KR101794482B1 - 생체 또는 비생체 접착성 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 생체접착성 물질로 작용하는 신규한 서열의 펩타이드 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 펩타이드는 세포 또는 조직과 같은 생체유래의 물질은 물론 비생체 유래 물질을 다양한 물체 또는 물질에 접착시킬 수 있어 접착용 조성물은 물론, 표지물질, 단백질, 탄수화물, 지질 등의 유기물과 다양한 무기물과 결합되어 바이오컨쥬게이팅 조성물과 같은 다양한 응용분야에 사용될 수 있다.

Description

생체 또는 비생체 접착성 펩타이드 및 그 용도 {Adhesive polypeptide and its use for biological or non-biological materials}
단백질 기재의 생물학적 물질을 포함하는 다양한 표면의 흡착성 및 부착성을 포함하는 접착성을 향상시키는 물질에 관한 것이다.
세포 또는 조직, 또는 이들 유래의 생물학적 물질의 접착에 사용될 수 있는 생체접착제는 다양한 기술 분야에서 폭넓게 사용될 수 있는 유용한 물질이다. 예를 들면 이러한 물질은 의학 분야에서 조직과 조직 또는 조직과 세포의 접착, 상처 치료, 조직의 재생 또는 수복 과정에 사용될 수 있거나, 또는 생명공학 분야에서 줄기세포 또는 일반 세포의 배양, 약물 전달 담체, 조직 충진제, 바이오컨쥬이션 등에 사용될 수 있다.
이러한 생체 접착제는 우수한 접착능력 및 가교능은 물론 특히 생체에 사용시 장기간의 기능유지가 필요하며, 부작용이 적어야 한다.
생체접착성 물질의 예로는 시아노아크릴레이트, 피브린, 젤라틴, 알부민 또는 폴리우레탄계 접착 물질을 들 수 있다. 시아노아크릴레이트는 통상 국소 상처 봉합에 사용되나, 독성 물질의 방출로 인해 그 사용이 제한적이다. 합성 고분자를 이용한 생체접착제는 용액 환경에서 접착성이 약한 단점이 있다. 미국 공개특허공보 제2002-0022588호 및 WO 제99/66964호는 알부민이 카르보디이미드로 가교된 젤라틴 또는 알부민을 개시하고 있다. 하지만 가교에 사용되는 카르보디이미드 역시 독성의 문제로 특히 인비보에서의 사용이 제한적이며, 부착 또한 접착의 강도 또한 충분하지 않다.
따라서, 기존의 것과 비교하여 독성이 적으면서도 다양한 환경에서의 적용이 가능한 접착성이 향상된 새로운 생체접착성 물질의 개발이 필요하다.
본원에서는 독성이 적으면서도 다양한 환경에서의 적용이 가능한 신규한 서서열의 접착성 폴리펩타이드 및 그 용도를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 하기 화학식 I의 펩타이드 또는 그 유도체를 제공한다:
[화학식 I]
[X1 - X2 - X3 - X4- X5]n
상기 화학식 I에서
상기 X1 은 임의의 아미노산이고,
X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E 및 A 중 어느 하나의 아미노산이며, 각각 동일 또는 상이하며, X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 n은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
본원에서 아미노산 잔기는 단일문자코드(single letter code)로 나타내며 약어는 다음과 같다: A, 알라닌; R, 알지닌; N, 아스파라진; D, 아스파르트산; C, 시스테인; E, 글루탐산; Q, 글루타민; G, 글라이신; H,히스티딘; I, 아이소루인신; L, 루이신; K, 라이신; M, 메티오닌; F, 페닐알라닌; P, 프롤린; S, 세린; T, 트레오닌; W, 트립토판; Y, 타이로신; V, 발린; B, 아스파라진, 아스파르트산; Z, 글루타민,글루탐산; X, 임의의 아미노산.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 화학식 I의 X1에서 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q일 수 있다.
다른 구현예에서 상기 화학식 I에서 X2- X3- X4 서열은 예를 들면 AAA, EEE, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, LLV 일 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 따른 화학식 I의 펩타이드는 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5)이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 II의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
[화학식 II]
[X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
상기 화학식 II에서
X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
X10 는 임의의 아미노산이고,
X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X7 및 X8 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 화학식 I에서 상기 X2 , X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고, 상기 화학식 II의 화합물은 상기 화학식 I의 화합물의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결된 것이다.
또 다른 구현예에서 화학식 II의 펩타이드는 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14)이다.
또 다른 구현예에서 상기 화학식 I 및/또는 II의 화합물은 하기 화학식 III의 화합물을 N 또는 C 말단, 또는 N 및 C 말단에 추가로 포함할 수 있으며, 일 구현예에서 화학식 III, 화학식 I 및 화학식 II의 순서로 연결될 수 있다
[화학식 III]
X12 1-15 으로, 상기 X12는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산으로, 일 구현예에서 상기 양하전된 아미노산은 K 또는 R이고, 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
본원에 따른 펩타이드는 본원에 따른 접착성 펩타이드가 사용되는 구체적 목적에 따라 예를 들면 약물, 표지물질, 또는 표적물질과 연결되어 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 접착성 펩타이드를 포함하는 바이오컨쥬게이팅용 조성물을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 접착성 펩타이드를 포함하는 생체유래 물질, 또는 비생체 유래 물질에 대한 접착용 조성물을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 하기 서열의 펩타이드를 제공한다: QLVVK (서열번호 1); FRALPC (서열번호 6); RQLVVK (서열번호 15); FRALPCRQLVVK (서열번호 16); RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18); RQKFRALPC (서열번호 22); EQLVVEFEALPC (서열번호 29); R-(QLVV)2-KFRALPC (서열번호 34); R-(QLVV)3-KFRALPC (서열번호 35); R-(QLVV)4-KFRALPC (서열번호 36); RQLVVKFKALPC (서열번호 55); RQLVVEFEALPC (서열번호 56); RQLVVKFRLLPC (서열번호 57); RQLVVKFRILPC (서열번호 58); RQLVVKFRVLPC (서열번호 59); RQLVVKFRELPC (서열번호 60); RQLVVKFRAAPC (서열번호 61); RQLVVKFRAIPC (서열번호 62); RQLVVKFRAVPC (서열번호 63); RQLVVKFRAEPC (서열번호 64); RQLVVKFRALPS (서열번호 67); 또는 RQLVVKFRALPT (서열번호 68).
또 다른 구현예에서, 상기 서열번호 15, 18, 22, 34 내지 36, 55 내지 64, 67 및 68의 N- 말단 첫 번째 아미노산은 K (Lysine)으로 치환되고, 상기 서열번호 29의 N-말단 첫 번째 아미노산은 D (Aspartice acid)로 치횐된 펩타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 상기 서열번호 15, 18, 22, 34 내지 36, 55 내지 64, 67 및 68의 N- 말단 첫 번째 아미노산은 D (Aspartic acid) 또는 E (glutamic acid)로 치환되고, 상기 서열번호 29의 N-말단 첫 번째 아미노산은 R (Arginine) 또는 K (Lysine)로 치횐된 펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본원에 따른 펩타이드는 생체접착성 물질로서 작용하여, 세포 또는 조직과 같은 생체유래의 물질을 다양한 표면에 접착시킬 수 있으며, 뿐만 아니라 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 등의 유기물과 다양한 무기물을 결합시켜 여러 표면에 접착시킬 수 있어, 이를 필요로 하는 다양한 응용분야에 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드 (A7-1)의 비생체유래 물질로서 유리(Glass), 지르코늄(Zr), 비닐(Vinyl), 폴리스티렌 파이버(PS fiber), PCL(Polycaprolactone), 티타늄(Ti) 및 콜라겐(Col)에 대한 접착성을 나타내는 결과이다.
도 1a는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드를 유리에 접착시킨 후, 이에 이황화 결합을 통해 결합된 바이오틴의 검출을 통해, 본원 펩타이드의 유리에의 접착성을 조사한 결과로, 바이오틴의 신호는 본원 펩타이드가 유리에 접착되었음을 나타내며, 이러한 결과는 DTT(dithiothreitol)의 처리로 이황화결합을 분해시 사라져, 이는 상기 결합이 이황화 결합에 의존하는 것을 나타낸다.
도 1b는 도 1a의 실험을 수행하기 위해 사용된 방법을 도식적으로 나타낸 것으로, 유리 접착된 본원의 펩타이드는 SH 기를 통해 표지물질인 바이오틴 (Biotin)과 연결되고, 바이오틴은 항체로 검출될 수 있으며, 이는 바이오틴을 펩타이드로부터 분리시키는 DTT의 처리로 인해 사라지는 결과를 나타낸다.
도 1c는 도 1a에 기재된 방법과 동일하나 바이오틴 대신에 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 사용하여, 다양한 비생체 유래 물질 표면에의 접착성을 분석하는 실험을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1d는 분석결과를 나타내며, 본원의 펩타이드가 다양한 비생체 유래 물질의 표면에 접착성을 가짐을 나타내는 것으로 좌측부터 PBS(phosphate buffer saline), FITC-컨쥬게이트 A7-1, 그리고 FITC 염료를 각 각 재료에 접착시킨 후 형광이미지를 분석한 결과이다.
도 2a는 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 골이식재인 Bio-OSSⓡ (Geistlich Pharma, Inc)의 표면에 대한 접착성 실험을 수행한 결과로, 본원에 따른 펩타이드의 상용화 골이식재에의 우수한 접착성을 나타낸다.
도 2b는 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 골이식재인 MBCPTM (Biomatlante)의 표면에 대한 접착성 실험을 수행한 결과로, 본원에 따른 펩타이드의 상용화 골이식재에의 우수한 접착성을 나타낸다. 사용된 형광현미경 배율은 200배이다.
도 2c는 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 연골조직/세포에의 접착성 실험을 마우스를 이용하여 수행한 결과로, 연골조직에 PBS, FITC-컨쥬게이트 A7-1, 또는 FITC 염료를 각각 주사기로 주입하고 마우스를 희생하여 조직을 절개한 후 형광이미지 분석장비로 형광을 측정한 것으로 펩타이드가 주입된 연골에서만 형광이 검출되었다. 이는 본원에 따른 펩타이드가 프로테오글리칸의 주성분인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate) 등의 GAG (glycoaminoglycan)을 다량 함유하는 연골조직(*)조직에서 우수한 접착성을 나타내며, 후술하는 도 4b의 실험결과와 일치하는 것이다.
도 2d는 본원의 일 구현예에 따른 Cy3로 표지된 펩타이드의 연골조직/세포에의 접착성 실험을 마우스를 이용하여 수행한 결과로, 연골조직에 PBS, Cy3-컨쥬게이트 A7-1, 또는 Cy3 염료를 각각 주사기로 주입한 후 마우스를 희생하여 조직을 절개한 후 공초점 현미경으로 형광을 측정한 것으로, 펩타이드가 주입된 연골(*) 및 골 (bone #)에서 형광이 검출되었다. 이는 본원에 따른 펩타이드의 연골조직에의 우수한 접착성을 나타내며, 후술하는 도 4b의 실험결과와 일치하는 것이다.
도 2e는 도 2d와 동일하나, 마우스의 관절 연골(articular cartilage)로 주입한 후, 적출된 조직을 파쇄한 후 고정하고, 공초점 현미경으로 형광을 측정한 결과로, GAG를 다량 함유하는 탄성섬유 (elastic fiber) 또는 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)에 우수한 접착성을 나타내며, 후술하는 도 4b의 실험결과와 일치하는 것이다.
도 2f는 도 2e와 동일하나, 마우스의 피부에 처리한 결과이며, 이는 탄성 섬유를 다량 함유하는 조직인 피부 또는 각 조직부위(표피 그리고 진피)의 기질에 대한 우수한 접착성을 나타내며, 이는 후술하는 도 4b의 실험결과와 일치하는 것이다.
도 2g는 도 2f와 동일하나 마우스의 헤어에 처리한 결과이며, 이는 탄성 섬유를 다량 함유하는 탄성 조직인 헤어에 대한 우수한 접착성을 나타내며, 이는 후술하는 도 4b의 실험결과와 일치하는 것이다.
도 2h는 도 2f와 동일하나 마우스의 피하지방 주입한 결과이며, 본원에 따른 펩타이드의 결합조직 (CT)에 대한 우수한 접착성을 나타내는 것이다.
도 2i는 도 2f와 동일하나, 콜라겐 및 GAG를 다량 함유하는 마우스의 안구(eye ball)에 처리한 결과, 처리 30분 후에 관찰 한 결과 안구표면이 강하게 착색되었으며, 이는 본원에 따른 펩타이드의 콜라겐에 대한 우수한 접착성을 나타내는 것이다.
도 2j는 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 헤파린 또는 N-아세틸글루코사민에의 접착성을 상기 물질에 연결된 비드를 이용한 친화성크로마토그래피로 수행한 결과이다. 표지되지 않은 콜드 펩타이드를 추가하는 경우, FITC 신호가 급격히 감소하였으며, 이는 본원에 따른 펩타이드의 상기 물질에 대한 접착성을 나타낸다. 따라서 본원에 따른 펩타이드는 신규한 헤파린 결합성/접착성이 있는 펩타이드로서 약물전달체로써 또는 헤파린이 갖는 항응고 효과를 완하하기 위해, 또는 성장인자에 결합하여 세포외기질에 대한 접근성을 높일 수 있어 이로 인해 세포자극을 더욱 항진시키는데 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
도 2k은 본원의 일 구현예에 따른 Cy3로 표지된 펩타이드의 키틴 (GlcNAc) 또는 베타(1.3)글루칸에 대한 접착성을 나타내는 형광현미경 관찰 결과로 본원에 따른 펩타이드가 FITC 표지된 자이모산(zymosan) 입자에 축적되어 있다. 자이모산입자는 이스트 세포벽을 구성하는 성분으로, 이는 키틴 및 베타(1.3)글루칸으로 구성되어 있으며, 키틴은 N-아세틸글루코사민의 중합체이며, 베타(1.3)글루칸은 글루코스이다.
도 2l은 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 GlcNAc (N-acetylglucosamine)와 MurNAc (N-acetylmuramic acid)로 구성된 프로테오글리칸이 주성분인 그람음성 박테리아 세포벽에의 접착성을 나타내는 결과로 카운터 염색은 DAPI로 수행한 후 형광현미경으로 관찰 하였다.
도 2m은 본원의 일 구현예에 따른 FITC로 표지된 펩타이드의 펩타이드의 GlcNAc (N-acetylglucosamine)와 MurNAc (N-acetylmuramic acid)로 구성된 프로테오글리칸이 주성분인 그람양성 박테리아 세포벽에의 접착성을 나타내는 결과로 카운터 염색은 DAPI로 수행한 후 형광현미경으로 관찰 하였다.
도 3a는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포인 MC3T3-E1의 배양접시에의 접착성 실험을 수행한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군 (PBS로 처리)과 비교하여, 거친 세포막 경계형태를 나타내며, 이는 본원 펩타이드에 의해 세포의 배양접시에의 접착성이 증가된 것을 나타낸다.
도 3b는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포 (MC3T3-E1)의 소수성 배양접시에의 접착능을 나타낸 결과로서, 기존의 세포 접착능 향상에 사용되는 물질인 PLL(poly-L-lysin)과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군 (PBS로 처리 및 PLL)과 비교하여, 접착성이 증가된 것을 나타낸다. 이러한 소수성 배양접시에서의 접착능은 소수성성질을 띠는 다양한 조직이식재료(PCL 등)가 가지는 세포접착의 단점을 보완 할 수 있어, 산업적 응용가치가 높음을 나타내는 것이다.
도 3c는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포 (ST2)의 소수성 배양접시에의 접착능을 매체 대조군과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군과 비교하여, 접착성이 증가된 것을 나타낸다.
도 3d는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 앵커리지 의존성 세포 (C2C12)를 해동한 후, 이의 배양접시에의 접착능을 매체 대조군과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 대조군과 비교하여, 접착성이 증가되었다. 특히 해동직후 세포의 접착능은 세포의 생존에 매우 중요한 영향을 미치며 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드 접착제가 해동 후 세포의 사멸을 최소화 하기 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 일차세포 (primary cell)의 배양 분야에서 유용하게 사용될 수 있어 산업적 응용가치가 높음을 나타낸다.
도 3e는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 마이토마이신 처리된 STO 피더(feeder) 세포의 친수성 배양접시에의 접착능을 음성 대조군(Mock) 및 젤라틴과 비교한 결과로, 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 세포는 현미경 관찰 결과 음성 대조군 및 젤라틴과 비교하여, 접착성이 증가되었음을 나타낸다.
도 3f는 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드의 본 도면에 표시된 다양한 세포 (확립 세포주 및 일차 세포)의 소수성 배양접시에의 접착능을 세포대사 측정을 이용하여 음성 대조군(Mock) 과 비교한 결과이다. 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드는 다양한 종류의 세포에서 음성 대조군과 비교하여, 그 접착성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 본원에 따른 펩타이드의 세포 접착능의 기전을 규명한 분석 결과이다.
도 4a는 A7-1에 의한 세포접착이 세포표면의 전해질 (EDTA 처리 결과)이나 새로운 단백질 합성 (CHX 처리 결과)을 필요로 하지 않는 반면, 혈청에 의해서는 초기에 저해가 일어나는 것을 나타내는 결과로, 이는 혈청내 존재하는 많은 종류의 GAG가 펩타이드에 일차적으로 결합한 것이 원인으로 판단된다.
도 4b는 펩타이드 세포접착 촉진 기전으로 GAG 또는 콜라겐과의 연관성을 분석한 결과로, 위의 도면은 콜라겐과 GAG 모두에 관련되어 있다는 결과로 효소처리에 의해 잠정적 표적을 분해함으로써 나타나는 현상을 관찰한 것이다. 콜라게나제처리에 의한 세포접착의 감소는 적어도 콜라겐과의 상호작용. 그리고 히알루로니다제 처리는 적어도 헤파린 설페이트를 가수 분해함으로써 세포접착이 감소했으며, 이는 GAG 중 헤파린 설페이트와 펩타이드의 상호작용을 나타낸다. 아래 도면은 GAG와의 관련성을 분석한 결과로 헤파린 및 C-설페이트를 첨가한 결과 A7-1을 통해 촉진되는 세포접착능이 농도의존적으로 현저히 감소하였으며, 이러한 결과는 A7-1의 세포접착능과 GAG와의 관련성을 나타내는 것이다. GAG 농도 변화는 다양한 질환과 관련성이 보고되어 있어, 본원에 따른 펩타이드는 신규한, GAG 결합성/접착성이 있는 펩타이드로서 혈액내 GAG를 조절하는 새로운 펩타이드 또는 GAG를 표적화하는 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
도 4c는 A7-1과 용해성 RGDS 펩타이드를 경쟁적으로 처리한 결과로 A7-1 비처리군에서는 용해성 RGDS를 처리할 경우 분착분자인 인테그린(integrin)에 우선적으로 결합하여 바닥(기질에) 대한 접착능을 유의미하게 감소시키지만, A7-1처리군에서는 RGDS를 처리함에도 세포의 접착에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 A7-1은 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가짐을 나타내는 것이다.
도 5a는 본원에 따른 펩타이드의 유도만능줄기세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)에 대한 접착능 향상을 측정하기 위해 제작된 리포터 시스템 및 이를 이용한 실험 절차를 도식적으로 나타낸 것으로, 상기 리포터 시스템은 유도만능 줄기세포의 전분화능 (Stemness)의 지표로 Oct4 유전자의 활성을 측정할 수 있는 구조를 포함한다.
도 5b는 도 5a에 따른 구축물을 이용하여 마우스 유도만능 줄기세포의 접착 및 전분화능 유지를 세포 배양 2일 및 3일째에 Oct4의 발현여부 검출로 측정한 결과로, 대조군으로서 피더세포 및 젤라틴으로 미리 코팅된 배양접시를 사용하였으며, 본원의 일 구현예에 따른 펩타이드는 미리 코팅 (precoated)되거나 또는 배양액에 혼합 (Mixed)되는 방식으로 추가되었으며, 두 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 5c는 도 5b와 동일하나, 세포배양 4일째에 측정한 결과로 본원에 따른 펩타이드는 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 6a는 전분화능을 나타내는 다른 마커인 Alp (alkaline phosphotase) 유전자의 발현을 염색을 통해 관찰한 결과로, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 6b는 전분화능을 나타내는 다른 마커인 Nanog 유전자의 발현을 염색을 통해 관찰한 결과로, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다.
도 6c는 도 6c와 동일한 실험이나 hESC를 이용한 실험결과이며, hESC에 대해서도 피더세포 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외부환경적 변화 없이도 잘 성장할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 7a는 본원에 따른 펩타이드를 이용한 바이오컨쥬게이션 과정을 도식적으로 나타낸 것으로, DSS(Disuccinimidyl suberate) 를 링커를 이용하여 본원의 일구현예에 따른 펩타이드를 골형성 단백질인 BMP2에 컨쥬게이션하였다.
도 7b는 도 7a와 같이 BMP2에 컨쥬게이션된 본원에 따른 펩타이드를 세포배양 접시에 처리한 후 C2C12 세포를 배양한 후 48시간 후에 골분화능 유전자인 Alp의 발현을 측정한 결과로, 재조합 BMP 처리군 (rhBMP2) 또는 가교제 처리군 (CL)과 비교하여 Alp 활성이 증가하였으며, 이는 본원의 펩타이드 처리에 의해 골분화가 촉진된 것을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 본원에 따른 펩타이드의 안전성을 조골세포 (MC3TC-E1) 을 이용하여 테스트한 결과이다.
도 8d는 본원에 따른 펩타이드의 안전성을 테스트한 결과로 마우스의 단핵구 (monocyte)를 분리한 후 펩타이드 자극을 가한 후 염증 유도가 발생하는지 조사한 결과이다.
도 9a 내지 9c는 기존의 접착성 펩타이드와 효과를 비교한 결과이다.
도 9a는 척수 유래의 신경세포를 기존의 펩타이드로 라미닌 (laminin)과 폴리-L-오르니틴 (poly-L-ornithin)으로 코팅된 배양접시 및 본원의 일 구현예에 따른 A7-1으로 코팅된 배양접시를 사용하여 배양한 후 각 시간대별로 CCK-8을 분석한 결과이다.
도 9b는 배양 4일 후 광학현미경을 통해 비교 관찰한 결과이다.
도 9c는 본원의 일 구현예에 따른 A7-1으로 코팅된 일차배양 세포가 신경유래세포가 맞음을 검증한 결과로써, 신경표지 단백질을 면역형광법으로 염색한 후 공초점 현미경을 통해 분석한 결과이다. 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드가 기존의 것과 비교해 월등히 우수한 접착능을 가짐을 나타내는 것이다.
도 10a 내지 10c는 hMSC를 이용하여 세포의 접착진행과정 (adhesion progression)이 A7-1에 의해 촉진됨을 규명하는 결과로써 세포배양 후 6시간을 기준으로 분석한 결과이다.
도 10a는 음성대조군은 여전히 접착초기단계인 액틴-링 형성이 다수를 이루고 있지만, A7-1 처리군의 경우 이미 그 단계를 지나 스트레스 파이버 형성이 다수의 세포에서 관찰되었음을 나타낸다.
도 10b는 상기 관찰결과를 정량한 그래프이다.
도 10c는 세포 접착에 따른 기하학적 양태 (geometric shape) (cell aspect ratio: 세포의 가로/세로의 비율, 1일 경우 완전한 원형이며 접착과정의 가장 초기 상태로 나타냄) 을 측정하여 나타낸 결과로써 A7-1의 처리군에서 월등히 성숙된 접착능을 보여 준다.
도 11은 본원에 따른 다양한 서열을 갖는 펩타이드와 GAG와 같은 세포외 기질간의 상호작용을 통하여 나타나는 세포 접착능 촉진을 측정한 결과이다.
한 양태에서 본원은 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 I]
하기 화학식 I의 펩타이드:
[화학식 I]
[X1 - X2 - X3 - X4- X5]n
상기 화학식 I에서
X1은 극성의 비하전된 임의의 아미노산이고,
X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E 및 A 중 어느 하나의 아미노산이며, 각각 동일 또는 상이하며,
X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 n은 1 내지 5의 정수이며, 상기 n이 2 이상인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이할 수 있으며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
본원에 사용된 용어 “아미노산은”은 20개의 천연에서 발견되는 아미노산 및 비천연 아미노산, 생체내에서 번역 후에 변형되는 아미노산 예를 들면 포스포세린 및 포스포쓰레오닌; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 노르-발린, 노르-루이신과 같은 기타 희귀 아미노산; 세포 투과 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함하며, 거울상 이성질체인 D- 및 L-형태를 모두 포함하는 것이다. 본원에서 양하전 아미노산, 음하전된 아미노산, 극성의 비하전된 아미노산 및 비극성의 지방족 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 양하전된 아미노산은 K 또는 R이다.
다른 구현예에서, 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
또 다른 구현예에서 상기 극성의 비하전된 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
또 다른 구현예에서 상기 비극성의 지방족 아미노산은 G, A, L, V, M 또는 I이다.
본원에서 사용된 용어 천연 및 비천연에서 전자는 세포, 조직 또는 생체내에서 발견되는 형태의 화합물을 칭하는 것이고, 후자는 이러한 화합물에 다양한 목적을 위해 인위적 변형이 가해진 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 “펩타이드”, “폴리펩타이드”는 서로 교환적으로 사용되며, 아미노산의 단위체가 공유결합으로 연결된 분자를 일컫는 것이다. 이는 원(native) 아미노산 또는 그 분해 산물, 합성 펩타이드, 재조합 방식으로 제조된 펩타이드, 펩타이드 모방체 (전형적으로 합성 펩타이드), 및 펩토이드 및 세미펩토이드와 같은 펩타이드 유사체와 세포 투과 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, N-말단 변형, C-말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함한다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.
본원에서 용어 접착은 부착 및 흡착을 포함하는 것으로, 가역적, 비가역적 접착을 포함하며, 다른 측면에서는 공유결합, 이온결합, 반데르발스 결합, 수소결합 등을 포함하는 하나 이상의 화학적 결합에 의한 접착을 포함한다.
본원에 따른 화학식 I의 화합물은 제 1 영역으로써 세포막 또는 세포표면과의 결합에 관여할 뿐만 아니라 서열의 갯수를 다양하게 적용함에 따라 본원에 개시된 다양한 목적에 사용될 수 있다. 제 1 영역은 소수성 특성을 가짐으로써 분자간 소수성결합, 세포와의 소수성 결합에 관여하며, 펩타이드의 2차구조에 영향을 줄 수 있는 핵심 영역으로써 후술하는 다른 기능영역의 분자특성을 잘 유지하게 해준다. 이 영역이 가지는 소수성 특성으로 인하여 조직재생을 위한 다양한 나노구조 지지체, 겔의 조성 등에 활용될 수 있다.
본원에 따른 펩타이드에서 제 1 영역은 5개의 아미노산으로 구성되며, 이러단위체가 한 개 이상 포함될 수 있으며, 두 개이상 포함하는 경우, 각 단위체는 상이하거나 동일할 수 있다. 단위체의 개수는 펩타이드의 제조, 보관, 전달 또는 후술하는 본원에 따른 펩타이드의 효능과 용도를 위해 다양한 기능화(functionalization)를 유도할 수 있는데, 이 과정에서 단위체는 다양한 경우의 수로 변형될 수 있다. 예를 들면 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 1개를 포함한다.
화학식 I에서 X1 은 임의의 아미노산이고, 일 구현예에서는 극성의 비하전된 아미노산, 또는 다른 구현예에서는 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
화학식 I에서 X2, X3 및 X4 는 각각 L, V, I, E 및 A중 하나로, 각 잔기는 동일 또는 상이할 수 있으며, X2- X3- X4 서열은 예를 들면 AAA, EEE, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, LLV 등 일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 화학식 I은 X1-LVV-X5 , X1-AAA-X5 또는 X1-EEE-X5 일 수 있다.
일구현예에서 화학식 I의 서열은 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5) 로 표시된다.
다른 측면에서 본원은 하기 화학식 II의 화합물, 또는 상기 화학식 I의 화합물에 하나 이상의 하기 화학식 II의 화합물을 추가로 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 II]
[X6- X7- X8- X9 X10-X11]n,
상기 화학식 II에서
X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
X10 는 임의의 아미노산이고,
X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X7 및 X8 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고,
상기 화학식 II의 화합물은 상기 화학식 I의 화합물의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결될 수 있다. 본원에 따르면 상기 화학식 II의 화합물은 제 2 영역으로서, 펩타이드 단일 분자로써 존재할 경우 제 1 영역과 함께 알파-헬릭스 구조를 쉽게 만들 수 있는 특성을 지닌 서열로 쉽게 해리될 수 있는 친수성 특성을 부여한다.
화학식 I의 제 1 영역과 화학식 II의 제 2 영역은 각각 1개 이상 포함될 수 있으며, 그 배열도 다양할 수 있다. 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개 이상씩 연결되어, 화학식 I- II의 펩타이드, 화학식 I-화학식 I-화학식 II-화학식 II의 구조를 갖거나 또는 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개씩 순차적으로 연결되고, 이 것이 다시 연결되어, 화학식 I-화학식 II-화학식 I-화학식 II 과 같은 구조를 포함할 수 있거나, 또는 화학식 I-화학식 II- 화학식 I, 또는 화학식 II-화학식 I- 화학식 II와 같은 구조를 포함할 수 있다. 상기 구조에서 화학식 I 및 II의 순서가 바뀔 수 있다.
본원의 일 구현예에서 상기 화학식 II의 펩타이드는 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14)로 표시된다.
다른 측면에서 본원의 화학식 I의 펩타이드, 또는 화학식 I 과 II를 모두 포함하는 펩타이드는 화학식 III의 X121-15 으로 표시되는 제 3 영역을 그 N 또는 C 말단에 추가로 포함할 수 있으며, 상기 X12는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산이다.
일 구현예에서 상기 화학식 III에서 양하전된 아미노산은 K 또는 R이다.
다른 구현예에서 상기 화학식 III에서 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
또 다른 구현예에서, 상기 화학식 III에서 상기 극성의 비하전된 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 펩타이드는 예를 들면 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: RQLVVK (서열번호 15); FRALPC (서열번호 6); FRALPCRQLVVK (서열번호 16); RQLVVKFRALPC (서열번호 17); RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18); RQLVVKFRALP (서열번호 19); RQLVVKFRAL (서열번호 20); KQLVVKFRALPC (서열번호 21); RQKFRALPC (서열번호 22); RQEEEKFRALPC (서열번호 23); RQAAAKFRALPC (서열번호 24); RQLVVKFRPC (서열번호 25); RQLVVKFREEPC (서열번호 26); RQLVVKFRVVPC (서열번호 27); RQEEEKFREEPC (서열번호 28); EQLVVEFEALPC (서열번호 29); RQLVVKYRALPC (서열번호 30); RQLVVKWRALPC (서열번호 31); RNLVVKFRALPC (서열번호 32); RSLVVKFRALPC (서열번호 33); R-(QLVV)2-KFRALPC (서열번호 34); R-(QLVV)3-KFRALPC (서열번호 35); R-(QLVV)4-KFRALPC (서열번호 36); RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37); (R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38); (R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39); (R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40) ; 및 (R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41).
또 다른 구현예에서 본원의 펩타이드는 예를 들면 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: RQLVVKFRALPC (서열번호 17); KQLVVKFRALPC (서열번호 21); RNLVVKFRALPC (서열번호 32); RSLVVKFRALPC (서열번호 33); RQVVVKFRALPC (서열번호 42); RQIVVKFRALPC (서열번호 43); RQAVVKFRALPC (서열번호 44); RQEVVKFRALPC (서열번호 45); RQLLVKFRALPC (서열번호 46); RQLIVKFRALPC (서열번호 47); RQLAVKFRALPC (서열번호 48); RQLEVKFRALPC (서열번호 49); RQLVLKFRALPC (서열번호 50); RQLVIKFRALPC (서열번호 51); RQLVAKFRALPC (서열번호 52); RQLVEKFRALPC (서열번호 53); RQAAAKFRALPC (서열번호 24); RQEEEKFRALPC (서열번호 23); RQLVVRFRALPC (서열번호 54); RQLVVKYRALPC (서열번호 30); RQLVVKWRALPC (서열번호 31); RQLVVKFKALPC (서열번호 55); RQLVVEFEALPC (서열번호 56); RQLVVKFRLLPC (서열번호 57); RQLVVKFRILPC (서열번호 58); RQLVVKFRVLPC (서열번호 59); RQLVVKFRELPC (서열번호 60); RQLVVKFRAAPC (서열번호 61); RQLVVKFRAIPC (서열번호 62); RQLVVKFRAVPC (서열번호 63); RQLVVKFRAEPC (서열번호 64); RQLVVKFRVVPC (서열번호 27); RQLVVKFREEPC (서열번호 26); RQEEEKFREEPC (서열번호 28); RQEEEEFEEEPC (서열번호 65); RQLVVKFRALXC (서열번호 66); RQLVVKFRALPS (서열번호 67); RQLVVKFRALPT (서열번호 68); 및 RQLVVKFRALPX (서열번호 69). 상기 펩타이드는 본원에서 합성된 다양한 변이를 갖는 12mer의 서열 및 접착 실험결과를 근거로 하기 기술된 사항을 고려하여, 가능한 변이를 도입하여 생성된 서열로 그 효과 또한 본원 실시예에 기재된 것과 같이 본원에서 개시된 것으로부터 예측가능하며, 따라서 본원의 범위에 포함되는 것이다.
하지만 본원에 따른 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물 (biologically equvalents)를 포함하는 것이다. 즉, 아미노산 서열에 추가적인 변형을 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 이러한 것을 고려하면, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한 아미노산 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
상기와 같은 소수성 인덱스는 특히 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산간의 치환이 유리하다.
또한 유사한 친수성 수치(hydrophilicity value)를 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다.
예를 들면 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
또한 본원에 따른 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 예를 들면 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있다.
따라서, 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상술한 본원에 따른 펩타이드는 C-말단이 비반응성기 예를 들면 NH2 등과 같은 기로 치환되어 안정성을 높일 수 있다.
본원에 따른 펩타이드는 다양한 생체 유래 또는 비생체 유래의 물질 또는 그 표면에 접착될 수 있으며, 이러한 특징을 이용하여, 하나의 물질과 이와 동일 또는 상이한 물질간의 접착을 매개할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 펩타이드를 이용할 경우, 인비트로 배양되는 세포를 배양접시에 접착시킬 수 있으며, 세포와 세포간 접착을 매개하거나, 또는 형광물질 등과 같은 표지물질과 결합된 펩타이드를 사용할 경우, 세포, 조직 등의 표지에 사용될 수 있으며, 유용한 생활성 물질 예를 들면 골형성단백질 등과 같은 물질을 본원의 펩타이드에 결합시켜, 생활성 물질이 효과를 나타낼 것으로 기대되는 조직에 처리할 경우, 치료 효과를 높일 수 있다.
본 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 본원에 따른 펩타이드는 펩타이도글리칸층에 대한 친화도가 있으며, 나아가 미생물의 세포벽 성분 (lipopolysaccharide 성분 포함)은 물론, 이스트의 세포벽 성분((1,3)-베타글루칸을 포함)에 선택적으로 결합할 수 있어, 다양한 응용분야에 사용될 수 있다.
또한 본원에 따른 펩타이드는 다양한 화합물을 엡실론 아미노기에 결합시키는 방식으로 약물전달체로써의 기능을 탑재하여 활용될 수 있다.
본 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 본원에 따른 펩타이드는 프로테오글리칸에 대한 높은 친화력을 나타내며, 프로테오글리칸을 연골을 형성하는 조직 구성 성분으로 조직재생 분야에서 응용가치가 매우 넓고 성형을 포함한 다양한 임상시술에 직접적으로 활용되는 물질들을 포함한다. 따라서 본원에 따른 펩타이드는 연골을 연골재생, 약물전달 등에 널리 활용될 수 있다. 본원에 따른 펩타이드는 물질, 특히 생체유래 물질 예를 들면 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부를 의미하며, 일예로는, 세포, 조직, 기관을 포함하는 생체물질의 표면으로의 접착을 유도한다.
이러한 측면에서 본원은 펩타이드는 약물, 표지물질, 또는 표적물질을 추가로 포함할 수 있다.
또다른 측면에서 본원은 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 바이오컨쥬게이팅용 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서 본원은 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 생체유래 물질 또는 비생체 유래 물질 접착용 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 펩타이드 또는 조성물이 적용될 수 있는 세포는 특별히 제한되지 않으며, 식물, 곤충 및 동물 세포에 적용될 수 있으며, 예를 들면 동물세포, 특히 사람 유래 세포에 적용될 수 있다. 예를 들면 다분화능 세포, 성체 줄기세포, 전구세포, 또는 전구세포의 접착에 사용될 수 있다. 다분화능 세포의 예로는 ES 세포, GS 세포, 및 iPS (유도만능줄기세포) 세포를 포함한다. 성체 줄기세포로는 MSC (mesenchymal stem cells), 조혈모세포, 신경줄기세포를 포함한다. 전구세포의 예로는 피부, 진피, 내피, 표피, 근육, 심근, 신경, 골, 연골, 뇌, 상피, 심장, 신장, 췌장, 비장, 구강, 각막 또는 모발 유래의 세포를 포함한다.
인간 유래 세포의 예로는 ES 세포 iPS 세포, MSC, 연골세포, 골모세포, 골전구세포, 중간엽세포, 근아세포, 심근세포, 신경세포, 간세포, 배아세포, 섬유세포, 각막상피세포, 각막내피세포, 혈관내피세포, 및 조혈모세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 치료의 목적을 위해서 세포는 자가, 타가 유래일 수 있다.
본원의 조성물이 적용될 수 있는 표면은 특별히 제한되는 것은 아니며, 친수성 또는 소수성의 유기물 또는 무기물 표면을 모두 포함하는 것이다. 일 구현예서 본원의 조성물이 적용될 수 있는 표면은 생체 유래 물질 또는 플라스틱, 유리, 고분자합성수지 및 금속을 포함하는 비생체유래 물질을 모두 포함하는 것이다.
본원에 따른 펩타이드 또는 조성물의 용도는 이에 한정되지 않으나, (1) 수 (물 또는 염분이 있는 물) 중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접합, 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; (7) 줄기세포를 포함하는 세포 또는 조직 배양; (8) 인공장기, 치과, 외과 또는 안과용 의료장치 예를 들면 임플란트, 골고정제, 골케이지, 가이드와이어, 카테터 및 스텐트를 포함하는 의료장치의 기저 물질 및 (9) 생리활성물질을 포함하는 다양한 생체물질 예를 들면 생체활성 물질, 약물, 표지물질, 또는 표적물질 등에 대한 바이오컨주게이션 등에 이용될 수 있다.
일 구현예에서는 본원의 펩타이드 또는 조성물은 질환의 치료를 위한 세포 또는 조직의 이식 또는 재건을 위한 치과적, 안과적 또는 정형외과적 치료에 사용되며, 이 경우 본원의 접착 조성물이 적용될 수 있는 표면은 이로 제한하는 것은 아니나, PLGA, 하이드록시아파타이트, 지르코니움, 타이타늄, 철, 스텐레스 스틸, 티타늄, 백금, 금, 합금을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또 다른 구현예에서 본원의 펩타이드 또는 조성물은 지지체(support)로의 세포의 접착에 사용된다. 본원에서 세포 접착 표면 또는 지지체는 세포배양 접시, 마이크로비드, 기저물질, 조직 이식물 등을 포함하며, 예를 들면 조직 또는 세포의 배양, 특히 줄기세포의 배양 등에 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 본원의 펩타이드를 이용한 경우, 기존 세포 접착에 사용하는 물질과 비교하여 월등히 높은 접착력을 나타냈다 (도 1, 2, 3, 4, 5 및 6 등 참조).
또 다른 구현예에서 본원의 펩타이드 또는 조성물은 바이오컨쥬게이션에 사용된다. 바이오컨주게이션이란 두 개의 바이오분자를 안정한 공유결합으로 연결하는 화학적 방법/수단을 일컫는 것으로, 본원에 따른 펩타이드는 직접 또는 저분자 링커를 사용하여, 다양한 바이오분자 예를 들면 효소, 호르몬으르 포함하는 단백질, 핵산, 지질 또는 탄수화물에 연결될 수 있다. 이러한 바이오컨쥬게이션은 연구용 툴로서, 생화학적 물질의 검출, 모니터링 등에 사용될 수 있거나, 또는 치료제로서 치료용 물질과 컨쥬게이션되어, 치료의 효율성을 높이거나, 표적 치료에 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 골형성 단백질에 컨쥬게이션되어, 골형성 단백질의 치료 효과를 증가시킨다.
본원에 따른 펩타이드 및 조성물의 사용방법은 통상의 생체접착 조성물의 사용방법에 준하며, 대표 적인 방법은 도포법이다. 예를 들면 본원에 따른 펩타이드 또는 조성물의 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 제품인 Cell-Tak® (BD Biosciences, USA)를 참조할 수 있다.
본원에 따른 조성물은 용제형, 수용성, 무용제 형일 수 있으며, 적용되는 표면의 면적을 기준으로 0.1 내지 1000 ng/mm2, 특히 1 내지 100 ng/mm2로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 따른 조성물은 계면활성제, 산화제, 가교제, 또는 충진제(filler)로 처리하거나, 또는 펩타이드의 농도를 조절함으로써 상기 접착력 및 이에 맞추어 적용양을 조절할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 접착성 펩타이드의 제조
실험에 사용된 펩타이드는 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) (Fmoc) 방법을 통하여 합성된 것으로 주문제작 하였다 (루젠 Sci, 대한민국; 펩트론, 대한민국). 펩타이드 효과의 재연성 검증을 위하여 두 개의 회사를 통해 각 각 3회(루젠) 그리고 2회(펩트론)의 펩타이드 합성을 수행하였으며, 각 각의 합성물에 대해 독립된 실험을 통해 분석을 하였으며, 합성회차별로 동일한 결과를 수득하였다.
실시예 2. 접착성 펩타이드와 형광 물질의 컨쥬게이션 및 이의 다양한 비생체 유래 표면에의 접착성 분석
실시예 1의 펩타이드는 A7-1 (RQLVVKFRALPC; 서열번호 20)(하기 표 1의 12mer (A) 서열에 해당)은 바이오틴 (Thermo Scientific), 그리고 FITC (Sigma)를 Cys에 SH기를 통해 각 각 컨쥬게이션 시켰다. 이어, 이를 유리, PCL, Ti, Col, Zr, 비닐, PS 파이버에 처리한 후 (PBS 중 각 10 μM, 상온에서 20분 흡착 후 PBS로 1회 세척), 접착여부는 LAS (Fuji, 일본)를 이용한 FITC 형광 이미지 측정을 통해 검출하였다. 펩타이드에 공유결합된 바이오틴을 유리시키기 위하여 DTT(PBS 중 100 mM, 상온에서 20분 처리 후 1회 세척)로 처리하여 환원반응을 유도하였다. 대조군으로는 염료만을 사용하였다.
결과는 도 1a 내지 도 1d에 기재되어 있으며, 항체의 검출은 본원에 따른 바이오틴은 본원에 따른 펩타이드를 통해 실험에 사용된 표면에 강하게 접착되었으며, 특히 이러한 효과는 DTT를 처리에 의해 사라졌으며 (도 1a), 이는 바이오틴 또는 FITC가 본원 펩타이드를 통해 유리에 접착됨을 나타내는 것이다.
실시예 3. 본원에 따른 접착성 펩타이드의 다양한 비생체 및 생체유래 물질에 대한 접착성 분석
실시예 2와 기본적으로 동일한 실험을 수행하였으며, 유리 대신에 골이식재로 널리 사용되는 Bio-OSS® (Geistlich Pharma, Inc) 및 MBCPTM (Biomatlante)를 사용하였다. 처리 조건은 다음과 같다: Bio-Oss입자를 10μM농도의 펩타이드-FITC 컨쥬게이트에 첨가하여 상온에서 10분간 반응시키고, 이어서 0.05% tween-20을 함유하는 PBS 용액에서 48시간 동안 5회 세척. 처리 후 공촛점 현미경으로 분석하였다. (Zeiss LSM-700 model with Zen 2011 software, x20)
또한 인비보상에서 펩타이드의 접착능을 검증하기 위하여 다양한 조직에 주입후 조직절편을 얻어 분석하였다. 펩타이드의 접착을 확인하기 위하여 PBS, Cys-또는 FITC-컨쥬게이트 A7-1, 또는 Cys 또는 FITC 염료를 10μM 농도로 PBS에 녹인 후 10-20μl의 수용액을 국부에 바르거나 주사기로 주입하였다. 조직내 접착유도시간은 2시간으로 고정하여 실험을 수행하였으며, 희생후 조직적출 후 PBS에서 30분씩 3회 세척후 조직절편을 만들어 공초점 현미경으로 분석하였다. 실험을 수행한 조직은 마우스의 연골, 피부, 헤어, 피하지방 및 안구를 중심으로 수행하였으며, 연골의 경우 콜라게나제를 부분적으로 처리하여 엘라스텍 파이버 구조를 노출 시킨 후 강한 세척 후 분석하였다.
결과는 도 2a 내지 도 2m에 기재되어 있으며, 본원에 따른 펩타이드가 비생체 및 생체 유래의 다양한 물질에 접착될 수 있음을 나타내는 것이다. 본원에 따른 펩타이드의 상용화 골이식재에의 우수한 접착성을 나타내며, 특히, 프로테오글리칸 성분이 다량 함유되어 있는 조직, 예를 들면 탄성조직, 결합조직 그리고 콜라겐 또는 히알루로난(hyaluronan)을 다량 함유하는 조직, 그리고 이스트, 박테리아 세포벽 등에 접착 친화성이 있음을 나타내는 것이다.
또한 본원의 펩타이드는 프로테오글리칸의 주성분인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate) 등의 GAG (glycoaminoglycan)을 다량 함유하는 연골조직(*)조직에서 우수한 접착성을 나타내며, 후술하는 도 4b의 실험결과와 일치하는 것이다. 참고로 GAG는 네 종류의 물질 즉 히알루론산 (hyaluronic acid), 데르마탄 황산(dermatan sulfate), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate), 헤파린 및 헤파란 황산 (heparin, heparan sulfates), 그리고 케라틴황산(keratan sulfate)을 포함한다. 이들은 모두 사실상 아민기가 결합된 글루코스 또는 갈락토스인 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 또는 N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 등으로 구성되는데, 이는 본원에 따른 펩타이드가 이러한 육탄당에 높은 친화성을 가짐을 나타내며, 이는 본원 발명에 따른 펩타이드의 표적 특이적으로 작용가능함을 나타내는 것이다.
실시예 4. 접착성 펩타이드를 이용한 세포 접착성 향상 효과
본 실험에 사용된 재료는 다음과 같다: PBS 중의 10 mM의 펩타이드 용액 (저장용액, Stock solution); 35mm 직경의 플라스틱 소수성세포배양접시 (세균배양용, Corning); DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, 세포배양 배지: Hyclone); 우태혈청 (fetal bovine serum, Hyclone); 및 C2C12 (mouse myoblast, 세포, ATCC, CRL-1772); MC3T3-E1 (Mouse C57BL/6 calvaria cell, ATCC, CRL-2593) 및 ST2 (bone marrow-derived stroma cell: EMBO J. 7:1337?1343, 1983); STO (feeder 세포: ATCC, CRL-1503), HEK-293 (ATCC, CRL-1573), SaOS2 (ATCC, HTB-85), HeLa(ATCC, CCL-2), ROS17/2.8, NIH3T3 (ATCC, CRL-1658), RAW264.7 (ATCC, TIB-71), hMSC (Lonza, PT-2501), hPDL(HPLF) (Sciencell, Cat.#2630) hDPSC (Cells Tissues Organs 184: 105?16 방법에 의거 인체조직으로부터 분리), mBMSC (Primary Bone Marrow Stromal Cell from mouse), MC (Primary Mouse Calvaria cell), MEF (Mouse Embryonic Fibroblast)
실험방법은 다음과 같다.
세포접착에는 펩타이드를 미리 코팅하는 방법과 코팅하지 않고 세포배양액에 직접 첨가하여 배양하는 두 가지의 방법으로 관찰 했으며, 일치하는 결과를 나타냈다. 코팅방법을 취할 경우 PBS 또는 우태혈청을 포함하지 않은 세포배양배지에 일정 농도의 펩타이드를 첨가하여 상온, 30분간 코팅한 후, 용액을 제거한 후 세포를 첨가하여 다양한 시간에 걸쳐 접착을 측정하였다. 또한 배양배지에 펩타이드를 첨가 할 경우 세포를 현탁할 때 일정 수준의 펩타이드를 함께 첨가하여 잘 현탁한 후 배양접시로 옮겼다. 세포접착 측정은 다음과 같이 수행되었다. 세포접착은 펩타이드를 첨가하지 않은 경우를 음성 대조군으로 PBS 그리고 poly-L-lysin을 코팅한 경우를 양성대조군으로 하여 광학 현미경을 통한 일반적 관찰, 액틴 필라멘트 구조 및 거친 세포막 경계형태 관찰을 위하여 F-actin 염색 및 공초점 현미경 분석 그리고 접착에 대한 정량화를 위해 세포의 대사량 또는 DNA 양을 측정하였다. 대사량은 CCK-8 (Dojindo)을 이용하여 흡광도를 측정하였고, DNA양은 피코그린 정량 키트(Picogreen assay kit (Life Technologies))를 제조자의 방법대로 이용하여 형광값을 측정하였다. 접착된 세포만을 정량화하기 위하여 접착되지 않은 세포는 버리고 PBS로 다시 2회 세척하여 표면에 붙어 있는 세포만을 대사량 또는 DNA를 정량에 사용하였다.
결과는 도 3a 내지 3f에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 본원에 따른 펩타이드는 다양한 유래의 앵커리지 의존적 세포의 접착, 예를 들면, 일차세포, 확립된 세포 및 해동된 세포, 피더세포의 접착에 유용하게 사용될 수 있으며, 기존에 사용되던 물질인 PLL과 비교하여 월등하게 우수한 효과를 나타냈다.
실시예 5. 접착성 펩타이드의 접착 기전 규명
본 실시예에서는 본원에 따른 펩타이드 접착능 기전을 규명하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(1) 단백질 관여 여부
우선, 단백질 합성을 저해하는 것으로 알려진 EDTA, 사이클로헥사미드 (CHX) (10 μM, 37 ℃ 1시간) 또는 GAG 처리 후 상술한 바와 같이 접착능을 실험하였다.
결과는 도 4a에 있으며, 이에 나타난 바와 같이 EDTA 또는 CHX를 처리한 경우에도 접착능에 차이가 없는 것으로 나타났다. 즉, A7-1에 의한 세포접착이 세포 표면의 전해질 (EDTA 처리 결과)이나 새로운 단백질 합성 (CHX 처리 결과)을 필요로 하지 않는 반면, 혈청에 의해서는 초기에 저해가 일어나는 것을 나타내는 결과로, 이는 혈청내 존재하는 많은 종류의 GAG가 펩타이드에 일차적으로 결합한 것이 원인으로 판단된다. 혈청내 존재하는 GAG의 농도변화는 다양한 질환의 발생과 관련성이 있는 것으로 보고되었다 (Volpi N. et al., Biochim Biophys Acta. (1995) Vol.18: 49-58; Komosinska-Vassev K. et al., Clin Chim Acta. (2003) Vol.331: 97-102; Anttonen A. et al., Lung Cancer. (2003) Vol.41: 171-7; Fuster M.M. et al., Nat Rev Cancer. (2005) Vol.5: 526-42; Hong Lu et al., 2010. Glycobiol. Insights Vol.2: 13-28; Anower-E-Khuda M.F. et al., Glycobiology. (2013) Vol.23: 865-76; Ibrahim S.A. et al., J. of Medical Lab. & Diagnosis (2013) Vol.4: 8-20). 따라서 본원에 따른 펩타이드는 신규한, GAG 결합성/부착성이 있는 펩타이드로서 혈액내 GAG를 조절하는 새로운 펩타이드 또는 GAG를 표적화하는 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 또한 본원에 따른 펩타이드는 세포막 단백질과의 상호작용을 통해 접착능을 증가시키는 것이 아님을 나타내는 것이다.
(2) 비단백질성 물질 관여 여부
다음으로는 비단백질 물질의 관여여부를 조사하였으며, 그 대상으로 세포표면의 세포외메트릭스 (Extracellualr matrix, ECM)에 다량 함유되어 있는 탄수화물 지질인 프로테오글리칸과의 관련성을 분석하였다.
- 프로테오글리칸에 대한 펩타이드의 분자 친화력
프로테오글리칸을 구성하는 주요 성분들인 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 콘트로이틴 황산(chondroitin sulfate), 데르마탄 황산(dermatan sulfate), 케라탄 황산(keratan sulafate) 등의 글리코아미노글리칸(glycoaminoglycan) (GAG)는 ECM을 구성하는 주요성분들이기도 하지만, ECM 구조의 보존성 (structural integrity of ECM)을 유지하여 세포의 형태를 유지할 뿐만 아니라, 세포의 접착, 세포의 극성 (cell polarity)을 조절한다. ECM이 갖는 이러한 기능은 환경에 대한 세포의 적응을 유도할 뿐만 아니라 복잡한 일련의 대사과정과 직접적으로 연관되어 있어서 다양한 생리학적 역할을 조절하는 복합적 기능을 가진다.
프로테오글리칸에 대한 본원 펩타이드의 분자 친화력은 (i) 친화크로마토그래피, (ii) 정제된 GAG 성분을 이용한 경쟁적 결합을 통한 세포접착, (iii) GAG성분을 포함하는 ECM을 특이적으로 분해하는 효소를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진의 억제, 이상의 세 가지 방법을 통하여 검증하였다. 효소처리의 경우 히알루로니다아제(hyaluronidase(Sigma)), 콜라게나아제(collagenase (Sigma))를 처리하였다. 정제된 GAG 는 hyaluronan (Sigma), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate (Sigma)), 헤파린(heparin (Sigma)), 헤파란 황산(heparan sulfate (Sigma))를 각 각 사용하였다.
(i) 친화크로마토그래피를 이용한 펩타이드-헤파린 또는 펩타이드-N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)과의 상호작용 측정
크로마토그래피를 위해 헤파린-아가로스 비드(heparin-agarose bead (Biovision)) 그리고 GlcNAc-아가로스 비드 (Sigma)를 각 각 사용하였다. PBS-T용액에 10 ng의 FITC로 표지된 펩타이드 (F-펩타이드)를 BSA로 미리 코팅된 헤파린-아가로스 비드 그리고 GlcNAc-아가로스 비드과 상온에서 10분간 반응 시킨후 PBS-T용액에서 3회 세척후 다시 PBS용액에 현탁한 후 형광을 측정하였다. 경쟁적 결합을 유도하기 위하여 FITC가 표지되지 않은 펩타이드 (Cold)를 각 각 1:1, 1:10(10배) 그리고 1:100(100배)만큼 첨가한 후 비드와 반응시킨 후 형광을 측정하였다. 음성대조군으로써 FITC 염료만을 각 비드에 반응시켜 측정하였으며, 단지 bead를 PBS에 현탁한 다음 마이크로 플레이트로 옮겨 측정되는 형광값을 블랭크로 사용하였다. 도4b에 나타난 결과는 헤파린 또는 GAG의 구성 성분인 GlcNAc에 펩타이드가 높은 친화력을 가지고 있음을 나타낸다.
(ii) 정제된 GAG 성분을 이용한 경쟁적 결합을 통한 세포접착능 조사
다음은 GAG처리에 의한 경쟁적 억제 방식에 의한 접착성 펩타이드에 의한 세포접착 저해를 나타내는 결과로써 펩타이드에 의한 세포의 접착 촉진은 헤파린, 헤파란 황산, 그리고 콘드로이틴 황산을 첨가할 경우 세포접착이 크게 저해 되었다.
(iii) GAG성분을 포함하는 ECM을 특이적으로 분해하는 효소를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진의 억제: ECM을 구성하는 프로테오글리칸(proteoglycan) 뿐만 아니라 콜라겐 등의 피브릴 단백질들은 GAG를 포함한다. GAG를 포함하는 콜라겐을 가수분해 하거나 GAG의 하나인 히알루로난을 가수분해하는 히알루로니다아제를 처리하여 펩타이드에 의한 세포접착 촉진능을 조사한 결과 모두 세포접착능력이 저해디는 것으로 나타났다. 이 역시 펩타이드에 의한 세포접착 촉진이 GAG와의 상호관련이 있음을 나타내는 증거이다.
실험방법은 다음과 같다: (i) 정제된 GAG 성분 처리에 의한 경쟁적 억제는 트립신으로 처리된 세포현탁액에 각 각의 GAG를 5mg/ml 되도록 첨가하고 37℃에서 10분간 반응 후 펩타이드가 코팅된 배양접시에 옮긴 후 30분 후 접착된 세포에 대한 DNA를 정량화 하여 접착정도를 측정하였다. DNA정량은 피코그린 정량 키트(picogreen assay kit (Life Technologies))를 이용하여 수행하였다; (ii) 콜라게나아제, 히알루로니다아제 처리에 의한 세포접착 조사는 트립신으로 처리된 세포를 우태혈청을 포함하지 않는 배지에 현탁시킨 후 각 효소를 첨가 후 37도에서 30분간 반응하였다. 효소는 10,000 unit/ 103 cell 수준에서 처리하였으며 효소반응 후 EDTA 및 우태혈청을 첨가하여 효소의 활성을 불활성화 시킨 후 원심분리 후 새로운 배지에 현탁한 후 펩타이드가 코팅된 배양접시에서 2시간 배양하였다. 접착된 세포의 측정은 피코그린 정량(picogreen assay)을 수행 하기전 PBS로 2회 세척 후, 접착된 세포만 회수하여 DNA를 정량화 하였다.
결과는 도 4b에 기재되어 있다. 결과는 본원의 펩타이드가 프로테오글리칸에 대해 높은 친화력이 있음을 보여주는 결과로, 연골을 형성하는 조직 구성 성분은 조직재생 분야에서 응용가치가 매우 넓고 성형을 포함한 다양한 임상시술에 직접적으로 활용되는 물질에 대한 접착능을 나타내는 것이다. 따라서 이는 본원의 펩타이드가 연골을 포함한 프로테오글리칸층과의 우수한 결합능은 연골재생, 약물전달 등에 널리 활용될 수 있는 잠재적 물질임을 나타내는 것이다.
(3) RGD와 비교
엥커리지 의존적 세포 (MC3T3-E1)에 A7-1 펩타이드 (10uM) 또는 이와 함께 용해성 RGDS 펩타이드 (0, 10, 100 및 1000μM) 를 시험튜브에서 세포와 함께 10분간 반응하여 경쟁적으로 처리한 후, 배양접시에 옮긴 후 다시 10분간 항온기에서 접착을 유도하였다. 10분 후 다시 배양액을 제거하고 PBS 용액으로 2회 세척하여 남아있는 미접착 상태의 세포를 제거하였으며, 펩타이드를 포함하지 않는 새로운 배지와 CCK-8 (Dojindo)를 혼합하여 항온기에서 1시간 반응 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. CCK-8과 혼합된 배지를 블랭크로 하여 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 4c에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, RGDS 펩타이드를 단독으로 처리한 경우, 농도의존적으로 접착이 감소되는 것으로 나타났다. 반면 A7-1과 RGD 펩타이드를 경쟁적으로 처리한 경우, A7-1 비처리군에서는 수용성 RGD를 처리할 경우 인테그린에 결합하여 바닥(기질에) 대한 접착능을 유의미하게 감소시키지만, A7-1 처리군에서는 RGD를 처리함에도 세포의 접착에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 A7-1은 RGD가 작용하는 인테그린을 통한 앵커리지 의존적 세포접착과는 별개의 세포 접착촉진 기전을 가짐을 나타내는 것이다.
이러한 결과는 RGDS 펩타이드를 이용한 세포접착 또는 조직 재생기술이 이미 잘 확립되었고 있는데, 이와는 다른 기전으로, 기술적 차별성이 있음을 나타내며, 또한 RGDS를 이용한 상용화 기술들은, 효율성이 좋지 않다고 알려져 있으며, 이를 대체할 수 있는 우수한 기술임을 나타낸다.
실시예 6. 접착성 펩타이드를 이용한 배아줄기세포 접착성 향상 효과
펩타이드를 100 μM 수준에서 배양재질에 코팅하거나 나노구조를 제작하여 마우스 유도만능 줄기세포와 인간배아줄기세포 접착 및 전분화능을 다음과 같이 조사하였다.
인간배아줄기세포의 경우 hESC-media (일반적인 배양액 조성), mTeSR (hES전용배지, Stem cell technology사로부터 구입), Essential 8 (hES 전용배지, Gibco BRL사로부터 구입), 그리고 각 각에 대해 10 ng/ml bFGF만을 첨가한 혈청 배제 배양액 (혈청에 의해 세포의 접착능력이 억제되는 현상을 방지하기 위한 배양액 조건) 조건으로 배양하여 기존의 다양한 배양기법에 대해 상호 호환성이 있는지 함께 분석하였다. 또한 세포의 경우 콜로니 상태의 배양기법과 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 단일세포를 이용한 배양기법을 분석하였다. 피더-프리(feeder-free)에 대한 ESC 또는 iPSC 배양효과를 검증하기 위하여 양성대조군으로 매트리겔(Matrigel (hESC)) 그리고 젤라틴(gelatin (miPSC))을 각 각 비교하였으며, 뿐만 아니라 모든 배아줄기세포 배양의 양성대조군으로 사용되는 지지세포(Feeder cell)에서의 배양도 함께 수행하였다.
해당 세포를 도 5a에 기재된 배아줄기세포의 전분화능 (Stemness)의 지표로 Oct4 유전자의 활성을 측정할 수 있는 구조를 갖는 플라스미드(Szabo et al., 2002, Mechanisms of Development Vol. 115: 157-160)를 이용하여 형광현미경으로 분석하였다 (도 5). 또한 전분화능을 나타내는 다른 마커인 Alp 및 Nanog 유전자에 대한 발현을 이에 특이적인 항체를 사용하여 염색하여 형광 현미경으로 관찰하고, hES 세포 배양에서 세포의 접착성 향상 여부도 조사하였다 (도 6).
결과는 도 5 및 6에 기재되어 있다. 도 5에 기재된 바와 같이, 본원의 펩타이드는 미리 코팅 (precoated)되거나 또는 배양액에 혼합 (Mixed)되는 방식으로 추가된, 두 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 5b). 아울러, 세포배양 4일째의 경우 도 본원에 따른 펩타이드는 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 5c). 또한 도 6a 및 도 6b에 기재된 바와 같이, 본원에 따른 펩타이드는 미리코팅 또는 배양액 혼합되는 경우 모두 iPSC의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났으며, hESC를 이용한 실험에서도 피더세포 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외부환경적 변화 없이도 세포의 접착을 매개하며 전분화능또한 유지시키는 것으로 나타났다 (도 6c).
실시예 7. 접착성 펩타이드와 단백질의 바이오컨쥬게이션
본 실험에 사용된 재료는 다음과 같다:
실시예 1에서 합성된 펩타이드는 10 μM (PBS 중) 농도로 사용; 1.9cm2 면적의 플라스틱 세포배양접시 (24-well plate, Corning사 제품); DSS (Disuccinimidyl suberate, C16H20N2O8, Thermo Scientific Inc.); 재조합 인간 BMP2 (rhBMP2, BD bioscience); DMSO (Dimethyl sulfoxide, DSS를 녹이는 용매, Sigma-Aldrich 사); Tris-HCl, pH7.0 (Stop solution); PBS(phosphate buffered saline, reaction solution);
분석 개념은 도식적으로 도 7a에 도시되어 있다. 도 7a를 참조하면, 가교제를 사용하여 본원의 펩타이드에 목적하는 생활성을 갖는 다양한 물질, 예를 들면 BMP와 같은 치료용 단백질을 연결하여 사용하면, 본원 펩타이드의 접착성으로 인해, 처리한 부위에 치료용 단백질의 농도를 높일 수 있고, 치료 효과를 극대화할 수 있다.
실험방법은 다음과 같다. 펩타이드-rhBMP2 공유결합 (Cross-linking) 반응은 기본적으로 사용된 가교연결자 (Cross-linker) 제조사의 방법을 따라 수행되었으며, 요약하면 그 과정은 다음과 같다: (i) 펩타이드 코팅: 세포배양접시에 200 ul의 펩타이드 용액 (PBS 용액 중의 10μM의 상기 실시예 1의 펩타이드) 을 분주하고 4℃에서 18시간 흡착시켰다; (ii) DSS-BMP2 복합체 형성: rhBMP2에 대하여 20 molar 과량의 DSS를 100μl의 반응용액에서 1시간 공유결합을 유도하였다. 1.9cm2 면적당 rhBMP2는 300ng 수준이 되도록 조정하였으며, 이 때 대조군으로써 각 각 DSS, rhBMP2, DSS-rhBMP2를 코팅하여 사용한 바, 이 경우 모두 배양접시 표면재질에 흡착력이 없는 바 세척과정에서 상당량 소실됨을 관찰 하였고, 따라서 이 경우 음성 대조군으로 사용되었다; (iii) 펩타이드-DSS-BMP2 복합체 형성:100ul의 DSS-BMP2 복합체를 미리 반응시킨 펩타이드 코팅 접시에 조심스럽게 첨가한 후 (overlay) 4℃에서 24시간 반응; (iv) 반응 정지: 1M Tris 용액을 200 ul 첨가하고 상온에서 15분 방치함으로써 공유 결합 후 잔존하는 DSS를 모두 중화시켰다; (v) 세척: PBS 용액으로 10회 세척후, 세포첨가 전 까지 우태혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 첨가한 후 37℃에 미리 방치하였다; (vi) C2C12 현탁액 준비 및 조골세포 분화: 4x105 개의 C2C12세포를 300 ul의 2% 우태혈청을 포함하는 DMEM배지에 현탁한 후 세포를 준비하였다. 펩타이드-DSS-BMP2 복합체가 코팅된 접시에 미리 담겨 있던 DMEM은 제거하고 300ul의 세포배양액을 첨가하여 5% CO2/37℃ 조건의 배양기에서 48시간 세포의 분화를 유도하였다; (vii) 세포분화 측정: C2C12세포의 조골세포로의 분화능은 알칼리탈인산화효소 (Alkaline phosphotase)의 활성을 세포염색법으로 측정하였다.
결과는 도 7b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 재조합 BMP 처리군 (rhBMP2) 또는 가교제 처리군 (CL)과 비교하여 Alp 활성이 증가하였으며, 이는 본원의 펩타이드 처리에 의해 골분화가 촉진된 것을 나타낸다.
실시예 8. 본원에 따른 펩타이드의 안정성 분석
본원에 따른 펩타이드의 안전성을 조골세포 (MC3TC-E1) 을 이용하여 테스트하였다. 실시예 1에서 합성한 본원에 따른 펩타이드 A7-1을 조골세포에 0.1μM, 1μM, 10 μM 및 100μM의 농도로 처리한 후, 증식 (도 8a), 생존 (도 8b) 및 분화능 (도 8c)에 미치는 영향을 측정한 것으로, 분화능의 경우, MC3T3-E1 세포주 또는 C2C12 세포주를 사용하였으며, 상기 세포주를 골형성분화 배지(6일간 처리)와 BMP2 (rhBMP2, 10ng/ml, 3일간 처리)로 자극을 주어 분화를 유도하였으며, 분화 효과는 세포 염색을 통해 수행되었다. 결과는 도 8a 내지 8c에 있으며, 농도에 따른 증식율, 생존율, 분화의 가부에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
또한 본원에 따른 펩타이드의 안전성을 마우스의 단핵구 (monocyte)를 이용하여 테스트하였다. 마우스의 골수로부터 분리한 단핵구에 본원에 따른 펩타이드로 처리 후 가한 후 염증 유도가 발생하는지 조사하였다. 양성대조군으로써 LPS를 처리하였으며, 24시간 후 염증 유발인자 마커인 IL-1β (interleukin-1β), Tnf-α (Tumor necrosis factor-α), iNos (Inducible nitric oxide synthase), Cox-2(cyclooxygenase-2)를 각 각 실시간 정량 역전사 PCR 방법을 사용하여 측정하였다. 그 결과 본원에 따른 펩타이드는 염증을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 결과는 도 8d에 있으며, 본원에 따른 펩타이드는 염증을 유발하지 않아, 생체내 사용이 안정한 물질로 판단되었다.
실시예 10. 접착성 펩타이드를 이용한 일차 신경 세포 접착능 향상 및 배양
본 실시예에서는 신경 세포 접착 및 배양에 미치는 영향을 기존의 접착성 펩타이드와 효과를 비교하였다. 펩타이드를 100μM 수준에서 배양재질에 코팅하거나 나노구조를 제작하여 마우스 배아뇌조직과 백서의 척수로부터 신경유래 세포를 얻어 접착된 세포를 광학현미경으로 분석하고 CCK-8을 통한 대사를 측정하여 분석하였다. 이 때 양성대조군으로 Laminin과 poly-L-ornithin (Sigma)을 혼용하여 제조사의 농도 및 방법대로 코팅하여 사용하였으며, 세포접착을 정량화하기 위하여 (각 시간에 대해) 접착하지 않은 세포는 PBS로 세척하여 제거하였고, 배양배지와 세포의 대사를 측정하는 CCK-8 용액 (Dojindo)을 혼합하여 첨가한 후 1시간 동안 배양 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 9에 기재되어 있다. 도 9a는 척수 유래의 신경세포를 기존의 펩타이드로 라미닌 (laminin)과 폴리-L-오르니틴 (poly-L-ornithin)으로 코팅된 배양접시 및 본원의 일 구현예에 따른 A7-1으로 코팅된 배양접시를 사용하여 배양한 후 각 시간대별로 CCK-8을 분석한 결과이며, A7-1가 코팅 (흡착)된 조건에서 접착능이 큰 폭의 차이를 보였다. 도 9b는 배양 4일 후 광학현미경을 통해 비교 관찰한 결과이며, 동일한 양의 세포를 사용하였지만, 접착의 정도는 A7-1에서 가장 탁월하였다. 도 9c는 본원의 일 구현예에 따른 A7-1으로 코팅된 일차배양 세포가 신경유래세포임을 신경세포에 특이적 마커를 이용하여 검증한 결과로써, 신경표지 단백질 (GFAP, MAP2 및 Nestin)을 면역형광법으로 염색한 후 공초점 현미경을 통해 분석한 결과이다. 상기 결과는 본원에 따른 펩타이드가 기존의 것과 비교해 월등히 우수한 접착능을 가짐을 나타낸다.
실시예 11. 인간 MSC (Mesenchymal Stem Cell)의 접착능 향상 효과
A7-1 펩타이드를 100 μM 수준에서 유리재질의 멸균된 coverslip 코팅한 후 MSC 세포 (Mesenchymal Stem cell)를 6시간 배양한 후, 세포의 접착진행과정 (adhesion progression)을 액틴 섬유에 대한 형광 염색시약인 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin) 염색약 (Life Technology Cat.# R415) 과 세포의 핵 (DNA)를 염색하는 DAPI (Sigma D9542) 염색약을 각 각 사용하여 세포를 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 이 때 음성 대조군으로 A7-1 펩타이드를 코팅하지 않은 커버슬립(coverslip)에 세포를 접착하여 비교하였다. 결과는 도 10에 기재되어 있다. 도 10a에서 음성대조군은 여전히 접착초기단계인 액틴-링(actin-ring) 형성이 다수를 이루고 있지만, A7-1 처리군의 경우 이미 그 단계를 지나 스트레스 파이버 형성이 다수의 세포에서 관찰되었으며, 도 10b는 이러한 관찰결과를 정량한 그래프이며, 도 10c는 세포 접착에 따른 기하학적 양태 (geometric shape) (cell aspect ratio: 세포의 가로/세로의 비율, 1일 경우 완전한 원형이며 접착과정의 가장 초기 상태로 나타냄. Prager-Khoutorsky et al., 2011. Nature Cell Biology 13, 1457?1465 참고) 을 측정하여 나타낸 결과로써 A7-1의 처리군에서 월등히 성숙된 접착능을 보여 준다.
실시예 12. 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 접착능 실험 I
하기 표 1과 같은 서열 및 명칭을 갖는 펩타이드를 실시예 1에서 같이 합성한 후에 헤파린 또는 N-아세틸글루코사민 (GAG)에 대한 접착능을 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방법을 이용하여 측정하였다.
[표 1]
Figure 112017074329085-pat00001
결과는 도 11에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 본원의 펩타이드는 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역이 다양한 조합으로 배열되거나 또는 각 영역의 서열이 본원에 정의된 바와 같은 아미노산으로 치환된 경우에도 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 13. 다양한 서열의 펩타이드를 이용한 접착능 실험 II
표 1에 A 서열로 명명된 RQLVVKFRALPC (서열번호 17) 서열을 기준으로 치환기의 화학적 성질, 크기, 전하적 특성 및/또는 표 1의 실험결과 등을 고려하여 다음의 표 2와 같은 서열을 생성하고 그 결과를 옆의 컬럼에 표시하였다. 굵게 표시된 부분이 치환된 부분이며, 실시예 12의 RQLVVKFRALPC를 이용한 실험결과와 비교하여 예측되는 효과의 정도를 +의 개수로 표현하였다.
[표 2]
Figure 112017074329085-pat00002
상기 표 2의 서열컬럼에서 굵게 표시된 부분이 A 서열과 비교하여 치환된 부분이고, 접착능 컬럼에서 볼드체로 표시되지 않은 결과는 실시예 12 및 도 11의 결과를 근거로 표시한 것이고, 볼드체로 표시된 문자는 상기 치환 및 실험결과를 근거로 예측된 결과이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> YOON, WON JOON <120> Adhesive polypeptide and its use for biological or non-biological materials <130> DP201408003PDIV <160> 69 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 1 Gln Leu Val Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 2 Gln Glu Glu Glu Lys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 3 Gln Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 4 Asn Leu Val Val Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 5 Ser Leu Val Val Lys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 6 Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 7 Phe Arg Glu Glu Pro Cys 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 8 Phe 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Phe Arg Ala Leu Pro Cys Phe Arg Ala Leu 1 5 10 15 Pro Cys <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 38 Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 39 Arg Arg Arg Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 40 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Arg Ala Leu Pro Cys 20 <210> 41 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 41 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 20 25 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 42 Arg Gln Val Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 43 Arg Gln Ile Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 44 Arg Gln Ala Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 45 Arg Gln Glu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 46 Arg Gln Leu Leu Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 47 Arg Gln Leu Ile Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 48 Arg Gln Leu Ala Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 49 Arg Gln Leu Glu Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 50 Arg Gln Leu Val Leu Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 51 Arg Gln Leu Val Ile Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 52 Arg Gln Leu Val Ala Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 53 Arg Gln Leu Val Glu Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 54 Arg Gln Leu Val Val Arg Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 55 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Lys Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 56 Arg Gln Leu Val Val Glu Phe Glu Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 57 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Leu Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 58 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ile Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 59 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Val Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 60 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Glu Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 61 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 62 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Ile Pro Cys 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 63 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Val Pro Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 64 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 65 Arg Gln Glu Glu Glu Glu Phe Glu Glu Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> any amino acids <400> 66 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Xaa Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 67 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 68 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Thr 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> any amino acids <400> 69 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Xaa 1 5 10

Claims (8)

  1. 하기 중 어느 하나의 서열로 표시되는 펩타이드:
    QLVVK (서열번호 1);
    FRALPC (서열번호 6);
    RQLVVK (서열번호 15);
    FRALPCRQLVVK (서열번호 16);
    RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18);
    RQKFRALPC (서열번호 22);
    EQLVVEFEALPC (서열번호 29);
    R-(QLVV)2-KFRALPC (서열번호 34);
    R-(QLVV)3-KFRALPC (서열번호 35);
    R-(QLVV)4-KFRALPC (서열번호 36);
    RQLVVKFKALPC (서열번호 55);
    RQLVVEFEALPC (서열번호 56);
    RQLVVKFRLLPC (서열번호 57);
    RQLVVKFRILPC (서열번호 58);
    RQLVVKFRVLPC (서열번호 59);
    RQLVVKFRELPC (서열번호 60);
    RQLVVKFRAAPC (서열번호 61);
    RQLVVKFRAIPC (서열번호 62);
    RQLVVKFRAVPC (서열번호 63);
    RQLVVKFRAEPC (서열번호 64);
    RQLVVKFRALPS (서열번호 67); 또는
    RQLVVKFRALPT (서열번호 68).
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 서열번호 15, 18, 22, 34 내지 36, 55 내지 64, 67 및 68의 N- 말단 첫 번째 아미노산은 K (Lysine)으로 치환되고, 상기 서열번호 29의 N-말단 첫 번째 아미노산은 D (Aspartice acid)로 치횐된 것인, 펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 서열번호 15, 18, 22, 34 내지 36, 55 내지 64, 67 및 68의 N- 말단 첫 번째 아미노산은 D (Aspartic acid) 또는 E (glutamic acid)로 치환되고, 상기 서열번호 29의 N-말단 첫 번째 아미노산은 R (Arginine) 또는 K (Lysine)로 치횐된 것인, 펩타이드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 바이오컨쥬게이팅 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 생체유래 물질 또는 비생체 유래 물질에 대한 접착용 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  7. 제 5 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제 6 항에 따른 벡터로 형질전환된 세포.





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