포의 본래의 생태 환경을 제시할 수 있다. 특히 살아있는 세포들과 생체 활성 물질의 활성을 유지하면서 복잡한 조직을 재생할 수 있는 하이드로젤 생체재료개발 및 전체 인공 장기 개발에 대한 가능성 및 필요성이 최근에 급격히 부각되고 있다. 특히 현존하는 기존의 마트리겔(Corning®)은 마우스 육종 (Sarcoma)에서 추출한 ECM 로서 이를 이용한 선방 (acinar)세포 및 관형 (ductal)세포로의 복원 및 기능성 회복에 대한 앞선 연구가 활발히 진행 되었으나, 이종 발생성의 (Xenogeneic) 마트리겔(Corning®)의 재료적 특성으로 실제 임상연구에 제한적이다 (Joao et al, stem cell, 2016). 따라서 실제적인 임상적용 가능한 안정적인 생체적합성(Biocompatible) ECM 재료가 요구되고 있으며, 특히 침샘 세포배양에 최적화 된 dECM-하이드로겔의 개발이 절대적으로 필요하다.

일 양상은 개체로부터 분리된 침샘 조직을 이용하여 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)-하이드로겔을 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 dECM-하이드로겔을 이용하여 침샘 오가노이드를 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 침샘 오가노이드를 포함하는 구강 건조증을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 dECM-하이드로겔을 제조하는 방법은, 개체로부터 분리된 침샘 조직을 준비하는 단계; 상기 침샘 조직에 탈세포화(decellularization)를 수행하여 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)을 얻는 단계; 상기 dECM을 1차 동결 건조하는 단계; 상기 1차 동결 건조된 dECM을 분말화 하는 단계; 상기 분말화된 dECM을 펩신 용액과 혼합하여 부분 용해시키는 단계; 상기 부분 용해된 dECM을 pH 7.0 내지 8.0으로 보정하는 단계; 상기 pH 보정된 dECM을 2차 동결 건조하는 단계; 상기 2차 동결건조된 dECM을 세포 배양액(culture media)와 혼합하여, ECM의 가교(crosslinking)를 유도하는 단계; 및 상기 가교로 형성된 dECM-하이드로겔을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 개체로부터 분리된 침샘 조직을 준비하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 인간, 원숭이, 소, 돼지, 염소, 마우스, 랫드, 양, 고양이 및 개를 포함하는 포유동물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 침샘 조직에 탈세포화(decellularization)를 수행하여 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)을 얻는 단계를 포함한다.

상기 조직의 탈세포화는 당해 분야에 알려진 방법에 따라 통상의 기술자가 적절히 수행할 수 있으며, 예를 들면, 산, 염기, 저장액, 고장액, 계면활성제, 알콜, 킬레이트제, 및 다른 용매, 뉴클레아제, 콜라게나제 및 리파제 등의 효소, 및 온도, 힘 및 압력, 비열 전기천공법을 포함하는 물리적 처리로 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 탈세포화는 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 또는 이들의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제의 조합을 사용하는 경우, 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제는 동시에 또는 순차적으로 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 탈세포화는 음이온성 계면활성제를 사용하여 수행한 후, 비이온성 계면활성제를 사용하여 수행하는 것일 수 있다. 상기 음이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제는 당해 분야에 알려진 것을 모두 포함할 수 있고, 특정 종류에 제한되지 않으며, 조직의 탈세포화에 적절한 것을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 음이온성 계면활성제는 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)일 수 있다. 상기 SDS의 농도는 통상의 기술자가 탈세포화에 적절한 농도를 선택할 수 있으며, 예를 들어 약 0.5% 내지 약 1.5%, 또는 약 1% SDS를 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100 (Triton X-100)일 수 있다. 상기 트리톤 X-100의 농도는 통상의 기술자가 탈세포화에 적절한 농도를 선택할 수 있으며, 예를 들어 약 0.5% 내지 약 1.5%, 또는 약 1% 트리톤 X-100을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 탈세포화는 SDS 및 트리톤 X-100를 순차적으로 사용하여 수행하는 것일 수 있다. 탈세포화를 위한 계면활성제로 SDS 및 트리톤 X-100을 순차적으로 사용할 경우, 다른 조직에 비해 침샘 조직의 탈세포화가 높은 효율로 이루어질 수 있다.

일 구체예에서, 상기 탈세포화는 침샘 조직 무게 (g) 당 1 내지 20 ml, 5 내지 20 ml, 10 내지 20 ml, 1 내지 15 ml, 5 내지 15 ml, 또는 약 10 ml의 계면활성제를 처리하여 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 탈세포화는 침샘 조직에 음이온성 계면활성제를 12 내지 30시간, 또는 15 내지 30시간, 18 내지 30시간, 21 내지 30시간, 12 내지 24시간, 15 내지 24시간, 18 내지 24시간, 또는 21 내지 24시간 동안 처리한 후, 비이온성 계면활성제를 30분 내지 2시간, 또는 1시간 내지 2시간 동안 처리하여 수행할 수 있다.

상기 탈세포화 단계를 수행하여 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 탈세포화된 탈세포화 세포외기질을 얻을 수 있다. 따라서, 상기 탈세포화 세포외기질(dECM)은 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 탈세포화된 세포외기질을 의미할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 dECM을 1차 동결 건조하는 단계를 포함한다.

상기 1차 동결 건조 단계는 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 따라 통상의 기술자가 적절히 수행할 수 있으며, 예를 들어, 약 -70℃ 이하, 또는 약 -80℃ 이하에서 수행할 수 있다. 상기 1차 동결 건조 단계는 dECM을 균일하게 분말화 하고 정량화 하기 위한 전처리 과정이다. 일 구체예에서, 상기 1차 동결 건조 단계는 dECM을 50ml 튜브에 20ml 이하로 나누어 분배하고, -80℃에서 2시간 이상 눕혀 동결 전처리 한 후 동결건조 장비를 이용하여 -80℃에서 약 0.005mTor의 진공 상태에서 60시간 이상 완전히 동결 건조하는 것일 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 1차 동결 건조된 dECM을 분말화 하는 단계를 포함한다.

상기 1차 동결 건조된 dECM을 분말화 하는 단계는 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 따라 통상의 기술자가 적절히 수행할 수 있으며, 예를 들어 막자 사발과 N2 용액을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 분말화 단계를 수행하여 얻은 분말화된 dECM은 정량화 될 수 있다. 이와 같이 정량화된 dECM을 사용함으로써 재현성 있는 침샘 조직 유래 dECM-하이드로겔을 제조할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 분말화된 dECM을 펩신 용액과 혼합하여 부분 용해시키는 단계를 포함한다.

상기 펩신 용액은 0.1 내지 0.5%(w/v), 0.1 내지 0.4%(w/v), 0.1 내지 0.3%(w/v), 0.2 내지 0.5%(w/v), 0.2 내지 0.4%(w/v), 0.2 내지 0.3%(w/v), 또는 약 0.25%(w/v) 펩신 용액일 수 있다. 펩신 용액의 상기 농도 범위를 벗어날 경우, 침샘 조직 유래 dECM의 펩신 용해 방법으로 적절하지 않을 수 있다.

상기 펩신 용액은 HCl을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 펩신 용액은 0.05M 내지 0.15M HCl을 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 펩신 용액은 0.1M HCl을 포함하는 것일 수 있다.

상기 혼합은 펩신 용액 1 ml 당 dECM 분말 15 내지 30 mg, 또는 20 내지 30 mg, 또는 약 25 mg을 혼합하는 것일 수 있다. 혼합 비율을 벗어날 경우, 침샘 조직 유래 dECM의 펩신 용해 방법으로 적절하지 않을 수 있다.

상기 펩신 용액의 혼합 시간 및 온도는 당해 분야의 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으나, 예를 들어 24시간 내지 72시간, 또는 36시간 내지 50시간 동안 상온, 또는 20 내지 30℃에서 수행할 수 있다.

상기 부분 용해는 dECM의 ECM 단백질의 일부 또는 전부의 용해를 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 부분 용해는 dECM의 ECM 단백질의 전부의 용해를 의미할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 부분 용해된 dECM을 pH 7.0 내지 8.0으로 보정하는 단계를 포함한다. 상기 pH 보정 단계를 수행하여 수소 농도 이온 지수를 생체와 유사하게 함으로써 dECM-하이드로겔의 생체 적합성을 증가시킬 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 2차 동결 건조 단계 이전에, dECM을 PBS (Phosphate buffer saline)와 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, dECM을 PBS와 혼합하여 염 이온 농도를 보정할 수 있다. 상기 PBS 혼합 단계를 수행하여 염 이온 농도를 생체와 유사하게 함으로써 dECM-하이드로겔의 생체 적합성을 증가시킬 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 pH 보정된 dECM을 2차 동결 건조하는 단계를 포함한다. 상기 2차 동결 건조는 상기 1차 동결 건조와 동일한 조건으로 수행할 수 있다. 상기 2차 동결 건조된 dECM은 세포 배양 직전에 세포배양액에 혼합하여 사용함으로써 재현성 있는 신선한 하이드로겔을 제조할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 2차 동결건조된 dECM을 세포 배양액(culture media)와 혼합하여, ECM의 가교(crosslinking)를 유도하는 단계를 포함한다.

상기 세포배양액은 dECM-하이드로겔에 배양하고자 하는 세포의 종류에 따라 통상의 기술자가 적절한 것을 선택할 수 있다. 일 구체예에서, dECM-하이드로겔에 랫드 악하선 침샘 조직 유래 1차 조직 세포 배양으로 얻어진 침샘 줄기/전구세포를 배양하고자 하는 경우, 세포배양액으로 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 니코틴아미드, 1% ITS-X, 100nM 덱사메타손, 100uM 베타-멀캅토에탄올 및 20ng/ml mEGF로 보충된 DMEM/F12 배양액을 사용할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 방법은 상기 가교로 형성된 dECM-하이드로겔을 얻는 단계를 포함한다.

상기 dECM의 하이드로겔화는 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 따라 통상의 기술자가 적절히 수행할 수 있으며, 물리적으로 가교된 것일 수 있다. 상기 가교는 인위적인 화학 물질의 첨가 없이 수행될 수 있다. 예를 들면, 30 내지 40℃로 온도 변화를 시킴으로써 가교를 수행할 수 있다. 따라서, 상기 일 양상에 따른 방법은 화학적 가교제를 첨가하지 않고도 온도 변화만으로 가교를 유도하여 하이드로겔 형태의 제조가 가능하다.

다른 양상은 상기 dECM-하이드로겔의 제조 방법으로 제조된 dECM-하이드로겔을 제공한다.

상기 dECM-하이드로겔의 농도는 10 내지 15 mg/ml일 수 있다. dECM-하이드로겔의 농도가 상기 범위를 벗어날 경우, 하이드로겔 형성이 잘 되지 않거나 세포 배양에 문제가 발생할 수 있다. 예를 들어, 대략 10 mg/ml 미만 농도의 dECM-하이드로겔은 30 내지 40℃로의 온도의 변화에 따른 겔화가 형성되지 않을 수 있으며, 20 내지 25 mg/ml 이상일 경우 30 내지 40℃로의 온도의 변화에 의해 형성된 dECM-하이드로겔의 강도가 매우 강하고 점성도 또한 균일하지 않아 세포 생장 효율 및 그 기능성이 좋지 않을 수 있다.

상기 dECM-하이드로겔의 겔화점(gel poing)은 30℃ 이상일 수 있다. 일 구체예에서, dECM-하이드로겔의 겔화점은 약 33℃일 수 있다. 따라서, dECM-하이드로겔의 겔화점이 체온 이하 또는 유사하므로, 생체 내에서 하이드로겔 형태 안정성이 우수할 수 있으며 세포 생장 및 생체 온도에 적합할 수 있다.

상기 dECM-하이드로겔의 강도는 10 내지 20 Pa일 수 있다. dECM-하이드로겔의 강도가 상기 범위를 벗어날 경우, 예를 들어 10 Pa 미만일 경우 하이드로겔 형태 유지가 어려울 수 있고, 20 Pa을 초과할 경우 세포 생장 및 이동성 그리고 침샘 세포 고유의 형태(예: 선방 세포, 관 세포 등) 형성과 그 기능성에 문제가 발생할 수 있다.

상기 dECM-하이드로겔의 점성도는 0.03 Pa·s 이하일 수 있다. dECM-하이드로겔의 점성도가 상기 범위를 벗어날 경우, 하이드로겔 형태 유지 및 세포 생장과 이동성 그리고 침샘 세포 고유의 형태(예: 선방 세포, 관 세포 등) 형성과 그 기능성에 문제가 발생할 수 있다.

다른 양상은 상기 dECM-하이드로겔을 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

상기 줄기세포는 인간, 원숭이, 소, 돼지, 염소, 마우스, 랫드, 양, 고양이 및 개를 포함하는 포유동물로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.

상기 줄기세포는 내배엽 줄기세포, 침샘 조직 유래 줄기세포, 배아 줄기세포(ESC), 유도만능줄기세포(iPSC), 또는 그들의 세포주로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 줄기세포는 침샘 조직 유래 줄기세포를 포함할 수 있다.

다른 양상은 상기 dECM-하이드로겔을 이용하여 줄기세포를 3차원 세포 배양하는 단계를 포함하는 침샘 오가노이드(organoid)를 제조하는 방법을 제공한다.

본 연구팀은 선행 연구를 통해 환자 침샘유래 줄기세포를 분리하여 방사선 손상 동물 모델의 침샘에 재이식하여 세포의 괴사 감소 및 손상된 침샘의 기능이 회복됨을 확인하였다 (Exp. Mol. Med., 2013),(J. Tissue Eng. Regen. Med., 2014). 그러나, 기존의 줄기세포 이식 방법은 이식된 줄기세포의 낮은 생존기간 (3일에서 최대 3주 보고 됨) 및 저조한 생존율로 그 효율이 낮았다.

그러나, 본 발명의 일 양상에 따른 dECM-하이드로겔을 이용하면 배양되는 침샘 줄기세포의 생존율, 분화능, 및 재생능력을 현저히 증대시킬 수 있고, 이를 통해 구강 건조증을 예방 또는 치료하는데 유용한 침샘 오가노이드를 제조할 수 있다.

다른 양상은 상기 침샘 오가노이드를 포함하는 구강 건조증을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 구강 건조증은 침샘 세포의 괴사, 위축, 또는 섬유화로 인한 것일 수 있다.

상기 구강 건조증은 방사선 조사에 의한 침샘 세포의 손상으로 인한 것일 수 있다.

일 양상에 따른 dECM-하이드로겔을 이용하면 침샘 줄기세포의 3D 배양을 통해 침샘 오가노이드를 효과적으로 제조할 수 있으며, 이를 구강 건조증의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 일 실시예에 따른 3D 세포 배양이 가능한 쥐의 침샘 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)-하이드로겔을 생산하는 프로토콜을 나타낸다.
도 2는 H&E 염색 및 IHC 염색으로 침샘 조직의 탈세포화 후 그 효율을 확인한 것을 나타낸다.
도 3은 DNA 정량 및 주요 ECM 단백질 정량 분석으로 침샘 조직의 탈세포화 후 그 효율을 확인한 것을 나타낸다.
도 4는 농도 별 dECM-하이드로겔의 37℃에서 겔화를 나타낸 사진이다.
도 5는 침샘 유래 줄기세포를 3D 배양한 12.5 mg/ml 농도의 dECM-하이드로겔에서 침샘 줄기세포의 세포 생장 및 선방/관(acinar/ductal) 세포 형태를 관찰한 결과이다.
도 6a는 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔의 겔화점을 분석한 그래프이다.
도 6b는 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔의 주파수 스윕을 분석한 그래프이다.
도 6c는 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔의 점성도를 분석한 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 랫드침샘 조직의 특이적 탈세포화를 통한 dECM-하이드로겔 제작

1.1 침샘 조직을 이용한 dECM-하이드로겔 제조

도 1은 일 실시예에 따른 3D 세포 배양이 가능한 쥐의 침샘 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)-하이드로겔을 생산하는 프로토콜을 나타낸다. 구체적으로는 다음과 같다.

문헌(J.L. Ungerleider et al., Method, 2015; Gao Z et al., Cell Tissues Organs, 2014, Jinah Jang et al., Biomaterials 2017)에 제시된 내용을 응용하여, 랫드 유래 침색조직 무게 (g) 당 10ml의 1% SDS 및 1% Triton X-100 탈세포화 용액을 단계적으로 처리하여 침샘(salivary gland: SG) 조직의 효율적이고 정량화된 탈세포화 방법을 적용하였다. 이는 침샘 조직에 특성화된 탈세포화 처리 방법으로서, 이온화성 1% SDS 용액을 처음 18시간 동안 처리하여 침샘 조직의 탈세포화를 유도하고, 18시간째에 신선한 1% SDS 용액을 5시간 동안 재 처리하여 대부분의 침샘 조직을 탈세포화 시킨 뒤, 비이온화성 1% Triton X-100을 1시간 동안 처리하여 부분적으로 잔존하는 비 탈세포화 침샘 조직을 95% 이상 탈세포화 시켰다. 이후, 탈세포화 된 침샘 조직을 멸균수에서 세척 한 후 순차적인 동결건조를 진행하였다. 즉, -80℃에서 1차 동결건조 후, 막자사발과 N2 용액을 이용하여 침샘 조직의 분말화를 진행하고, 0.25%(w/v) 펩신 용액(Sigma, cat# p-7012)을 이용하여 생체 지지체의 부분적인 ECM 단백질 용해를 수행하였다. 이는 1% 펩신 용액을 사용하고 dECM 분말 10mg 당 1 ml의 농도(10 mg/ml)로 펩신 용해를 수행하는 다른 장기 조직에 대한 방법과 달리, 침샘 조직 탈세포화 dECM 분말 25mg 당 0.1M HCl을 포함하는 0.25% 펩신 용액 1 ml (25 mg/ml)을 48시간 상온에서 처리함으로써 침샘 조직 유래 dECM에 특성화된 펩신 용해 방법을 적용한 것이다. 다음으로, 최적의 세포 생장 및 생체모사 오가노이드 형성을 위하여 1M NaOH를 사용하여 탈세포화 dECM 용액의 수소농도 이온 지수를 pH 7.4로 보정하고, 10X PBS용액을 사용하여 1X PBS로 조정하여 염 이온 농도를 생체와 같이 보정하였다. 이후, 적정 농도로 분취(aliquot)한 후, -80℃에서 2차 동결건조하여 -80℃에 보관하였다. 동결 건조한 시료는 -80℃에 보관 하였다가 ECM 성분의 가교(cross linking)를 위한 인위적인 화학물질을 첨가하지 않고 오직 사용 직전에 세포 배양액(culture media)을 넣어 주고 온도 변화에 따른 자연적인 ECM 성분의 가교를 유도하였다. 상온에서 용액 상태였다가, 37℃에서 겔화가 진행되어 탈세포화 침샘(decellularized salivary gland: DSG) 하이드로겔, 즉 dECM-하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

1.2 침샘 dECM-하이드로겔 생산 프로토콜에서 탈세포화의 효율 검증

상기 실시예 1.1의 침샘 dECM-하이드로겔 생산 프로토콜을 통해 탈세포화 된 침샘 조직에 대하여, H&E 및 IHC 조직 염색을 통해 탈세포화의 효율을 검증하는 실험을 하였다.

구체적으로, H&E 및 IHC 조직 염색은, 정상 침샘 조직과 탈세포화 된 침샘 조직에 4% PFA (Paraformaldehyde) 용액을 처리하여 약 16시간 동안 4℃에서 경화 시킨 후, 8시간 동안 흐르는 물에 수세 하고 파라핀 블록을 제작하여 진행하였다. 파라핀 블록은 마이크로톰(Microtome) 기기를 사용하여 6μm 두께로 조직 절편을 자른 후, 조직 슬라이드를 만들고 자일렌(Xylene) 유기용매 및 100%, 90% 그리고 70% 에탄올을 단계적으로 처리하여 파라핀을 제거하고 항원 회복(Antigen retrieval)을 수행 한 후 IHC를 진행하였다.

도 2는 침샘 조직의 탈세포화 후, 염색을 통해 탈세포화의 효율을 확인한 것을 나타낸다.

도 2와 같이 H&E 염색을 통해 탈세포화 후 조직의 세포핵이 제거되고 세포질 및 생체 지지체만 염색되어 남아 있는 것을 확인하였다. 또한, IHC 염색(DAPI 및 형광 염색)을 통해, 탈세포화 후 핵이 제거된 반면, 주요 ECM 성분인 콜라겐, 라미닌, 및 피브로넥틴은 존재하고 있음을 확인하였다.

또한, 도 3은 침샘 조직의 탈세포화 후 DNA 정량 및 주요 ECM 성분인 콜라겐, α-엘라스틴, 및 sGAG를 정량 분석한 결과를 나타낸다. H&E 및 IHC 조직 염색에서 정상 침샘 조직에 대비하여 탈세포화 된 침샘 조직은 세포 핵이 제거되어 Hematoxylin 및 DAPI 염색이 되지 않았으며, 또한 DNA 정량에서도 정상 침샘 조직에 비하여 DNA 농도가 5% 이하로 감소하는 것을 알 수 있다. 이는 침샘 조직의 탈세포화 처리에 의해 세포는 제거 되고 조직의 지지체인 ECM만 남게 되어, 성공적으로 탈세포화가 이루어진 것을 의미한다. ECM 주요 성분인 콜라겐은 약 3배 증가 되었으며, α-엘라스틴은 정상 침샘 조직 대비 10% 이하로 감소, sGAG 구조 단백질은 정상 침샘 조직 대비 유의성 있는 차이가 없는 것으로 확인되었다. 이로부터 정상 침샘 조직 대비 ECM 성분은 정량적인 차이는 있지만 현존 하며, 그 밖의 ECM 성분들도 다소 존재 할 것으로 예상되었다. 또한 sGAG 구조 단백질의 정량적인 차이가 없는 것으로 분석되어, 생산된 dECM-하이드로겔이 3D 세포생장 및 오가노이드 형성에 유용한 생체모사 지지체 및 활성 물질을 제공할 것으로 예상되었다.

실시예 2. dECM-하이드로겔 농도에 따른 침샘줄기세포 배양 효율 확인

상기 실시예 1과 같이 생산된 농도별(25 mg/ml, 20 mg/ml, 15 mg/ml, 12.5 mg/ml) dECM-하이드로겔을 이용하여 침샘줄기세포를 3D 배양하고, 침샘줄기세포 배양 효율을 확인하는 실험을 하였다.

구체적으로, dECM-하이드로겔에 3D 세포를 배양하기 직전에, 실시예 1에서 상온에서 -80℃에 저장 되어 있던 2차 동결건조 된 dECM 분말을 다양한 양의 세포배양액으로 녹여서 25 mg/ml, 20 mg/ml, 15 mg/ml, 12.5 mg/ml의 농도 별 dECM-하이드로겔 용액을 미리 준비하였다. 예를 들어, 25 mg/ml 농도의 dECM-하이드로겔 용액은 세포배양액 1ml 당 2차 동결건조 된 dECM 분말 25mg을 포함하는 것이다. 이때 세포배양액은 10% FBS (Welgene, ES cell qualified #S00104), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 1% 니코틴아미드 (Sigma), 1% ITS-X (Gibco), 100nM 덱사메타손 (Sigma), 100uM 베타-멀캅토에탄올 (Sigma) 및 20ng/ml mEGF (Prospec)로 보충된 DMEM/F12 배양액 (Gibco, cat# 11330032)을 사용하였다. 2차 동결 건조된 dECM 분말을 세포배양액과 혼합한 상기 dECM-하이드로겔 용액을 1200rpm에서 3분 동안 원심분리를 수행하여 dECM-하이드로겔 용액에 생성된 버블을 제거하였다. 상기 dECM-하이드로겔 용액 200μl에 랫드 악하선 침샘 조직의 1차 세포 배양으로 얻은 침샘 줄기/전구세포 1X10⁶ 개를 혼합하여 96well 플레이트 디시에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 겔화시켜 5~6일 동안 세포배양 하였다.

도 4는 상기 농도 별 dECM-하이드로겔의 37℃에서 겔화를 나타낸 사진이다.

도 5는 상기 침샘 유래 줄기세포를 3D 배양한 12.5 mg/ml 농도의 dECM-하이드로겔에서 침샘 줄기세포의 세포 생장 및 선방/관(acinar/ductal) 세포 형태를 관찰한 결과이다.

도 4 및 5와 같이, 12.5 mg/ml 농도로 제조한 dECM-하이드로겔에서 침샘 줄기세포의 세포 생장 및 선방/관(acinar/ductal) 세포 형태가 관찰되었다.

실시예 3. dECM-하이드로겔에 대한 유동학적 분석

줄기세포의 세포 생장 및 선방/관 세포의 형태가 관찰된 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔에 대하여, 겔화점(gel point), 주파수 스윕(frequency sweep), 점성(viscosity) 측정을 통한 유동학적 분석을 진행하였다.

3.1 겔화점 분석

유동학적 분석기기 (AR 2000eX, TA, USA)를 이용하여 1Hz 주파수 빈도 (frequency) 및 1% 중압 (strain) 조건에서 30초간 평형상태 (equilibrium)를 유지한 다음, 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔 용액 500μl를 40 mm 지름 1℃ cone-plate 부위에 올려놓고 10℃에서 40℃까지 겔이 되는 온도(겔화점)을 분석하였다.

겔화점 분석에서는 도 6a와 같이, 온도에 따른 G' 값이 33.5℃ 이상에서 G'' 값보다 증가함을 확인함으로써, 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔은 상온 졸(sol) 상태에서 33.5℃ 이상일 때 겔 상태가 된다는 것을 확인하였다.

3.2 주파수 스윕 분석

상기의 동일한 유동학적 분석기기를 사용하되 37℃에서 20분 동안 평형상태 (equilibrium)를 유지한 다음, 500μl의 12.5 mg/ml 농도의 dECM-하이드로겔 용액을 1% 중압 (strain)으로 0.1Hz 에서 10Hz까지의 주파수 스윕 (Freqeuncy sweep)을 분석하였다.

주파수 스윕 분석에서는 도 6b와 같이, 일정한 힘, 진동(1Hz)을 dECM-하이드로겔에 일정하게 가해 주었을 때, G' 값이 G'' 값보다 높고(겔화점과 일치), G^*값, 즉 dECM-하이드로겔 강도(stiffness)가 G' 값과 거의 일치하며 12.9 Pa로 일정하게 유지됨을 확인하였다.

3.3 점성도 분석

상기의 동일한 유동학적 분석기기를 사용하되 20℃에서 30초 동안 평형상태 (equilibrium)를 유지한 다음, 500μl의 12.5 mg/ml 농도의 dECM-하이드로겔 용액을 1Pa 전단응력 (shearing stress)으로 300 초간 분석 하였다.

점성도 분석 결과, 도 6c와 같이 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔은 0.023 Pa·s의 비교적 낮은 점성도를 가지는 것으로 확인하였다.

실시예 4. dECM - 하이드로겔에서 랫드 침샘줄기세포를 3D 배양한 후 침샘 오가노이드 형성 관찰

상기의 실시예 2와 같이 랫드 악하선 침샘 조직의 1차 세포 배양으로 얻은 줄기/전구세포 1X10⁶ 개를 12.5 mg/ml 농도의 dECM-하이드로겔 용액 200μl와 혼합하여 96 well 플레이트 디시에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5~6일 동안 세포배양 하며, 주기적으로 현미경을 통하여 줄기세포의 세포 생장 및 형태를 관찰 하였다.

기존의 플레이트 디시를 이용한 2D 세포 배양 및 마트리겔(Corning®)을 이용한 2.5D 세포배양과는 달리, 12.5 mg/ml dECM-하이드로겔에서 랫드 침샘 유래 줄기세포 1X10⁶ 세포를 3D 세포 배양하였을 때, 배양 6일차에 다수의 선방(acinar) 세포(붉은 점선) 및 관형(ductal) 세포(파란 점선)의 형태를 확인하였다(도 5).

Claims

개체로부터 분리된 침샘 조직을 준비하는 단계;
상기 침샘 조직에 탈세포화(decellularization)를 수행하여 탈세포화 세포외기질(decellularized Extracellular Matrix: dECM)을 얻는 단계;
상기 dECM을 1차 동결 건조하는 단계;
상기 1차 동결 건조된 dECM을 분말화 하는 단계;
상기 분말화된 dECM을 펩신 용액과 혼합하여 부분 용해시키는 단계;
상기 부분 용해된 dECM을 pH 7.0 내지 8.0으로 보정하는 단계;
상기 pH 보정된 dECM을 2차 동결 건조하는 단계;
상기 2차 동결건조된 dECM을 세포 배양액(culture media)와 혼합하여, ECM의 가교(crosslinking)를 유도하는 단계; 및
상기 가교로 형성된 dECM-하이드로겔을 얻는 단계를 포함하는, dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개체는 인간, 원숭이, 소, 돼지, 염소, 마우스, 랫드 및 양을 포함하는 포유동물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 탈세포화는 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 또는 이들의 조합을 사용하여 수행하는 것인 dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 음이온성 계면활성제는 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)이고, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100 (Triton X-100)인 것인 dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 펩신 용액은 0.1 내지 0.5%(w/v) 펩신 용액인 것인 dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 2차 동결 건조 단계 이전에, dECM을 PBS (Phosphate buffer saline)와 혼합하는 단계를 더 포함하는 dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ECM의 가교를 유도하는 단계는 35 내지 40℃에서 수행하는 것인 dECM-하이드로겔의 제조 방법.
청구항 1의 방법으로 제조된 dECM-하이드로겔.
청구항 8에 있어서, 상기 dECM-하이드로겔의 농도는 10 내지 15 mg/ml인 dECM-하이드로겔.
청구항 8에 있어서, 상기 dECM-하이드로겔의 겔화점(gel poing)은 30℃이상인 dECM-하이드로겔.
청구항 8에 있어서, 상기 dECM-하이드로겔의 강도는 10 내지 20 Pa인 dECM-하이드로겔.
청구항 8에 있어서, 상기 dECM-하이드로겔의 점성도는 0.03 Pa·s 이하인 dECM-하이드로겔.
청구항 8의 dECM-하이드로겔을 이용하여 줄기세포를 3차원 세포 배양하는 방법.
청구항 8의 dECM-하이드로겔을 이용하여 줄기세포를 3차원 세포 배양하는 단계를 포함하는 침샘 오가노이드(organoid)를 제조하는 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 줄기세포는 침샘 조직 유래 줄기세포인 것인 침샘 오가노이드를 제조하는 방법.
청구항 14의 방법으로 제조된 침샘 오가노이드.
청구항 16의 침샘 오가노이드를 포함하는 구강 건조증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
청구항 17에 있어서, 상기 구강 건조증은 침샘 세포의 괴사, 위축, 또는 섬유화로 인한 것인 약학적 조성물.
청구항 17에 있어서, 상기 구강 건조증은 방사선 조사에 의한 침샘 세포의 손상으로 인한 것인 약학적 조성물.