WO2022005106A1 - 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법 - Google Patents

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장진아
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a composition for culturing a pancreatic organoid, the composition and a method for culturing an organoid using the same.
  • Organoids are three-dimensional cell aggregates formed from stem cells through phylogeny and differentiation, and the development of organs can be observed, and actual tissues can be reproduced in terms of function and structure.
  • a support or scaffold which plays a supporting role so that cells can grow and grow, also plays a very important role in biotissue engineering. play a role Most of the cells in the human body are adherent cells that grow and attach, and if there is no place to attach, the cells cannot grow and die. Therefore, the scaffold should provide a suitable environment for cell adhesion, differentiation, growth and cell migration.
  • Such a support can be made of various materials, and research to develop a support using a natural material, a synthetic polymer, bioceramics, and a polymer-ceramic composite material is being actively conducted. Accordingly, organoids that mimic various organs have been developed so far, and these are mainly cultured in a three-dimensional culture environment, Matrigel.
  • Matrigel is widely used for organoid culture, it is derived from mouse sarcoma, and there is no special substitute, so despite the high cost, Matrigel is limited in that it has no choice but to rely on the use of Matrigel. In addition, certain components dominate and there is a limit to the reflection of tissue-specific characteristics. Decellularization of tissues and organs has been studied and necessary as a promising method for preparing functional scaffolds or scaffolds for cell culture and transplantation for complementation and replacement. On the other hand, organoids produced by the current organoid culture technology have many differences from actual human tissues in terms of differentiation and function, and thus the development of technology for culturing more mature organoids is required.
  • Non-Patent Document 1 discloses that decellularized pancreatic tissue can be used as a scaffold for forming a pancreatic islet.
  • the decellularization process is not specifically disclosed here.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing a brain organoid culture composition in which brain tissue is decellularized, freeze-dried, and the freeze-dried tissue is dispersed, then dissolved in an acidic solution, and the pH is adjusted. has been However, this is for brain tissue and not for pancreas, it is only described that pepsin or trypsin can be used as a protease for the solution step, and the general gelation temperature after pH adjustment (25 to 25 to 38°C) only.
  • Patent Document 1 Korea Patent Publication 10-2019-0143830 (2019.12.31.)
  • Patent Document 2 Korean Patent Registration 10-2015368
  • Patent Document 3 Korean Patent Laid-Open Patent No. 10-2017-0078460
  • Non-Patent Document 1 Damodran, RG. & Vermette, P. J Tissue Eng Regen med.
  • the present invention is to solve the point that the existing Matrigel-based culture system is an extract derived from animal cancer tissue, the difference between batches is large, does not simulate the environment of the actual tissue, and the efficiency of tissue differentiation and development is insufficient.
  • the composition is intended to provide an optimal environment for culturing organoids by creating an actual tissue-like environment and to improve organ-specific differentiation ability.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for culturing an organoid, which has excellent physical properties of a decellularized tissue, and can significantly increase an organoid culture rate, and a method for producing the same.
  • an object of the present invention is to provide a composition for culturing an organoid that has excellent physical properties of a decellularized tissue, can prevent gelation, and enables uniform hydrogelation, and a method for preparing the same.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for culturing pancreatic organoids, the composition, and a method for culturing organoids using the same.
  • the present invention comprises the steps of: S1) decellularizing pancreatic tissue; S2) lyophilizing the decellularized tissue; S3) pulverizing the freeze-dried tissue; S4) dissolving by adding a protein-digesting enzyme and acid to the pulverized tissue; And S5) provides a method for producing a composition for culturing a pancreatic organoid comprising the step of adjusting the pH by adding a basic solution to the dissolved solution.
  • the decellularized tissue contains an actual tissue-specific extracellular matrix component, it is possible to provide a physical, mechanical, and biochemical environment of the corresponding tissue, and is very effective in promoting differentiation into pancreatic tissue cells and tissue-specific functionality. .
  • the “organoid” refers to a micro-organism manufactured in the form of an artificial organ by culturing cells derived from tissues or pluripotent stem cells in 3D form.
  • the organoids are three-dimensional tissue analogues including organ-specific cells that arise from stem cells and self-organize in a manner similar to the in vivo state, and can develop into specific tissues by patterning restricted elements (eg, growth factors).
  • restricted elements eg, growth factors
  • the organoid has the intrinsic physiological properties of a cell, and may have an anatomical structure that mimics the original state of a cell mixture (including not only limited cell types, but also residual stem cells and proximal physiological niche). .
  • the organoid may have a shape and tissue-specific function, such as an organ, in which cells and cell functions are better arranged through a three-dimensional culture method, and have functionality.
  • the step S1) decellularization comprises sodium dodecyl sulfate (SDS), polyethylene glycol (PEG), Triton X-100, ethylenediaminetetraacetic acid (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), peracetic acid, deoxycholic acid, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate ( propanesulfonate (CHAPS), sodium deoxycholate, ammonium hydroxide, trypsin, benzonase, DNase, calcium chloride, magnesium sulfate, azide
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PEG polyethylene glycol
  • Triton X-100 ethylenediaminetetraacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • peracetic acid deoxycholic acid
  • deoxycholic acid 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio
  • decellularized extracellular matrix (dECM) can be obtained, and the “decellularized extracellular matrix” is a natural for cell growth prepared through decellularization of tissues found in mammals and multicellular organisms. means support.
  • the extracellular matrix is limited to collagen, elastins, laminins, glycosaminoglycans, proteoglycans, antimicrobials, chemoattractants, cytokines, and growth factors. It may be a mixture of structural and non-structural biomolecules.
  • the extracellular matrix may contain about 90% collagen in various forms in mammals.
  • the extracellular matrix derived from various living tissues may have a different overall structure and composition due to the unique role required for each tissue.
  • the decellularization step includes: a1) washing the pancreas tissue, a2) using any one or more selected from peracetic acid, Triton-X, and SDS. treating, a3) treating at least one selected from ethanol, isopropanol and n-propanol, a4) washing, a5) treating at least one selected from peracetic acid, triton-X, and sodium dodecyl sulfate , and a6) washing.
  • the washing of a1), a4) or a6) may be performed with at least one selected from distilled water, physiological saline, and phosphate buffered saline.
  • a composition for culturing organoids having excellent differentiation into tissue cells and tissue specificity can be obtained.
  • a composition capable of improving the differentiation ability of pancreatic organoids can be obtained in the scaffold using the pancreatic dECM.
  • step a1) is 12 to 48 hours
  • step a2) is 12 to 120 hours
  • step a3) is 0.5 to 4 hours
  • step a4) is 12 to 48 hours
  • step a5) is 0.5 to 4 hours
  • step a6) may be performed for 2 to 12 hours.
  • step a1) is 12 to 24 hours
  • a2) is 48 to 96 hours
  • a3) is 1 to 3 hours
  • a4) is 12 to 36 hours
  • a5) is 1 to 3 hours
  • a6 ) step can be performed for 4 to 8 hours.
  • the step S2) freeze-drying is to freeze-dry the tissue decellularized in step S1).
  • the freeze-drying method or specific conditions are not particularly limited, and various known in the art may be used.
  • the decellularized tissue may be frozen at -100°C to -50°C, and then dried at -70°C to -30°C for 1 to 10 days.
  • the pulverizing step S3) is pulverizing the tissue freeze-dried in step S2).
  • the grinding method, size, and specific conditions are not particularly limited, and various known in the art may be used. For example, it is possible to put the lyophilized tissue in a mortar and pulverize it using liquid nitrogen.
  • the step of dissolving S4) is dissolving the tissue pulverized in step S3). That is, it is possible to dissolve the protein digesting enzyme and acid by adding and stirring the pulverized tissue.
  • the present invention is characterized in that the protein digestion enzyme and acid are added to the pulverized tissue and dissolved while stirring at a speed of 330 rpm to 500 rpm for 72 hours to 96 hours.
  • it may be dissolved while stirring at a speed of 330 rpm for 72 to 96 hours.
  • the present inventors found that not the process of decellularization, but the stirring time and speed in the process of dissolving by adding protein digesting enzyme and acid to decellularized tissue (dECM) that has undergone lyophilization and pulverization after decellularization. After finding out that it is important for the physical properties and the subsequent culture effect, the present invention was completed.
  • dECM decellularized tissue
  • the modulus values representing the physical properties for each stirring time were shown in the order of 24h ⁇ 72h ⁇ 96h > 120h (24h ⁇ 120h). That is, it was confirmed to have the most excellent physical properties when 72-96 hours.
  • the physical properties at 120 hours were too low to conduct the organoid culture experiment itself, and it was found that the culture tendency improved in the order of 24 h ⁇ 72 h ⁇ 96 h during organoid culture.
  • the physical properties of the tissue were better when stirred for 72 hours, but the organoid culture efficiency was even better when stirred for 96 hours.
  • the modulus value representing the physical properties for each stirring speed was 80 ⁇ 150 ⁇ 250 ⁇ 330 ⁇ 500 ⁇ 1000 (330 ⁇ 1000 ⁇ 500) rpm in the order of 330-500 rpm.
  • the culture efficiency was in the order of 250 ⁇ 330 ⁇ 500 ⁇ 1000, and dome formation was impossible at 80 rpm.
  • the tissue properties were more excellent, but the organoid culture efficiency was even better when stirring at a speed of 330 rpm.
  • the protein digestion enzyme in step S4) may be pepsin or trypsin. Preferably, it may be pepsin.
  • the acid in step S4) may be hydrochloric acid or acetic acid.
  • it may be acetic acid.
  • the step S5) adjusting the pH is adjusting the pH by adding a basic solution to the solution dissolved in the step S4).
  • the method of adding the basic solution or the type of the basic solution to be used is not particularly limited, and various basic solutions known in the art may be used.
  • the final pH can be adjusted to be 7 to 7.5.
  • the present invention is particularly characterized in that the step of adjusting the pH in S5) is performed within the range of 1°C to 10°C in order to prevent gelation. Preferably it can be carried out within the range of 2 °C to 7 °C. That is, the pH adjustment process may not be performed at room temperature, but may be performed in a lower refrigeration temperature range.
  • the step of adjusting the pH of S5) may be performed on ice to prevent gelation.
  • the "on ice” means that the lysing solution is present on the surface of the ice or provided in the ice.
  • the present inventors found that the temperature (1 ° C. to 10 ° C.) and / or conditions (on ice) of the process of adjusting the pH by adding a basic solution to the decellularization lysate, not the process of decellularization, is the result of hydrogelation of the composition and subsequent organoids After finding out that it also affects the encapsulation of , the present invention was completed.
  • pancreatic dECM scaffold prepared in this way has excellent rheological properties (physical properties) and culture effect, compared to the case where it is not.
  • the decellularization composition adjusted to the pH on ice according to the present invention was able to form a uniform gel during the gelation process, but the decellularization composition adjusted to the pH at room temperature (RT) resulted in partial gelation and As the aggregation occurred, the dome shape could not be maintained and broken, and it was confirmed that the complex modulus (G*) was low.
  • RT room temperature
  • the present invention may be characterized in that the pH adjustment process is not performed at room temperature, but in a lower refrigeration temperature range, and further, the basic solution is stored at a refrigeration temperature within the range of 1°C to 10°C prior to use. It can be characterized as being stored in If the basic solution to be used is stored at a refrigeration temperature (or ice), it is preferable because gelation prevention and uniform hydrogelation can be further improved.
  • tissue cells compared to before treatment 95% or more of tissue cells compared to before treatment, specifically 97% or more can be removed.
  • the glucosaminoglycan content may be 90 to 120%, specifically 95 to 110% compared to before treatment.
  • the collagen content may be 200 to 2000% compared to before treatment, specifically 500 to 1700%.
  • a cytokine-rich composition excellent for organoid culture through the above method.
  • the residual amount of any one or more cytokines selected from angiopoietin-1, insulin growth factor, TGF-beta, and placental growth factor may be large.
  • the present invention also provides a composition for culturing pancreatic organoids prepared by the above-described method.
  • the composition may contain 0.1 to 10% (w/v) of dried decellularized tissue based on the total volume of the composition, specifically 0.1 to 5% (w/v) ) may be included.
  • the organoid when the organoid is cultured in the decellularization scaffold (dECM) based on the present invention, the organoid is well cultured (culture, expansion, proliferation), and in particular, in the pancreatic dECM scaffold, the pancreatic organoid is It is possible to obtain an excellent composition capable of improving the differentiation ability and maintaining the tissue properties well.
  • dECM decellularization scaffold
  • the composition of the present invention may further include matrigel.
  • the “matrigel” is a protein complex extracted from EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) mouse sarcoma cells (product name of BD Bioscience), laminin, collagen, heparan sulfate proteoglycan ( Extracellular matrix such as heparan sulfate proteoglycan, fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), TGF- ⁇ Or it may include platelet-derived growth factor (PDGF).
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells
  • laminin collagen
  • collagen heparan sulfate proteoglycan
  • Extracellular matrix such as heparan sulfate proteoglycan
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the composition may contain 0.1 to 10% (w/v) of dried decellularized tissue based on the total volume of the composition, specifically 0.1 to 5% (w/v) ) may be included.
  • the organoid when the organoid is cultured in the decellularization scaffold (dECM) based on the present invention, the organoid is well cultured (culture, expansion, proliferation), and in particular, in the pancreatic dECM scaffold, the pancreatic organoid is It is possible to obtain an excellent composition capable of improving the differentiation ability and maintaining the tissue properties well.
  • dECM decellularization scaffold
  • the present invention also provides a method for culturing a pancreatic organoid comprising the step of culturing the pancreatic organoid in the composition for culturing the pancreatic organoid described above.
  • the culture refers to a process of maintaining and growing cells under suitable conditions, and suitable conditions may refer to, for example, a temperature at which cells are maintained, nutrient availability, atmospheric CO2 content, and cell density.
  • Conditions suitable for the formation of the organoid may be conditions that facilitate or allow cell differentiation and formation of multicellular structures.
  • the present invention also provides a method for culturing a pancreatic organoid comprising the step of culturing the pancreatic organoid in the composition for culturing the pancreatic organoid described above.
  • the present invention also provides an extracellular matrix support for culturing organoids prepared from the above-described composition for culturing pancreatic organoids.
  • the present invention also provides a method for culturing a pancreatic organoid comprising the step of mixing the extracellular matrix support for culturing the organoid and the pancreatic organoid.
  • the present invention can create an environment more similar to an actual tissue than a conventional matrigel-based culture system, and in particular, promotes tissue differentiation in pancreatic organoid culture and effectively develops a form similar to an actual tissue.
  • the decellularized tissue is stirred at a specific time and/or rpm in the step of dissolving the decellularized tissue with a protein-digesting enzyme and acid according to the present invention, the physical properties of the decellularized tissue are excellent and the organoid culture rate is significantly increased.
  • the process of adjusting the pH by adding a basic solution to the decellularization solution according to the present invention is performed under specific conditions, the physical properties of the decellularized tissue are excellent, gelation can be prevented, and uniform hydrogelation is possible. It works.
  • FIG. 1 shows a representative diagram for preparing a composition for culturing pancreatic organoids according to an embodiment of the present invention, and culturing and applying the composition and organoids using the same.
  • FIG. 2 is an analysis of dsDNA, GAGs, and collagen contents compared to native tissues of pancreatic dECM according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 3a and 3b is an analysis of the rheological properties of pancreatic dECM according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 4a to 4e is an analysis of the remaining cytokines of the pancreatic dECM according to an embodiment of the present invention.
  • pancreatic dECM is an analysis of the histological characteristics of pancreatic dECM according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is an analysis of the surface structure of pancreatic dECM using FE-SEM according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is an analysis of the protein components of pancreatic dECM using LC-MS/MS according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8A is an analysis of gelation tendency (sol-gel transition) for selecting culture-appropriate conditions for pancreatic organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8a shows an analysis of a mixture mixed with dECM alone and Matrigel in the ratio shown after preparing pancreatic dECM at 1% and 1.5% according to one embodiment.
  • Figure 8b is an analysis of the frequency sweep of the support of the pancreatic organoid culture suitable conditions selected according to an embodiment of the present invention. After the pancreatic dECM was prepared at 1% and 1.5% according to one embodiment, the mixture mixed with dECM alone and Matrigel in the indicated proportions was analyzed.
  • FIG. 9 is an analysis of the cytotoxicity of pancreatic organoids using a Live/Dead assay according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 shows the results of the evaluation of the proliferation of pancreatic organoids within the limits using the CCK-8 assay according to an embodiment of the present invention. Based on pancreatic 1% dECM, it is the result of analyzing the tendency of proliferation after culturing normal mouse pancreatic organoids under the conditions of mixing with dECM and Matrigel in the indicated ratio.
  • 11A to 11B show the validation of the culture effectiveness of pancreatic organoids cultured in dECM through gene expression verification of normal mouse pancreatic organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 11a is a qualitative analysis of the expression level of pancreatic markers in normal mouse pancreatic organoids cultured on the basis of pancreatic dECM
  • 11b is a quantitative analysis result.
  • ⁇ -actin house keeping gene
  • Lgr5 Leucine-rich repeat containing G-protein coupled receptor 5
  • Pdx1 Pancreatic and duodenal homebox 1
  • Sox9 SRY-box containing gene 9
  • Krt19 Keratin 19
  • Muc1 Mucin 1
  • Amy Amylase
  • Ins Insulin.
  • G1 Matrigel
  • G2 1% dECM
  • G3 Matrigel 1+1% dCEM 8
  • G4 Matrigel 1+1% dCEM 4
  • G5 Matrigel 1+1% dCEM 2
  • G6 Matrigel 1+ 1% dCEM 0.5.
  • FIG. 12A to 12C show organ-specific gene expression of pancreatic organoids cultured in dECM by long-term culture of mouse pancreatic organoids according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12a is the result of observing under a microscope the results of long-term culture of mouse pancreatic organoids for 14 days under the conditions of mixing dECM and Matrigel alone and with Matrigel based on 1% dECM of the pancreas prepared according to an embodiment of the present invention.
  • 12b is a qualitative analysis of the expression level of pancreatic markers in mouse pancreatic organoids on the 14th day of culture
  • 12c is a quantitative analysis.
  • G1 Matrigel
  • G2 1% dECM
  • G3 Matrigel 1+1% dCEM 8
  • G4 Matrigel 1+1% dCEM 4
  • G5 Matrigel 1+1% dCEM 2
  • G6 Matrigel 1+ 1% dCEM 0.5.
  • FIG. 13 is a graph showing the modulus value of pancreatic dECM when the stirring time is changed in the dissolution step S4) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the gelation kinetic values of pancreatic dECM according to the stirring time of S4) dissolution step according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a photograph showing the state of culturing pancreatic organoids for each stirring time in S4) dissolution step according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a graph showing the proliferation rate (proliferation) of the pancreatic organoid culture according to the stirring time of S4) dissolution step according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 17 is a graph showing the modulus value of pancreatic dECM when the stirring speed is changed in the dissolution step S4) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a graph showing the gelation kinetic values of pancreatic dECM according to the stirring speed of the dissolution step S4) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 is a photograph showing the state of pancreatic organoid culture according to agitation speed in S4) dissolution step according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 20 is a graph showing the proliferation rate (proliferation) of the pancreatic organoid culture according to the stirring speed of the dissolution step S4) according to an embodiment of the present invention.
  • 21 is a photograph for explaining the process of performing S5) pH adjustment step on ice according to an embodiment of the present invention.
  • 22 to 24 are photographs showing the gelation state of the composition in which the pH adjustment step S5) was performed on ice according to an embodiment of the present invention.
  • 25 is a graph showing a modulus value of a composition in which the pH adjustment step S5) is performed on ice according to an embodiment of the present invention.
  • 26 is a graph showing a gelation kinetic value of a composition in which the pH adjustment step S5) is performed on ice according to an embodiment of the present invention.
  • 27 is a diagram showing changes in physical properties according to temperature increase when a pancreatic dECM+matrigel (2:1) mixture is cultured using a composition in which S5) pH adjustment step is performed on ice according to an embodiment of the present invention; It is a graph.
  • pancreas After washing the pancreas tissue in running water and removing the extrapancreatic tissue with sterile operating scissors, the pancreas is transferred to a plastic bag using forceps and then frozen at -80°C for 1 hour. After mincing the frozen pancreatic tissue to a thickness of 1 mm, transfer it to a 500 mL plastic container. In this case, it is recommended to use a plastic container with a lid to prevent tissue contamination and evaporation of the solution.
  • the tissue Before reagent treatment, the tissue is washed with distilled water (dH 2 O; secondary water) within 12 hours. After washing, the tissue is treated with 1% Triton-X 100 within 84 hours. At this stage, the amount of tissue is reduced. Treatment with isopropyl alcohol (isopropanol (IPA)) for 2 hours to remove residual adipose tissue. At this stage, the tissue becomes tough. After removing IPA, 1X PBS (phosphate buffered saline) is treated for 24 hours. For sterilization, ethanol containing peracetic acid is treated for 2 hours. Afterwards, use tertiary distilled water (ddH 2 O) as all base buffers. Treat with 1X PBS for 6 hours to remove residual reagents.
  • IPA isopropyl alcohol
  • 1X PBS phosphate buffered saline
  • pancreatic dECM prepared in Example 1 was ground with liquid nitrogen using a mortar and pestle.
  • Pancreatic dECM is placed in a 50 mL conical tube and dissolved in 0.5 M acetic acid with pepsin for 96 hours. Filter undissolved pancreatic dECM powder using a cell strainer. In order to prevent gelation, it should be done on ice from the next step.
  • 10X PBS before treatment with 10 N sodium hydroxide (NaOH)
  • pH indicator strip observe the change in pH, and add 10 N sodium hydroxide (NaOH) to adjust the final pH to 7-7.5. Add cold 1X PBS to adjust final dose.
  • DMMB dimethyl-methylene blue
  • the specific process is as follows. 1 To prepare DMMB dye, dissolve 1,9-dimethyl-methylene blue zinc chloride double salt, glycine, and sodium chloride in autoclaved distilled water. Adjust the pH to 3 by adding 0.5 M HCl solution while measuring the change in pH using a bench-top pH meter. Then, after filtering using a filter, aliquot it in a conical tube, wrap it in silver foil and store it. 2 Make 100 ⁇ g/mL of 10 mg/mL chondroitin sulfate A solution stock using 1X PBS.
  • Chloramine Working Solution Dissolve sodium acetate, citric acid, and sodium hydroxide in distilled water, and add glacial acetic acid, toluene, and IPA. Chloramine working solution is stored at 4 °C and can be used for about 6 months.
  • Chloramine T solution After dissolving Chloramine T in the chloramine working solution, add IPA. Mix well with a vortex mixer to mix well. However, Chloramine T solution should be prepared immediately before use.
  • P-DAB solution Add P-DAB to perchloric acid, add IPA, and mix well. However, P-DAB is also prepared just before use and is sensitive to light, so be sure to wrap the tube with aluminum foil before use.
  • a DMMB assay is performed to quantify the amount of GAGs in dECM.
  • the specific process is as follows. 1 Prepare a standard in a specific range according to the purpose of the experiment by using distilled water for the chondroitin sulfate A solution stock prepared at 100 ⁇ g/mL. 2 Load the standard and sample in 3 repetitions at 40 ⁇ L/well in a 96 well plate. 3 Add 160 ⁇ L/well of DMMB dye with a multi-channel pipettor. 4 Measure the absorbance at 525 nm wavelength with a microplate reader.
  • a hydroxyproline assay was performed to quantify the amount of collagen in dECM.
  • the specific process is as follows. 1 React with the same amount of hydrochloric acid as the tissue dissolved in papain solution in an oven at 120°C for 16 hours. 2 After the reaction, the residue remaining on the glass wall is dried and cooled at room temperature for 3 hours, and then dissolved again in 1X PBS. 3 The completely dissolved sample is transferred to the e-tube and centrifuged at 5,000 x g for 10 minutes at 4°C, and only the supernatant is transferred to a new e-tube.
  • FIG. 2 Specific experimental results are shown in FIG. 2 .
  • DNA content was 2.48% and 2.05%, respectively, and more than 97% of cells were removed.
  • the content of GAGs which is mainly lost in the decellularization process, was 96% in pancreatic dECM, similar to that of native, suggesting that the decellularization process was well established.
  • Collagen content also showed 1537% in pancreatic dECM compared to native group, so it was verified that cells were removed during decellularization and main components of extracellular matrix were well preserved.
  • pancreatic dECM scaffold To evaluate the rheological properties, prepare the pancreatic dECM scaffold to pH 7. Set the 20 mm cone plate geometry (cone diameter of 20 mm at a 2° angle) in the rate-controlled mode of the rheometer. Measure the viscosity, gelation kinetics, and dynamic modulus of the dECM scaffold by creating an experiment sequence in the installed software (TRIOS).
  • TRIOS installed software
  • Dynamic modulus Before measurement, the dECM scaffold is placed on the plate at 37°C for 30 minutes. Measure the frequency-dependent storage modulus (G') and loss modulus (G'') of the dECM scaffold at 2% strain, 0.1-100 rad/s.
  • the amount of dECM loading is set to 250 ⁇ L, and the running GAP is set to 500 ⁇ m. dECM that has escaped from around the cone plate before running is removed as much as possible with a thin scraper.
  • pancreatic dECM scaffold is adjusted to pH 7.
  • Pancreatic dECM gelated at 37°C for 30 minutes is immersed in 4% paraformaldehyde and fixed. Samples are washed 3 times with 1X PBS for 10 min each. Prepare 30, 50, 70, 90, and 100% ethanol and treat them in sequence for 10 minutes each. It is rapidly cooled with liquid nitrogen (LN) and then freeze-dried. This process is to preserve the internal structure, and if this process is omitted and freeze-dried, there may be structural damage. After platinum (Pt) coating, image.
  • LN liquid nitrogen
  • pancreatic dECM scaffold Prepare the pancreatic dECM scaffold to pH 7. After adding the RIPA buffer to the neutralized dECM, keep it on ice and react for about 30 minutes. Mix well by using a vortex mixer once every 5 minutes. Quantify the total protein in dECM using the BCA protein assay kit. Prepare standards by diluting a 2 mg/mL stock of bovine serum albumin (BSA) with ddH 2 O. Prepare pancreatic dECM dissociated in RIPA buffer as a stock solution and dilute 2/5/10/50/100/200/500/1000 times with ddH 2 O. Standards and samples are loaded into 96-well plates in triplicate at 20 ⁇ L/well each. Blank is RIPA buffer.
  • BSA bovine serum albumin
  • pancreatic dECM stock solution was prepared by diluting it to a concentration of 50 ⁇ g/mL so that the total protein was 50 ⁇ g.
  • the analysis method was carried out in the same manner as the protocol of the manufacturer (RayBio ® C-Series Porcine cytokine array 1).
  • Figs. 4a to 4e are the results of analysis of the remaining cytokines in pancreatic dECM.
  • SCF stem cell growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • TGF- ⁇ or Major factors affecting organoid culture such as placental growth factor (PIGF)
  • pancreatic dECM contains a large amount of cytokine produced and secreted by immune cells, vascular cells, and various other stromal cells in actual tissues, so that it can more closely mimic the tissue microenvironment.
  • PIGF placental growth factor
  • pancreatic dECM contains a large amount of cytokine produced and secreted by immune cells, vascular cells, and various other stromal cells in actual tissues, so that it can more closely mimic the tissue microenvironment.
  • cytokines related to angiogenesis and cell proliferation so it is more effective in culturing organoids than Matrigel.
  • tissue staining of the pancreatic dECM prepared in Examples 1 and 2 was performed.
  • pancreatic dECM The residual protein of pancreatic dECM prepared in Example was analyzed using LC-MS/MS (Liquid Chromatography-Mass spectrometry).
  • Protein unfolding In order to split the remaining protein into peptide fragments, it is first dissolved in a buffer to break the covalent bond.
  • glycoproteins This is a process specifically applied to glycoproteins.
  • sugar chains since they have sugar chains in the middle of the sequence, the sugar chains may cause problems in the mass value later.
  • pancreatic dECM contained a large amount of collagen VI, which is related to the improvement of cell survival and function. These proteins are known to be related to the survival and function of the islet responsible for insulin secretion in the pancreas, and the growth and It can help to improve differentiation.
  • the decellularization-based pancreatic dECM scaffold developed in the present invention can help organoid growth and improve organoid differentiation and function. have.
  • Example 9 Selection of suitable formulations for organoid culture
  • pancreatic dECM ready for use as a support, was selected by screening a hydrogel formulation condition similar to the gelation tendency of a support (Matrigel) that is often used for organoid culture. dECM alone or a mixture of Matrigel and dECM was verified.
  • pancreatic dECM scaffold To evaluate the rheological properties, prepare the pancreatic dECM scaffold at pH 7-7.5. Mount the measuring plate PP25 on the rheometer and proceed. The amount of dECM loading should be 300 ⁇ L or more, and the running GAP should be 500 ⁇ m for the pancreas. Remove the dECM that has escaped around the measuring plate before running with a scraper as much as possible. Measure the sol-gel transition, complex viscosity, and frequency sweep of the dECM scaffold by making an experiment under the following conditions in the installed software (RheoCompass 1.19).
  • FIGS. 8a and 8b show the results of analyzing a mixture prepared with 1% and 1.5% of pancreatic dECM according to one embodiment, and then mixed with dECM alone and Matrigel at the indicated ratio. Gelation similar to that of Matrigel was observed in both the control group (Matrigel) and the presented experimental group, and as the ratio of pancreatic dECM in the mixture mixed with Matrigel based on 1% and 1.5% dECM of pancreas and dECM increased, the gelation was slower than that of Matrigel. progress could be observed.
  • pancreatic dECM As a result of analyzing the viscoelasticity (frequency sweep) of the hydrogel of pancreatic dECM and its mixture, which has been gelled at 37 ° C, similar properties to Matrigel were observed in pancreatic 1% and 1.5% dECM 1% and 1.5% dECM and mixtures thereof, As the mixing ratio of pancreatic 1% dECM increased, the tendency to have lower physical properties than that of Matrigel was confirmed. When used alone, pancreatic 1.5% dECM showed the tendency of properties most similar to that of Matrigel.
  • a formulation suitable for culturing organoids based on neutralized pancreatic dECM is based on 1% dECM of the pancreas according to the results of Examples 10 and 11 and FIG. 8a.
  • Example 10 the neutralized pancreatic dECM and the mixture in the ratio selected as a result of the above among the mixtures presented in Example 9 were gelled for 30 minutes ( FIGS. 8a and 8b ).
  • gelation was performed at 37° C. for 40 minutes or longer.
  • Example 10 dECM based organoid culture
  • pancreatic organoids prepare a medium by mixing Glutamax, HEPES, and Anti-anti based on Advanced DMEM/F12.
  • growth factors such as N2, B27, N-acetylcysteine, mEGF, hNoggin, Rspondin-1, Nicotinamide, hGastrin, and hFGF10 are added.
  • the pancreatic organoids in culture are recovered in Matrigel.
  • the specific process is as follows. 1 Remove the old medium and add PBS. 2 Physically destroy Matrigel, where pancreatic organoids are growing, through pipetting. 3 Disassemble the organoid with syringe and needle. 4 Pipetting is additionally performed using a 10ml tip. 5 Centrifuge at 4°C, 200xg, for 5 minutes. 6 Remove the supernatant and obtain an organoid pellet. 7 Calculate the amount required for embedding and mix with the organoid pellet and the dECM support made in Example 3 (a mixture made according to the mixing ratio of Matrigel and dECM). 8 Drop 40-50ul of the dECM mixture into a 24-well plate (or culture plate). 9 Incubate at 37°C for 30-40 minutes.
  • the toxicity of the dECM scaffold was confirmed by staining and observing live and dead cells of organoids cultured in dECM using the Invitrogen Live/Dead ® Viability/Cytotoxicity Kit. Wash the dECM scaffold in which the organoids are incubated with pre-warmed DPBS (1X) 3 times at 37°C for 5 minutes each. Afterwards, the method was performed in the same manner as the manufacturer's protocol.
  • Example 12 Evaluation of proliferation of dECM-based organoids
  • the proliferation potential of organoids in dECM is evaluated with the CCK-8 assay, which checks whether or not the organoids cultured on dECM supports proliferate or the respiration rate of cells.
  • Proliferation of organoids (and cells) cultured in dECM was confirmed by measuring the respiration volume of organoids cultured in dECM by using DOJINDO's CCK-8 assay kit. Wash the dECM scaffold in which the organoids are being cultured with pre-warmed DPBS (1X) 3 times at 37°C for 5 minutes each. Afterwards, the method was performed in the same manner as the manufacturer's protocol. In the analysis of the results, proliferation was confirmed by comparing the absorbance values of the samples for each period.
  • N.C means a negative control value, and was measured in a blank without cells.
  • pancreatic 1% dECM and Matrigel were mixed with 8:1, 4:1 , it was confirmed that cell proliferation occurred in all the experimental groups mixed at 2:1 and 0.5:1. Among them, it was observed that when pancreatic 1% dECM and Matrigel were mixed in a ratio of 2: 1, the number of cells constituting an organoid similarly or superior to that of Matrigel proliferated.
  • Example 13 Culture validation of dECM-based mouse pancreatic organoids
  • organoids cultured on dECM supports it is checked whether organoids cultured on dECM supports are effective with organoids cultured on scaffolds (Matrigel), which are mainly used for organoid culture.
  • organoids cultured on scaffolds Matrigel
  • cDNA was synthesized based on the RNA extracted in (1) using Applied biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor. It proceeded in the same manner as the manufacturer's protocol.
  • 11a is a result of confirming the pancreatic organoid markers of mouse pancreatic organoids cultured in pancreatic dECM-based hydrogels.
  • all Lgr5 markers which can determine the expression level of Lgr+5 stem cells, which are known to be key in organoids, were expressed except when pancreatic 1% dECM was used alone.
  • Fig. 11b which quantitatively analyzed the gene expression level
  • the expression level of Lgr5 was 1% dECM of the pancreas and 2:1 of Matrigel as in Example 10.
  • amylase (Amy) and insulin (Insulin; Ins) which are expected to be expressed and differentiated by the pancreas
  • an organoid similar to that when cultured on Matrigel can be cultured, and in particular, by increasing the expression level of pancreatic-specific markers, pancreatic organoid culture and It can be effective for differentiation.
  • Fig. 12a shows the results of observation under a microscope of long-term culture in which mouse pancreatic organoids were cultured for 14 days under the conditions of mixing dECM and Matrigel alone and with Matrigel at the suggested ratio based on the pancreatic 1% dECM of the present invention
  • 12b is the result of The expression level of pancreatic markers in mouse pancreatic organoids on the 14th day of culture was analyzed qualitatively, and 12c was quantitatively analyzed.
  • G1 Matrigel
  • G2 1% dECM
  • G3 Matrigel 1+1% dCEM 8
  • G4 Matrigel 1+1% dCEM 4
  • G5 Matrigel 1+1% dCEM 2
  • G6 Matrigel 1+ 1% dCEM 0.5.
  • This example is an experimental method and results obtained by varying the stirring time and speed in the dissolution step S4) according to the present invention.
  • Example 2 The experimental method was carried out based on the methods described in Example 2 and Examples 10 to 12 of the present invention.
  • a decellularization composition was prepared according to the method of Example 2 of the present invention.
  • the pulverized dECM prepared in Example 2 was put into a 50 mL conical tube, and 0.5M acetic acid was added with pepsin at a stirring speed of 330 rpm for 24 hours, 72 hours, and 96, respectively. hours, dissolved for 120 hours.
  • the mixture was dissolved at a stirring speed of 80 rpm, 150 rpm, 250 rpm, 330 rpm, 500 rpm, and 1000 rpm for 72 hours. Undissolved pancreatic dECM powder was filtered out using a cell strainer.
  • 10X PBS and 10N sodium hydroxide (NaOH) were added to adjust the pH of the decellularization composition thus made, and the PBS and NaOH were stored at a refrigerated temperature before use and used for pH adjustment in a cold state.
  • pancreatic organoids were cultured according to the method of Example 10 of the present invention.
  • pancreatic organoids were obtained with a 1000ul tip and a pipette and collected in a conical tube. After that, organoids were primarily disassembled using a syringe and needle, and then pipetting was additionally performed with a 10ml tip and pipette aid. The decomposed organoids were obtained through centrifugation and removal of the supernatant.
  • the number of organoids required for this experiment and the amount of dECM required were calculated (40ul dECM per dome is required).
  • the calculated organoid pellet and dECM made at different stirring times (24 hours, 72 hours, 96 hours, 120 hours) and stirring speed (80rpm, 150rpm, 250rpm, 330rpm, 500rpm, 1000rpm) were mixed with Matrigel 2:1 Each was mixed and encapsulated at a ratio of (this is an organoid culture appropriate condition derived from Examples 11-13 and FIGS. 9-12c of the present invention).
  • pancreatic dECM The physical properties and organoid culture results of pancreatic dECM for each stirring time are shown in FIGS. 13 to 16 .
  • FIG. 13 is a graph showing the modulus value of pancreatic dECM when the stirring time is changed in S4) dissolution step according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 14 is a gelation kinetic of pancreatic dECM by stirring time (gelation kinetic) It is a graph showing the values
  • FIG. 15 is a photograph showing the culture state of pancreatic organoids for each stirring time
  • FIG. 16 is a graph showing the proliferation rate (proliferation) of the pancreatic organoid culture for each stirring time.
  • the modulus value representing the physical properties for each stirring time was 24h ⁇ 72h ⁇ 96h > 120h (24h ⁇ 120h). That is, it was confirmed to have the best physical properties when 72-96 hours ( FIGS. 13 and 14 ).
  • the present inventors have found that the suitable conditions for culturing organoids for each stirring time are 72-96 hours.
  • pancreatic dECM results of pancreatic dECM according to agitation speed are as shown in FIGS. 17 to 20 .
  • FIG. 17 is a graph showing the modulus value of pancreatic dECM when the stirring speed is changed in the dissolution step S4) according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 18 is a gelation kinetic of pancreatic dECM according to the stirring speed.
  • ) is a graph showing the value
  • FIG. 19 is a photograph showing the culture state of pancreatic organoids by stirring speed
  • FIG. 20 is a graph showing the proliferation rate (proliferation) of the pancreatic organoid culture by stirring speed.
  • the modulus value representing the physical properties for each stirring speed is 80 ⁇ 150 ⁇ 250 ⁇ 330 ⁇ 500 ⁇ 1000 (330 ⁇ 1000 ⁇ 500) rpm. There were (FIGS. 17 and 18).
  • the modulus value of 330 rpm and 1000 rpm does not differ significantly, and the value of 1000 rpm is slightly higher than the modulus value of 330 rpm, the organoid culture result shows that the organoid culture result is remarkably low under the stirring condition at 1000 rpm. could Therefore, it can be seen that even a very minute difference in rpm can have a significant effect on organoid culture when the decellularization composition is dissolved.
  • the present inventors have found that the suitable conditions for culturing organoids for each stirring speed are 330-500 rpm.
  • This example is an experimental method and results obtained by varying the conditions and temperatures performed in the step S5) pH adjustment according to the present invention.
  • the experimental method was carried out based on the method described in Example 2 of the present invention.
  • the pH adjustment process was performed while the tube containing the lysate was put on ice.
  • FIG. 21 is a photograph for explaining the process of performing S5) pH adjustment step on ice according to an embodiment of the present invention. That is, as shown in FIG. 21 , the pH adjustment process was performed in a state in which the container containing the decellularization composition according to the present invention was completely submerged in ice. As a control, the pH adjustment process was performed while the container containing the decellularization composition was placed at room temperature (about 26° C.).
  • pancreatic dECM lysate for each condition of the pH adjustment process are as shown in FIGS. 22 to 25 .
  • FIG. 22 to 24 are photographs showing the gelation state of the composition in which S5) pH adjustment step is performed on ice according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 25 is S5) pH adjustment step according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the modulus value of the composition performed on ice.
  • the decellularization composition was gelated at 37° C. for 30 minutes in the same manner as in the organoid culture condition, and when the hydrogels made under each pH adjustment condition were observed, the pH adjustment was also performed at room temperature (RT). In one hydrogel, the separation of the water layer and the gelled decellularization composition occurred much more conspicuously, and it was confirmed that it was not suitable for organoid culture as the gel was not stably maintained (see Fig. 24). .
  • the decellularization composition adjusted to pH at room temperature was difficult to pipette when encapsulating organoids, and the dome was not maintained and broken during culturing with encapsulated organoids, and the culture itself was difficult because the organoids were also not uniformly encapsulated ( 22, 23 and 24).
  • the decellularization composition adjusted to the pH on ice according to the present invention was able to form a uniform gel during the gelation process, but the decellularization composition adjusted to the pH at room temperature (RT) resulted in partial gelation and aggregation. It was confirmed that the dome was not maintained and broken, and the physical properties (complex modulus (G*)) were also low (see FIG. 25 ).
  • FIG. 26 is a graph showing the gelation kinetic value of the composition in which the pH adjustment step S5) was performed on ice according to an embodiment of the present invention.
  • the pH-adjusted decellularization composition according to the present invention on ice showed a marked increase in the complex modulus (G*) value during temperature changes (4-37°C), whereas the pH-adjusted decellularization composition at room temperature (RT)
  • the saturated composition showed a linear change in G* value, which means that partial gelation occurred and gelation occurred when the pH was already adjusted at room temperature.

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Abstract

본 발명은 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명은 기존의 매트리겔 기반 배양 시스템 대비하여 실제 조직 유사 환경을 조성할 수 있고, 특히 췌장 오가노이드 배양에 있어서 조직 분화를 촉진시키고 실제 조직과 유사한 형태로 효과적으로 발달시키는 효과를 발휘한다.

Description

췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법
본 발명은 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 것이다.
오가노이드는 줄기세포로부터 계통 발생 및 분화를 통해 형성된 3차원 세포 집합체로 장기의 발달 과정을 관찰할 수 있고, 기능 및 구조적인 측면에서 실제 조직을 재현할 수 있다. 이렇듯 세포가 붙어 자랄 수 있도록 지지역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold) 또한 생체조직공학에서 매우 중요한 역할을 수행함은 물로, 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체 내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸하게 된다. 따라서 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다. 이러한 지지체는 다양한 소재로 제조될 수 있는데, 보통 천연재료, 합성 고분자, 생체 세라믹스 및 고분자-세라믹 복합소재를 사용하여 지지체를 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이에 현재까지 다양한 장기를 모사하는 오가노이드가 개발되었으며, 이들은 주로 3차원 배양 환경인 매트리겔(Matrigel)에서 배양된다.
그러나, 매트리겔은 오가노이드 배양에 널리 사용되고 있지만 마우스 육종 (sarcoma)에서 유래된 것으로 특별한 대체제가 없어 높은 비용에도 불구하고 매트리겔 사용에 의존할 수 밖에 없다는 것이 한계이다. 또한 특정 성분이 지배하고 조직 특이적 특성의 반영에 한계점이 존재한다. 이의 보완 및 대체를 위하여 조직 및 기관의 탈세포화가 세포 배양 및 이식을 위한 기능성 지지체 또는 스캐폴드(scaffold)를 제조하기 위한 유망한 방안으로써 연구되고 필요성이 대두되고 있다. 한편, 현재 오가노이드 배양 기술로 제작된 오가노이드는 분화도 및 기능적인 측면에서 실제 인체 조직과 많은 차이를 가지고 있어 더욱 성숙한 오가노이드 배양을 위한 기술 개발이 요구되는 실정이다.
이와 관련하여, 하기 비특허문헌 1에는 탈세포화된 췌장 조직이 췌장 아일렛(islet) 형성을 위한 스캐폴드로 사용될 수 있다는 것이 개시되어 있다. 그러나, 여기에는 탈세포화 과정이 구체적으로 개시되어 있지 않다.
또한, 하기 특허문헌 1에는 뇌조직을 탈세포화하고, 동결건조하며, 동결건조된 조직을 분산시킨 후, 산성용액에서 용액화하고, pH를 조정하는, 뇌 오가노이드 배양용 조성물의 제조방법이 개시되어 있다. 그러나, 이것은 뇌조직에 대한 것으로 췌장에 대한 것이 아닐 뿐만 아니라, 용액화 단계에 대하여 단백질분해효소로 펩신 또는 트립신을 이용할 수 있다고만 기재되어 있을 뿐이고, pH 조정 후의 일반적인 겔화(gelatation) 온도(25 내지 38℃)만이 기재되어 있을 뿐이다.
이에 따라, 췌장 오가노이드의 배양 효율을 높일 수 있는, 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법과, 그에 따른 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 연구개발의 필요성은 항시 존재하는 실정이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국공개특허 10-2019-0143830 (2019.12.31.)
(특허문헌 2) 한국등록특허 10-2015368
(특허문헌 3) 한국공개특허 10-2017-0078460
[비특허문헌}
(비특허문헌 1) Damodran, RG. & Vermette, P. J Tissue Eng Regen med.
본 발명은 기존의 매트리겔 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 조직의 환경을 모사해주지 못하고, 조직 분화, 발달되는 효율이 미흡한 점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 조성물은 실제 조직 유사 환경을 조성하여 오가노이드 배양에 있어서 최적의 환경을 제공하고 장기 특이적 분화능을 향상시키기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 탈세포화 조직의 물성이 우수하고, 오가노이드 배양율도 현저히 높일 수 있는 오가노이드 배양용 조성물 및 그것의 제조방법을 제공하는 것이 목적이다.
또한, 본 발명은 탈세포화 조직의 물성이 우수해지고, 겔화를 방지할 수 있며, 균일한 하이드로젤화를 가능하게 하는 오가노이드 배양용 조성물 및 그것의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법을 제공한다.
본 발명은, S1) 췌장 조직을 탈세포하는 단계; S2) 상기 탈세포한 조직을 동결건조하는 단계; S3) 상기 동결건조한 조직을 분쇄하는 단계; S4) 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 용해하는 단계; 및 S5) 상기 용해한 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 단계를 포함하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 탈세포화된 조직은 실제 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 췌장 조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.
상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.
상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(예. 성장인자) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.
상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 S1) 탈세포하는 단계는, 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 트리톤(Triton) X-100, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 과산화 아세트산(peracetic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 3-[(3-콜아미도프로필(cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판설포네이트(propanesulfonate)(CHAPS), 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 수산화암모늄(ammoniumhydroxide), 트립신(Trypsin), 벤조나제(benzonase), DNase, 염화칼슘(calcium chloride), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 아지드화 나트륨(Sodium Azide, NaN3) 및 염화나트륨(sodium chloride) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 용액을 가하는 과정을 2회 이상 포함할 수 있다. 또한, 2회의 탈세포화 과정 중간에 세척 과정을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 탈세포화 하는 동안 조직을 교반시킬 수 있다.
상기 방법을 통해 탈세포화된 세포외기질(decellized extracellular matrix, dECM)을 얻을 수 있으며, 상기 “탈세포화 세포외기질”은 포유류 및 다세포 생물에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글리칸, 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인(cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다. 상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 탈세포화 하는 단계는, a1) 췌장 조직을 세척하는 단계, a2) 과산화 아세트산(peracetic acid), 트리톤-X(Triton-X) 및 SDS 중에서 선택된 어느 하나 이상을 처리하는 단계, a3) 에탄올, 이소프로판올 및 n-프로판올 중에서 선택된 어느 하나 이상을 처리하는 단계, a4) 세척하는 단계, a5) 과산화 아세트산, 트리톤-X 및 도데실황산나트륨 중에서 선택된 어느 하나 이상을 처리하는 단계, 및 a6) 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 a1), a4) 또는 a6)의 세척하는 단계는 증류수, 생리식염수 및 인산완충식염수 중에서 선택된 어느 하나 이상으로 수행할 수 있다. 상기 방법으로 탈세포화 수행하는 경우 조직 세포로의 분화 및 조직 특이성이 우수한 오가노이드 배양용 조성물을 얻을 수 있다. 특히, 상기 췌장 dECM을 이용한 지지체 내에서는 췌장 오가노이드의 분화능을 향상 시킬 수 있는 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, a1) 단계는 12 내지 48시간, a2) 단계는 12 내지 120시간, a3) 단계는 0.5 내지 4시간, a4) 단계는 12 내지 48시간, a5) 단계는 0.5 내지 4시간, 및 a6) 단계는 2 내지 12시간 수행할 수 있다. 구체적으로, a1) 단계는 12 내지 24시간, a2) 단계는 48 내지 96시간, a3) 단계는 1 내지 3시간, a4) 단계는 12 내지 36시간, a5) 단계는 1 내지 3시간, 및 a6) 단계는 4 내지 8시간 수행할 수 있다. 상기 범위에서 수행하는 경우 조직 세포로의 분화 및 조직 특이성이 우수한 오가노이드 배양용 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 S2) 동결건조하는 단계는 상기 S1) 단계에서 탈세포화한 조직을 동결건조시키는 것이다. 동결건조시키는 방법이나 구체적인 조건은 특별히 제한되지 않고 이 기술분야에 알려진 다양한 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, 탈세포화한 조직을 -100℃ 내지 -50℃에서 동결한 후, -70℃ 내지 -30℃에서 1일 내지 10일간 건조시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 S3) 분쇄하는 단계는 상기 S2) 단계에서 동결건조한 조직을 분쇄하는 것이다. 분쇄하는 방법이나 크기 및 구체적인 조건은 특별히 제한되지 않고 이 기술분야에 알려진 다양한 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, 동결건조한 조직을 막자사발에 넣고 액체 질소를 이용해서 분쇄시키는 것이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 S4) 용해하는 단계는, 상기 S3) 단계에서 분쇄한 조직을 용해하는 것이다. 즉, 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하고 교반하면서 용해하는 것이 가능하다.
여기서, 본 발명은 특별히 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 72 시간 내지 96 시간 동안, 330 rpm 내지 500 rpm의 속도로 교반하면서 용해하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 72 시간 내지 96 시간 동안, 330 rpm 의 속도로 교반하면서 용해하는 것일 수 있다. 또한, 96 시간 동안, 330 rpm 내지 500 rpm의 속도로 교반하면서 용해하는 것도 가능하다. 더욱 바람직하게는, 96 시간 동안, 330 rpm 의 속도로 교반하면서 용해하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 탈세포화하는 과정이 아니라, 탈세포화한 후 동결건조 및 분쇄를 거친 탈세포화 조직(dECM)에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 용해하는 과정에서의 교반 시간 및 속도가 상기 탈세포화 조직의 물성과 이후 배양효과에도 중요하다는 것을 알게된 후, 본 발명을 완성하였다.
후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 용해단계에서 72 시간 내지 96 시간 동안, 330 rpm 내지 500 rpm의 속도로 교반하면서 용해시키는 경우, 그렇지 않은 경우와 비교하여, 우수한 유변학적 특성(물성)과 배양 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
즉, 교반시간별 물성을 나타내는 modulus 값은 24h < 72h ≒ 96h > 120h (24h ≒ 120h) 순으로 나타났다. 즉, 72-96 시간일 때 가장 우수한 물성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, 120 시간일 때의 물성은 너무 낮아서 오가노이드 배양 실험 자체가 불가능 했고, 오가노이드 배양시 24h < 72h < 96h 순으로 배양 경향이 좋아짐을 알 수 있었다. 바람직하게는, 72 시간 교반하는 경우 조직의 물성이 더욱 우수했지만, 오가노이드 배양 효율은 96시간 교반할때 더욱 우수했다.
또한, 교반속도별 물성을 나타내는 modulus 값은 80 < 150 < 250 < 330 ≪ 500 ≫ 1000 (330 < 1000 ≪ 500) rpm 순으로, 330-500 rpm일 때 가장 우수한 물성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, 오가노이드 배양시 250 ≪ 330≒500 ≫ 1000 순의 배양 효율을 가지며, 80 rpm에서는 dome 형성이 불가함을 확인하였다. 바람직하게는, 500 rpm 의 속도로 교반하는 경우 조직의 물성이 더욱 우수했지만, 오가노이드 배양 효율은 330 rpm의 속도로 교반할때 더욱 우수했다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, S4) 단계의 단백질 소화 효소는 펩신 또는 트립신일 수 있다. 바람직하게는 펩신일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, S4) 단계의 산은 염산 또는 아세트산일 수 있다. 바람직하게는 아세트산일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 S5) pH를 조정하는 단계는, 상기 S4) 단계에서 용해한 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 것이다. 염기성 용액을 가하는 방법이나 사용하는 염기성 용액의 종류는 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 알려진 다양한 염기성 용액을 이용할 수 있다. 최종 pH는 7 내지 7.5 되도록 조정할 수 있다.
여기서, 본 발명은 특별히 상기 S5) pH를 조정하는 단계는 겔화를 방지하기 위하여 1℃ 내지 10℃ 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 2℃ 내지 7℃ 범위 내에서 수행할 수 있다. 즉, pH 조정 과정을 상온에서 수행하는 것이 아니라 그보다는 낮은 냉장온도 범위에서 수행하는 것일 수 있다.
또한, 상기 S5) pH를 조정하는 단계는 겔화를 방지하기 위하여 얼음 위에서 수행하는 것도 가능하다. 상기 "얼음 위에서" 수행한다는 것은, 상기 용해액이 얼음의 표면 위에 존재하거나 또는 얼음 내부에 구비되는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 용해한 용해액을 포함하는 용기를 얼음 안에 삽입한 후, 염기를 가하여 pH를 조정하는 것도 가능하다.
본 발명자들은 탈세포화하는 과정이 아니라, 탈세포화 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 과정의 온도(1℃ 내지 10℃) 및/또는 조건(얼음 위에서)이 조성물의 하이드로젤화 및 이후 오가노이드의 봉입에도 영향을 미친다는 것을 알게된 후, 본 발명을 완성하였다.
후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 탈세포화 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH 조정하는 과정을 "얼음 위에서(1℃ 내지 10℃에서)" 수행하는 경우, 용해액의 겔화(gelatation)를 방지할 수 있고, 균일한 하이드로젤화를 가능하게 하는 효과가 있다. 또한, 이렇게 제조된 췌장 dECM 지지체는, 그렇지 않은 경우와 비교하여, 우수한 유변학적 특성(물성)과 배양 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따라 얼음 위(ice)에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 겔화(gelation) 과정동안 균일한 겔을 형성할 수 있었지만, 상온(RT)에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 부분적인 겔화와 응집(aggregation)이 되면서 돔(dome) 형태가 유지 되지 못하고 부서지며, 물성(complex modulus(G*))도 낮음을 확인할 수 있었다.
상기와 같이, 본 발명은 pH 조정 과정을 상온에서 수행하는 것이 아니라 그보다는 낮은 냉장온도 범위에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 나아가 상기 염기성 용액은 사용 전 미리 1℃ 내지 10℃ 범위 내의 냉장온도에서 보관한 것임을 특징으로 할 수 있다. 사용하는 염기성 용액까지 냉장온도(또는 얼음)에서 보관한 것을 사용하면, 겔화 방지 및 균일한 하이드로젤화를 더욱 우수하게 할 수 있어서 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기한 본 발명에 의하는 경우, 조직 세포가 처리 전 대비 95% 이상, 구체적으로 97% 이상 제거될 수 있다. 또한 글루코사미노글리칸 함량은 처리 전 대비 90 내지 120%, 구체적으로 95 내지 110% 일 수 있다. 또한 콜라겐 함량은 처리 전 대비 200 내지 2000%, 구체적으로 500 내지 1700% 일 수 있다. 이를 통해 세포제거율은 우수하면서도 유용 성분은 남겨서 이를 기반으로 하는 지지체에서 오가노이드 배양이 잘 되고 (culture, expansion, proliferation) 조직 세포로의 분화 및 조직 특이성이 우수한 오가노이드 배양용 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법을 통해 오가노이드 배양에 우수한 사이토카인이 풍부한 조성물을 얻을 수 있다. 구체적으로, 매트리겔 대비하여 엔지오포이에틴-1, 인슐린 성장인자, TGF-베타 및 태반성장인자 중에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인의 잔류량이 많은 것일 수 있다. 이를 통해 오가노이드 배양이 잘 되고 (culture, expansion, proliferation) 조직 세포로의 분화 및 조직 특이성이 우수한 오가노이드 배양용 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 상술한 방법으로 제조한 췌장 오가노이드 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 조성물의 총 부피를 기준으로 건조된 탈세포화 조직을 0.1 내지 10%(w/v) 포함할 수 있고, 구체적으로는 0.1 내지 5%(w/v) 포함할 수 있다. 상기 함량을 만족하는 경우, 본 발명을 기반으로 하는 탈세포화 지지체(dECM)에서 오가노이드를 배양하게 되면 오가노이드가 잘 배양이 되고 (culture, expansion, proliferation) 특히, 췌장 dECM 지지체 내에서는 췌장 오가노이드의 분화능이 향상되고 조직 특성을 잘 유지할 수 있는 우수한 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 매트리겔을 더 포함할 수 있다.
상기 “매트리겔(matrigel)”은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서 (BD Bioscience社의 제품명), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스와 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 상피 세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), TGF-β 또는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 조성물의 총 부피를 기준으로 건조된 탈세포화 조직을 0.1 내지 10%(w/v) 포함할 수 있고, 구체적으로는 0.1 내지 5%(w/v) 포함할 수 있다. 상기 함량을 만족하는 경우, 본 발명을 기반으로 하는 탈세포화 지지체(dECM)에서 오가노이드를 배양하게 되면 오가노이드가 잘 배양이 되고 (culture, expansion, proliferation) 특히, 췌장 dECM 지지체 내에서는 췌장 오가노이드의 분화능이 향상되고 조직 특성을 잘 유지할 수 있는 우수한 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 상기에서 상술한 췌장 오가노이드 배양용 조성물에 췌장 오가노이드를 배양하는 단계를 포함하는 췌장 오가노이드 배양 방법을 제공한다.
상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.
서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화 시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기에서 상술한 췌장 오가노이드 배양용 조성물에 췌장 오가노이드를 배양하는 단계를 포함하는 췌장 오가노이드 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상술한 췌장 오가노이드 배양용 조성물로 제조한 오가노이드 배양용 세포외기질 지지체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 오가노이드 배양용 세포외기질 지지체와 췌장 오가노이드를 혼합하는 단계를 포함하는 췌장 오가노이드 배양 방법을 제공한다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명은 기존의 매트리겔 기반 배양 시스템 보다 더 실제 조직과 유사한 환경을 조성할 수 있고, 특히 췌장 오가노이드 배양에 있어서 조직 분화를 촉진시키고 실제 조직과 유사한 형태로 효과적으로 발달시키는 효과를 발휘한다.
또한, 본 발명에 따라 탈세포화 조직을 단백질 소화효소 및 산으로 용해하는 단계에서 특정한 시간 또는/및 rpm으로 교반하는 경우, 탈세포화 조직의 물성이 우수해지고, 오가노이드 배양율도 현저히 높아지는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따라 탈세포화 용액에 염기성 용액을 가하여 pH 조정하는 과정을 특정한 조건에서 수행하는 경우, 탈세포화 조직의 물성이 우수해지고, 겔화를 방지할 수 있며, 균일한 하이드로젤화를 가능하게 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 췌장 오가노이드 배양용 조성물을 제조하고, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양과 응용에 대한 대표도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 췌장 dECM의 native 조직 대비 dsDNA, GAGs, 콜라겐 함량을 분석한 것이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 췌장 dECM의 유변학적 특성을 분석한 것이다.
도 4a 내지 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라 췌장 dECM의 잔존 사이토카인을 분석한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 췌장 dECM의 조직학적 특성을 분석한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 FE-SEM을 활용하여 췌장 dECM의 표면 구조를 분석한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 LC-MS/MS를 활용하여 췌장 dECM의 단백질 성분을 분석한 것이다.
도 8a은 본 발명의 일 실시예에 따라 췌장 오가노이드의 배양적합 조건을 선별하기 위한 Gelation 경향 (sol-gel transition)을 분석한 것이다. 도 8a는 췌장 dECM을 일 구현예에 따라 1 % 와 1.5 % 으로 제작한 후 단독 dECM 및 Matrigel과 제시된 비율대로 혼합한 혼합물을 분석한 것이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 췌장 오가노이드 배양 적합 조건의 지지체의 Frequency sweep을 분석한 것이다. 췌장 dECM을 일 구현예에 따라 1 % 와 1.5 % 으로 제작한 후 단독 dECM 및 Matrigel과 제시된 비율대로 혼합한 혼합물을 분석한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 Live/Dead assay를 활용하여 췌장 오가노이드의 세포 독성을 분석한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 CCK-8 분석법을 활용하여 한계대 안에서의 췌장 오가노이드의 증식평가에 대한 결과를 나타낸다. 췌장 1% dECM 을 기반으로 단독 dECM 및 Matrigel 과 제시된 비율대로 혼합한 조건에서 마우스 췌장 정상 오가노이드를 배양한 후 증식의 경향을 분석한 결과이다.
도 11a 내지 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스 췌장 정상 오가노이드의 유전자 발현검증을 통해 dECM에서 배양된 췌장 오가노이드의 배양 유효성을 검증한 것이다. 도 11a는 췌장 dECM 기반에서 배양된 마우스 췌장 정상 오가노이드의 췌장 마커 발현 정도를 정성적으로 분석한 것이며, 11b는 정량적으로 분석한 결과이다. β-actin : house keeping gene, Lgr5 : Leucine-rich repeat containing G-protein coupled receptor 5, Pdx1 : Pancreatic and duodenal homebox 1, Sox9 : SRY-box containing gene 9, Krt19 : Keratin 19, Muc1 : Mucin 1, Amy : Amylase, Ins : Insulin 임. G1 : 매트리겔, G2: 1% dECM, G3:매트리겔1+1% dCEM 8, G4:매트리겔1+1% dCEM 4, G5:매트리겔1+1% dCEM 2, G6:매트리겔1+1% dCEM 0.5 임.
도 12a 내지 12c는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스 췌장 오가노이드의 장기 배양을 실시하여 dECM에서 배양된 췌장 오가노이드의 장기특이적 유전자 발현을 검증한 것이다. 도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 췌장 1% dECM 을 기반으로 단독 dECM 및 Matrigel 과 제시된 비율대로 혼합한 조건에서 마우스 췌장 오가노이드를 14일간 진행한 장기배양을 현미경으로 관찰한 결과이며, 12b는 그에 따른 배양 14일 차의 마우스 췌장 오가노이드의 췌장 마커 발현 정도를 정성적으로, 12c는 정량적으로 분석한 것이다. G1 : 매트리겔, G2: 1% dECM, G3:매트리겔1+1% dCEM 8, G4:매트리겔1+1% dCEM 4, G5:매트리겔1+1% dCEM 2, G6:매트리겔1+1% dCEM 0.5 임.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계에서 교반시간을 달리한 경우, 췌장 dECM의 모듈러스(modulus) 값을 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계의 교반시간별 췌장 dECM의 젤화 특성(gelation kinetic) 값을 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계의 교반시간별 췌장 오가노이드 배양 상태를 나타내는 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계의 교반시간별 췌장 오가노이드 배양물의 증식률(proliferation)을 나타내는 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계에서 교반속도를 달리한 경우, 췌장 dECM의 모듈러스(modulus) 값을 나타내는 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계의 교반속도별 췌장 dECM의 젤화 특성(gelation kinetic) 값을 나타내는 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계의 교반속도별 췌장 오가노이드 배양 상태를 나타내는 사진이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계의 교반속도별 췌장 오가노이드 배양물의 증식률(proliferation)을 나타내는 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행하는 과정을 설명하기 위한 사진이다.
도 22 내지 도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물의 젤화 상태를 보여주는 사진이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물의 모듈러스(modulus) 값을 나타내는 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물의 젤화 특성(gelation kinetic) 값을 나타내는 그래프이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물을 이용하여, 췌장 dECM+matrigel (2:1) 혼합물을 배양한 경우의, 온도증가에 따른 물성 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
실시예 1 : 돼지 췌장의 탈세포화
(1) 췌장 외 조직 제거 및 췌장 조직 세절
흐르는 물에 췌장 조직을 세척하고 췌장 외 조직을 멸균된 가위(operating scissors)로 제거한 후, 포셉(forcep)을 사용하여 췌장을 비닐백으로 옮긴 후 -80℃에 1시간 동안 동결시킨다. 1 mm 의 두께로 동결된 췌장 조직을 세절한 후, 500 mL 플라스틱 용기에 옮긴다. 이 때 사용하는 용기는 조직의 오염과 용액(solution)의 증발을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 플라스틱 용기의 사용을 권장한다.
(2) 탈세포화 시약 처리
시약 처리 전 조직을 증류수(dH2O;2차수)를 사용하여 12시간 이내로 세척한다. 세척 후 조직에 1 % Triton-X 100를 84시간 이내로 처리한다. 이 단계에서 조직의 양이 줄어든다. 잔존 지방 조직을 제거하기 위해 아이소프로필 알코올(isopropanol(IPA))을 2시간 처리한다. 이 단계에서 조직이 질겨진다. IPA를 제거 후 1X PBS(인산완충식염수)를 24시간 처리한다. 멸균을 위해 과산화아세트산이 포함된 에탄올을 2시간 처리한다. 이후 모든 base buffer로 3차 증류수(ddH2O)를 사용하도록 한다. 잔존 시약을 제거하기 위해 1X PBS를 6시간동안 처리한다. 포셉을 사용하여 조직을 50 mL 코니칼 튜브(conical tube)에 옮긴다. -80℃에서 조직을 동결 후, -50℃에서 4일간 동결건조 시킨다. 탈세포화 전체 공정에서 오비탈 쉐이커(digital orbital shaker)를 100-200 rpm으로 4℃에서 사용하도록 하며, 모든 단계에서 조직이 엉겨 붙는 것을 방지하기 위해 포셉을 사용하여 풀어준다. 남아있는 시약을 제거하기 위해 매 단계에서 플라스틱 용기를 증류수로 세척한다.
실시예 2 : 췌장 dECM 지지체 제조
실시예 1에서 제작한 동결 건조된 췌장 dECM을 막자사발(mortar and pestle)을 이용하여 액체 질소와 함께 분쇄한다. 췌장 dECM을 50 mL 코니칼 튜브(conical tube)에 넣고 펩신(pepsin)과 함께 0.5 M 아세트산(acetic acid)에 96 시간 녹인다. Cell strainer를 사용하여 녹지 않은 췌장 dECM 분말(powder)를 거른다. 젤화(gelation)을 방지하기 위해 이후 과정부터 얼음 위에서 이루어져야 한다. 10 N 수산화나트륨(NaOH) 처리 전 차가운 10X PBS를 첨가한 후 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 골고루 섞어준다. pH 시험지(pH indicator strip)을 사용하여 pH의 변화를 관찰하며 10 N 수산화나트륨(NaOH)를 첨가하여 최종 pH를 7-7.5로 맞춘다. 차가운 1X PBS를 첨가하여 최종 용량을 맞춘다.
실시예 3 : 췌장 dECM biochemical assay
탈세포가 완료된 돼지 췌장 조직에 대한 검증으로서 native 조직 대비 탈세포화 조직에서의 dsDNA, GAGs 및 collagen의 함량을 확인한다.
(1) 탈세포화 췌장 조직의 dsDNA 함량 확인
GeneJET Genomic DNA Purification Kit를 이용하여 native 조직과 탈세포화 조직에서 dsDNA를 분리한다. 제조사의 프로토콜과 동일하게 진행하였다. Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay Kit를 이용하여 native 조직 대비 탈세포화 조직에서의 dsDNA 함량을 확인하였다. 제조사의 프로토콜과 동일하게 진행하였다.
(2) 탈세포화 췌장 조직의 글루코사미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)와 콜라겐 함량 확인을 위한 용액 준비
dECM의 소화(digestion)을 위해 파파인(papain) 용액을 준비한다. 모든 용액의 준비에서(papain, buffer 등) 용액의 양은 샘플 수에 따라 조정할 수 있다. 구체적인 공정은 다음과 같다. ① 고압 멸균 증류수에 0.1 M 소듐 포스페이트 (monobasic), 0.5 mM Na2-EDTA, 5mM 시스테인-염산을 용해시킨다. ② 10 N 수산화나트륨를 첨가하여 용액의 pH를 6.5로 조정한다. ③ 위의 용액에 10 mg/mL로 만들어둔 파파인 스톡을 첨가하여 고르게 혼합되도록 vortex mixer로 잘 섞는다.
디메틸-메틸렌 블루(Dimethyl-methylene blue, DMMB) 어세이를 위한 solution을 준비한다. 구체적인 공정은 다음과 같다. ① DMMB dye를 제조하기 위해, 고압 멸균 증류수에 1,9-dimethyl-methylene blue zinc chloride double salt, 글리신, 염화나트륨을 용해시킨다. bench-top pH meter를 사용하여 pH 변화를 측정하면서 0.5 M HCl 용액을 추가하여 pH 3으로 조정한다. 그런 다음 filter를 이용하여 여과한 후, 코니칼 튜브에 aliquot하여 은박지로 감싸서 보관한다. ② 10 mg/mL 콘드로이틴 설페이트 A 솔루션 스톡(chondroitin sulfate A solution stock)을 1X PBS를 이용하여 100 μg/mL로 만든다.
하이드록시프롤린(Hydroxyproline) 어세이를 위한 솔루션을 준비한다. 구체적인 공정은 다음과 같다.
① 클로라민 워킹 솔루션 : 소듐 아세테이트(sodium acetate), 시트르산(citric acid), 소듐 하이드록시드(sodium hydroxide)을 증류수에 녹이고, glacial acetic acid, 톨루엔, IPA을 추가한다. 클로라민 워킹 솔루션(Chloramine working solution)은 4℃에서 보관하고, 약 6개월 정도 사용 가능하다.
② 클로라민 T 솔루션 : Chloramine T를 클로라민 워킹 솔루션에 녹인후, IPA를 첨가한다. 고르게 잘 섞이도록 vortex mixer로 잘 섞는다. 단, Chloramine T solution은 사용 직전에 준비한다.
③ P-DAB 솔루션 : P-DAB을 perchloric acid에 넣고, IPA을 추가하여 잘 섞어준다. 단, P-DAB 역시 사용 직전에 준비하고 빛에 민감하므로 사용 전까지 반드시 튜브를 알루미늄 호일로 감싼다.
(3) 탈세포화 췌장 조직의 dECM digestion
1.7 mL microcentrifuge tube (e-tube)에 동결 건조된 조직을 넣고, papain 용액을 첨가하여 vortex mixer로 잘 섞어준다. 조직이 들어 있는 e-튜브를 고무랙에 끼우고, 비커에 물을 담아서 띄운 후 60℃ 에서 16 시간 동안 조직을 digestion 시킨다. 단, 남아있는 조직이 없이 완전히 녹아야 한다. 12000 x g 에서 20분 동안 원심분리 하고, 상층액을 취하여 새로운 e-tube로 옮긴다.
(4) 탈세포화 췌장 조직의 Glycosaminoglycans(GAGs)와 콜라겐 함량 확인
dECM 내 GAGs의 양을 정량화하기 위해 DMMB 분석을 실시한다. 구체적인 공정은 다음과 같다. ① 100 μg/mL로 만들어 둔 콘드로이틴 설페이트 A 솔루션 스톡을 증류수를 이용하여 실험 목적에 맞춰 특정 범위의 standard를 준비한다. ② 96 well plate에 40 μL/well로 3반복의 standard 및 sample을 loading한다. ③ Multi-channel pipettor로 160 μL/well의 DMMB dye를 첨가해준다. ④ microplate reader기로 525 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
dECM 내 콜라겐의 양을 정량화 하기 위해 하이드록시프롤린 분석을 실시한다. 구체적인 공정은 다음과 같다. ① 파파인 용액에 녹인 조직과 동일한 양의 염산을 120℃ 오븐에서 16 시간 동안 반응시킨다. ② 반응 후 유리벽에 남아있는 잔류물을 실온에서 3 시간 동안 건조 및 냉각시킨 후, 1X PBS에 다시 용해시킨다. ③ 완전히 용해시킨 샘플은 e-튜브에 옮겨 담은 후 4℃, 10분 동안 5,000 x g 에서 원심 분리하여 상층액만 새로운 e-튜브로 옮긴다. ④ 원심분리 하는 동안, 100 μg/mL 하이드록시프롤린 솔루션 스톡을 증류수로 희석하여 실험 목적에 맞춰 특정 범위의 standard를 준비한다. ⑤ 96 well plate에 50 μL/well로 3반복의 standard 및 샘플을 로딩한다. ⑥ 50 μL의 클로라민 T solution을 첨가한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨다. ⑦ 50 μL의 P-DAB solution을 첨가하고 60℃ 에서 30분 동안 반응시킨다. P-DAB은 빛에 민감하므로, 불을 끄고 loading 한 후 plate를 알루미늄 호일로 감싸서 incubation을 진행한다. ⑧ 상온에서 30분 동안 냉각 시킨 후, microplate reader기로 540 nm에서 흡광도를 측정한다.
(5)　실험 결과
구체적인 실험 결과는 도 2에 나타냈다. 췌장 dECM의 경우 native 군 대비하여 DNA 함량은 각각 2.48%, 2.05%로 세포가 97%이상 제거되었다. 또한 탈세포화 과정에서 주로 많은 손실이 발생하는 GAGs 함량은 췌장 dECM에서 96% 로 native와 유사하였으며, 이는 탈세포화 공정 확립이 잘 이루어졌다고 판단할 수 있다. 콜라겐 함량 역시 native군 대비 췌장 dECM에서 1537% 수치를 나타냄으로써, 탈세포화 과정 중에 세포는 제거되고 세포외기질의 주요 성분들은 보존이 잘 되었음이 검증되었다.
실시예 4 : 췌장 dECM의 유변학적 특성 분석
(1) 실험 방법
유변학적 특성을 평가하기 위해 췌장 dECM 지지체를 pH 7로 맞춰서 준비한다. 레오미터의 rate-controlled mode에서 20 mm cone plate geometry (2 °각도에서 20 mm의 콘 직경)을 설정한다. 설치된 소프트웨어(TRIOS)에서 실험 순서를 만들어 dECM 지지체의 viscosity, gelation kinetics, dynamic modulus를 측정한다.
* Gelation kinetics : dECM 지지체를 플레이트에 놓고, 5℃/min의 incremental increase rate (time-sweep mode)으로 4-37℃에서 dECM 지지체의 storage & loss modulus를 측정하여 complex modulus (G *)를 계산한다.
* Dynamic modulus : 측정하기 전에 dECM 지지체를 37℃에서 30분 동안 플레이트에 놓는다. 2% strain, 0.1-100 rad/s 범위에서 dECM 지지체의 frequency-dependent storage modulus (G')와 loss modulus (G'')를 측정한다.
dECM loading 양은 250 μL로 하고, running GAP은 500 μm로 설정한다. Running 전 cone plate 주변에 빠져나온 dECM은 얇은 scraper 등으로 최대한 제거해준다.
(2) 실험 결과
분석 결과는 도 3a 및 3b에 나타냈다. 매트리겔 및 중성화 시킨 췌장 dECM 하이드로겔은 열 반응 거동을 나타내며 15 ℃ 미만의 온도에서 용액과 같은 상을 나타내며 온도가 생리학적 온도(37 ℃)로 증가 할 때 겔과 같은 상(가교 겔)으로 변형된다. Rheometer를 이용하여 매트리겔(Matrigel)과 췌장 dECM의 유변학적 특성을 분석한 결과 모든 그룹에서 안정적인 하이드로겔을 형성하였다. 췌장 dECM은 겔화는 서서히 일어나지만 더 높은 복합 모듈러스를 형성함을 확인하였다. 최종적으로, 중성화 시킨 췌장 dECM은 50분 동안 유체에서 겔로의 전이가 나타났다(도3a). 또한, 생리학적 온도(37 ℃)에서 겔화 후 가교 된 췌장 dECM 하이드로겔은 낮은 전단 주파수에서 높은 전단 주파수 (0.1-100 rad/s)범위의 동적 외력 하에서 매우 안정적인 가교 과정을 나타냄을 확인하였다(도3b).
실시예 5 : FE-SEM을 활용한 췌장 dECM의 표면 특성 분석
췌장 dECM 지지체를 pH 7로 맞춘다.
(1) Freeze dry 전처리 (췌장 dECM 적용)
37℃ 에서 30분 동안 gelation 시킨 췌장 dECM을 4% paraformaldehyde에 담궈 고정시킨다. 샘플을 1X PBS로 10분씩 3번 세척한다. 30, 50, 70, 90, 100 % 에탄올을 준비하고 순서대로 각 10분씩 처리해준다. 액체 질소(LN)으로 급속 냉각 시킨 후 동결건조 시킨다. 이 과정은 내부 구조 보존을 위한 것으로, 이 과정을 생략하고 동결 건조를 시킬 경우 구조 손상이 있을 수 있다. 백금(Pt) coating 한 후, imaging 한다.
(2) 실험 결과
결과는 도 6에 나타냈으며, ECM 성분들이 fiber 형태를 잘 이루고 있는 것을 확인하였다.
실시예 6 : 췌장 dECM의 잔존 cytokine 분석
(1) Solution 제조 및 췌장 dECM 지지체 준비
(2) 췌장 dECM 단백질 정량
췌장 dECM 지지체를 pH 7로 맞춰서 준비한다. 중성화 시킨 dECM에 RIPA 버퍼를 첨가한 뒤 ice에 박은 채로 약 30분 정도 반응시킨다. 5분에 한번씩 vortex mixer를 사용하여 잘 섞이도록 한다. BCA 단백질 어세이 키트를 사용하여 dECM 내 총 단백질을 정량 한다. 소혈청 알부민 (BSA) 2 mg/mL stock을 ddH2O로 희석하여 standard를 준비한다. RIPA buffer에 해리시킨 췌장 dECM을 원액으로 두고, ddH2O를 이용하여 2/5/10/50/100/200/500/1000배 희석하여 준비한다. 96-well plate에 standard와 sample을 20 μL/well씩 3반복으로 로딩한다. Blank는 RIPA buffer로 한다. BCA 솔루션을 필요한 만큼 계산하여 solution A: solution B=49:1로 섞어 준비한다. 반드시 튜브는 은박지로 싸고 A,B 용액은 미리 섞어 두지 않고, 샘플 로딩 후 용액을 혼합하도록 한다. Reservoir에 혼합한 용액을 붓고 multi-channel pipettor를 이용하여 160 μL/well씩 로딩한다. 96-well plate 전체를 은박지로 감싼 후 37℃ incubator에서 30분간 반응시킨다. Microplate reader기로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정한다. 표준 곡선을 그리고, 샘플의 총 단백질을 계산한다. 사이토카인 어레이 프로토콜 상 단백질 로딩 양 추천 범위 내 (load 50 to 500 μg of total protein)에서 희석 배수를 결정하였다. 총 단백질이 50 μg이 되도록 췌장 dECM 원액을 50 μg/mL 농도로 희석하여 준비하였다. 분석 방법은 제조사(RayBio®C-Series Porcine cytokine array 1)의 프로토콜과 동일하게 진행하였다.
(3) 실험 결과
결과는 도 4a 내지 도 4e에 나타냈으며, 도 4a 내지 도 4e는 췌장 dECM의 잔존 cytokine을 분석한 결과이다. 이 중 줄기세포성장인자 (stem cell factor; SCF)가 매트리겔과 비교하여 췌장 dECM에서 2배 이상 높게 존재하는 것으로 확인되었으며, 이외에도 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), TGF-β 또는 태반성장인자(placental growth factor; PIGF)와 같은 오가노이드 배양에 영향을 주는 주요 인자들이 매트리겔에 비해 다량 함유되어 있다. 따라서, 췌장 dECM은 실제 조직에서 면역 세포, 혈관 세포 및 그 외 다양한 기질 세포들이 생성하고 분비하는 cytokine을 다량 함유함으로써, 조직의 미세 환경을 더욱 가깝게 모사할 수 있을 뿐만 아니라 특히, 췌장 dECM은 세포외기질의 제공과 더불어 혈관신생 및 세포 증식 등과 관련된 cytokine을 다량 함유하고 있어 매트리겔보다 오가노이드 배양에 효과적이다.
실시예 7 : 췌장 dECM의 조직학적 특성 평가
실시예 1과 2에서 제작한 췌장 dECM의 조직 염색(Hematoxylin&Eosin, Masson's trichrome stain)을 실시하였다.
실험 결과 도 5에 나타난 것처럼 조직학(H&E, MT staining) 분석을 통해 탈세포화 과정을 거친 후 조직으로부터 세포는 제거된 반면, 생화학적 미세환경을 모사하는 세포외기질 성분은 유지됨을 확인하였다.
실시예 8 : 췌장 dECM의 잔존 protein 분석
실시예에서 제작한 췌장 dECM의 잔존 protein을 LC-MS/MS(Liquid Chromatography - Mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다.
(1) 시료 전처리
* Protein unfolding : 잔존 단백질을 펩타이드 조각으로 쪼개기 위해서 1차적으로 buffer에 녹여서 공유결합을 끊는 과정을 거친다.
* Deglycosylation : 당단백질에 특이적으로 가하는 과정이다. 당단백질의 경우 서열 중간에 당쇄를 가지고 있어서 이 당쇄로 인해서 후에 질량값에 문제가 생길 수 있기 때문에 효소를 이용해서 당 부분을 제거하고 당단백질 부분을 normal peptide 형태로 바꾸어 준다.
* Digestion : LysC/Trypsin 등으로 단백질을 분해한다.
* Clean up : Buffer에 들어있는 SDS와 같은 detergent와 염 성분들을 제거한다. 본 과정은 염의 간섭시 문제가 될 수도 있기 때문에 펩타이드 이온의 정확한 검출을 위해서 꼭 거쳐야 한다.
(2) LC-MS/MS를 이용한 분석
개체의 database를 끌고 와서 sequence library를 이용해서 분석한다.
(3) 실험 결과
실험 결과 도 7에 나타난 것처럼 췌장 dECM은 세포의 생존 및 기능 향상과 관련된 콜라젠 VI가 다량 함유되어 있음을 확인하였다. 이러한 단백질들은 췌장에서 인슐린 분비를 담당하는 islet의 생존 및 기능과 관련되어 있다고 알려져 있어, 본 발명에서 개발된 췌장 dECM 단독 또는 매트리겔과의 혼합 지지체 내에 췌장 오가노이드를 배양했을 때 오가노이드의 성장 및 분화능 향상에 도움을 줄 수 있다. 이외에도 조직 특이적인 세포외기질 단백질들이 탈세포화 과정을 거친 후에도 잔존함을 확인함으로써, 본 발명에서 개발된 탈세포화 기반 췌장 dECM 지지체는 오가노이드의 성장을 돕고, 오가노이드의 분화 및 기능을 향상 시킬 수 있다.
실시예 9 : 오가노이드 배양 적합 제형 선별
지지체로서 사용 준비가 완료된 췌장 dECM을 오가노이드 배양을 하기 위해 오가노이드 배양에 많이 사용하는 지지체(매트리겔, Matrigel)의 gelation 경향과 유사한 하이드로젤 제형 조건을 스크리닝하여 선별하였다. dECM 단독 혹은 매트리겔과 dECM을 혼합하여 검증하였다.
(1) 췌장 dECM 오가노이드 배양 적합 제형 선별
췌장 dECM은 1 %, 1.5 %의 농도를 기반으로 시험하였으며 각 농도의 dECM을 단독, 매트리겔과 혼합하여 (dECM:매트리겔 비율 = 2:1, 1:1, 1:2) 비교하였다. 각 농도의 dECM을 단독으로와 매트리겔과 혼합하여 (dECM:매트리겔 비율 = 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2) 비교하였다. 전반적인 사항은 “실시예 4 : 췌장 dECM의 유변학적 특성 분석”과 유사하다.
(2) Gelation 경향 (sol-gel transition) 및 지지체의 Frequency sweep 분석
유변학적 특성을 평가하기 위해 췌장 dECM 지지체를 pH 7-7.5로 맞춰서 준비한다. 레오미터에 measuring plate PP25를 장착하여 진행한다. dECM loading 양은 300 μL 이상으로 하고, running GAP은 췌장은 500 μm로 한다. Running 전 measuring plate 주변에 빠져나온 dECM은 scraper 등으로 최대한 제거해준다. 설치된 소프트웨어(RheoCompass 1.19)에서 다음 조건과 같은 실험을 만들어 dECM 지지체의 sol-gel transition, complex viscosity, frequency sweep를 측정한다.
* Gelation kinetics : dECM 지지체를 플레이트에 놓고, 췌장은 2% strain, 100rad/s, 2℃/min으로 4-37℃에서 dECM 지지체의 storage & loss modulus를 30분간 측정하여 sol-gel transition 경향과 complex viscosity (η*)를 계산한다.
* Frequency sweep : gel화가 완료된 dECM 지지체를 37℃에서 2% strain, 500 rad/s에서 1 rad/s 으로 dECM 지지체의 frequency-dependent storage modulus (G')와 loss modulus (G'')를 측정한다.
(3) 실험 결과
결과는 도 8a 및 8b에 나타냈다. 실시예 5와 같이 매트리겔 및 중성화 시킨 췌장 dECM 하이드로겔은 열 반응 거동을 나타내며 5 ℃ 미만의 온도에서 용액과 같은 상을 나타내며 온도가 체내와 같은 37 ℃로 증가함에 따라 겔과 같은 상태로 변형된다. Rheometer를 이용하여 매트리겔을 대조군으로, 췌장 dECM 단독 및 실시예 9의 (1)에 제시된 비율대로 Matrigel과 혼합한 혼합겔의 sol-gel transition과 Frequency sweep을 분석한 결과 각 장기별로 다음과 같은 결과를 관찰했다.
먼저 도 8a 과 8b는 췌장 dECM 일 구현예에 따라 1 % 와 1.5 % 으로 제작한 후 단독 dECM 및 Matrigel과 제시된 비율대로 혼합한 혼합물을 분석한 결과이다. 대조군(Matrigel) 및 제시된 실험군에서 모두 마트리겔과 비슷한 겔화가 관찰되었으며, 췌장 1 % 및 1.5 % dECM 과 dECM을 기반으로 마트리겔과 혼합한 혼합물 중 췌장 dECM의 비율이 증가할수록 마트리겔보다 겔화가 천천히 진행되는 것을 관찰 할 수 있었다. 37 ℃에서 겔화가 완료된 췌장 dECM 및 그 혼합물의 하이드로겔의 점탄성(Frequency sweep)을 분석한 결과 췌장 １ % 및 1.5 % dECM 1 % 및 1.5 % dECM과 그 혼합물에서 마트리겔과 유사한 물성을 관찰하였으며, 췌장 1% dECM의 혼합비율이 증가할 수록 마트리겔보다 낮은 물성을 가지는 경향을 확인하였고 췌장 1.5% dECM은 단독으로 사용했을때 마트리겔과 가장 유사한 물성의 경향을 보였다. 중성화 시킨 췌장 dECM 기반으로 오가노이드 배양을 하기 위해 적합한 제형은 실시예 10, 11 및 도 8a 의 결과에 따라 췌장 1% dECM 기반으로 하는 것이다.
최종적으로, 중성화 시킨 췌장 dECM 및 실시예 9에서 제시된 혼합물 중 위의 결과로 선별된 비율의 혼합물은 30분 동안 겔화가 진행되었다(도 8a, 8b). 실시예 10에서는 겔화 안정화를 고려하여 37 ℃에서 40분 이상의 겔화를 진행한다.
실시예 10 : dECM 기반 오가노이드 배양
지지체로서 사용 준비가 완료된 췌장 dECM의 오가노이드 배양 적합성을 평가하기 위해 dECM을 기반으로 오가노이드 배양을 진행한다.
(1) 마우스 췌장 오가노이드 배양 및 dECM embedding
*마우스 췌장 오가노이드를 배양하기 위해 Advanced DMEM/F12을 기반으로, Glutamax, HEPES, Anti-anti를 혼합하여 배지를 준비한다. 췌장 오가노이드 배양을 위해 N2, B27, N-acetylcysteine, mEGF, hNoggin, Rspondin-1, Nicotinamide, hGastrin, hFGF10 와 같은 성장인자를 넣어준다. 배양 중인 췌장 오가노이드를 dECM에 배양하기 위해 매트리겔에서 배양 중인 췌장 오가노이드를 회수한다.
구체적인 공정은 다음과 같다. ① 기존 배지를 제거한 후 PBS를 첨가한다. ② 췌장 오가노이드가 자라고 있는 매트리겔을 pipetting을 통해 물리적으로 파괴한다. ③ Syringe와 needle으로 오가노이드를 분해한다. ④ 10ml tip을 이용하여 pipetting을 추가적으로 한다. ⑤ 4℃, 200xg, 5분간 원심분리를 수행한다. ⑥ 상층액을 제거하고 오가노이드 pellet을 얻는다. ⑦ Embedding에 필요한 양을 계산하여 오가노이드 pellet과 실시예 3에서 만들어진 dECM지지체 (매트리겔과 dECM의 혼합비율에 따라 만든 혼합물) 와 혼합한다. ⑧ 40-50ul의 dECM 혼합물을 24-well plate (또는 culture plate)에 drop한다. ⑨ 37℃에서 30-40 분 배양한다. ⑩ Y-27632가 포함된 오가노이드 배양 배지를 첨가한다. ⑪ 2-3일에 한번 Y-27632가 포함되지 않은 오가노이드 배양 배지로 교환을 실시한다. ⑫ 계대 후 7-14일 뒤, 오가노이드 상태에 따라 계대 배양을 실시하여 장기배양 (14일)을 실시한다.
실시예 11 : dECM 기반 오가노이드의 Cytotoxicity 평가
dECM 지지체에서 배양된 오가노이드의 배양 적합성을 평가하기 위해 dECM 지지체가 오가노이드 배양에 독성이 없는지 확인하기 위해 Live/Dead 어세이로 Live cell을 확인한다.
(1) dECM 기반 배양 중인 오가노이드의 Live/Dead 어세이
Invitrogen Live/Dead® Viability/Cytotoxicity Kit를 이용하여 dECM에서 배양 중인 오가노이드의 Live cell과 Dead cell을 염색, 관찰하여 dECM 지지체의 독성을 확인하였다. 오가노이드가 배양중인 dECM 지지체를 pre-warmed DPBS(1X)로 5분씩 3번 37℃에서 washing 한다. 이후 방법은 제조사의 프로토콜과 동일하게 진행하였다.
(2) 실험 결과
실험 결과는 도 9에 나타난 것처럼 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 췌장 dECM 및 실시예 9에서 선별된 오가노이드 배양적합 하이드로겔에서 오가노이드를 배양함에 있어서 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다.
실시예 9에서 언급한 바와 같이 췌장 1 % dECM 과 1.5 % dECM 을 기반으로 마우스 췌장 오가노이드를 배양했을 때 췌장 1 % dECM 에서 오가노이드의 배양이 효과적으로 이루어지는 것을 확인했으며 (도 9 첫 번째 그림), 그 결과를 기반으로 췌장 1 % dECM과 마트리겔의 혼합 비율을 다양하게 하여 실험한 결과 췌장 1 % dECM과 마트리겔을 8:1, 4:1, 2:1, 0.5:1 로 섞은 실험군에서 마트리젤과 유사하게 독성없이 유사하게 배양되는 것을 관찰하였다 (도 9 두번째 그림).
실시예 12 : dECM 기반 오가노이드의 증식 평가
dECM 지지체에서 배양된 오가노이드의 배양 적합성을 평가하기 위해 dECM 지지체에서 배양한 오가노이드가 증식을 하는지 세포의 호흡량을 확인하는 CCK-8 어세이로 dECM내에서 오가노이드의 증식 가능성을 평가한다.
(1) dECM 기반 배양 중인 오가노이드의 CCK-8 어세이
DOJINDO의 CCK-8 어세이 kit를 이용하여 dECM에서 배양 중인 오가노이드의 호흡량을 일정 시기별로 측정하여 dECM에서 배양중인 오가노이드(및 세포)의 증식을 확인하였다. 오가노이드가 배양중인 dECM 지지체를 pre-warmed DPBS(1X)로 5분씩 3번 37℃에서 washing 한다. 이후 방법은 제조사의 프로토콜과 동일하게 진행하였다. 결과 분석은 각 시기별 샘플의 absorbance값을 비교하여 증식여부를 확인하였다.
(2) 실험 결과
결과는 도 10에 나타냈으며, 췌장 dECM을 기반으로 오가노이드를 배양 했을 때의 세포 증식 경향을 확인한 결과이다. N.C는 negative control 값을 의미하며, 세포가 없는 Blank에서 측정되었다.
췌장 dECM을 기반으로 마우스 췌장 정상 오가노이드를 배양했을 때 췌장 1 % dECM 단독으로 배양했을 때는 4일간 배양하는 동안 세포의 수가 증식하지 않고, 췌장 1 % dECM 과 마트리겔을 8:1, 4:1, 2:1, 0.5:1 로 혼합한 실험군에서는 모두 세포 증식이 일어남을 확인하였다. 그 중 췌장 1 % dECM과 마트리겔을 2:1 의 비율로 혼합했을 때 마트리겔보다 유사 혹은 우수하게 오가노이드를 구성하는 세포의 수가 증식했음을 관찰했다.
최종적으로 췌장 1% dECM 과 Matrigel을 2:1로 혼합한 하이드로겔에서 마트리겔보다 오가노이드 증식에 유사 혹은 우수한 효과가 있음을 확인했다.
실시예 13 : dECM 기반 마우스 췌장 오가노이드의 배양 유효성 검증
dECM 지지체에서 배양된 오가노이드의 배양 적합성을 평가하기 위해 dECM 지지체에서 배양한 오가노이드가 주로 오가노이드 배양에 많이 쓰이는 지지체 (Matrigel)에서 배양한 오가노이드와 유효한지 확인한다. dECM 지지체에서 배양한 마우스 췌장 오가노이드와 대조군에서 배양한 마우스 췌장 오가노이드 간 유전자 발현을 비교함으로서 dECM의 각 장기의 특징을 나타내는 유전자의 발현을 확인한다.
(1) 췌장 dECM에서 배양된 마우스 췌장 오가노이드의 RNA 추출
TRIzol™ reagent를 이용하여 췌장 dECM 및 매트리겔(대조군)에 배양 중인 마우스 췌장 오가노이드를 sampling 하였다. (①~⑧ 과정) Qiagen RNeasy mini kit를 이용하여 RNA를 추출하였다. 제조사의 protocol과 동일하게 진행하였다. (⑨ 이후 진행) 구체적인 공정은 다음과 같다.
① 매트리겔 및 dECM에서 배양 중인 마우스 췌장 오가노이드의 배지를 제거한다. ② 1ml의 TRIzol™ reagent를 넣어 pipetting을 통해 물리적으로 부순 후 microcentrifuge 튜브로 옮긴다. ③ 5분간 상온에서 반응시킨다. ④ 200ul의 클로로포름을 첨가하고 vortexing을 통해 잘 섞어준다. ⑤ 3분간 상온에서 반응시킨다. ⑥ 4℃, 12,000xg, 15분간 원심분리를 수행한다. ⑦ 상층액을 새 microcentrifuge 튜브로 옮긴다 (약 500ul) ⑧ ⑦의 상층액의 0.5 volume의 100% 에탄올을 첨가하고 잘 섞어준다. ⑨ 섞어준 샘플을 RNeasy mini spin column에 넣는다. 이후 과정은 Qiagen RNeasy kit 프로토콜에 따라서 진행한다.
(2) 추출된 RNA를 기반으로하는 cDNA 합성
Applied biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor를 이용하여 (1)에서 추출한 RNA를 기반으로 cDNA를 합성하였다. 제조사의 프로토콜과 동일하게 진행하였다.
(3) 합성된 cDNA를 template로 RT-qPCR 진행
Applied biosystems PowerUp SYBR Green Master Mix를 이용하여 (2)에서 합성된 cDNA를 template로서 real time qPCR을 진행하였다. 마우스 췌장 정상 오가노이드의 배양 유효성을 확인하기 위해 다음과 같은 마커로 유전자 발현량을 확인하였다. Pancreatic progenitor (Pdx1), Ductal lineage (Sox9, Krt19), Endocrine (Muc1, Insulin), Acinar cells (Amylase), Lgr5+ stem cell (Lgr5), Housekeeping (β-actin). 결과 분석은 전기영동을 통하여 나타나는 밴드로 분석하였다. 그와 더불어 Day0의 각 유전자 발현 정도 대비 dECM 유무 및 시기별 유전자 발현 정도를 비교 분석하였다.
(4) 실험 결과
실험 결과는 도 11a 및 도 11b 에 나타내었다. 도 11a 는 췌장 dECM 기반 하이드로겔에서 배양한 마우스 췌장 오가노이드의 췌장 오가노이드 마커를 확인한 결과이다. 이 중 오가노이드에서 핵심적이라고 알려진 Lgr+5 stem cell의 발현정도를 알 수 있는 Lgr5 마커는 췌장 1% dECM을 단독으로 사용했을 때를 제외하고 모두 발현이 되었으며 췌장 1% dECM 과 마트리겔을 혼합한 하이드로젤의 마트리겔의 함량이 높아질수록 마트리겔과 유사하게 발현되는 것을 관찰하였다. 그리고 담관 마커인 Sox9 과 Krt19, 내분비세포 마커인 Muc1은 모든 실험군에서 발현되는 것을 확인했으며 췌장 전구세포에서 발현되는 Pdx1도 모든 실험군에서 발현되는 것을 확인했다. 이외에도 선모세포 (acinar cell)에서 발현되는 아밀라아제 (Amylase; Amy) 도 모든 실험군에서 발현되는 것을 확인했다. 특히 췌장의 베타세포에서 발견되는 인슐린 (Insulin ;Ins)은 췌장 1% dECM을 단독으로 사용하거나 마트리겔과 혼합하여 사용할때 dECM의 함량이 높을 때 발현정도가 나타나는 것을 확인했다.
유전자 발현 정도를 정량적으로 분석한 도 11b의 결과에 따르면 도 11a에서 검증한 정성결과와 유사한 결과를 보이며, Lgr5의 발현정도는 실시예 10에서와 마찬가지로 췌장 1% dECM 과 마트리겔을 2:1 의 비율로 혼합한 하이드로겔에서 마트리겔보다 유사 혹은 더 많이 발현되었다. 특히, 도 11b에서 나타난 결과에서 췌장이 분화가 진행되고 발현될 것으로 예상되는 아밀라아제 (Amylase; Amy)와 인슐린 (Insulin ;Ins)은 췌장 1% dECM을 단독으로 사용하거나, dECM 과 마트리겔을 혼합한 하이드로겔 중 췌장 1% dECM의 함량이 높아질 수록 마트리겔 대비 발현량이 매우 크게 증가함을 확인했다.
따라서, 췌장 1% dECM을 마트리겔과 혼합하여 오가노이드를 배양 할 시 때 마트리겔에서 배양했을 때와 유사한 오가노이드를 배양할 수 있으며 특히 췌장 특이적인 마커의 발현량이 늘어나게 됨으로써, 췌장 오가노이드 배양 및 분화에 효과적일 수 있다.
*또한, 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스 췌장 오가노이드의 장기 배양을 실시하여 dECM에서 배양된 췌장 오가노이드의 장기특이적 유전자 발현을 검증하였다. 이에, 도 12a는 본 발명의 췌장 1% dECM 을 기반으로 단독 dECM 및 Matrigel 과 제시된 비율대로 혼합한 조건에서 마우스 췌장 오가노이드를 14일간 진행한 장기배양을 현미경으로 관찰한 결과이며, 12b는 그에 따른 배양 14일 차의 마우스 췌장 오가노이드의 췌장 마커 발현 정도를 정성적으로, 12c는 정량적으로 분석한 것이다. G1 : 매트리겔, G2: 1% dECM, G3:매트리겔1+1% dCEM 8, G4:매트리겔1+1% dCEM 4, G5:매트리겔1+1% dCEM 2, G6:매트리겔1+1% dCEM 0.5 임. 실험 결과, 췌장 1% dECM을 마트리겔과 혼합하여 오가노이드를 배양 할 시 때 마트리겔에서 배양했을 때와 유사한 오가노이드를 배양할 수 있으며 특히 췌장 특이적인 마커의 발현량이 늘어나게 됨으로써, 췌장 오가노이드 배양 및 분화에 효과적임을 확인하였다.
실시예 14 : S4 용해 단계의 교반 시간 및 교반 속도별 효과 검증
본 실시예는 본 발명에 따른 S4) 용해 단계에서 교반 시간과 속도를 달리한 실험 방법 및 결과이다.
(1) 실험 방법
실험의 방법은 본 발명의 실시예 2와 실시예 10 내지 12에 기재된 방법을 바탕으로 진행하였다.
교반 시간과 속도가 각기 다른 dECM을 제조하기 위해, 본 발명의 실시예 2의 방법에 따라 탈세포화 조성물을 제조하였다.
먼저, 교반 시간이 각기 다른 dECM을 제조하기 위해, 실시예2를 통해 만들어진 분쇄된 dECM을 50 mL 코니칼 튜브에 넣고 펩신과 함께 0.5M 아세트산에서 330rpm의 교반 속도로 각각 24시간, 72시간, 96시간, 120시간 동안 녹였다.
더불어, 교반 속도가 각기 다른 dECM을 제조하기 위해 80rpm, 150rpm, 250rpm, 330rpm, 500rpm, 1000rpm 의 교반 속도로 72시간 동안 녹였다. 녹여진 dECM을 cell strainer를 사용하여 녹지 않은 췌장 dECM 분말을 걸러냈다.
이어서, 이렇게 만들어진 탈세포화 조성물의 pH를 맞추기 위해 10X PBS 및 10N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하였고, 상기 PBS 및 NaOH은 사용 전 미리 냉장 온도에서 보관하여 차가운 상태로 pH조절에 사용하였다.
그리고, 교반 속도, 시간별 오가노이드 배양 테스트를 하기 위해, 우선 췌장 오가노이드를 본 발명의 실시예 10의 방법에 따라 배양했다.
배양된 췌장오가노이드를 dECM에 봉입하기 위해 본 발명의 실시예 10의 방법에 따라 췌장 오가노이드를 1000ul tip과 파이펫으로 수득하여 코니칼튜브에 모았다. 이후 syringe와 needle을 이용하여 1차적으로 오가노이드를 분해한 후, 10ml tip과 파이펫에이드로 파이펫팅을 추가적으로 진행하였다. 분해된 오가노이드를 원심분리 후 상층액 제거를 통해 수득하였다.
오가노이드 상태에 따라 적절한 계대 비율을 산정하여, 본 실험에 필요한 오가노이드 수와 필요한 dECM의 양을 계산하였다(1dome 당 40ul dECM이 필요함). 계산된 오가노이드 pellet와 각기 다른 교반시간별 (24시간, 72시간, 96시간, 120시간 )그리고 교반속도별(80rpm, 150rpm, 250rpm, 330rpm, 500rpm, 1000rpm)로 만들어진 dECM을 마트리겔과 2:1의 비율로 각각 혼합하여 봉입하였다(이는 본 발명의 실시예 11-13과 도 9-12c에서 도출된 오가노이드 배양 적정조건임). 오가노이드와 혼합된 dECM 40ul를 파이펫을 이용하여 culture plate에 drop 하여 오가노이드 배양을 위한 dome을 형성하고, 37℃에서 30-40분간 겔화(gelation)를 진행하였다. 이후 오가노이드 배양배지를 첨가하고, 첨가된 배지는 2-3일에 한번 교환하였다. 오가노이드 봉입 후 4일 뒤 오가노이드 배양 상태를 본 발명에 따른 실시예 11-12의 방법에 의거하여 관찰하였다.
(2) 실험 결과
교반시간별 췌장 dECM의 물성과 오가노이드 배양 결과는 도 13 내지 도 16에 나타난 바와 같다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계에서 교반시간을 달리한 경우, 췌장 dECM의 모듈러스(modulus) 값을 나타내는 그래프이고, 도 14는 교반시간별 췌장 dECM의 젤화 특성(gelation kinetic) 값을 나타내는 그래프이며, 도 15는 교반시간별 췌장 오가노이드 배양 상태를 나타내는 사진이고, 도 16은 교반시간별 췌장 오가노이드 배양물의 증식률(proliferation)을 나타내는 그래프이다.
여기에 나타난 바와 같이, 교반시간별 물성을 나타내는 modulus 값은 24h < 72h ≒ 96h > 120h (24h ≒ 120h)으로 나타났다. 즉, 72-96 시간일 때 가장 우수한 물성을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 13 및 도 14).
또한, 120 시간일 때의 물성은 너무 낮아서 오가노이드 배양 실험 자체가 불가능 했다. 오가노이드 배양시 24h < 72h < 96h 순으로 배양 경향이 좋아짐을 알 수 있었다(도 15 및 도 16).
이에 따라, 본 발명자들은 교반 시간별 오가노이드 배양 적합 조건이 72-96 시간임을 알게된 것이다.
그리고, 교반속도별 췌장 dECM의 물성과 오가노이드 배양 결과는 도 17 내지 도 20에 나타난 바와 같다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 S4) 용해 단계에서 교반속도를 달리한 경우, 췌장 dECM의 모듈러스(modulus) 값을 나타내는 그래프이고, 도 18은 교반속도별 췌장 dECM의 젤화 특성(gelation kinetic) 값을 나타내는 그래프이며, 도 19는 교반속도별 췌장 오가노이드 배양 상태를 나타내는 사진이고, 도 20은 교반속도별 췌장 오가노이드 배양물의 증식률(proliferation)을 나타내는 그래프이다.
여기에 나타난 바와 같이, 교반속도별 물성을 나타내는 modulus 값은 80 < 150 < 250 < 330 ≪ 500 ≫ 1000 (330 < 1000 ≪ 500) rpm으로, 330-500 rpm일 때 가장 우수한 물성을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 17 및 도 18).
또한, 오가노이드 배양시 250 ≪ 330≒500 ≫ 1000 순의 배양 효율을 가지며, 80 rpm에서는 dome 형성이 불가함을 확인하였다(도 19 및 도 20).
교반속도별 물성에서는 250rpm과 330rpm이 크게 차이가 나진 않았지만, 오가노이드 배양 결과에서는 250rpm의 배양이 330rpm보다 현저히 낮음을 알 수 있다.
또한, 330rpm과 1000rpm의 modulus값이 크게 차이가 나지 않고, 오히려 1000rpm의 값이 330rpm의 modulus 값보다 약간 높은데도 불구하고 오가노이드 배양결과에서는 1000rpm으로 교반한 조건에서 오가노이드 배양 결과가 현저히 낮음을 알 수 있었다. 따라서, 탈세포화 조성물을 용액화 시킬 때 매우 미세한 rpm의 차이라도 오가노이드 배양에는 큰 영향을 줄 수 있음을 알 수 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 교반 속도별 오가노이드 배양 적합 조건은 330-500 rpm 임을 알게된 것이다.
실시예 15 : S5 pH 조정 단계의 조건별 효과 검증
본 실시예는 본 발명에 따른 S5) pH 조정 단계에서 수행 조건 및 온도를 달리한 실험 방법 및 결과이다.
(1) 실험 방법
실험의 방법은 본 발명의 실시예 2에 기재된 방법을 바탕으로 진행하였다.
pH 조정과정에서 췌장 dECM 용해액의 겔화(gelation)을 방지하기 위해, 상기용해액이 담긴 튜브를 얼음에 박은 채로 pH 조정과정을 수행하였다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행하는 과정을 설명하기 위한 사진이다. 즉, 도 21에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 탈세포화 조성물이 담긴 용기가 완전히 얼음에 잠기도록 한 상태에서 pH 조정과정을 진행하였다. 대조군으로는 탈세포화 조성물이 담긴 용기를 상온(약 26℃)에 놓은 상태에서 pH 조정과정을 진행하였다.
pH 조정과정에서 10X PBS 및 10N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하였고, 상기 PBS 및 NaOH은 사용 전 미리 냉장 온도(1℃ 내지 10℃)에서 보관하여 차가운 상태로 pH조절에 사용하였다.
pH가 중성으로 맞춰지면 필요한 양만큼 덜어 dome을 만들고 37℃ 온도(incubator 사용)에서 30분간 gelation 시켰다(도 22, 도 23 및 도 24 참조).
그리고, 위와 같이 gelation 된 탈세포화 조성물에 대하여 complex modulus(G*)값을 측정하여 물성을 평가하였다.
(2) 실험 결과
pH 조정 과정의 조건별 췌장 dECM 용해액의 물성은 도 22 내지 도 25에 나타난 바와 같다.
도 22 내지 도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물의 젤화 상태를 보여주는 사진이고, 도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물의 모듈러스(modulus) 값을 나타내는 그래프이다.
여기에 나타난 바와 같이, pH 조정 과정을 본 발명처럼 얼음 위에서 수행하면, 탈세포화 조성물의 겔화가 방지되고, 균일한 하이드로젤화가 이루어 진 것을 알 수 있었다. 이는 이후 파이펫팅 및 봉입 뿐만 아니라 오가노이드 배양도 용이하게 한다.
이와 비교하여, pH 조정 과정을 상온(RT)에서 진행하면, dECM의 일부가 부분적으로 겔화 및 aggregation 되었고, 시간이 지날수록 물층과 탈세포화 조성물의 분리가 발생하여 균일하지 못한 상태가 되었다(도 22 및 도 23 참조).
또한, pH조정단계 이후 탈세포화 조성물을 오가노이드 배양 조건과 동일하게 37℃에서 30분간 gelation을 진행 한 후, 각 pH조정 조건에서 만들어진 하이드로젤을 관찰 했을 때 역시, 상온(RT)에서 pH 조정을 한 하이드로젤은 물층과 겔화가 된 탈세포화 조성물의 층 분리가 훨씬 더 두드러지게 발생하였고, 이는 겔이 안정적으로 유지 되지 못하기 때문에 결국 오가노이드 배양에도 적합하지 않음을 확인할 수 있었다(도 24 참조).
이러한 결과에 따르면 상온에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 오가노이드 봉입 시 파이펫팅이 어렵고, 오가노이드를 봉입하여 배양시 dome이 유지되지 못하고 부서지거나, 오가노이드 또한 균일하게 봉입되지 않아 배양 자체가 어려웠다(도 22, 도 23 및 도 24).
즉, 본 발명에 따라 얼음 위(ice)에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 gelation 과정동안 균일한 겔을 형성할 수 있었지만, 상온(RT)에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 부분적인 겔화와 aggregation이 되면서 dome이 유지 되지 못하고 부서지며, 물성(complex modulus(G*))도 낮음을 확인할 수 있었다(도 25 참조).
아울러, 도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 S5) pH 조정 단계를 얼음 위에서 수행한 조성물의 젤화 특성(gelation kinetic) 값을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따라 얼음 위(ice)에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 온도 변화(4-37°C) 동안 complex modulus(G*)값의 뚜렷한 증가를 보여주는 반면, 상온(RT)에서 pH를 맞춘 탈세포화 조성물은 liner한 G*값의 변화가 나타났고, 이는 이미 상온에서 pH를 맞출 때 부분적인 겔화가 발생되어 gelation이 되었음을 의미한다. 이러한 결과는 상온(RT)에서 pH를 맞추는 경우 오가노이드 봉입시 파이펫팅의 어려움을 발생시키고, dome 형성 및 유지에 영향을 주어 오가노이드의 배양 자체가 어려울 수 있다(도 26 참조).
그리고, 본 발명의 실시예 10-13에 따라 오가노이드 배양 최적 조건으로 선별된 dECM+matrigel (2:1) 혼합조건 하에서, 온도증가에 따른 물성 변화를 분석하는 경우, pH조정이 상온(RT)에서 이루어졌을 때와 얼음위(ice)에서 이루어졌을 때의 그 초기 물성 차이는 dECM 단독이었을 때보다 더 크게 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다(도 27 참조).
또한, pH조정이 얼음위(ice)에서 이루어진 탈세포화 조성물은 sol상태에서 gel 상태로 변화하는 패턴이 관찰되었지만, 상온(RT)에서 이루어졌을 때는 거의 상 변화가 일어나지 않기 때문에 오가노이드 봉입과정을 수행하기 어렵고 그 때문에 오가노이드 배양에 적합하지 않음을 알 수 있었다(도 27 참조).
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. S1) 췌장 조직을 탈세포하는 단계;
    S2) 상기 탈세포한 조직을 동결건조하는 단계;
    S3) 상기 동결건조한 조직을 분쇄하는 단계;
    S4) 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 72 시간 내지 96 시간 동안, 330 rpm 내지 500 rpm의 속도로 교반하면서 용해하는 단계; 및
    S5) 상기 용해한 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 단계를 포함하는, 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 S4) 단계는, 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 72 시간 내지 96 시간 동안, 330 rpm 의 속도로 교반하면서 용해하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 S4) 단계는, 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 96 시간 동안, 330 rpm 내지 500 rpm의 속도로 교반하면서 용해하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 S4) 단계는, 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 96 시간 동안, 330 rpm 의 속도로 교반하면서 용해하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  5. S1) 췌장 조직을 탈세포하는 단계;
    S2) 상기 탈세포한 조직을 동결건조하는 단계;
    S3) 상기 동결건조한 조직을 분쇄하는 단계;
    S4) 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 용해하는 단계; 및
    S5) 상기 용해한 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 단계를 포함하며,
    상기 S5)단계는 겔화를 방지하기 위하여 2℃ 내지 7℃ 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  6. S1) 췌장 조직을 탈세포하는 단계;
    S2) 상기 탈세포한 조직을 동결건조하는 단계;
    S3) 상기 동결건조한 조직을 분쇄하는 단계;
    S4) 상기 분쇄한 조직에 단백질 소화효소 및 산을 첨가하여 용해하는 단계; 및
    S5) 상기 용해한 용해액에 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 단계를 포함하며,
    상기 S5)단계는 겔화를 방지하기 위하여 얼음 위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 얼음 위에서 수행하는 것은, 상기 용해한 용해액을 포함하는 용기를 얼음 안에 삽입한 후, 염기성 용액을 가하여 pH를 조정하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 염기는 사용 전 미리 1℃ 내지 10℃ 범위 내의 냉장온도에서 보관한 것임을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 췌장 오가노이드 배양용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    매트리겔을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 오가노이드 배양용 조성물.
  11. 제9항에 따른 췌장 오가노이드 배양용 조성물에 췌장 오가노이드를 배양하는 단계를 포함하는 췌장 오가노이드 배양 방법.
  12. 제9항에 따른 췌장 오가노이드 배양용 조성물로 제조한 오가노이드 배양용 세포외기질 지지체.
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