WO2017034211A1 - 무기물 표면 접착 또는 코팅용 단백질 접착제 - Google Patents

무기물 표면 접착 또는 코팅용 단백질 접착제 Download PDF

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Definitions

  • It relates to an adhesive material based on a protein or peptide, and relates to a technology capable of adhering various biological or non-biological materials to inorganic surfaces.
  • the adhesion of two materials or surfaces of the same or different, in particular different structures, is a very important process that is required in various fields.
  • the problem that occurs during the adhesion process is characterized by a different nature of the problem depending on the type of material to be bonded.
  • Adhesion in the medical field includes closure of incisions or injuries, bonding of fractured bones, corneal adhesion, and the like, and can also be used in dental practice for dental caries, sealant procedures and gum surgery.
  • Adhesion in this environment is advantageous in that a small amount of adhesive is used because of the small size of the components involved, as well as being able to adhere in wet conditions with water or water.
  • adhesives used in the medical or biological fields must be safe for the use of cells, tissues or organisms, and must have biocompatibility and further biodegradability conditions that do not cause inflammatory or toxic reactions.
  • bio-based adhesives are adhesives using mefp1, a mussel (Mytilus, Marine mussels) protein (Waite, JH Int. J. Adhes. Adhes., 1987. 7 (1): p. 9-14; Yamamoto, H. , Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 1996. 13: p. 133-65; and US 7,622,550).
  • Their adhesion is known to involve DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) -DOPA crosslinking (Deming, T. J., Polymeric Materials: Science and Engineering, 1999. 80: p. 471-472.).
  • the present application provides an adhesive or adhesive or coating composition for adhesion or coating to an inorganic surface comprising a peptide of formula (I) or a derivative thereof:
  • X 1 is any amino acid
  • X 2 , X 3 and X 4 are amino acids of any one of L, V, I, E and A, each being the same or different, X 5 is an amino acid of K or R,
  • N is an integer of 1 to 5, and when two or more are included, the amino acid sequence of each peptide is the same or different, and the amino acid is a natural or unnatural amino acid of D- or L-type or a derivative thereof.
  • Amino acid residues herein are denoted by single letter code and abbreviations are as follows: A, alanine; R, arginine; N, asparagine; D, aspartic acid; C, cysteine; E, glutamic acid; Q, glutamine; G, glycine; H, histidine; I, isoleucine; L, leucine; K, lysine; M, methionine; F, phenylalanine; P, proline; S, serine; T, threonine; W, tryptophan; Y, tyrosine; V, valine; B, asparagine, aspartic acid; Z, glutamine, glutamic acid; X, any amino acid.
  • any amino acid in X 1 of Formula I may be S, T, C, P, N or Q.
  • the X 2 -X 3 -X 4 sequence in Formula I can be, for example, AAA, EEE, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, LLV.
  • the peptide of formula (I) according to the invention is QLVVK (SEQ ID NO: 1), QEEEK (SEQ ID NO: 2), QAAAK (SEQ ID NO: 3), NLVVK (SEQ ID NO: 4), or SLVVK (SEQ ID NO: 5).
  • the compound of formula I according to the present application may further comprise a compound of formula II.
  • X 6 is an amino acid of any one of F, Y and W,
  • X 7 is an amino acid of K or R
  • X 8 is an amino acid of any one of A, M and I,
  • X 9 is an amino acid of any one of L, M and G,
  • X 10 is any amino acid
  • X 11 is an amino acid of any one of C, S and T,
  • One or more of X 7 and X 8 or X 10 and X 11 may be absent,
  • At least one of X 2 , X 3 or X 4 may be absent,
  • N is 1 or 2
  • the compound of formula II is connected to the amino terminus (N-terminus) or carboxy terminus (C-terminus), or both the N-terminus and C-terminus of the compound of formula (I).
  • the peptide of Formula II is FRALPC (SEQ ID NO: 6), FREEPC (SEQ ID NO: 7), FRVVPC (SEQ ID NO: 8), FEALPC (SEQ ID NO: 9), YRALPC (SEQ ID NO: 10), WRALPC (SEQ ID NO: 11) ), FRALP (SEQ ID NO: 12), FRAL (SEQ ID NO: 13), or FRPC (SEQ ID NO: 14).
  • the compound of Formula I and / or II may further comprise a compound of Formula III at the N or C terminus, or at the N and C terminus, and in one embodiment, is a compound of Formula III, Formula I and Formula Can be linked in the order of II
  • X 12 is any positive or negatively charged amino acid, in one embodiment the positively charged amino acid is K or R, and the negatively charged amino acid is D or E.
  • Adhesives or adhesive compositions according to the present disclosure allow for the attachment of various materials to inorganic surfaces.
  • inorganic surfaces include materials having a free electron distribution due to excellent electrostatic conductivity or inorganic materials in a conventional sense that do not include carbon, silicon, nitrogen, and the like, particularly materials having a hydrophobic surface, such as metals, for example.
  • Adhesives or adhesive compositions according to the present disclosure allow for the adhesion of various materials, including biological and / or non-biological materials, to inorganic surfaces, for example, non-biological materials include metals, glass, plastics, metals or polymer composite resins.
  • non-biological materials include metals, glass, plastics, metals or polymer composite resins.
  • the biological material may include cells, tissues, proteins, lipids, sugars or nucleic acids, or a combination thereof.
  • the present disclosure also discloses a method of adhering two surfaces comprising at least one inorganic surface using an adhesive or adhesive composition according to the present application.
  • the peptide according to the present invention is a bioadhesive material that is safe and has excellent adhesive effect, and may be usefully used for bonding various materials or surfaces including biological and non-biological materials to inorganic surfaces, or coating inorganic surfaces.
  • the adhesives or compositions or methods according to the invention are not only capable of adhesion in the wet state, but also of biocompatibility which does not cause inflammatory or toxic reactions.
  • FIG. 1A to 1D illustrate glass, zirconium (Zr), vinyl (Vinyl), polystyrene fibers (PS fibers), as non-biological or non-biological materials of the peptide (A7-1) according to one embodiment of the present application.
  • the results show the adhesion to polycaprolactone (PCL), titanium (Ti) and collagen (Col).
  • 1A is a result of investigating the adhesion of the peptide to the glass through the detection of biotin bound to the glass after the peptide according to an embodiment of the present application to the glass disulfide bond, the signal of the biotin is It is adhered to the glass, and this result disappears upon decomposition of disulfide bonds by treatment with dithiothreitol (DTT), indicating that the bond is dependent on disulfide bonds.
  • DTT dithiothreitol
  • FIG. 1B schematically illustrates the method used to perform the experiment of FIG. 1A, wherein the free-bonded peptide of the present disclosure is linked to Biotin, a labeling substance, through SH group, and the biotin may be detected as an antibody. This results in disappearance due to the treatment of DTT to separate biotin from the peptide.
  • FIG. 1C is the same as the method described in FIG. 1A but schematically illustrates an experiment to analyze adhesion to various non-biologically derived materials using fluorescein isothiocyanate (FITC) instead of biotin.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Figure 1d shows the analysis results, showing that the peptides of the present application has the adhesion to the surface of a variety of non-derived material, PBS (phosphate buffer saline), FITC-conjugate A7-1, and FITC dye from the left, respectively It is the result of analyzing the fluorescence image after adhering to the material.
  • PBS phosphate buffer saline
  • FITC-conjugate A7-1 FITC dye from the left
  • Figure 2a is a result of performing an adhesion test on the surface of the synthetic bone graft Bio-OSS ® (Geistlich Pharma, Inc) of the FITC-labeled peptides according to an embodiment of the present application, the commercialized bone of the peptides according to the present application Excellent adhesion to the implant.
  • Figure 2b is a result of performing an adhesion test on the surface of the synthetic bone graft MBCP TM (Biomatlante, Biphasic calcuim phosphate) of the FITC-labeled peptide according to an embodiment of the present application, the commercialized bone graft material of the peptide according to the present application It shows excellent adhesion to.
  • the fluorescence microscope magnification used was 200 times.
  • Figure 3a is a result of performing an adhesion test on the culture plate of MC3T3-E1, an anchorage-dependent cell of the peptide according to an embodiment of the present application, the cell containing the peptide according to the present invention was treated with a control group (PBS) Compared to), which indicates that the peptides of the present invention increase the adhesion of non-biological materials, such as culture plates of biological materials, such as cells.
  • PBS control group
  • Figure 3b is a result of the adhesion of the peptide to the hydrophobic culture dish of the anchorage-dependent cells (MC3T3-E1) of the peptide according to an embodiment of the present application, PLL (poly-L-) which is a substance used for improving the conventional cell adhesion lysin) shows that the cells comprising the peptides according to the present invention have increased adhesion as compared to the control (treated with PBS and PLL) microscopically.
  • Adhesion in the hydrophobic culture dish can compensate for the disadvantages of cell adhesion of various tissue-transfer materials (PCL, etc.) having hydrophobic properties, indicating that the industrial application value is high.
  • Figure 3c is the result of comparing the adhesion of the peptide to the hydrophobic culture plate of the anchorage-dependent cells (ST2) of the peptide according to an embodiment of the present invention, the cell containing the peptide according to the present application compared to the control group microscopic observation This indicates that the adhesion is increased.
  • Figure 3d is a result of thawing the anchorage-dependent cells (C2C12) of the peptide according to an embodiment of the present application, and comparing the adhesion ability to the culture dish with the medium control, the cells containing the peptide according to the present application microscopic observation Results Compared to the control, the adhesion to the culture dish was increased. In particular, the cell adhesion ability immediately after thawing has a very important effect on the survival of the cell, and the results indicate that the peptide adhesive according to the present invention may be usefully used to minimize the death of cells after thawing. It can be usefully used at, indicating high industrial application value.
  • Figure 3e is a result of comparing the adhesion of the peptide to the hydrophilic culture dish of the mitomycin treated STO feeder cells according to an embodiment of the present invention with the negative control (Mock) and gelatin, the peptide according to the present application Comprising cells show increased adhesion as compared to the negative control and gelatin.
  • Figure 3f is a result of comparing the adhesion of various peptides (established cell line and primary cells) in the hydrophobic culture dish of the peptide according to an embodiment of the present application with a negative control (Mock) using a cell metabolism measurement .
  • the results indicate that the peptides according to the present disclosure can increase their adhesion compared to negative controls in various kinds of cells.
  • 4b to 4c are results of analysis of the mechanism of cell adhesion of the peptide according to the present application.
  • Figure 4b is a result of analyzing the association with GAG or collagen as a peptide cell adhesion promoting mechanism, the above figure is observed that the phenomenon appears by decomposing the potential target by the enzyme treatment as a result that is related to both collagen and GAG .
  • Reduction of cell adhesion by collagenase treatment at least interacts with collagen.
  • hyaluronidase treatment reduced cell adhesion by hydrolyzing at least heparin sulphate, indicating interaction of heparin sulphate and peptide in GAG.
  • the addition of heparin and C-sulfate significantly reduced the cell adhesion capacity promoted through A7-1 in a concentration-dependent manner. Relevance.
  • Figure 4c shows the result of competitive treatment of A7-1 and soluble RGDS peptides, in the A7-1 untreated group, preferential binding to integrin, an adhesion molecule, when treated with soluble RGDS results in adhesion to the bottom (substrate).
  • Figure 5a is a schematic diagram showing a reporter system and an experimental procedure prepared for measuring the adhesion of the peptide to induced pluripotent stem cells (iPSC) according to the present application, the reporter system is induced pluripotent It includes a structure capable of measuring the activity of the Oct4 gene as an index of stem cell pluripotency (Stemness).
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • Figure 5b is a result of measuring the adhesion and maintenance of pluripotent mouse pluripotent stem cells using the construct according to Figure 5a by detecting the expression of Oct4 on day 2 and 3 of the cell culture, feeder cells and gelatin as a control in advance Coated culture plates were used, and peptides according to one embodiment of the present application were added in a precoated or mixed manner to the culture medium, both of which mediate the adhesion of iPSCs and also maintain pluripotency. Appeared.
  • Figure 5c is the same as Figure 5b, but as measured on the day 4 cell culture, the peptide according to the present invention was shown to mediate the adhesion of iPSC and also maintain the pluripotency.
  • Figure 6a is a result of observing the expression of the Alp (alkaline phosphotase) gene, another marker indicating the pluripotency, the peptides according to the present invention mediate adhesion of iPSC when precoated or mixed with the culture medium and also maintain pluripotency Appeared to.
  • Alp alkaline phosphotase
  • Nanog gene which is another marker indicating pluripotency, through staining, and the peptide according to the present invention mediated adhesion of iPSC and maintained pluripotency even when precoated or mixed with a culture solution.
  • FIG. 6C shows the same experiment as in FIG. 6C or the result of using the hESC, and shows that the hESC can grow well without any external environmental changes such as feeder cells or Matrigel.
  • FIG. 7A schematically illustrates the attachment of a therapeutic protein, such as BMP, as an example of a bioactive material to an inorganic surface using an adhesive according to the present application.
  • a therapeutic protein such as BMP
  • Figure 7b is a result showing the bone differentiation promoting effect by the BMP attached to the culture dish by the adhesive according to the present application.
  • 8A to 8C show the results of testing the safety of the peptides according to the present invention using osteoblasts (MC3TC-E1).
  • Figure 8d is a result of testing the safety of the peptides according to the present invention is isolated from the monocytes (monocytes) of the mouse after the peptide stimulation is investigated whether the induction of inflammation occurs.
  • FIG. 10A to 10C show that the adhesion progression of cells is promoted by A7-1 using hMSC.
  • the negative control group in FIG. 10A is still analyzed.
  • the actin-ring formation which is the initial stage of adhesion, is formed in a large number
  • stress fiber formation has already been observed in many cells after the step
  • FIG. 10B is a graph quantifying these observations.
  • 10c is a result of measuring the geometric shape (cell aspect ratio) of the cell attachment (a ratio of the cell width / vertical, 1 if it is a complete circle and the initial state of the attachment process).
  • the maturation ability is shown to be significantly matured.
  • Figure 11 is a result of measuring the promotion of cell adhesion appeared through the interaction between extracellular matrix, such as GAG and peptides having various sequences according to the present application.
  • the present application relates to an adhesive for coating various inorganic or non-biological substances on the inorganic surface, or coating the inorganic surface, or an adhesive or coating composition comprising the adhesive, including the peptide represented by the following formula (I).
  • X 1 is any polar, uncharged amino acid
  • X 2 , X 3 and X 4 are amino acids of any one of L, V, I, E and A, each being the same or different,
  • X 5 is an amino acid of K or R
  • N is an integer of 1 to 5, when n is 2 or more, the amino acid sequence of each peptide may be the same or different, and the amino acid is a natural or unnatural amino acid of D- or L- type or a derivative thereof.
  • amino acid refers to 20 naturally occurring and non-natural amino acids, amino acids that are modified after translation in vivo, such as phosphoserine and phosphothreonine; And other rare amino acids such as 2-aminoadipic acid, hydroxylysine, nor-valine, nor-leucine; It includes modifications to improve cell permeation or stability in vivo, and includes both the enantiomers of the D- and L-forms.
  • Positively charged amino acids, negatively charged amino acids, polar uncharged amino acids and nonpolar aliphatic amino acids herein are known in the art and those skilled in the art will be able to select appropriate ones.
  • the positively charged amino acid is K or R.
  • the negatively charged amino acid is D or E.
  • the polar uncharged amino acid is S, T, C, P, N or Q.
  • nonpolar aliphatic amino acid is G, A, L, V, M or I.
  • the former refers to compounds of the form found in cells, tissues or in vivo, the latter means that these compounds have been artificially modified for various purposes.
  • adhesion encompasses adhesion or adsorption, and includes reversible and irreversible adhesion, meaning that two different materials or surfaces of materials are in tightly coupled state to achieve the desired effect.
  • inorganic or inorganic surfaces are used interchangeably, and materials having a free distribution of electrons due to their good electrostatic conductivity or inorganic matter in a conventional sense that do not contain carbon, silicon, nitrogen, etc. are particularly hydrophobic materials.
  • metals such as precious metals including iron, copper, gold, silver and platinum, titanium or aluminum; Ceramics such as zirconia; Calcium apatite crystals such as hydroxyapatite; Polymer synthetic resins such as polyethylene; Glass; And combinations thereof, but is not limited thereto.
  • surface according to the present invention is interpreted in the widest range and is present in two-dimensional or more materials and is not limited to a specific shape or specific size. It includes the surface which has. For example, it is present in particles or materials on the nanometer to micrometer level, as well as on the order of several millimeters to several meters in size.
  • the compounds of formula (I) according to the invention can be used for the various purposes disclosed herein by varying the number of sequences as well as being involved in binding between surfaces as the first region.
  • the first region has hydrophobic properties and is involved in intermolecular hydrophobic bonds or hydrophobic bonds with cells, and it is a key region that can affect the secondary structure of the peptide and maintains the molecular characteristics of other functional regions described later. Let's do it.
  • the first region is composed of five amino acids, and one or more such units may be included. When two or more units are included, each unit may be different or the same.
  • the number of monomers can induce a variety of functionalizations for the preparation, storage, delivery of peptides or for the efficacy and use of the peptides according to the present application described below, in the process of which the monomers can be modified in various cases. For example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 Includes a dog.
  • X 1 in Formula (I) is any amino acid and in one embodiment is a polar uncharged amino acid, or in other embodiments is S, T, C, P, N or Q.
  • X 2 , X 3 and X 4 are each one of L, V, I, E and A, and each residue may be the same or different, and the X 2 -X 3 -X 4 sequence is for example AAA, EEE, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, LLV, etc., but is not limited thereto.
  • Formula I may be X 1 -LVV-X 5 , X 1 -AAA-X 5 or X 1 -EEE-X 5 .
  • sequence of Formula I is represented by QLVVK (SEQ ID NO: 1), QEEEK (SEQ ID NO: 2), QAAAK (SEQ ID NO: 3), NLVVK (SEQ ID NO: 4), or SLVVK (SEQ ID NO: 5).
  • the present application relates to a compound of Formula II, or a peptide further comprising at least one compound of Formula II below.
  • X 6 is an amino acid of any one of F, Y and W,
  • X 7 is an amino acid of K or R
  • X 8 is an amino acid of any one of A, M and I,
  • X 9 is an amino acid of any one of L, M and G,
  • X 10 is any amino acid
  • X 11 is an amino acid of any one of C, S and T,
  • One or more of X 7 and X 8 or X 10 and X 11 may be absent,
  • N 1 or 2
  • the compound of formula II may be linked to the amino terminus (N-terminus) or carboxy terminus (C-terminus), or both the N-terminus and C-terminus of the compound of Formula I.
  • the compound of formula II when present as a peptide single molecule, confers hydrophilic properties that can be easily dissociated into a sequence having the property of easily making an alpha-helix structure together with the first region.
  • At least one first region of formula (I) and at least one second region of formula (II) may be included, and arrangement thereof may vary.
  • at least one peptide of formula (I) and (II) is linked to each other to have a structure of the peptide of formula (I-II), formula (I)-(II)-(II), or
  • the peptides are linked one by one each sequentially, and they can be linked again to include a structure such as Formula I-Formula II-Formula I-Formula II, or Formula I-Formula II-Formula I, or Formula II- Formula I- may include a structure such as Formula II.
  • the order of Formulas I and II may be reversed.
  • the peptide of Formula II is FRALPC (SEQ ID NO: 6), FREEPC (SEQ ID NO: 7), FRVVPC (SEQ ID NO: 8), FEALPC (SEQ ID NO: 9), YRALPC (SEQ ID NO: 10), WRALPC (SEQ ID NO: Number 11), FRALP (SEQ ID NO: 12), FRAL (SEQ ID NO: 13), or FRPC (SEQ ID NO: 14).
  • a peptide of Formula (I) herein, or a peptide comprising both Formulas (I) and (II) may further include a third region represented by X 12 1-15 of Formula III at its N or C terminus, and X 12 is any amino acid that is positive or negatively charged.
  • the positively charged amino acid in Formula III is K or R.
  • the negatively charged amino acid in Formula III is D or E.
  • the polar uncharged amino acid of Formula III is S, T, C, P, N or Q.
  • the peptides herein may be selected from the group consisting of: RQLVVK (SEQ ID NO: 15); FRALPC (SEQ ID NO: 6); FRALPCRQLVVK (SEQ ID NO: 16); RQLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 17); RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 18); RQLVVKFRALP (SEQ ID NO: 19); RQLVVKFRAL (SEQ ID NO: 20); KQLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 21); RQKFRALPC (SEQ ID NO: 22); RQEEEKFRALPC (SEQ ID NO: 23); RQAAAKFRALPC (SEQ ID NO: 24); RQLVVKFRPC (SEQ ID NO: 25); RQLVVKFREEPC (SEQ ID NO: 26); RQLVVKFRVVPC (SEQ ID NO: 27); RQEEEKFREEPC (SEQ ID NO:
  • the peptides of the present disclosure can be selected, for example, from the group consisting of: RQLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 17); KQLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 21); RNLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 32); RSLVVKFRALPC (SEQ ID NO: 33); RQVVVKFRALPC (SEQ ID NO: 42); RQIVVKFRALPC (SEQ ID NO: 43); RQAVVKFRALPC (SEQ ID NO: 44); RQEVVKFRALPC (SEQ ID NO: 45); RQLLVKFRALPC (SEQ ID NO: 46); RQLIVKFRALPC (SEQ ID NO: 47); RQLAVKFRALPC (SEQ ID NO: 48); RQLEVKFRALPC (SEQ ID NO: 49); RQLVLKFRALPC (SEQ ID NO: 50); RQLVIKFRALPC (SEQ ID NO: 51); RQLVAKF
  • the peptide according to the present application is not limited to the above sequence, and includes biologically equivalents thereof. That is, additional modifications can be made to the amino acid sequence. Such modifications include, for example, deletions, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues. Such amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine Alanine, glycine and serine
  • Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.
  • conservative amino acid substitutions have occurred in a polypeptide according to the present disclosure.
  • Conservative amino acid substitutions mean substitutions that do not substantially affect or reduce the activity of a particular polypeptide. For example, conservative substitutions occur at one or more amino acid residues.
  • the present application includes the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 69 and those in which conservative substitutions have occurred.
  • the hydropathic index of amino acids can be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • hydrophobicity indexes are particularly important for imparting the interactive biological function of proteins. It is known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes can retain similar biological activity. When introducing mutations with reference to the hydrophobicity index, substitutions between amino acids which exhibit a hydrophobicity index difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1 and even more preferably within ⁇ 0.5 are advantageous.
  • hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+ 3.0 ⁇ 1); Glutamate (+ 3.0 ⁇ 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5 ⁇ 1); Alanine (-0.5); Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
  • Amino acid substitutions that do not alter the activity of the peptides according to the invention as a whole are also known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • substitutions are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thr / Phe And substitutions between Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • the amino acid sequence disclosed herein or the nucleic acid molecule encoding the same includes those having substantially the same identity as disclosed herein.
  • Substantial identity is at least 61% homology, more preferably, when aligning the sequence disclosed herein to any other sequence as closely as possible and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art.
  • the above-described peptide according to the present application may improve the stability by the C-terminus is substituted with a group such as a chemical non-reactive group, such as NH2.
  • Adhesives or adhesive compositions according to the invention allow for the adhesion of various materials to inorganic surfaces.
  • inorganic surfaces include materials having a free electron distribution due to excellent electrostatic conductivity or inorganic materials in a conventional sense that do not include carbon, silicon, nitrogen, and the like, particularly materials having a hydrophobic surface, such as metals, for example.
  • Precious metals titanium or aluminum, including iron, copper, gold, silver and platinum; Ceramics such as zirconia; Calcium apatite crystals such as hydroxyapatite; Polymer synthetic resins such as polyethylene; Glass; And combinations thereof, but is not limited thereto.
  • Adhesives or adhesive compositions according to the present disclosure allow for the adhesion of various materials, including biological and / or non-biological materials, to inorganic surfaces, for example, non-biological materials include metals, glass, plastics, metals or polymer composite resins.
  • non-biological materials include metals, glass, plastics, metals or polymer composite resins.
  • the biological material may include cells, tissues, proteins, lipids, sugars or nucleic acids, or a combination thereof.
  • the adhesion of the inorganic surface with an inorganic surface having the same or different properties or properties, or the adhesion of one inorganic material with a biologically derived material can be mediated.
  • the adhesive or composition according to the present invention may be used for the adhesion of inorganic materials such as metals, glass, plastics, polymer resins, or cell walls of yeast, including cell wall tissue (including lipopolysaccharide components) of cells, tissues, proteins or microorganisms, as well as the cell walls of yeast.
  • the component including (1,3) -betaglucan
  • the peptide according to the present invention shows a high affinity for proteoglycans and is a tissue component that forms cartilage, and has a wide application value in the field of tissue regeneration and is directly used in various clinical procedures including plastic surgery. It includes substances that become.
  • biologically derived materials or surfaces thereof, to which the adhesives or compositions herein may be applied include, for example, all copper, plants classified as living organisms, and some, such as cells, tissues, organs derived from such copper, plants It can be used for adhesion or coating to biological material surfaces.
  • the cells to which the peptides or compositions according to the present invention can be applied are not particularly limited, and can be applied to plant, insect and animal cells, for example, to animal cells, especially human derived cells.
  • it can be used for adhesion of multipotent cells, adult stem cells, progenitor cells, or progenitor cells.
  • multipotent cells include ES cells, GS cells, and iPS (induced pluripotent stem cells) cells.
  • Adult stem cells include mesenchymal stem cells (MSCs), hematopoietic stem cells, and neural stem cells.
  • progenitor cells include cells derived from skin, dermis, endothelial, epidermis, muscle, myocardium, nerve, bone, cartilage, brain, epithelium, heart, kidney, pancreas, spleen, oral cavity, cornea or hair.
  • human-derived cells include ES cell iPS cells, MSCs, chondrocytes, osteoblasts, bone precursor cells, mesenchymal cells, myoblasts, cardiomyocytes, neurons, hepatocytes, embryonic cells, fibroblasts, corneal epithelial cells and corneal endothelial cells.
  • Cells, vascular endothelial cells, and hematopoietic stem cells including but not limited to.
  • the cells may be autologous, taga derived.
  • peptides according to the present application may be modified with various compounds, for example, may be modified in a manner of binding various functional substances and the like to epsilon amino groups.
  • peptide adhesive or composition includes, but is not limited to, at least one inorganic surface (1) adhesion between substrates in water (water or saline water); (2) orthopedic treatments such as bone, ligament, tendon, meniscus and muscle treatments and artificial material implants; (3) ophthalmic conjugation such as treatment of perforation, fissures, incisions, etc., corneal transplantation, artificial corneal insertion; (4) dental abutments such as correction devices, dentures, crown mounts, rocking teeth fixation, broken tooth care and filler fixation; (5) surgical treatments such as vascular bonding, tissue bonding, artificial material implantation, wound closure; (6) cell or tissue culture comprising stem cells; (7) base materials of medical devices including artificial organs, dental, surgical or ophthalmic medical devices such as implants, bone fixatives, bone cages, guidewires, catheters and stents; (8) bone surfaces, titanium, ceramics, etc. (9) various biomaterials, including bioactive materials, for example bioactive materials, drugs, markers
  • the adhesives or compositions herein are used for dental, ophthalmic or orthopedic treatment for transplantation or reconstruction of cells or tissues for the treatment of a disease, in which case the surface to which the adhesive composition herein can be applied This includes, but is not limited to, PLGA, hydroxyapatite, zirconium, ceramics, titanium, iron, stainless steel, platinum, gold, or alloys.
  • the peptides or compositions herein are used for adhesion of cells to a support.
  • the cell adhesion surface or support herein includes cell culture dishes, microbeads, substrates, tissue implants, and the like, and can be used, for example, for culturing tissues or cells, in particular for culturing stem cells.
  • the peptide of the present application when using the peptide of the present application, it showed a significantly higher adhesion compared to the material used for conventional cell adhesion (see FIGS. 1, 2, 3, 4, 5 and 6, etc.).
  • the method of using the adhesive or the composition according to the present application is based on the method of using a conventional protein adhesive composition, and a representative method is an application method.
  • a representative method is an application method.
  • the specific usage, amount of use and formulation of the adhesive or composition according to the present application may refer to Cell-Tak (BD Biosciences, USA) which is a commercially available product.
  • composition according to the present application may be a solvent type, a water soluble type, a solventless type, and may be used at 0.1 to 1000 ng / mm 2 , especially 1 to 100 ng / mm 2 , based on the area of the surface to be applied, but is not limited thereto.
  • composition according to the present application may be adjusted with the adhesion and the amount of application according to the treatment with a surfactant, an oxidizing agent, a crosslinking agent, and / or a filler, or by adjusting the concentration of the peptide.
  • fillers are not limited to collagen, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, elastin, laminin, casein, hydroxyapatite, albumin, or fibronectin.
  • the present invention is also a coating, in particular an adhesive coating or a protective coating, containing the adhesive protein as an active ingredient.
  • the adhesive of the present invention has the property of adhering between non-biological materials such as glass, plastic, and polymer resin or between non-biological materials and biological materials, so that it can be used as a coating agent for such surfaces or substrates, and in particular, water and water resistance. Since it has, it is possible to prevent oxidation of the substrate by applying it to the surface of the substrate used in the aquatic environment.
  • Application examples of the protective coating include, but are not limited to, the use of a coating to prevent corrosion by applying to devices or appliances used in water, such as ships.
  • the adhesive, the composition or the coating agent according to the present invention may include only the adhesive protein alone, but other known adhesives, adhesive proteins other than the adhesive protein of the present invention, resins, organic solvents, surfactants, which are included in known adhesives or coating agents, It may further include a corrosion inhibitor or a pigment.
  • the content of the component to be included can be appropriately adjusted within the range generally acceptable according to the kind of component or the formulation of the coating agent.
  • the active protein, an adhesive protein is included in a content that can maintain adhesive activity in the coating, such as 0.01 to 80% by weight in the adhesive or coating.
  • the adhesive or coating composition of the present invention may be prepared in a creamy, aerosol (spray), solid, liquid or oil phase, but is not limited to the above formulation.
  • the present disclosure also relates to a method of adhering two or more material surfaces using an adhesive or adhesive composition according to the disclosure disclosed herein.
  • the method according to the present invention comprises the steps of treating the adhesive according to the present invention with a first material and / or a second material; And contacting the two materials under sufficient conditions for adhesion to occur so that the two materials can adhere, wherein at least one of the first or second material is an inorganic surface.
  • suitable conditions such as temperature, time , The composition of the medium in which the adhesion takes place may be determined.
  • the first or second material according to the present application may be treated in whole or in only one for attachment.
  • the adhesive or composition is treated on a mineral surface, such as a cell culture dish, and adding cells thereto causes the cells to adhere to the cell culture dish.
  • an adhesive or composition according to the present application may be added to a culture solution containing cells, and it may be added to a cell culture dish.
  • inorganic surfaces such as commercially available bone grafts can be coated with an adhesive according to the present application and attached useful biological materials such as osteogenic proteins.
  • a biological material useful for the adhesive according to the present invention may be conjugated and then attached to the inorganic surface.
  • Peptides used in the experiment was synthesized by the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) method was customized (Ruzen Sci, South Korea; Peptron, South Korea). In order to verify the reproducibility of the peptide effect, peptide synthesis was performed three times (ruzen) and two times (peptron) through two companies, and each compound was analyzed through independent experiments. The result was obtained.
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
  • the peptide of Example 1 is A7-1 (RQLVVKFRALPC; SEQ ID NO: 20) (corresponding to the 12mer (A) sequence of Table 2 below) is biotin (Thermo Scientific), and FITC (Sigma) to Cys, respectively, through the conjugate Gated. Subsequently, it was treated with glass, PCL, Ti, Col, Zr, vinyl, and PS fibers (each 10 ⁇ M in PBS, washed once with PBS after adsorption at room temperature for 20 minutes), and the adhesion was LAS (Fuji, Japan). Detection was by FITC fluorescence image measurement used. In order to liberate the biotin covalently bound to the peptide, a reduction reaction was induced by treatment with DTT (100 mM in PBS, washing once after 20 minutes at room temperature). Only dye was used as a control.
  • FIGS. 1A-1D The results are described in FIGS. 1A-1D, and the detection of the antibodies indicated that the biotin according to the present application was strongly adhered to the surface used in the experiment via the peptide according to the present application, in particular this effect disappeared by treatment of DTT (FIG. 1a), indicating that the biotin or FITC is attached to the glass through the peptides herein.
  • PBS Cys- or FITC-conjugate A7-1, or Cys or FITC dye was dissolved in PBS at a concentration of 10 ⁇ M, followed by 10-20 ⁇ l aqueous solution.
  • FIGS. 2A-2B The results are described in FIGS. 2A-2B, indicating that the peptides according to the present disclosure can adhere to non-living inorganic surface. These results show good adhesion of the peptides according to the present application to commercially available bone grafts.
  • the materials used in this experiment were as follows: 10 mM peptide solution (stock solution) in PBS; 35 mm diameter plastic hydrophobic cell culture dish (for cell culture, Corning); DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Cell Culture Medium: Hyclone); Fetal bovine serum (Hyclone); And C2C12 (mouse myoblast, cells, ATCC, CRL-1772); MC3T3-E1 (Mouse C57BL / 6 calvaria cell, ATCC, CRL-2593) and ST2 (bone marrow-derived stroma cell: EMBO J.
  • hDPSC Kerkis I et al., Cells Tissues Organs, 2006; 184: isolated from human tissue according to the method described in 105-16
  • mBMSC Primary Bone Marrow Stromal Cell from mouse
  • MC Primary Mouse Calvaria cell
  • MEF Mouse Embryonic Fibroblast
  • the experimental method is as follows.
  • Cell adhesion measurements were performed as follows. For cell adhesion, F-actin was observed for general observation through optical microscope, actin filament structure, and rough cell membrane boundary pattern, with PBS and poly-L-lysin coated as a negative control, when no peptide was added. Cell metabolism or DNA amount was measured for staining and confocal microscopy and quantification for adhesion. Metabolism was measured by absorbance using CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., USA), and the amount of DNA was measured using the Picogreen assay kit (Life Technologies, USA) according to the manufacturer's method. Measured. In order to quantify only adhered cells, non-bonded cells were discarded and washed twice with PBS, and only the cells attached to the surface were used for quantification of metabolic amount or DNA.
  • the peptides according to the present invention can be usefully used for adhesion of anchorage dependent cells of various origins, for example, primary cells, established cells and thawed cells, and feeder cells to cell culture dishes. Compared to PLL, a material used in the past, it showed an excellent effect. In the case of the existing product, the recommended concentration is 10 to 100 ⁇ g / ml, whereas the peptide according to the present invention can be used at a concentration of 0.32 to 1.6 ⁇ g / ml.
  • the residues after coating should be removed by washing due to the strong toxicity, while the peptides according to the present invention are not easily washed. It is not necessary and can be used by mixing in the medium as described above.
  • cyclohexamide (CHX) (10 ⁇ M, 37 °C 1 hour) or GAG (glycoaminoglycan) treatment known to inhibit protein synthesis was tested for adhesion as described above.
  • ECM extracellular matrix
  • GAG glycoaminoglycan
  • GAG glycoaminoglycan
  • GAG such as heparan sulfate, heparin, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, and other major constituents of the proteoglycan
  • GAG glycoaminoglycan
  • it is a major component of ECM, it not only maintains the morphology of cells by maintaining the structural integrity of ECM, but also regulates cell adhesion and cell polarity. This function of ECM not only induces the adaptation of cells to the environment, but also has a complex function of directly regulating a complex series of metabolic processes and regulating various physiological roles.
  • the molecular affinity of the peptides for proteoglycans can be determined by treating (i) affinity chromatography, (ii) cell adhesion through competitive binding using purified GAG components, and (iii) enzymes that specifically degrade ECMs comprising GAG components. Inhibition of cell adhesion promotion by peptides was verified through the above three methods. In the case of enzyme treatment, hyaluronidase (hyaluronidase (Sigma)) and collagenase (collagenase (Sigma)) were treated. Purified GAG used hyaluronan (Sigma), chondroitin sulfate (Sigma), heparin (Sigma), heparan sulfate (Sigma), respectively.
  • Heparin-agarose beads Biovision
  • GlcNAc-agarose beads Sigma were used for chromatography, respectively.
  • 10ng FITC-labeled peptide (F-peptide) in PBS-T solution was reacted with Heparin-Agarose beads and GlcNAc-Agarose beads pre-coated with BSA for 10 minutes at room temperature and then washed three times in PBS-T solution. After suspended again in PBS solution, the fluorescence was measured.
  • FITC unlabeled peptides Cold were added by 1: 1, 1:10 (10-fold) and 1: 100 (100-fold), respectively, and reacted with beads, and fluorescence was measured.
  • the following shows the inhibition of cell adhesion by adhesive peptides by competitive inhibition method by GAG treatment.
  • Cell adhesion was significantly inhibited when heparin, heparan sulfate, and chondroitin sulfate were added. .
  • Fibril proteins such as collagen as well as proteoglycans that comprise ECMs include GAGs.
  • the cell adhesion promoting ability by peptides was examined by hydrolyzing collagen containing GAG or by treating hyaluronidase that hydrolyzes hyaluronan, one of GAGs. This also indicates that the promotion of cell adhesion by peptides correlates with GAG.
  • the A7-1 peptide (10 ⁇ M) or soluble RGDS peptides (0, 10, 100 and 1000 ⁇ M) together with the cells in a test tube was competitively treated with an anchorage dependent cell (MC3T3-E1) for 10 minutes and then cultured. After transfer to the dish it was further induced to bond in a thermostat for 10 minutes. After 10 minutes, the culture medium was removed again and washed twice with PBS solution to remove the remaining unbonded cells, and mixed with fresh medium containing no peptide and CCK-8 (Dojindo) for 1 hour in a thermostat and then 450nm Absorbance was measured at. Absorbance was measured by blanking the medium mixed with CCK-8.
  • Peptide was coated on the culture material at 100 ⁇ M level or nanostructures were prepared to investigate the adhesion and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells as follows.
  • hESC-media general culture composition, purchased from Gibco BRL
  • mTeSR hES-only medium, purchased from Stem cell technology
  • Essential 8 hES-only medium, purchased from Gibco BRL
  • the cells were incubated under serum exclusion culture medium containing only 10 ng / ml bFGF (a condition for preventing the cell's adhesion from being inhibited by serum). Analyzed.
  • the cells were treated with a colony culture method and 0.25% trypsin-EDTA to analyze the culture method using a single cell.
  • hESC matrigel
  • miPSC gelatin
  • the cells were plasmids having a structure capable of measuring the activity of the Oct4 gene as an indicator of the stem cells of embryonic stem cells described in FIG. 5A (Szabo et al., 2002, Mechanisms of Development Vol. 115: 157-160 ) was analyzed by fluorescence microscope (FIG. 5).
  • the expression of Alp and Nanog genes which are markers of pluripotency, were observed by fluorescence microscopy by staining with specific antibodies, and whether cell adhesion was improved in hES cell culture was also examined (FIG. 6).
  • FIGS. 5 and 6 The results are described in FIGS. 5 and 6. As shown in FIG. 5, the peptides of the present disclosure have been shown to mediate adhesion of iPSCs while maintaining predifferentiation in both cases, either precoated or added in a mixed manner to the culture (FIG. 5B). . In addition, in the case of day 4 cell culture, the peptide according to the present invention was shown to mediate the adhesion of iPSC and also maintain the pluripotency (FIG. 5C).
  • the peptide according to the present application was shown to mediate the adhesion of the iPSC and to maintain the pluripotency even when precoated or mixed with the culture medium, even in experiments using hESC feeder cells or Matrigel (Matrigel) mediated the adhesion of cells without the external environmental changes and also appeared to maintain the pluripotency (Fig. 6c).
  • Peptides synthesized in Example 1 were used at a concentration of 10 ⁇ M (in PBS); Plastic cell culture dish with a area of 1.9 cm 2 (24-well plate, manufactured by Corning); DSS (Disuccinimidyl suberate, C 16 H 20 N 2 O 8 , Thermo Scientific Inc.); Recombinant human BMP2 (rhBMP2, BD bioscience); DMSO (Dimethyl sulfoxide, solvent for dissolving DSS, Sigma-Aldrich); Tris-HCl, pH7.0 (Stop solution); Phosphate buffered saline, reaction solution;
  • FIG. 7A The analysis concept is shown schematically in FIG. 7A.
  • a cross-linking agent to connect various substances having the desired bioactivity to the peptide of the present application, for example, therapeutic proteins such as BMP, due to the adhesion of the peptide of the present application, The concentration of the therapeutic protein can be increased, and the therapeutic effect can be maximized.
  • the experimental method is as follows.
  • the peptide-rhBMP2 cross-linking reaction was carried out following the method of the cross-linker manufacturer used basically, and in summary, the process was as follows: (i) Peptide coating: cell culture dish 200 ⁇ l of peptide solution (10 ⁇ M of the peptide of Example 1 in PBS solution) were aliquoted and adsorbed at 4 ° C. for 18 hours; (ii) Formation of DSS-BMP2 complex: 20 molar excess of DSS against rhBMP2 was induced for 1 hour in 100 ⁇ l of reaction solution. The rhBMP2 per area of 1.9cm 2 was adjusted to 300ng level.
  • the safety of the peptides according to the invention was tested using osteoblasts (MC3TC-E1).
  • the peptide A7-1 according to the present invention synthesized in Example 1 was treated with osteoblasts at concentrations of 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M and 100 ⁇ M, followed by proliferation (FIG. 8A), survival (FIG. 8B) and differentiation capacity (FIG. 8C).
  • proliferation FIG. 8A
  • survival FIG. 8B
  • differentiation capacity MC3T3-E1 cell line or C2C12 cell line was used, and the cell line was stimulated with bone constituent medium (6 days treatment) and BMP2 (rhBMP2, 10ng / ml, 3 days treatment).
  • Subject differentiation was induced and differentiation effect was performed through cell staining. Results are shown in Figures 8a to 8c, it did not appear to affect the proliferation rate, survival rate, differentiation according to the concentration.
  • FIG. Figure 9 is spinal cord-derived neurons coated with a conventional peptide (laminin) and poly-L- ornithin (poly-L-ornithin) and coated with A7-1 according to an embodiment of the present application After incubation using a culture plate, the results were analyzed by CCK-8 at each time zone. A7-1 coated (adsorption) conditions showed a significant difference in adhesion.
  • A7-1 peptide was coated on glass sterilized coverslips at 100 ⁇ M level, followed by incubation of MSC cells (Mesenchymal Stem Cells) for 6 hours, followed by fluorescence staining reagents on actin fibers. Cells were stained using Rhodamine Phalloidin dye (Life Technology Cat. # R415) and DAPI (Sigma D9542) dye, which stains the nucleus of the cells, and analyzed by confocal microscopy. . At this time, the cells were adhered to the coverslips not coated with the A7-1 peptide as a negative control and compared.
  • FIG. 10A the negative control group still has a large number of actin-ring formations, which are the initial adhesion stages, but in the case of the A7-1 treatment group, stress fiber formation has already been observed in a large number of cells.
  • 10b is a graph quantifying these observations
  • Figure 10c is a cell aspect ratio (cell aspect ratio: the ratio of cells to cell, 1 is a perfect circular shape and the initial state of the adhesion process Prager-Khoutorsky et al., 2011. See Nature Cell Biology 13, 1457-1465), showing excellent maturation of adhesion in the treated group of A7-1.
  • the peptide of the present invention has an effect even when the first region, the second region, and the third region are arranged in various combinations or when the sequence of each region is substituted with an amino acid as defined herein. .
  • RQLVVKFRALPC SEQ ID NO: 17 sequence designated as A sequence in Table 2, the following sequence is generated in consideration of the chemical properties, the size, the charge characteristics, and / or the experimental results of Table 2, and the like. The results are shown in the next column. The part shown in bold is a substituted part and the degree of the effect predicted compared with the experiment result using RQLVVKFRALPC of Example 11 was expressed by the number of +.
  • the part shown in bold in the sequence column of Table 3 is a substituted part in comparison with the A sequence, and the results not shown in bold in the adhesion column are shown based on the results of Example 11 and FIG. 11 and are indicated in bold. Letters are the predicted results based on the substitutions and experimental results.

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Abstract

본원은 신규한 서열의 단백질 접착제를 개시한다. 본원에 따른 단백질 접착제는 두 개의 비생물학적 물질간 또는 비생물학적 물질과 생물학적 물질간의 부착이 가능하여 다양한 분야에 적용될 수 있다.

Description

무기물 표면 접착 또는 코팅용 단백질 접착제
단백질 또는 펩타이드 기재의 접착 물질에 관한 것으로, 다양한 생물학적 또는 비생물학적 물질을 무기물 표면에 접착할 수 있는 기술과 관련된 것이다.
동일 또는 상이한, 특히 상이한 구조의 두 가지 물질 또는 표면의 접착은 다양한 분야에서 필요로 하는 매우 중요한 과정이다. 하지만 접착 과정에서 발생하는 문제는 접착하고자 하는 물질의 종류에 따라서 문제의 본질이 다 다른 특징이 있다.
특히 문제가 많은 영역은 의학/생물학 분야로서, 아주 작은 크기의 마이크로 또는 나노 크기의 물질의 접착이 필요하다. 의학분야에서 접착은 절개 또는 손상 부위의 봉합, 골절된 뼈의 접합, 각막 접착 등을 포함하며, 치과 분야에서도 충치 치료, 실란트 시술 및 잇몸 수술 등에 사용될 수 있다.
이러한 환경에서 접착은 물 또는 물이 있는 습윤한 상태에서의 접착이 가능해야 하는 것은 물론이고, 작은 크기의 성분이 관여하기 때문에 사용되는 접착제의 양이 적은 것이 유리하다. 아울러 의학 또는 생물학 분야에서 사용되는 접착제는 세포, 조직 또는 생물체의 사용에 안전해야 하는 것으로, 염증 또는 독성 반응을 일으키지 않는 생물학적 적합성과 나아가 생분해성의 조건을 갖추어야 한다.
하지만 시중에서 판매되는 거의 모든 접착제는 환경 및 인체에 해로울 수 있는 화합물을 기반으로 한 것이다. 따라서 이를 대체하면서도 환경에 유해하지 않은 안전한 바이오 기반의 접착제가 필요하다.
대표적인 바이오 기반의 접착제는 홍합(Mytilus, Marine mussels) 단백질인 mefp1을 이용한 접착제이다 (Waite, J. H. Int. J. Adhes. Adhes., 1987. 7(1): p. 9-14; Yamamoto, H., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 1996. 13: p. 133-65; 및 US 7,622,550). 이들의 접착력은 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)-DOPA 가교가 관여하는 것으로 알려져 있다 (Deming, T. J., Polymeric Materials: Science and Engineering, 1999. 80: p. 471-472.).
아울러 홍합 단백질 기재의 접착제를 모방하는 물질도 개발되었다. 예를 들면 DNA 재조합기술을 이용하여 향상된 접착성 단백질을 생산하거나 DOPA-함유 펩타이드를 합성하는 기술이 개시되었다 (Filpula, D. R., et al., Biotechnol. Prog., 1990. 6(3): p. 171-7; 및 Yu, M. and T. J. Deming, Macromolecules, 1998. 31(15): p. 4739-45.).
그 외 US 8,845,851 및 US 2010-0089287은 콩단백질을 이용한 단백질 접착 조성물을 개시한다.
하지만 다른 종류의 단백질을 기반으로 하는 다양한 환경에서의 적용이 가능한 접착성이 향상된 새로운 단백질 기재 접착제 또는 접착 조성물의 개발이 필요하다.
본원에서는 다양한 환경에서 다양한 물질을 무기물 표면에 적용이 가능한 신규한 서열의 폴리펩타이드를 포함하는 접착제를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 하기 화학식 I의 펩타이드 또는 그 유도체를 포함하는 무기물 표면에의 접착 또는 코팅용 접착제 또는 접착 또는 코팅 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
[X1 - X2 - X3 - X4- X5]n
상기 화학식 I에서
상기 X1 은 임의의 아미노산이고,
X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E 및 A 중 어느 하나의 아미노산이며, 각각 동일 또는 상이하며, X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 n은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
본원에서 아미노산 잔기는 단일문자코드(single letter code)로 나타내며 약어는 다음과 같다: A, 알라닌; R, 알지닌; N, 아스파라진; D, 아스파르트산; C, 시스테인; E, 글루탐산; Q, 글루타민; G, 글라이신; H,히스티딘; I, 아이소루인신; L, 루이신; K, 라이신; M, 메티오닌; F, 페닐알라닌; P, 프롤린; S, 세린; T, 트레오닌; W, 트립토판; Y, 타이로신; V, 발린; B, 아스파라진, 아스파르트산; Z, 글루타민,글루탐산; X, 임의의 아미노산.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 화학식 I의 X1에서 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q일 수 있다.
다른 구현예에서 상기 화학식 I에서 X2- X3- X4 서열은 예를 들면 AAA, EEE, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, LLV 일 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 따른 화학식 I의 펩타이드는 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5)이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 II의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
[화학식 II]
[X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
상기 화학식 II에서
X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
X10 는 임의의 아미노산이고,
X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X7 및 X8 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 화학식 I에서 상기 X2 , X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고, 상기 화학식 II의 화합물은 상기 화학식 I의 화합물의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결된 것이다.
또 다른 구현예에서 화학식 II의 펩타이드는 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14)이다.
또 다른 구현예에서 상기 화학식 I 및/또는 II의 화합물은 하기 화학식 III의 화합물을 N 또는 C 말단, 또는 N 및 C 말단에 추가로 포함할 수 있으며, 일 구현예에서 화학식 III, 화학식 I 및 화학식 II의 순서로 연결될 수 있다
[화학식 III]
X12 1-15 으로, 상기 X12는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산으로, 일 구현예에서 상기 양하전된 아미노산은 K 또는 R이고, 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
본원에 따른 접착제 또는 접착 조성물은 다양한 물질을 무기물 표면에의 접착을 가능하게 한다. 이러한 무기질 표면은 우수한 정전기적 전도성으로 인해 전자의 분포가 자유로운 물질 또는 탄소, 실리콘 또는 질소 등을 포함하지 않는 통상적 의미에서의 무기물로서 특히 표면이 소수성인 물질을 포함하며, 그 예로는 금속 예를 들면 철, 구리, 금, 은 및 백금을 포함하는 귀금속, 티타늄 또는 알루미늄; 세라믹 예를 들면 지르코니아; 칼슘인회석 결정 예를 들면 하이드록시 아파타이트; 고분자합성수지 예를 들면 비닐, 폴리스티렌, 폴리에틸렌; 유리; 및 이들의 조합체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 접착제 또는 접착 조성물은 생물학적 및/또는 비생물학적 물질을 포함하는 다양한 물질의 무기질 표면에의 접착을 가능하게 하며, 예를 들면 비생물학적 물질은 금속, 유리, 플라스틱, 금속 또는 고분자합성수지를 포함하고, 상기 생물학적 물질은, 세포, 조직, 단백질, 지질, 당 또는 핵산 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 접착제 또는 접착조성물을 이용한 적어도 하나의 무기물 표면을 포함하는 두 개 표면을 접착하는 방법을 개시한다.
본원에 따른 펩타이드는 안전하면서도 접착효과가 우수한 생접착물질로서, 생물학적 및 비생물학적 물질을 포함하는 다양한 물질 또는 표면을 무기물 표면에 접착하는데, 또는 무기물 표면의 코팅에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 접착제 또는 조성물 또는 방법은 물기가 있는 상태에서의 접착이 가능한 것은 물론이고, 염증 또는 독성 반응을 일으키지 않는 생물학적 적합성이 있다.
도 1a 내지 도 1d는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드(A7-1)의 비생체유래 또는 비생물학적 물질로서 유리(Glass), 지르코늄(Zr), 비닐(Vinyl), 폴리스티렌 파이버(PS fiber), PCL(Polycaprolactone), 티타늄(Ti) 및 콜라겐(Col)에 대한 접착성을 나타내는 결과이다.
도 1a는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드를 유리에 접착시킨 후, 이에 이황화 결합을 통해 결합된 바이오틴의 검출을 통해, 본원 펩타이드의 유리에의 접착성을 조사한 결과로, 바이오틴의 신호는 본원 펩타이드가 유리에 접착되었음을 나타내며, 이러한 결과는 DTT(dithiothreitol)의 처리로 이황화결합을 분해시 사라져, 이는 상기 결합이 이황화 결합에 의존하는 것을 나타낸다.
도 1b는 도 1a의 실험을 수행하기 위해 사용된 방법을 도식적으로 나타낸 것으로, 유리 접착된 본원의 펩타이드는 SH 기를 통해 표지물질인 바이오틴(Biotin)과 연결되고, 바이오틴은 항체로 검출될 수 있으며, 이는 바이오틴을 펩타이드로부터 분리시키는 DTT의 처리로 인해 사라지는 결과를 나타낸다.
도 1c는 도 1a에 기재된 방법과 동일하나 바이오틴 대신에 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 사용하여, 다양한 비생체 유래 물질 표면에의 접착성을 분석하는 실험을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1d는 분석결과를 나타내며, 본원의 펩타이드가 다양한 비생체 유래 물질의 표면에 접착성을 가짐을 나타내는 것으로 좌측부터 PBS(phosphate buffer saline), FITC-컨쥬게이트 A7-1, 그리고 FITC 염료를 각 각 재료에 접착시킨 후 형광이미지를 분석한 결과이다.
도 2a는 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 합성 골이식재인 Bio-OSS®(Geistlich Pharma, Inc)의 표면에 대한 접착성 실험을 수행한 결과로, 본원에 따른 펩타이드의 상용화 골이식재에의 우수한 접착성을 나타낸다.
도 2b는 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 합성 골이식재인 MBCPTM(Biomatlante, Biphasic calcuim phosphate)의 표면에 대한 접착성 실험을 수행한 결과로, 본원에 따른 펩타이드의 상용화 골이식재에의 우수한 접착성을 나타낸다. 사용된 형광현미경 배율은 200배이다.
도 3a는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포인 MC3T3-E1의 배양접시에의 접착성 실험을 수행한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군(PBS로 처리)과 비교하여, 거친 세포막 경계형태를 나타내며, 이는 본원 펩타이드에 의해 세포와 같은 생물학적 물질의 배양접시와 같은 비생물학적 물질의 접착성을 증가시키는 것을 나타낸다.
도 3b는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포(MC3T3-E1)의 소수성 배양접시에의 접착능을 나타낸 결과로서, 기존의 세포 접착능 향상에 사용되는 물질인 PLL(poly-L-lysin)과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군(PBS로 처리 및 PLL)과 비교하여, 접착성이 증가된 것을 나타낸다. 이러한 소수성 배양접시에서의 접착능은 소수성성질을 띠는 다양한 조직이식재료(PCL 등)가 가지는 세포접착의 단점을 보완할 수 있어, 산업적 응용가치가 높음을 나타내는 것이다.
도 3c는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포(ST2)의 소수성 배양접시에의 접착능을 매체 대조군과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군과 비교하여, 접착성이 증가된 것을 나타낸다.
도 3d는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포(C2C12)를 해동한 후, 이의 배양접시에의 접착능을 매체 대조군과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군과 비교하여, 배양접시에의 접착성이 증가되었다. 특히 해동직후 세포의 접착능은 세포의 생존에 매우 중요한 영향을 미치며 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드 접착제가 해동 후 세포의 사멸을 최소화하기 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 일차세포(primary cell)의 배양 분야에서 유용하게 사용될 수 있어 산업적 응용가치가 높음을 나타낸다.
도 3e는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 마이토마이신 처리된 STO 피더(feeder) 세포의 친수성 배양접시에의 접착능을 음성 대조군(Mock) 및 젤라틴과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 음성 대조군 및 젤라틴과 비교하여, 접착성이 증가되었음을 나타낸다.
도 3f는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 본 도면에 표시된 다양한 세포(확립 세포주 및 일차 세포)의 소수성 배양접시에의 접착능을 세포대사 측정을 이용하여 음성 대조군(Mock) 과 비교한 결과이다. 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드는 다양한 종류의 세포에서 음성 대조군과 비교하여, 그 접착성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
도 4b 내지 도 4c는 본원에 따른 펩타이드의 세포 접착능의 기전을 규명한 분석 결과이다.
도 4b는 펩타이드 세포접착 촉진 기전으로 GAG 또는 콜라겐과의 연관성을 분석한 결과로, 위의 도면은 콜라겐과 GAG 모두에 관련되어 있다는 결과로 효소처리에 의해 잠정적 표적을 분해함으로써 나타나는 현상을 관찰한 것이다. 콜라게나제처리에 의한 세포접착의 감소는 적어도 콜라겐과의 상호작용. 그리고 히알루로니다제 처리는 적어도 헤파린 설페이트를 가수 분해함으로써 세포접착이 감소했으며, 이는 GAG 중 헤파린 설페이트와 펩타이드의 상호작용을 나타낸다. 아래 도면은 GAG와의 관련성을 분석한 결과로 헤파린 및 C-설페이트를 첨가한 결과 A7-1을 통해 촉진되는 세포접착능이 농도의존적으로 현저히 감소하였으며, 이러한 결과는 A7-1의 세포접착능과 GAG와의 관련성을 나타내는 것이다. GAG 농도 변화는 다양한 질환과 관련성이 보고되어 있어, 본원에 따른 펩타이드는 신규한, GAG 결합성/접착성이 있는 펩타이드로서 혈액내 GAG를 조절하는 새로운 펩타이드 또는 GAG를 표적화하는 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
도 4c는 A7-1과 용해성 RGDS 펩타이드를 경쟁적으로 처리한 결과로 A7-1 비처리군에서는 용해성 RGDS를 처리할 경우 분착분자인 인테그린(integrin)에 우선적으로 결합하여 바닥(기질에) 대한 접착능을 유의미하게 감소시키지만, A7-1처리군에서는 RGDS를 처리함에도 세포의 접착에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 A7-1은 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가짐을 나타내는 것이다.
도 5a는 본원에 따른 펩타이드의 유도만능줄기세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)에 대한 접착능 향상을 측정하기 위해 제작된 리포터 시스템 및 이를 이용한 실험 절차를 도식적으로 나타낸 것으로, 상기 리포터 시스템은 유도만능 줄기세포의 전분화능(Stemness)의 지표로 Oct4 유전자의 활성을 측정할 수 있는 구조를 포함한다.
도 5b는 도 5a에 따른 구축물을 이용하여 마우스 유도만능 줄기세포의 접착 및 전분화능 유지를 세포 배양 2일 및 3일째에 Oct4의 발현여부 검출로 측정한 결과로, 대조군으로서 피더세포 및 젤라틴으로 미리 코팅된 배양접시를 사용하였으며, 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드는 미리 코팅(precoated)되거나 또는 배양액에 혼합(Mixed)되는 방식으로 추가되었으며, 두 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 5c는 도 5b와 동일하나, 세포배양 4일째에 측정한 결과로 본원에 따른 펩타이드는 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 6a는 전분화능을 나타내는 다른 마커인 Alp(alkaline phosphotase) 유전자의 발현을 염색을 통해 관찰한 결과로, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 6b는 전분화능을 나타내는 다른 마커인 Nanog 유전자의 발현을 염색을 통해 관찰한 결과로, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 6c는 도 6c와 동일한 실험이나 hESC를 이용한 실험결과이며, hESC에 대해서도 피더세포 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외부환경적 변화 없이도 잘 성장할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 7a는 본원에 따른 접착제를 이용하여 무기물 표면에 생활성을 갖는 물질의 예로서 BMP과 같은 치료용 단백질의 부착을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 7b는 본원에 따른 접착제에 의해 배양접시에 부착된 BMP에 의한 골분화 촉진 효과를 나타내는 결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 본원에 따른 펩타이드의 안전성을 조골세포(MC3TC-E1)를 이용하여 테스트한 결과이다.
도 8d는 본원에 따른 펩타이드의 안전성을 테스트한 결과로 마우스의 단핵구(monocyte)를 분리한 후 펩타이드 자극을 가한 후 염증 유도가 발생하는지 조사한 결과이다.
도 9는 기존의 접착성 펩타이드와 효과를 비교한 결과로 척수 유래의 신경세포를 기존의 펩타이드로 라미닌(laminin)과 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithin)으로 코팅된 배양접시 및 본원의 일 구현예에 따른 A7-1으로 코팅된 배양접시를 사용하여 배양한 후 각 시간대별로 CCK-8을 분석한 결과이다. 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드가 기존의 것과 비교해 월등히 우수한 접착능을 가짐을 나타내는 것이다.
도 10a 내지 10c는 hMSC를 이용하여 세포의 접착진행과정(adhesion progression)이 A7-1에 의해 촉진됨을 규명하는 결과로써 세포배양 후 6시간을 기준으로 분석한 결과로, 도 10a에서 음성대조군은 여전히 부착초기단계인 actin-ring 형성이 다수를 이루고 있지만, A7-1 처리군의 경우 이미 그 단계를 지나 스트레스 파이버 형성이 다수의 세포에서 관찰되었으며, 도 10b는 이러한 관찰결과를 정량한 그래프이며, 도 10c는 세포 부착에 따른 기하학적 양태(geometric shape) (cell aspect ratio: 세포의 가로/세로의 비율, 1일 경우 완전한 원형이며 부착과정의 가장 초기 상태로 나타냄)를 측정하여 나타낸 결과로써 A7-1의 처리군에서 월등히 성숙된 접착능을 보여 준다.
도 11은 본원에 따른 다양한 서열을 갖는 펩타이드와 GAG와 같은 세포외 기질간의 상호작용을 통하여 나타나는 세포 접착능 촉진을 측정한 결과이다.
한 양태에서 본원은 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드를 포함하는, 다양한 생물학적 또는 비생물학적 물질을 무기물 표면에 접착, 또는 무기물 표면을 코팅하는 접착제 또는 상기 접착제를 포함하는 접착 또는 코팅 조성물에 관한 것이다.
[화학식 I]
하기 화학식 I의 펩타이드:
[화학식 I]
[X1 - X2 - X3 - X4- X5]n
상기 화학식 I에서
X1은 극성의 비하전된 임의의 아미노산이고,
X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E 및 A 중 어느 하나의 아미노산이며, 각각 동일 또는 상이하며,
X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 n은 1 내지 5의 정수이며, 상기 n이 2 이상인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이할 수 있으며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
본원에 사용된 용어 아미노산은 20개의 천연에서 발견되는 아미노산 및 비천연 아미노산, 생체내에서 번역 후에 변형되는 아미노산 예를 들면 포스포세린 및 포스포쓰레오닌; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 노르-발린, 노르-루이신과 같은 기타 희귀 아미노산; 세포 투과 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함하며, 거울상 이성질체인 D- 및 L-형태를 모두 포함하는 것이다. 본원에서 양하전 아미노산, 음하전된 아미노산, 극성의 비하전된 아미노산 및 비극성의 지방족 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 양하전된 아미노산은 K 또는 R이다.
다른 구현예에서, 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
또 다른 구현예에서 상기 극성의 비하전된 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
또 다른 구현예에서 상기 비극성의 지방족 아미노산은 G, A, L, V, M 또는 I이다.
본원에서 사용된 용어 천연 및 비천연에서 전자는 세포, 조직 또는 생체내에서 발견되는 형태의 화합물을 칭하는 것이고, 후자는 이러한 화합물에 다양한 목적을 위해 인위적 변형이 가해진 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 서로 교환적으로 사용되며, 아미노산의 단위체가 공유결합으로 연결된 분자를 일컫는 것이다. 이는 원(native) 아미노산 또는 그 분해 산물, 합성 펩타이드, 재조합 방식으로 제조된 펩타이드, 펩타이드 모방체(전형적으로 합성 펩타이드), 및 펩토이드 및 세미펩토이드와 같은 펩타이드 유사체와 세포 투과 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, N-말단 변형, C-말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함한다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.
본원에서 용어 접착은 부착 또는 흡착을 포함하는 것으로, 가역적, 비가역적 접착을 포함하며, 서로 다른 두 개의 물질 또는 물질의 표면이 목적하는 효과를 달성하기 위해 긴밀하게 연계된 상태로 있는 것을 의미한다.
본원에서 무기물 또는 무기질 표면은 상호 교환적으로 사용되며, 우수한 정전기적 전도성으로 인해 전자의 분포가 자유로운 물질 또는 탄소, 실리콘 또는 질소 등을 포함하지 않는 통상적 의미에서의 무기물로서 특히 표면이 소수성인 물질을 포함하며, 그 예로는 금속 예를 들면 철, 구리, 금, 은 및 백금을 포함하는 귀금속, 티타늄 또는 알루미늄; 세라믹 예를 들면 지르코니아; 칼슘인회석 결정 예를 들면 하이드록시 아파타이트; 고분자합성수지 예를 들면 폴리에틸렌; 유리; 및 이들의 조합체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 용어 표면은 가장 넓은 범위에서 해석이 되며 2차원 이상의 물질에 존재하는 것으로 특정 모양, 특정 크기로 한정되는 것이 아니며, 특정 단위체 또는 분자수준의 물질에 존재하는 표면은 물론, 이들로 이루어진 물질이 갖는 표면을 포함하는 것이다. 예를 들면 나노미터 내지 마이크로미터 수준의 입자 또는 물질에 존재하는 것은 물론 수 밀리미터 내지 수 미터 크기의 수준도 포함하는 것이다.
본원에 따른 화학식 I의 화합물은 제 1 영역으로써 표면간의 결합에 관여할 뿐만 아니라 서열의 갯수를 다양하게 적용함에 따라 본원에 개시된 다양한 목적에 사용될 수 있다. 제 1 영역은 소수성 특성을 가짐으로써 표면의 분자간 소수성결합, 또는 세포와의 소수성 결합에 관여하며, 펩타이드의 2차구조에 영향을 줄 수 있는 핵심 영역으로써 후술하는 다른 기능영역의 분자특성을 잘 유지하게 해준다.
본원에 따른 펩타이드에서 제 1 영역은 5개의 아미노산으로 구성되며, 이러한 단위체가 한 개 이상 포함될 수 있으며, 두 개이상 포함하는 경우, 각 단위체는 상이하거나 동일할 수 있다. 단위체의 개수는 펩타이드의 제조, 보관, 전달 또는 후술하는 본원에 따른 펩타이드의 효능과 용도를 위해 다양한 기능화 (functionalization)를 유도할 수 있는데, 이 과정에서 단위체는 다양한 경우의 수로 변형될 수 있다. 예를 들면 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 1개를 포함한다.
화학식 I에서 X1 은 임의의 아미노산이고, 일 구현예에서는 극성의 비하전된 아미노산, 또는 다른 구현예에서는 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
화학식 I에서 X2, X3 및 X4 는 각각 L, V, I, E 및 A중 하나로, 각 잔기는 동일 또는 상이할 수 있으며, X2- X3- X4 서열은 예를 들면 AAA, EEE, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, LLV 등 일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 화학식 I은 X1-LVV-X5 , X1-AAA-X5 또는 X1-EEE-X5 일 수 있다.
일구현예에서 화학식 I의 서열은 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5) 로 표시된다.
다른 측면에서 본원은 하기 화학식 II의 화합물, 또는 상기 화학식 I의 화합물에 하나 이상의 하기 화학식 II의 화합물을 추가로 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 II]
[X6- X7- X8- X9 X10-X11]n,
상기 화학식 II에서
X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
X10 는 임의의 아미노산이고,
X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X7 및 X8 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고,
상기 화학식 II의 화합물은 상기 화학식 I의 화합물의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결될 수 있다.
본원에 따르면 상기 화학식 II의 화합물은 제 2 영역으로서, 펩타이드 단일 분자로써 존재할 경우 제 1 영역과 함께 알파-헬릭스 구조를 쉽게 만들 수 있는 특성을 지닌 서열로 쉽게 해리될 수 있는 친수성 특성을 부여한다.
화학식 I의 제 1 영역과 화학식 II의 제 2 영역은 각각 1개 이상 포함될 수 있으며, 그 배열도 다양할 수 있다. 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개 이상씩 연결되어, 화학식 I- II의 펩타이드, 화학식 I-화학식 I-화학식 II-화학식 II의 구조를 갖거나 또는 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개씩 순차적으로 연결되고, 이 것이 다시 연결되어, 화학식 I-화학식 II-화학식 I-화학식 II 과 같은 구조를 포함할 수 있거나, 또는 화학식 I-화학식 II- 화학식 I, 또는 화학식 II-화학식 I- 화학식 II와 같은 구조를 포함할 수 있다. 상기 구조에서 화학식 I 및 II의 순서가 바뀔 수 있다.
본원의 일 구현예에서 상기 화학식 II의 펩타이드는 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14)로 표시된다.
다른 측면에서 본원의 화학식 I의 펩타이드, 또는 화학식 I 과 II를 모두 포함하는 펩타이드는 화학식 III의 X12 1-15 으로 표시되는 제 3 영역을 그 N 또는 C 말단에 추가로 포함할 수 있으며, 상기 X12는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산이다.
일 구현예에서 상기 화학식 III에서 양하전된 아미노산은 K 또는 R이다.
다른 구현예에서 상기 화학식 III에서 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
또 다른 구현예에서, 상기 화학식 III에서 상기 극성의 비하전된 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 펩타이드는 예를 들면 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: RQLVVK (서열번호 15); FRALPC (서열번호 6); FRALPCRQLVVK (서열번호 16); RQLVVKFRALPC (서열번호 17); RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18); RQLVVKFRALP (서열번호 19); RQLVVKFRAL (서열번호 20); KQLVVKFRALPC (서열번호 21); RQKFRALPC (서열번호 22); RQEEEKFRALPC (서열번호 23); RQAAAKFRALPC (서열번호 24); RQLVVKFRPC (서열번호 25); RQLVVKFREEPC (서열번호 26); RQLVVKFRVVPC (서열번호 27); RQEEEKFREEPC (서열번호 28); EQLVVEFEALPC (서열번호 29); RQLVVKYRALPC (서열번호 30); RQLVVKWRALPC (서열번호 31); RNLVVKFRALPC (서열번호 32); RSLVVKFRALPC (서열번호 33); R-(QLVV)2-KFRALPC (서열번호 34); R-(QLVV)3-KFRALPC (서열번호 35); R-(QLVV)4-KFRALPC (서열번호 36); RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37); (R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38); (R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39); (R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40) ; 및 (R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41).
또 다른 구현예에서 본원의 펩타이드는 예를 들면 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: RQLVVKFRALPC (서열번호 17); KQLVVKFRALPC (서열번호 21); RNLVVKFRALPC (서열번호 32); RSLVVKFRALPC (서열번호 33); RQVVVKFRALPC (서열번호 42); RQIVVKFRALPC (서열번호 43); RQAVVKFRALPC (서열번호 44); RQEVVKFRALPC (서열번호 45); RQLLVKFRALPC (서열번호 46); RQLIVKFRALPC (서열번호 47); RQLAVKFRALPC (서열번호 48); RQLEVKFRALPC (서열번호 49); RQLVLKFRALPC (서열번호 50); RQLVIKFRALPC (서열번호 51); RQLVAKFRALPC (서열번호 52); RQLVEKFRALPC (서열번호 53); RQAAAKFRALPC (서열번호 24); RQEEEKFRALPC (서열번호 23); RQLVVRFRALPC (서열번호 54); RQLVVKYRALPC (서열번호 30); RQLVVKWRALPC (서열번호 31); RQLVVKFKALPC (서열번호 55); RQLVVEFEALPC (서열번호 56); RQLVVKFRLLPC (서열번호 57); RQLVVKFRILPC (서열번호 58); RQLVVKFRVLPC (서열번호 59); RQLVVKFRELPC (서열번호 60); RQLVVKFRAAPC (서열번호 61); RQLVVKFRAIPC (서열번호 62); RQLVVKFRAVPC (서열번호 63); RQLVVKFRAEPC (서열번호 64); RQLVVKFRVVPC (서열번호 27); RQLVVKFREEPC (서열번호 26); RQEEEKFREEPC (서열번호 28); RQEEEEFEEEPC (서열번호 65); RQLVVKFRALXC (서열번호 66); RQLVVKFRALPS (서열번호 67); RQLVVKFRALPT (서열번호 68); 및 RQLVVKFRALPX (서열번호 69). 상기 펩타이드는 본원에서 합성된 다양한 변이를 갖는 12mer의 서열 및 접착 실험결과를 근거로 하기 기술된 사항을 고려하여, 가능한 변이를 도입하여 생성된 서열로 그 효과 또한 본원 실시예에 기재된 것과 같이 본원에서 개시된 것으로부터 예측가능하며, 따라서 본원의 범위에 포함되는 것이다.
하지만 본원에 따른 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물(biologically equivalents)을 포함하는 것이다. 즉, 아미노산 서열에 추가적인 변형을 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 이러한 것을 고려하면, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
일 구현예에서는 본원에 따른 폴리펩타이드에 보존적 아미노산 치환이 일어난 것을 포함한다. 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이란 특정 폴리펩타이드가 갖는 활성을 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환을 의미하는 것으로 예를 들면 1개 이상의 아미노산 잔기에서 보존적 치환이 일어난다.
보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 Blosum (BLOcks SUbstitution Matrix) 기반한 표 1에 기재된 바와 같으며, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds); 및 Henikoff, S.; Henikoff, J.G. (1992). "Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks". PNAS 89 (22): 10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915; WO2009012175 A1 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.
[표 1]
Figure PCTKR2016009066-appb-I000001
따라서 본원은 서열번호 1 내지 69로 표시되는 서열 및 상기 서열에 보존적 치환이 일어난 것을 포함하는 것이다.
또한 아미노산 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
상기와 같은 소수성 인덱스는 특히 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산간의 치환이 유리하다.
또한 유사한 친수성 수치(hydrophilicity value)를 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다.
예를 들면 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
또한 본원에 따른 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 예를 들면 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있다.
따라서, 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상술한 본원에 따른 펩타이드는 C-말단이 화학 비반응성기 예를 들면 NH2 등과 같은 기로 치환되어 안정성을 높일 수 있다.
본원에 따른 접착제 또는 접착 조성물은 다양한 물질의 무기물 표면에의 접착을 가능하게 한다. 이러한 무기질 표면은 우수한 정전기적 전도성으로 인해 전자의 분포가 자유로운 물질 또는 탄소, 실리콘 또는 질소 등을 포함하지 않는 통상적 의미에서의 무기물로서 특히 표면이 소수성인 물질을 포함하며, 그 예로는 금속 예를 들면 철, 구리, 금, 은 및 백금을 포함하는 귀금속, 티타늄 또는 알루미늄; 세라믹 예를 들면 지르코니아; 칼슘인회석 결정 예를 들면 하이드록시 아파타이트; 고분자합성수지 예를 들면 폴리에틸렌; 유리; 및 이들의 조합체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 접착제 또는 접착 조성물은 생물학적 및/또는 비생물학적 물질을 포함하는 다양한 물질의 무기질 표면에의 접착을 가능하게 하며, 예를 들면 비생물학적 물질은 금속, 유리, 플라스틱, 금속 또는 고분자합성수지를 포함하고, 상기 생물학적 물질은, 세포, 조직, 단백질, 지질, 당 또는 핵산 또는 이들의 조합을 포함한다.
예를 들면 무기물 표면과 이와 동일 또는 상이한 성질 또는 특성을 갖는 무기물 표면과의 접착, 또는 하나의 무기물과 생물학적 유래 물질과의 접착을 매개할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 접착제 또는 조성물은 금속, 유리,플라스틱, 고분자 합성수지와 같은 무기물간의 접착 또는 생물학적 물질 예를 들면 세포, 조직, 단백질 또는 미생물의 세포벽 성분(lipopolysaccharide 성분 포함)은 물론, 이스트의 세포벽 성분((1,3)-베타글루칸을 포함)을 생물학적 물질을 무기물 표면의 예로 배양접시에의 접착에 사용될 수 있다.
본 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 본원에 따른 펩타이드는 프로테오글리칸에 대한 높은 친화력을 나타내며, 프로테오글리칸을 연골을 형성하는 조직 구성 성분으로 조직재생 분야에서 응용가치가 매우 넓고 성형을 포함한 다양한 임상시술에 직접적으로 활용되는 물질들을 포함한다. 따라서 본원의 접착제 또는 조성물이 적용될 수 있는 생물학적 유래 물질 또는 그 표면은 예를 들면 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부, 일예로는, 세포, 조직, 기관을 포함하는 생물학적 물질 표면으로의 접착 또는 코팅에 사용될 수 있다. 본원에 따른 펩타이드 또는 조성물이 적용될 수 있는 세포는 특별히 제한되지 않으며, 식물, 곤충 및 동물 세포에 적용될 수 있으며, 예를 들면 동물세포, 특히 사람 유래 세포에 적용될 수 있다. 예를 들면 다분화능 세포, 성체 줄기세포, 전구세포, 또는 전구세포의 접착에 사용될 수 있다. 다분화능 세포의 예로는 ES 세포, GS 세포, 및 iPS (유도만능줄기세포) 세포를 포함한다. 성체 줄기세포로는 MSC (mesenchymal stem cells), 조혈모세포, 신경줄기세포를 포함한다. 전구세포의 예로는 피부, 진피, 내피, 표피, 근육, 심근, 신경, 골, 연골, 뇌, 상피, 심장, 신장, 췌장, 비장, 구강, 각막 또는 모발 유래의 세포를 포함한다. 인간 유래 세포의 예로는 ES 세포 iPS 세포, MSC, 연골세포, 골모세포, 골전구세포, 중간엽세포, 근아세포, 심근세포, 신경세포, 간세포, 배아세포, 섬유세포, 각막상피세포, 각막내피세포, 혈관내피세포, 및 조혈모세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 치료의 목적을 위해서 세포는 자가, 타가 유래일 수 있다.
또한 본원에 따른 펩타이드는 다양한 화합물로 변형될 수 있으며, 예를 들면 엡실론 아미노기에 다양한 성능의 기능성 물질 등을 결합시키는 방식으로 개질될 수 있다.
본원에 따른 펩타이드 접착제 또는 조성물의 용도는 이에 한정되지 않으나, 적어도 하나의 무기물 표면을 포함하는 것으로 (1) 수(물 또는 염분이 있는 물) 중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 줄기세포를 포함하는 세포 또는 조직 배양; (7) 인공장기, 치과, 외과 또는 안과용 의료장치 예를 들면 임플란트, 골고정제, 골케이지, 가이드와이어, 카테터 및 스텐트를 포함하는 의료장치의 기저 물질; (8) 골표면, 티타늄, 세라믹 등 (9) 생리활성물질을 포함하는 다양한 생체물질 예를 들면 생체활성 물질, 약물, 표지물질, 또는 표적물질의 예를 들면 골표면, 티타늄, 세라믹 물질의 바이오컨주게이션 등에 이용될 수 있다.
일 구현예에서는 본원의 접착제 또는 조성물은 질환의 치료를 위한 세포 또는 조직의 이식 또는 재건을 위한 치과적, 안과적 또는 정형외과적 치료에 사용되며, 이 경우 본원의 접착 조성물이 적용될 수 있는 표면은 이로 제한하는 것은 아니나, PLGA, 하이드록시아파타이트, 지르코니움, 세라믹, 타이타늄, 철, 스텐레스 스틸, 백금, 금, 또는 합금을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또 다른 구현예에서 본원의 펩타이드 또는 조성물은 지지체(support)로의 세포의 접착에 사용된다. 본원에서 세포 접착 표면 또는 지지체는 세포배양 접시, 마이크로비드, 기저물질, 조직 이식물 등을 포함하며, 예를 들면 조직 또는 세포의 배양, 특히 줄기세포의 배양 등에 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 본원의 펩타이드를 이용한 경우, 기존 세포 접착에 사용하는 물질과 비교하여 월등히 높은 접착력을 나타냈다 (도 1, 2, 3, 4, 5 및 6 등 참조).
본원에 따른 접착제 또는 조성물의 사용방법은 통상의 단백질 접착 조성물의 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다. 예를 들면 본원에 따른 접착제 또는 조성물의 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 제품인 Cell-Tak (BD Biosciences, USA)를 참조할 수 있다.
본원에 따른 조성물은 용제형, 수용성, 무용제 형일 수 있으며, 적용되는 표면의 면적을 기준으로 0.1 내지 1000 ng/mm2, 특히 1 내지 100 ng/mm2로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 따른 조성물은 계면활성제, 산화제, 가교제, 및/또는 충진제(filler)로 처리하거나, 또는 펩타이드의 농도를 조절함으로써 상기 접착력 및 이에 맞추어 적용양을 조절할 수 있다. 예를 들면 충진제는 콜라젠, 히알루론산, 콘드로이친 설페이트, 엘라스틴, 라미닌, 카제인, 하이드록시아파타이트, 알부민, 또는 피브로넥틴을 포함하는 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 접착 단백질을 유효성분으로 함유하는 코팅제 특히 접착 코팅제 또는 보호 코팅제이다. 이는 예를 들면 테이프, 라벨지 또는 보호성 필름과 같은 일상 생활에서 사용되는 접착 코팅제를 포함하는 것이다. 본 발명의 접착제는 유리, 플라스틱, 고분자합성수지와 같은 비생물학적 물질 간의 또는 비생물학적 물질과 생물학적 물질간을 접착하는 특성이 있어 이러한 표면 또는 기질에 대한 코팅제로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 특히 내수성 및 방수성을 가지므로, 수중 환경에 사용되는 기질의 표면에 도포함으로써 기질의 산화를 방지할 수 있다. 보호 코팅제의 적용예로는 선박과 같은 수중에서 사용되는 장치 또는 기구에 도포하여 부식을 방지하는 용도를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 따른 접착제, 조성물 또는 코팅제는 접착 단백질만을 단독으로 포함할 수 있으나, 그외 공지의 접착제, 본 발명의 접착 단백질을 제외한 접착 단백질, 공지의 접착제 또는 코팅제에 포함하는 수지, 유기용매, 계면활성제, 부식방지제 또는 색소 등을 더욱 포함할 수 있다. 부가적으로 포함하는 성분의 함량은, 성분의 종류나 코팅제의 제형에 따라 통상적으로 허용되는 범위내에서 적절히 조절할 수 있다. 부가적인 성분이 포함되는 경우, 유효 성분인 접착 단백질은 코팅제내에 접착 활성을 유지할 수 있는 함량으로 포함되며, 예컨대 접착 또는 코팅제에 0.01 내지 80 중량％로 포함될 수 있다.
본 발명의 접착 또는 코팅용 조성물은 크림상, 에어졸상(분무형), 고체상, 액상 및 유상으로 제조할 수 있으나, 상기한 제형에 한정되지 않는다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 본원에 따른 접착제 또는 접착 조성물을 이용하는 두 개 또는 그 이상의 물질 표면을 접착하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 제 1 물질 및/또는 제 2 물질에 본원에 따른 접착제를 처리하는 단계; 및 상기 두 개의 물질이 접착될 수 있도록 상기 두 개의 물질을 접착이 일어날 수 있는 충분한 조건에서 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 제 1 물질 또는 제 2 물질 중 적어도 하나는 무기물 표면이다. 상기 충분한 조건은 접착에 사용되는 구체적 물질의 종류에 따라 상이할 것이며, 당업자라면 본원 실시예의 기재, 본원 명세서의 기재를 근거로, 당업계에 알려진 지식을 고려하여 적절한 조건 예를 들면, 온도, 시간, 접착이 일어나는 배지의 조성 등을 결정할 수 있을 것이다.
본원에 따른 제1 물질 또는 제2 물질은 부착을 위해 전부 또는 하나에만 처리될 수 있다. 일 구현예에서 무기물 표면, 예를 들어 세포배양 접시에 접착제 또는 조성물이 처리되고, 여기에 세포를 추가하면 세포가 세포배양 접시에 접착된다. 다른 구현예에서는 세포를 포함하는 배양액에 본원에 따른 접착제 또는 조성물을 추가하고, 이를 세포배양 접시에 추가 할 수 있다. 다른 구현예에서는 무기물 표면 예를 들면 상용화된 골이식재를 본원에 따른 접착제로 코팅하고 여기에 유용한 생물학적 물질 예를 들면 골형성단백질을 부착시킬 수 있다. 또는 본원에 따른 접착제에 유용한 생물학적 물질을 컨주게이션 한 후 이를 무기질 표면에 부착시킬 수 있다.
기타 본원에 따른 방법의 무기물 표면 또는 이에 부착될 수 있는 물질과 관련되서는 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 접착성 펩타이드의 제조
실험에 사용된 펩타이드는 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) (Fmoc) 방법을 통하여 합성된 것으로 주문제작 하였다(루젠 Sci, 대한민국; 펩트론, 대한민국). 펩타이드 효과의 재연성 검증을 위하여 두 개의 회사를 통해 각 각 3회(루젠) 그리고 2회(펩트론)의 펩타이드 합성을 수행하였으며, 각 각의 합성물에 대해 독립된 실험을 통해 분석을 하였으며, 합성회차별로 동일한 결과를 수득하였다.
실시예 2. 접착성 펩타이드와 형광 물질의 컨쥬게이션 및 이의 다양한 비생체 유래 표면에의 접착성 분석
실시예 1의 펩타이드는 A7-1 (RQLVVKFRALPC; 서열번호 20)(하기 표 2의 12mer (A) 서열에 해당)은 바이오틴(Thermo Scientific), 그리고 FITC(Sigma)를 Cys에 SH기를 통해 각 각 컨쥬게이션 시켰다. 이어, 이를 유리, PCL, Ti, Col, Zr, 비닐, PS 파이버에 처리한 후(PBS 중 각 10μM, 상온에서 20분 흡착 후 PBS로 1회 세척), 접착여부는 LAS(Fuji, 일본)를 이용한 FITC 형광 이미지 측정을 통해 검출하였다. 펩타이드에 공유결합된 바이오틴을 유리시키기 위하여 DTT(PBS 중 100mM, 상온에서 20분 처리 후 1회 세척)로 처리하여 환원반응을 유도하였다. 대조군으로는 염료만을 사용하였다.
결과는 도 1a 내지 도 1d에 기재되어 있으며, 항체의 검출은 본원에 따른 바이오틴은 본원에 따른 펩타이드를 통해 실험에 사용된 표면에 강하게 접착되었으며, 특히 이러한 효과는 DTT를 처리에 의해 사라졌으며 (도 1a), 이는 바이오틴 또는 FITC가 본원 펩타이드를 통해 유리에 접착됨을 나타내는 것이다.
실시예 3. 본원에 따른 접착성 펩타이드의 다양한 비생체 및 생체유래 물질에 대한 접착성 분석
실시예 2와 기본적으로 동일한 실험을 수행하였으며, 유리 대신에 골이식재로 널리 사용되는 Bio-OSS(Geistlich Pharma, Inc) 및 MBCPTM(Biomatlante)를 사용하였다. 처리 조건은 다음과 같다: Bio-Oss 입자를 10μM농도의 펩타이드-FITC 컨쥬게이트에 첨가하여 상온에서 10분간 반응시키고, 이어서 0.05% tween-20을 함유하는 PBS 용액에서 48시간 동안 5회 세척. 처리 후 공촛점 현미경으로 분석하였다(Zeiss LSM-700 model with Zen 2011 software, x20).
펩타이드의 접착을 확인하기 위하여 PBS, Cys-또는 FITC-컨쥬게이트 A7-1, 또는 Cys 또는 FITC 염료를 10μM 농도로 PBS에 녹인 후 10-20μl의 수용액을 국소 처리하였다.
결과는 도 2a 내지 도 2b에 기재되어 있으며, 본원에 따른 펩타이드가 비생체 유래의 무기물 표면에의 접착될 수 있음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 본원에 따른 펩타이드의 상용화 골이식재에의 우수한 접착성을 나타낸다.
실시예 4. 접착성 펩타이드를 이용한 세포의 무기물 표면에의 접착성 향상 효과
본 실험에 사용된 재료는 다음과 같다: PBS 중의 10 mM의 펩타이드 용액 (저장용액, Stock solution); 35mm 직경의 플라스틱 소수성 세포배양접시 (세포배양용, Corning); DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, 세포배양 배지: Hyclone); 우태혈청 (fetal bovine serum, Hyclone); 및 C2C12 (mouse myoblast, 세포, ATCC, CRL-1772); MC3T3-E1 (Mouse C57BL/6 calvaria cell, ATCC, CRL-2593) 및 ST2 (bone marrow-derived stroma cell: EMBO J. 7:1337-1343, 1983); STO (feeder 세포: ATCC, CRL-1503), HEK-293 (ATCC, CRL-1573), SaOS2 (ATCC, HTB-85), HeLa(ATCC, CCL-2), ROS17/2.8, NIH3T3 (ATCC, CRL-1658), RAW264.7 (ATCC, TIB-71), hMSC (Lonza, PT-2501), hPDL(HPLF) (Sciencell, Cat.#2630) hDPSC (Kerkis I et al., Cells Tissues Organs, 2006; 184: 105-16에 기재된 방법에 의거 인체조직으로부터 분리), mBMSC (Primary Bone Marrow Stromal Cell from mouse), MC (Primary Mouse Calvaria cell), MEF (Mouse Embryonic Fibroblast).
실험방법은 다음과 같다.
세포접착에는 세포배양 접시를 펩타이드로 미리 코팅하는 방법과 코팅하지 않고 세포배양액에 직접 첨가하여 배양하는 두 가지의 방법으로 관찰했으며, 두 가지 경우 모두 일치하는 결과를 나타냈다. 코팅방법을 취할 경우 PBS 또는 우태혈청을 포함하지 않은 세포배양배지에 일정 농도의 펩타이드를 첨가하여 상온, 30분간 코팅한 후, 용액을 제거한 후 세포를 첨가하여 다양한 시간에 걸쳐 접착을 측정하였다. 또한 배양배지에 펩타이드를 첨가 할 경우 세포를 현탁할 때 일정 수준의 펩타이드를 함께 첨가하여 잘 현탁한 후 배양접시로 옮겼다.
세포접착 측정은 다음과 같이 수행되었다. 세포접착은 펩타이드를 첨가하지 않은 경우를 음성 대조군으로 PBS 그리고 poly-L-lysin을 코팅한 경우를 양성대조군으로 하여 광학 현미경을 통한 일반적 관찰, 액틴 필라멘트 구조 및 거친 세포막 경계형태 관찰을 위하여 F-actin 염색 및 공초점 현미경 분석 그리고 접착에 대한 정량화를 위해 세포의 대사량 또는 DNA 양을 측정하였다. 대사량은 CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., USA)을 이용하여 흡광도를 측정하였고, DNA양은 피코그린 정량 키트(Picogreen assay kit)(Life Technologies, USA)를 제조자의 방법대로 이용하여 형광값을 측정하였다. 접착된 세포만을 정량화하기 위하여 접착되지 않은 세포는 버리고 PBS로 다시 2회 세척하여 표면에 붙어 있는 세포만을 대사량 또는 DNA를 정량에 사용하였다.
결과는 도 3a 내지 3f에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 본원에 따른 펩타이드는 다양한 유래의 앵커리지 의존적 세포의 접착, 예를 들면, 일차세포, 확립된 세포 및 해동된 세포, 피더세포의 세포배양 접시에의 접착에 유용하게 사용될 수 있으며, 기존에 사용되던 물질인 PLL과 비교하여 월등하게 우수한 효과를 나타냈다. 기존제품의 경우 추천 농도가 10 내지 100μg/ml인 반면 본원에 따른 펩타이드의 경우, 0.32 내지 1.6μg/ml의 농도로 사용가능하다. 나아가 종전의 세포부착용 펩타이드 예를 들면 PLL, PDL(D-form), PLO(poly-L-ornithine)의 경우 강한 독성으로 인해 코팅 후 잔여물을 세척하여 제거해야 하는 반면 본원에 따른 펩타이드는 세척이 필요없고, 상기 기재된 바와 같이 배지에 혼합하여 사용이 가능하다.
실시예 5. 접착성 펩타이드의 접착 기전 규명
본 실시예에서는 본원에 따른 펩타이드 접착능 기전을 규명하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(1) 단백질 관여 여부
우선, 단백질 합성을 저해하는 것으로 알려진 EDTA, 사이클로헥사미드(CHX) (10μM, 37℃ 1시간) 또는 GAG(glycoaminoglycan)처리 후 상술한 바와 같이 접착능을 실험하였다.
결과는 도 4a에 있으며, 이에 나타난 바와 같이 EDTA 또는 CHX를 처리한 경우에도 접착능에 차이가 없는 것으로 나타났다. 즉, A7-1에 의한 세포접착이 세포 표면의 전해질(EDTA 처리 결과)이나 새로운 단백질 합성(CHX 처리 결과)을 필요로 하지 않는 반면, 혈청에 의해서는 초기에 저해가 일어나는 것을 나타내는 결과이다. 이는 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만 혈청내 존재하는 많은 종류의 프로테오글리칸의 주성분인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate) 등의 GAG(glycoaminoglycan)가 펩타이드에 일차적으로 결합한 것이 원인으로 판단된다. 또한 본원에 따른 펩타이드는 세포막 단백질과의 상호작용을 통해 접착능을 증가시키는 것이 아님을 나타내는 것이다.
(2) 비단백질성 물질 관여 여부
다음으로는 비단백질 물질의 관여여부를 조사하였으며, 그 대상으로 세포표면의 세포외메트릭스(Extracellualr matrix, ECM)에 다량 함유되어 있는 탄수화물 지질인 프로테오글리칸과의 관련성을 분석하였다.
- 프로테오글리칸에 대한 펩타이드의 분자 친화력
프로테오글리칸을 구성하는 주요 성분들인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate), 데르마탄 황산(dermatan sulfate), 케라탄 황산(keratan sulafate) 등의 GAG(glycoaminoglycan)는 ECM을 구성하는 주요성분들이기도 하지만, ECM 구조의 보존성(structural integrity of ECM)을 유지하여 세포의 형태를 유지할 뿐만 아니라, 세포의 접착, 세포의 극성(cell polarity)을 조절한다. ECM이 갖는 이러한 기능은 환경에 대한 세포의 적응을 유도할 뿐만 아니라 복잡한 일련의 대사과정과 직접적으로 연관되어 있어서 다양한 생리학적 역할을 조절하는 복합적 기능을 가진다.
프로테오글리칸에 대한 본원 펩타이드의 분자 친화력은 (i) 친화크로마토그래피, (ii) 정제된 GAG 성분을 이용한 경쟁적 결합을 통한 세포접착, (iii) GAG성분을 포함하는 ECM을 특이적으로 분해하는 효소를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진의 억제, 이상의 세 가지 방법을 통하여 검증하였다. 효소처리의 경우 히알루로니다아제(hyaluronidase (Sigma)), 콜라게나아제(collagenase (Sigma))를 처리하였다. 정제된 GAG는 hyaluronan (Sigma), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate (Sigma)), 헤파린(heparin (Sigma)), 헤파란 황산(heparan sulfate (Sigma))를 각각 사용하였다.
(i) 친화크로마토그래피를 이용한 펩타이드-헤파린 또는 펩타이드-N-아세틸글루코사민(GlcNAc)과의 상호작용 측정
크로마토그래피를 위해 헤파린-아가로스 비드(heparin-agarose bead (Biovision)) 그리고 GlcNAc-아가로스 비드(Sigma)를 각각 사용하였다. PBS-T용액에 10ng의 FITC로 표지된 펩타이드(F-펩타이드)를 BSA로 미리 코팅된 헤파린-아가로스 비드 그리고 GlcNAc-아가로스 비드와 상온에서 10분간 반응 시킨후 PBS-T용액에서 3회 세척후 다시 PBS용액에 현탁한 후 형광을 측정하였다. 경쟁적 결합을 유도하기 위하여 FITC가 표지되지 않은 펩타이드(Cold)를 각각 1:1, 1:10(10배) 그리고 1:100(100배)만큼 첨가한 후 비드와 반응시킨 후 형광을 측정하였다. 음성대조군으로써 FITC 염료만을 각 비드에 반응시켜 측정하였으며, 단지 비드를 PBS에 현탁한 다음 마이크로 플레이트로 옮겨 측정되는 형광값을 블랭크로 사용하였다. 도 4b에 나타난 결과는 헤파린 또는 GAG의 구성 성분인 GlcNAc에 펩타이드가 높은 친화력을 가지고 있음을 나타낸다.
(ii) 정제된 GAG 성분을 이용한 경쟁적 결합을 통한 세포접착능 조사
다음은 GAG처리에 의한 경쟁적 억제 방식에 의한 접착성 펩타이드에 의한 세포접착 저해를 나타내는 결과로써 펩타이드에 의한 세포의 접착 촉진은 헤파린, 헤파란 황산, 그리고 콘드로이틴 황산을 첨가할 경우 세포접착이 크게 저해 되었다.
(iii) GAG성분을 포함하는 ECM을 특이적으로 분해하는 효소를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진의 억제: ECM을 구성하는 프로테오글리칸(proteoglycan) 뿐만 아니라 콜라겐 등의 피브릴 단백질들은 GAG를 포함한다. GAG를 포함하는 콜라겐을 가수분해 하거나 GAG의 하나인 히알루로난을 가수분해하는 히알루로니다아제를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진능을 조사한 결과 모두 세포접착능력이 저해디는 것으로 나타났다. 이 역시 펩타이드에 의한 세포접착 촉진이 GAG와의 상호관련이 있음을 나타내는 증거이다.
실험방법은 다음과 같다: (i) 정제된 GAG 성분 처리에 의한 경쟁적 억제는 트립신으로 처리된 세포현탁액에 각각의 GAG를 5mg/ml 되도록 첨가하고 37℃에서 10분간 반응 후 펩타이드가 코팅된 배양접시에 옮긴 후 30분 후 접착된 세포에 대한 DNA를 정량화하여 접착정도를 측정하였다. DNA정량은 피코그린 정량 키트(picogreen assay kit (Life Technologies))를 이용하여 수행하였다; (ii) 콜라게나아제, 히알루로니다아제 처리에 의한 세포접착 조사는 트립신으로 처리된 세포를 우태혈청을 포함하지 않는 배지에 현탁시킨 후 각 효소를 첨가 후 37도에서 30분간 반응하였다. 효소는 10,000 unit/ 103 cell 수준에서 처리하였으며 효소반응 후 EDTA 및 우태혈청을 첨가하여 효소의 활성을 불활성화시킨 후 원심분리 후 새로운 배지에 현탁한 후 펩타이드가 코팅된 배양접시에서 2시간 배양하였다. 접착된 세포의 측정은 피코그린 정량(picogreen assay)을 수행하기 전 PBS로 2회 세척 후, 접착된 세포만 회수하여 DNA를 정량화하였다.
결과는 도 4b에 기재되어 있다. 결과는 본원의 펩타이드가 프로테오글리칸에 대해 높은 친화력이 있음을 보여주는 결과이다.
(3) RGD와 비교
엥커리지 의존적 세포(MC3T3-E1)에 A7-1 펩타이드(10μM) 또는 이와 함께 용해성 RGDS 펩타이드(0, 10, 100 및 1000μM)를 시험튜브에서 세포와 함께 10분간 반응하여 경쟁적으로 처리한 후, 배양접시에 옮긴 후 다시 10분간 항온기에서 접착을 유도하였다. 10분 후 다시 배양액을 제거하고 PBS 용액으로 2회 세척하여 남아있는 미접착 상태의 세포를 제거하였으며, 펩타이드를 포함하지 않는 새로운 배지와 CCK-8(Dojindo)를 혼합하여 항온기에서 1시간 반응 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. CCK-8과 혼합된 배지를 블랭크로 하여 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 4c에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, RGDS 펩타이드를 단독으로 처리한 경우, 농도의존적으로 접착이 감소되는 것으로 나타났다. 반면 A7-1과 RGD 펩타이드를 경쟁적으로 처리한 경우, A7-1 비처리군에서는 수용성 RGD를 처리할 경우 인테그린에 결합하여 바닥(기질에) 대한 접착능을 유의미하게 감소시키지만, A7-1 처리군에서는 RGD를 처리함에도 세포의 접착에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 A7-1은 RGD가 작용하는 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가짐을 나타내는 것이다. RGD와 비교하여 처리 농도면에서도 월등하게 적은 양의 사용이 가능한 것으로 나타났다. 즉 도 4c의 결과로부터 본원에 따른 펩타이드의 사용농도는 10μM (1.6μg/ml)로 RGD는 10배 또는 100배로 사용하였다.
이러한 결과는 RGDS 펩타이드를 이용한 세포접착 또는 조직 재생기술이 이미 잘 확립되었고 있는데, 이와는 다른 기전으로, 기술적 차별성이 있음을 나타내며, 또한 RGDS를 이용한 상용화 기술들은, 효율성이 좋지 않다고 알려져 있으며, 이를 대체할 수 있는 우수한 기술임을 나타낸다.
실시예 6. 접착성 펩타이드를 이용한 배아줄기세포의 무기물 표면에의 접착성 향상 효과
펩타이드를 100μM 수준에서 배양재질에 코팅하거나 나노구조를 제작하여 마우스 유도만능 줄기세포와 인간배아줄기세포 접착 및 전분화능을 다음과 같이 조사하였다.
인간배아줄기세포의 경우 hESC-media (일반적인 배양액 조성, Gibco BRL사로부터 구입), mTeSR (hES전용배지, Stem cell technology사로부터 구입), Essential 8 (hES 전용배지, Gibco BRL사로부터 구입), 그리고 각 각에 대해 10 ng/ml bFGF만을 첨가한 혈청 배제 배양액 (혈청에 의해 세포의 접착능력이 억제되는 현상을 방지하기 위한 배양액 조건) 조건으로 배양하여 기존의 양한 배양기법에 대해 상호 호환성이 있는지 함께 분석하였다. 또한 세포의 경우 콜로니 상태의 배양기법과 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 단일세포를 이용한 배양기법을 분석하였다. 피더-프리(feeder-free)에 대한 ESC 또는 iPSC 배양효과를 검증하기 위하여 양성대조군으로 매트리겔(Matrigel (hESC)) 그리고 젤라틴(gelatin (miPSC))을 각 각 비교하였으며, 뿐만 아니라 모든 배아줄기세포 배양의 양성대조군으로 사용되는 지지세포(Feeder cell)에서의 배양도 함께 수행하였다.
해당 세포를 도 5a에 기재된 배아줄기세포의 전분화능(Stemness)의 지표로 Oct4 유전자의 활성을 측정할 수 있는 구조를 갖는 플라스미드(Szabo et al., 2002, Mechanisms of Development Vol. 115: 157-160)를 이용하여 형광현미경으로 분석하였다 (도 5). 또한 전분화능을 나타내는 다른 마커인 Alp 및 Nanog 유전자에 대한 발현을 이에 특이적인 항체를 사용하여 염색하여 형광 현미경으로 관찰하고, hES 세포 배양에서 세포의 접착성 향상 여부도 조사하였다 (도 6).
결과는 도 5 및 6에 기재되어 있다. 도 5에 기재된 바와 같이, 본원의 펩타이드는 미리 코팅(precoated)되거나 또는 배양액에 혼합(Mixed)되는 방식으로 추가된, 두 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 5b). 아울러, 세포배양 4일째의 경우도 본원에 따른 펩타이드는 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 5c). 또한 도 6a 및 도 6b에 기재된 바와 같이, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났으며, hESC를 이용한 실험에서도 피더세포 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외부환경적 변화 없이도 세포의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 6c).
실시예 7. 접착성 펩타이드를 매개로 한 단백질의 무기물 표면에의 바이오컨쥬게이션
본 실험에 사용된 재료는 다음과 같다:
실시예 1에서 합성된 펩타이드는 10μM (PBS 중) 농도로 사용; 1.9cm2 면적의 플라스틱 세포배양접시 (24-well plate, Corning사 제품); DSS (Disuccinimidyl suberate, C16H20N2O8, Thermo Scientific Inc.); 재조합 인간 BMP2 (rhBMP2, BD bioscience); DMSO (Dimethyl sulfoxide, DSS를 녹이는 용매, Sigma-Aldrich 사); Tris-HCl, pH7.0 (Stop solution); PBS (phosphate buffered saline, reaction solution);
분석 개념은 도식적으로 도 7a에 도시되어 있다. 도 7a를 참조하면, 가교제를 사용하여 본원의 펩타이드에 목적하는 생활성을 갖는 다양한 물질, 예를 들면 BMP와 같은 치료용 단백질을 연결하여 사용하면, 본원 펩타이드의 접착성으로 인해, 처리한 부위에 치료용 단백질의 농도를 높일 수 있고, 치료 효과를 극대화할 수 있다.
실험방법은 다음과 같다. 펩타이드-rhBMP2 공유결합(Cross-linking) 반응은 기본적으로 사용된 가교연결자(Cross-linker) 제조사의 방법을 따라 수행되었으며, 요약하면 그 과정은 다음과 같다: (i) 펩타이드 코팅: 세포배양접시에 200μl의 펩타이드 용액 (PBS 용액 중의 10μM의 상기 실시예 1의 펩타이드)을 분주하고 4℃에서 18시간 흡착시켰다; (ii) DSS-BMP2 복합체 형성: rhBMP2에 대하여 20 molar 과량의 DSS를 100μl의 반응용액에서 1시간 공유결합을 유도하였다. 1.9cm2 면적당 rhBMP2는 300ng 수준이 되도록 조정하였으며, 이 때 대조군으로써 각각 DSS, rhBMP2, DSS-rhBMP2를 코팅하여 사용한 바, 이 경우 모두 배양접시 표면재질에 흡착력이 없는 바 세척과정에서 상당량 소실됨을 관찰하였고, 따라서 이 경우 음성 대조군으로 사용되었다; (iii) 펩타이드-DSS-BMP2 복합체 형성:100μl의 DSS-BMP2 복합체를 미리 반응시킨 펩타이드 코팅 접시에 조심스럽게 첨가한 후(overlay) 4℃에서 24시간 반응; (iv) 반응 정지: 1M Tris 용액을 200μl 첨가하고 상온에서 15분 방치함으로써 공유 결합 후 잔존하는 DSS를 모두 중화시켰다; (v) 세척: PBS 용액으로 10회 세척후, 세포첨가 전까지 우태혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 첨가한 후 37℃에 미리 방치하였다; (vi) C2C12 현탁액 준비 및 조골세포 분화: 4x105개의 C2C12세포를 300μl의 2% 우태혈청을 포함하는 DMEM배지에 현탁한 후 세포를 준비하였다. 펩타이드-DSS-BMP2 복합체가 코팅된 접시에 미리 담겨 있던 DMEM은 제거하고 300μl의 세포배양액을 첨가하여 5% CO2/37℃ 조건의 배양기에서 48시간 세포의 분화를 유도하였다; (vii) 세포분화 측정: C2C12세포의 조골세포로의 분화능은 알칼리탈인산화효소(Alkaline phosphotase)의 활성을 세포염색법으로 측정하였다.
결과는 도 7b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 재조합 BMP 처리군(rhBMP2) 또는 가교제 처리군(CL)과 비교하여 Alp 활성이 증가하였으며, 이는 본원의 펩타이드 처리에 의해 골분화가 촉진된 것을 나타낸다.
실시예 8. 본원에 따른 펩타이드의 안전성 분석
본원에 따른 펩타이드의 안전성을 조골세포(MC3TC-E1)를 이용하여 테스트하였다. 실시예 1에서 합성한 본원에 따른 펩타이드 A7-1을 조골세포에 0.1μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 농도로 처리한 후, 증식 (도 8a), 생존 (도 8b) 및 분화능 (도 8c)에 미치는 영향을 측정한 것으로, 분화능의 경우, MC3T3-E1 세포주 또는 C2C12 세포주를 사용하였으며, 상기 세포주를 골형성분화 배지(6일간 처리)와 BMP2(rhBMP2, 10ng/ml, 3일간 처리)로 자극을 주어 분화를 유도하였으며, 분화 효과는 세포 염색을 통해 수행되었다. 결과는 도 8a 내지 8c에 있으며, 농도에 따른 증식율, 생존율, 분화의 가부에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
또한 본원에 따른 펩타이드의 안전성을 마우스의 단핵구(monocyte)를 이용하여 테스트하였다. 마우스의 골수로부터 분리한 단핵구에 본원에 따른 펩타이드로 처리 후 가한 후 염증 유도가 발생하는지 조사하였다. 양성대조군으로써 LPS를 처리하였으며, 24시간 후 염증 유발인자 마커인 IL-1β (interleukin-1β), TNF-α (Tumor necrosis factor-α), iNos (Inducible nitric oxide synthase), Cox-2 (cyclooxygenase-2)를 각 각 실시간 정량 역전사 PCR 방법을 사용하여 측정하였다. 그 결과 본원에 따른 펩타이드는 염증을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 결과는 도 8d에 있으며, 본원에 따른 펩타이드는 염증을 유발하지 않아, 생체내 사용이 안전한 물질로 판단되었다.
실시예 9. 접착성 펩타이드에 의한 일차 신경 세포의 무기물 표면에의 접착능 향상 및 배양
본 실시예에서는 신경 세포 접착 및 배양에 미치는 영향을 기존의 접착성 펩타이드와 효과를 비교하였다. 펩타이드를 100μM 수준에서 배양재질에 코팅하거나 나노구조를 제작하여 마우스 배아뇌조직과 백서의 척수로부터 신경유래 세포를 얻어 접착된 세포를 광학현미경으로 분석하고 CCK-8을 통한 대사를 측정하여 분석하였다. 이 때 양성대조군으로 Laminin과 poly-L-ornithin (Sigma)을 혼용하여 제조사의 농도 및 방법대로 코팅하여 사용하였으며, 세포접착을 정량화하기 위하여 (각 시간에 대해) 접착하지 않은 세포는 PBS로 세척하여 제거하였고, 배양배지와 세포의 대사를 측정하는 CCK-8 용액(Dojindo)을 혼합하여 첨가한 후 1시간 동안 배양 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 9에 기재되어 있다. 도 9는 척수 유래의 신경세포를 기존의 펩타이드로 라미닌(laminin)과 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithin)으로 코팅된 배양접시 및 본원의 일 구현예에 따른 A7-1으로 코팅된 배양접시를 사용하여 배양한 후 각 시간대별로 CCK-8을 분석한 결과이며, A7-1가 코팅(흡착)된 조건에서 접착능이 큰 폭의 차이를 보였다.
실시예 10. 접착성 펩타이드에 의한 인간 MSC(Mesenchymal Stem Cell)의 무기물 표면에의 접착능 향상 효과
A7-1 펩타이드를 100μM 수준에서 유리재질의 멸균된 커버슬립에 코팅한 후 MSC 세포(Mesenchymal Stem Cell)를 6시간 배양한 후, 세포의 접착진행과정(adhesion progression)을 액틴 섬유에 대한 형광 염색시약인 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin) 염색약 (Life Technology Cat.# R415)과 세포의 핵(DNA)을 염색하는 DAPI (Sigma D9542) 염색약을 각 각 사용하여 세포를 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 이 때 음성 대조군으로 A7-1 펩타이드를 코팅하지 않은 커버슬립에 세포를 접착하여 비교하였다.
결과는 도 10에 기재되어 있다. 도 10a에서 음성대조군은 여전히 접착초기단계인 액틴-링(actin-ring) 형성이 다수를 이루고 있지만, A7-1 처리군의 경우 이미 그 단계를 지나 스트레스 파이버 형성이 다수의 세포에서 관찰되었으며, 도 10b는 이러한 관찰결과를 정량한 그래프이며, 도 10c는 세포 접착에 따른 기하학적 양태(geometric shape) (cell aspect ratio: 세포의 가로/세로의 비율, 1일 경우 완전한 원형이며 접착과정의 가장 초기 상태로 나타냄. Prager-Khoutorsky et al., 2011. Nature Cell Biology 13, 1457-1465 참고)를 측정하여 나타낸 결과로써 A7-1의 처리군에서 월등히 성숙된 접착능을 보여 준다.
실시예 11. 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 접착능 실험 I
하기 표 2과 같은 서열 및 명칭을 갖는 펩타이드를 실시예 1에서 같이 합성한 후에 헤파린 또는 N-아세틸글루코사민(GAG)에 대한 접착능을 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방법을 이용하여 측정하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2016009066-appb-I000002
결과는 도 11에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 본원의 펩타이드는 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역이 다양한 조합으로 배열되거나 또는 각 영역의 서열이 본원에 정의된 바와 같은 아미노산으로 치환된 경우에도 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 12. 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 접착능 실험 II
표 2에 A 서열로 명명된 RQLVVKFRALPC (서열번호 17) 서열을 기준으로 치환기의 화학적 성질, 크기, 전하적 특성 및/또는 표 2의 실험결과 등을 고려하여 다음의 표 3와 같은 서열을 생성하고 그 결과를 옆의 컬럼에 표시하였다. 굵게 표시된 부분이 치환된 부분이며, 실시예 11의 RQLVVKFRALPC를 이용한 실험결과와 비교하여 예측되는 효과의 정도를 +의 개수로 표현하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2016009066-appb-I000003
상기 표 3의 서열컬럼에서 굵게 표시된 부분이 A 서열과 비교하여 치환된 부분이고, 접착능 컬럼에서 볼드체로 표시되지 않은 결과는 실시예 11 및 도 11의 결과를 근거로 표시한 것이고, 볼드체로 표시된 문자는 상기 치환 및 실험결과를 근거로 예측된 결과이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 I의 펩타이드를 포함하는 무기물 표면 접착용 접착제:
    [화학식 I]
    [X1 - X2 - X3 - X4- X5]n
    상기 화학식 I에서
    상기 X1 은 임의의 아미노산이고,
    X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E 및 A 중 어느 하나의 아미노산이며, 각각 동일 또는 상이하며,
    X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
    상기 n은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체임.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 X1 의 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q인, 접착제.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 X2-X3-X4 는 LVV, AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 인, 접착제.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 접착제: QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5).
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 I의 펩타이드는 하나 이상의 하기 화학식 II의 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 접착제:
    [화학식 II]
    [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
    상기 화학식 II에서
    X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
    X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
    X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
    X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
    X10 는 임의의 아미노산이고,
    X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
    상기 X7 및 X8 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
    상기 화학식 I에서 상기 X2 , X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
    상기 n은 1 또는 2이고,
    상기 화학식 II의 펩타이드는 상기 화학식 I의 펩타이드의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결된 것인, 접착제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 화학식 II의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 접착제:
    FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14).
  7. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하나 이상의 하기 화학식 III의 펩타이드를 그 N 또는 C 말단, 또는 N 및 C 말단에 추가로 포함하는 것인, 접착제:
    [화학식 III]
    X12 1-15 으로, 상기 X12는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산인, 펩타이드.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 양하전된 아미노산은 K 또는 R이고, 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E인, 접착제.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 접착제:
    RQLVVK (서열번호 15);
    FRALPC (서열번호 6);
    FRALPCRQLVVK (서열번호 16);
    RQLVVKFRALPC (서열번호 17);
    RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18);
    RQLVVKFRALP(서열번호 19);
    RQLVVKFRAL(서열번호 20);
    KQLVVKFRALPC (서열번호 21);
    RQKFRALPC (서열번호 22);
    RQEEEKFRALPC (서열번호 23);
    RQAAAKFRALPC (서열번호 24);
    RQLVVKFRPC (서열번호 25);
    RQLVVKFREEPC (서열번호 26);
    RQLVVKFRVVPC (서열번호 27);
    RQEEEKFREEPC (서열번호 28);
    EQLVVEFEALPC (서열번호 29);
    RQLVVKYRALPC (서열번호 30);
    RQLVVKWRALPC (서열번호 31);
    RNLVVKFRALPC (서열번호 32);
    RSLVVKFRALPC (서열번호 33);
    R-(QLVV)2-KFRALPC (서열번호 34);
    R-(QLVV)3-KFRALPC (서열번호 35);
    R-(QLVV)4-KFRALPC (서열번호 36);
    RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37);
    (R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38);
    (R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39);
    (R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40) ; 또는
    (R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41).
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 접착제:
    RQLVVKFRALPC (서열번호 17);
    KQLVVKFRALPC (서열번호 21);
    RNLVVKFRALPC (서열번호 32);
    RSLVVKFRALPC (서열번호 33);
    RQVVVKFRALPC (서열번호 42);
    RQIVVKFRALPC (서열번호 43);
    RQAVVKFRALPC (서열번호 44);
    RQEVVKFRALPC (서열번호 45);
    RQLLVKFRALPC (서열번호 46);
    RQLIVKFRALPC (서열번호 47);
    RQLAVKFRALPC (서열번호 48);
    RQLEVKFRALPC (서열번호 49);
    RQLVLKFRALPC (서열번호 50);
    RQLVIKFRALPC (서열번호 51);
    RQLVAKFRALPC (서열번호 52);
    RQLVEKFRALPC (서열번호 53);
    RQAAAKFRALPC (서열번호 24);
    RQEEEKFRALPC (서열번호 23);
    RQLVVRFRALPC (서열번호 54);
    RQLVVKYRALPC (서열번호 30);
    RQLVVKWRALPC (서열번호 31);
    RQLVVKFKALPC (서열번호 55);
    RQLVVEFEALPC (서열번호 56);
    RQLVVKFRLLPC (서열번호 57);
    RQLVVKFRILPC (서열번호 58);
    RQLVVKFRVLPC (서열번호 59);
    RQLVVKFRELPC (서열번호 60);
    RQLVVKFRAAPC (서열번호 61);
    RQLVVKFRAIPC (서열번호 62);
    RQLVVKFRAVPC (서열번호 63);
    RQLVVKFRAEPC (서열번호 64);
    RQLVVKFRVVPC (서열번호 27);
    RQLVVKFREEPC (서열번호 26);
    RQEEEKFREEPC (서열번호 28);
    RQEEEEFEEEPC (서열번호 65);
    RQLVVKFRALXC (서열번호 66);
    RQLVVKFRALPS (서열번호 67);
    RQLVVKFRALPT (서열번호 68); 또는
    RQLVVKFRALPX (서열번호 69).
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드의 C-말단은 비반응성기로 치환된 것인, 접착제.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무기물 표면은 금속, 세라믹, 칼슘인회석 결정, 고분자합성수지, 또는 유리인, 접착제.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무기물 표면에 접착되는 것은 생물학적 또는 비생물학적인 물질인, 접착제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 비생물학적 물질은 금속, 유리, 플라스틱, 금속 또는 고분자합성수지이고, 상기 생물학적 물질은, 세포, 조직, 단백질, 지질, 당 또는 핵산 또는 이들의 조합인, 접착제.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 접착제를 포함하는 접착 또는 코팅용 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 조성물은 계면활성제, 산화제 또는 충진제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 충진제는 콜라젠, 히알루론산, 콘드로이친 설페이트, 엘라스틴, 라미닌, 카제인, 하이드록시아파타이트, 알부민, 또는 피브로넥틴인, 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 접착제를 제 1 물질 및/또는 제2 물질에 처리하는 단계; 및 상기 두 개의 물질을 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 제1 물질 또는 제2 물질 중 적어도 하나는 무기물 표면인, 두 개의 물질의 접착 방법.
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