JP2021514676A - 幹細胞の拡大および分化 - Google Patents

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Abstract

本開示は、幹細胞の拡大および分化中の幹細胞の可塑性を保持して骨細胞、軟骨細胞および他の中胚葉系細胞を産生することを含む、間葉系幹細胞および骨髄細胞の拡大および分化に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１日に提出されたオーストラリア仮特許出願第２０１８９００６６３号の利益を主張し、その開示全体は、この特定の参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、幹細胞の拡大および分化中の幹細胞の可塑性を保持して骨細胞、軟骨細胞および他の中胚葉系細胞を産生することを含む、間葉系幹細胞および骨髄細胞の拡大および分化に関する。
本明細書での先行技術への言及は、この先行技術が任意の管轄区域において、共通の一般知識の一部を形成すること、またはこの先行技術が理解され、妥当であると見なされ、および／もしくは当業者によって先行技術の他の部分と組み合わされることが合理的に予想され得ることを承認、または提案するものではない。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、およびにそれに由来する分化細胞、例えば骨細胞、脂肪細胞および軟骨細胞などは、骨格組織の損傷、心筋梗塞、変性疾患、ならびに固有の分化および再生能力、免疫調節特性、ならびに損傷および疾患部位への遊走能に起因する臓器不全の治療介入に、増々利用されている。しかしながら、臨床診療への広範な移行を妨げる大きなハードルは、これらの細胞の、天然からの入手性が限られていることである。例えば、ヒト骨髄由来のＭＳＣは、骨髄単核細胞集団中、わずか０．００１〜０．０１％しか含まれない。対照的に、患者１人の治療用量に、通常、体重１キログラムあたり少なくとも１００万〜２００万の細胞が必要となり、その部分的な原因は、投与されたＭＳＣの非効率的な帰巣である。骨細胞、脂肪細胞または軟骨細胞を産生するためのｅｘ ｖｉｖｏ培養は、治療する適応症の性質に応じて、約１ｘ １０５〜１０６のＭＳＣの分離を要する場合がある。治療効果と密接に連結する幹細胞の特性を維持しながら、高い費用効率でＭＳＣを拡大できる能力が強く求められていることは、明らかである。従来のｅｘ ｖｉｖｏ拡大を前提とするか否かにかかわらず、ＭＳＣをｅｘ ｖｉｖｏで分化する能力に対する需要もある。
ＭＳＣ、および他の一般の付着性治療用幹細胞の拡大および分化は、培養培地の可溶性成分、周囲細胞、および下にある基材との相互作用に依存する。これらの要因は、相乗効果的だが重複せずに機能することが認められており、そのため、下にある基材タンパク質が可溶性成分と入れ替わることは、予想されない。したがって、ｅｘ ｖｉｖｏでのＭＳＣ拡大は、外因性の可溶性因子で培地を強化することによって、および／または血清で培養表面を被覆することによって増強されている。例えば、基礎培地に追加の血清タンパク質、ホルモン、または成長因子を補充することで、ＭＳＣの増殖を増幅できる。これらの成長因子には、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、最も一般的には塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）がある。特に、ｂＦＧＦは、ＭＳＣに対する強力な分裂促進効果を有し、幹細胞培養培地に最大または最小の血清含有量を補充するために、頻繁に使用される。
フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、およびラミニンの形態の細胞外マトリックス成分は、主に細胞を基材表面に保持するための培養基材として使用され、一般に血清または成長因子補充培地と協調させて使用され、後者は、ＭＳＣの接着、拡散、拡大を促進する。
Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２８、１１２３−１１２８（２０１０））は、トロポエラスチンを用いてマウス骨髄細胞およびヒト造血幹細胞を培養し、モノマートロポエラスチンを必要とする増殖効果について記述した。基材の弾力性およびテンセグリティは、増殖効果の確認に重要であると説明された。トロポエラスチンによるサイトカインのさらなる拡大は、相加効果をもたらした。
Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１ ８１２１−８１３１）は、蚕絹フィブロインおよび不溶性膜を形成する組換え型ヒトトロポエラスチンをベースにした、構造タンパク質混合システムについて記述した。このシステムは、ヒト間葉系幹細胞の付着および増殖を促進する。純粋な絹または純粋なトロポエラスチン培養物で産生される細胞数は、そのシステムよりも少なかった。
Ｈｕ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２、８９７９−８９８９（２０１１））は、ＭＳＣの付着、増殖、筋原性または骨原性成分化を促進する、同システムの能力について記述した。ＭＳＣの増殖および骨原性分化は、マイクロ／ナノスケールの表面パターンによる高い面粗度を必要とする。トロポエラスチン濃度は、ｈＭＳＣ増殖の量に影響しなかった。
Ｈｕ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２３、３８７５−３８８４（２０１３））は、同システムを「タンパク質合金（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｏｙ）」としてさらに説明し、細胞の形態および成長への効果に必要なコンフォメーションおよび安定性を提供するのは、合金自体および不溶性ベータシート結晶ネットワークである、と説明した。
Ｃａｌａｂｒｅｓｅ（Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ １１：２５４９−２５６４（２０１７））は、ヒドロゲルの形態のタンパク質合金（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｏｙ）をさらに研究し、それにより合金は、ＭＳＣのカプセル化に使用された。Ｈｕによる以前の研究とは対照的に、合金中のトロポエラスチンの高い含有量は、分化培地の存在下でさえ、ＭＳＣの分化能を阻害することが見出された。上述のＣａｌａｂｒｅｓｅは、トロポエラスチンがｈＭＳＣ分化をダウンレギュレートすると説明した。
第１の態様では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法が提供される。方法は、ＭＳＣを（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子と接触させる工程、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させる工程を含み、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する。ここでトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。
第２の態様では、細胞の組成物が提供され、その細胞は、本明細書の実施形態のいずれか１つによる方法によって形成される。組成物の細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法によって形成される。方法は、ＭＳＣを（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子と接触させる工程、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させる工程を含み、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する。ここでトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の骨細胞である。組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
第３の態様では、骨障害または骨折を有する個体を治療する方法が提供される。この方法は、本明細書で提供される実施形態のいずれか１つによる組成物を個体に提供し、それにより、個体の骨障害または骨折を治療する工程を含む。組成物の細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法によって形成される。方法は、ＭＳＣを（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子と接触させる工程、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させる工程を含み、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する。ここでトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の骨細胞である。組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、個体に組成物が提供され、個体に提供される組成物中のＭＳＣの総量は、個体の体重１キログラムあたり少なくとも１００万〜２００万細胞である。いくつかの実施形態では、個体に組成物が提供され、少なくとも１００万〜２００万細胞が、局所部位に投与される。
第４の態様では、トロポエラスチンを含む細胞培養培地が提供され、細胞培養培地は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２％〜約１０％の血清を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は無血清である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、最小必須培地（ＭＥＭ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
第５の態様では、トロポエラスチンを含む細胞培養培地が提供され、この培地は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子を含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２％〜約１０％の血清を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は無血清である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、最小必須培地（ＭＥＭ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
第６の態様では、細胞培養物が提供され、細胞培養物は、間葉系幹細胞、およびトロポエラスチン含有培地を含み、培地は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約１０％の血清または約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。
第７の態様では、少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンを含む細胞培養培地が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
第８の態様では、間葉系幹細胞、およびトロポエラスチン含有培地を含む細胞培養物が提供され、ここで培地は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子を含まない。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約１０％の血清または約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。
第９の態様では、細胞培養物であって、間葉系幹細胞、ならびにトロポエラスチンおよび少なくとも１つの分化因子を含む培地を含む細胞培養物が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
第１０の態様では、間葉系幹細胞を培養する方法が提供され、方法は、ａ）間葉系幹細胞を細胞培養培地で培養すること、およびｂ）トロポエラスチンの存在下で間葉系幹細胞を拡大することを含み、ここで培地は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子を含まない。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、７日間の拡大期間中の１〜７日目、２〜５日目、または４〜７日目から、トロポエラスチンに曝露される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約１０％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの分化因子を含む培地中で、間葉系幹細胞を分化させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、ＭＳＣを、（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させ、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含み、ここでトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、通常、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、その方法は、（ｉ）ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させて、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣとトロポエラスチンとの接触は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣとトロポエラスチンとの接触は、ＩＧＦ−１またはｂＦＧＦの非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、培養物は、通常、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、（ｉ）細胞培養物表面を有する細胞培養容器であって、細胞培養物表面上にトロポエラスチンが配置され、細胞が細胞培養物表面上で培養される場合、前記配置によって細胞が、細胞の培養中に細胞培養物表面上に配置されたトロポエラスチンに接触できる、細胞培養容器を準備すること、および（ｉｉ）細胞培養物表面上での細胞の培養を可能にする条件下で、ＭＳＣを培養容器内で培養し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する、少なくとも１つの分化因子を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、通常、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、（ｉ）細胞培養物表面を有する細胞培養容器であって、細胞培養物表面上にトロポエラスチンが配置され、前記配置によって、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地にトロポエラスチンを少なくとも部分的に溶解できる、細胞培養容器を準備すること、および（ｉｉ）ＭＳＣを培養容器内で培養し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する、少なくとも１つの分化因子を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、通常、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法であって、可溶化トロポエラスチンを含む細胞培養培地中でＭＳＣを培養し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための、少なくとも１つの分化因子を細胞培養培地に加えることをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、通常、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子を含み得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、可溶化トロポエラスチンおよびＭＳＣの分化を誘導する少なくとも１つの分化因子を含む細胞培養培地でＭＳＣを培養し、それによってＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含む第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養集団を形成すること、およびその後、（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養集団を、ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子を含む第２の培地で培養し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、第１の培地でのＭＳＣの培養は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、第１の培地でのＭＳＣの培養は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ増殖を改善し、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦに代えて使用でき、細胞拡大の増幅されたレベルを維持するために使用できる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、ヒアルロン酸とトロポエラスチンとの複合体を含む細胞培養培地でＭＳＣを培養し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。培養物は、ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための、少なくとも１つの分化因子を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
一実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、方法は、ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによってＭＳＣの増殖を誘導することを含み、ここで、トロポエラスチンの存在下で形成されるＭＳＣの数は、トロポエラスチンの非存在下で形成されるＭＳＣの数よりも多い。いくつかの実施形態では、方法は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、方法は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。
別の実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、方法は、（ｉ）細胞培養物表面を有する細胞培養容器であって、細胞培養物表面上にトロポエラスチンが配置され、細胞が細胞培養物表面上で培養される場合、前記配置によって細胞が、細胞の培養中に細胞培養物表面上に配置されたトロポエラスチンに接触できる、細胞培養容器を準備すること、および（ｉｉ）細胞培養物表面上での細胞の培養を可能にする条件下で、ＭＳＣを培養容器内で培養し、それによりＭＳＣの増殖を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの増殖因子を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増殖因子は、トロポエラスチンおよび／またはウシ胎児血清である。
別の実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、方法は、細胞培養物表面を有する細胞培養容器であって、細胞培養物表面上にトロポエラスチンが配置され、前記配置によって、トロポエラスチンが少なくとも部分的にＭＳＣの培養用の細胞培養培地に溶解できる、細胞培養容器を準備すること、および培養容器中でＭＳＣを培養して、それによりＭＳＣの増殖を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの増殖因子を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増殖因子は、トロポエラスチンおよび／またはウシ胎児血清である。
別の実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、方法は、可溶化トロポエラスチンを含む細胞培養培地でＭＳＣを培養し、それによってＭＳＣの増殖を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの増殖因子を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増殖因子は、トロポエラスチンおよび／またはウシ胎児血清を含む。
別の実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、この方法は、可溶化トロポエラスチン、およびＭＳＣの増殖を誘導する少なくとも１つの因子を含む細胞培養培地でＭＳＣを培養し、それによりＭＳＣの増殖を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増殖因子は、トロポエラスチンおよび／またはウシ胎児血清を含む。
別の実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、この方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、およびその後に、（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養し、それによりＭＳＣの増殖を誘導することを含む。第２の培地は、ＭＳＣの増殖を誘導する少なくとも１つの増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増殖因子は、トロポエラスチンおよび／またはウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、方法は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。
別の実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、方法は、複合体を含む細胞培養培地でＭＳＣを培養し、それによりＭＳＣの増殖を誘導することを含み、ここで複合体は、ヒアルロン酸およびトロポエラスチンを含む。
ＭＳＣの増殖の誘導に関連する上記の実施形態では、細胞培養培地は、典型的には、ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための因子を含まなくてもよい。
上記の実施形態では、トロポエラスチンは、不溶性複合体の形態で、または別の分子、例えば絹タンパク質との不溶性複合体もしくは組成物の形態で培養に提供されないことが理解されるであろう。
上記の実施形態では、トロポエラスチンは、一般に、トロポエラスチンが細胞培地を形成する溶媒に少なくとも部分的に、または完全に溶解できる形態で提供されることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、トロポエラスチンが溶媒に部分的に溶解できる濃度で提供される。
上述の実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶性であるヒアルロン酸との複合体の形態で提供され得ることが理解されるであろう。ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成するための上記の方法のいずれか１つの実施によって形成された中胚葉系細胞を含む、細胞培養物が提供される。
別の実施形態では、治療のためにＭＳＣまたは中胚葉系細胞を必要とする状態について、個体を治療する方法が提供され、この方法は、上記の方法のいずれか１つを実施してＭＳＣの組成物または中胚葉系細胞の組成物を形成すること、および個体に前記組成物を提供して状態の治療を可能にし、それにより、治療のためにＭＳＣまたは中胚葉系細胞を必要とする状態について個体を治療することを含む。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、（ｉ）ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣおよびトロポエラスチンの組成物を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体に組成物を投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、（ｉ）ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣおよびトロポエラスチンの組成物を形成すること、およびその後、（ｉｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体に組成物を投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、接触は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、接触は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、方法は、（ｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体にトロポエラスチンを投与し、それによって個体にトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣがトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）に接触するようにＭＳＣを個体に投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。
前の段落で説明した態様のさらなる態様は、例として、添付の図面を参照して与えられる以下の説明から明らかになるであろう。
被覆しない、またはトロポエラスチンで被覆した組織培養プレート（ＴＣＰ）上の、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）成長因子を含む、および含まない培地でのＭＳＣ増殖。 被覆しない、またはトロポエラスチンで被覆した組織培養プレート（ＴＣＰ）上の、７％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含み、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）成長因子を含む、および含まない培地でのＭＳＣ増殖。 いずれのパネルも、播種後の様々な日数での相対的な純細胞の増加を示す。柱の真上にあるアスタリスクは、被覆しないＴＣＰとトロポエラスチン被覆ＴＣＰとの、各培地配合における統計的な差異を表す。図１Ａおよび図１Ｂで、グラフの棒は左から右に、被覆なしのＴＣＰ、次にトロポエラスチン（ＴＥ）被覆ＴＣＰのように交互に繰り返す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし。
減量した血清でのＭＳＣ増殖を示す。細胞を、被覆なしＴＣＰ、トロポエラスチン（ＴＥ）被覆ＴＣＰ、またはフィブロネクチン（ＦＮ）被覆ＴＣＰ上の通常培地で増殖させた。グラフの棒は左から右に、被覆なしＴＣＰ、ＴＥで被覆したＴＣＰ、ＦＮで被覆したＴＣＰのように交互に繰り返す。 減量した血清でのＭＳＣ増殖を示す。細胞を、トロポエラスチン被覆ＴＣＰ上の通常培地、ＴＣＰ上のＩＧＦ−１およびｂＦＧＦ成長因子（ＧＦ）を含む培地、またはトロポエラスチン被覆ＴＣＰ上のＧＦ補充培地で培養した。グラフの棒は左から右に、ＴＥコーティングＴＣＰ、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦ成長因子含有培地を含むＴＣＰ、およびＧＦを補充した培地のＴＥコーティングＴＣＰのように交互に繰り返す。 いずれのパネルも、播種後３、５、および７日での相対的な正味の細胞増加を示し、１日目の初期細胞数に正規化されている。柱の真上のアスタリスクは、通常培地でのトロポエラスチン被覆ＴＣＰ上の細胞との統計的な比較を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
溶液中のトロポエラスチンを含む培地でのＭＳＣ増殖を示す。細胞は、ＴＣＰ上の漸増的に濃度を上げた可溶性トロポエラスチン（ＴＥ）を補充した培地で、またはＴＥ被覆ＴＣＰ上の通常培地で増殖させた。パネルは、播種後３、５、および７日での相対的な正味細胞の増加を示す。個々の柱の上のアスタリスクは、トロポエラスチンなしの対照との統計的な差異を示す。 溶液中のトロポエラスチンを含む培地でのＭＳＣ増殖を示す。細胞は、ＴＣＰ上の通常培地、またはトロポエラスチンもしくは成長因子を補充した培地で培養した。パネルは、播種後３、５、および７日での相対的な正味細胞の増加を示す。データ柱の真上のアスタリスクは、通常培地の対照との統計的な差異を示す。 溶液中のトロポエラスチンを含む培地でのＭＳＣ増殖を示す。通常培地、またはκ−エラスチン（κＥＬＮ）、α−エラスチン（αＥＬＮ）、もしくはトロポエラスチンを補充した培地での７日間の細胞増殖。アスタリスクは、通常培地の対照との統計的な差異を示す。 細胞は、通常培地、または溶液中のフィブロネクチンもしくはトロポエラスチンを補充した培地で、最大７日間増殖させた。アスタリスクは、通常培地の対照との統計的な差異を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし。
トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。ＥＤＴＡの存在下での基材結合トロポエラスチンへの細胞接着。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。カチオンを含まないバッファーに、外因性のＭｇ２＋、Ｃａ２＋、およびＭｎ２＋２価カチオンの量を増加させた場合のトロポエラスチンへの細胞結合。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。抗αｖβ５の濃度上昇によるトロポエラスチン上の細胞拡散。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。抗αｖβ３の濃度上昇によるトロポエラスチン上の細胞拡散。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。汎抗αｖインテグリン抗体の濃度上昇によるトロポエラスチン上の細胞拡散。抗αｖインテグリン抗体を含む、および含まないフィブロネクチン上での細胞の拡散が、対照として示されている。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。最適阻害濃度の抗αｖβ３、抗αｖβ５、抗αｖβ３と抗αｖβ５との組み合わせ、および抗αｖインテグリン抗体の存在下での、トロポエラスチン上の細胞拡散。ＴＣＰの細胞拡散、および抗体非存在の、または非特異的マウスＩｇＧ抗体を含むトロポエラスチンでの細胞拡散も、対照として含まれる。データ柱の上のアスタリスクは、抗体なしの対照との統計的な差異を示す。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。インテグリン遮断抗体を含む、および含まない場合の、トロポエラスチン上に拡散するＭＳＣの代表的な画像。 トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。トロポエラスチン被覆またはＢＳＡ被覆したＴＣＰに付着したＭＳＣの共焦点顕微鏡画像。焦点接着ビンキュリン（緑）および細胞核（青）が染色されている。細胞あたりの焦点接着染色の相対密度を示す。スケールバー：２０μｍ トロポエラスチンへのＭＳＣの付着および拡散を示す。ＦＡＫ阻害剤（ＦＡＫ阻害剤１４またはＰＫＢ／ＡＫＴ阻害剤（ペリフォシン）の存在下での７日後のＭＳＣ増殖。細胞数は、阻害されていないサンプルに対して正規化された。個々の柱の上のアスタリスクは、阻害剤なしの対照との比較を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし。
線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）存在下でのＭＳＣ増殖。 インテグリン阻害剤の存在下でのＭＳＣ増殖。 細胞は、ＴＣＰ上の通常培地、２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む培地、またはｂＦＧＦを補充した培地で７日間増殖させた。増殖期間中に、ＦＧＦＲ阻害剤であるＳＵ−５４０２を漸増的な量で培地に添加した（図５Ａ）。各日の細胞数は、ＳＵ−５４０２なしのサンプルに対して正規化した。各阻害剤濃度において、トロポエラスチンまたはｂＦＧＦを含む培地の細胞数と、通常培地の細胞数とを比較して、ＳＵ−５４０２の非特異的毒性を説明した。抗αｖβ３、抗αｖβ５、抗αｖβ５および抗αｖβ３、または抗αｖを最適阻害濃度で、７日間にわたり培地に添加した（図５Ｂ）。図５Ｂで、グラフの棒は左から右に、通常培地、ＴＥ含有培地、およびｂＦＧＦ含有培地が交互に並ぶ。抗体を含まない対照、または発現していないインテグリンに対する抗体（抗β８）を含む対照を含めた。棒グラフの棒の上にある緑色の矢印は、トロポエラスチンおよびαｖインテグリンサブユニット抗体の存在下で増殖した細胞を示す。個々の柱の上のアスタリスクは、各抗体条件での通常培地の細胞との有意な差異を示す。
ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。遊走アッセイの設定を示す画像。細胞は、基材結合トロポエラスチンまたはＰＢＳを含む隣接チャンバーから等距離にある中央チャンバーに播種された。ウェル表面は、細胞数が位置的な細胞遊走の指標として測定される標識領域に分割された。 ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。細胞遊走の広がりを示す、５日間にわたる標識領域のバイナリ画像。各黒い点は、蛍光顕微鏡下で可視化された１つの細胞核を表す。 ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。トロポエラスチンまたはＰＢＳで被覆した領域に隣接する領域内の細胞存在度の比較。 ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。トロポエラスチンまたはＰＢＳで被覆した領域内の細胞存在度の比較。 ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。実験期間中のすべての領域内の総細胞存在度。 ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイの下部チャンバーで、拡散性化学誘引物質としてのトロポエラスチンの濃度上昇に対する細胞遊走。５μｇ／ｍＬの抗αｖインテグリン抗体を含む、または含まない細胞を、上部チャンバー内でインキュベートした。細胞遊走は、トロポエラスチンなしの対照で示された無刺激遊走のレベルに正規化された。データポイント上のアスタリスクは、トロポエラスチンなしの対照との有意差を表す。 ＭＳＣのトロポエラスチンへの遊走を示す。インテグリン遮断抗体の存在下での、通常またはトロポエラスチン補充培地に対する細胞の化学走性。抗体を含まない対照、または発現していないインテグリンに対する抗体（抗β８）を含む対照を含めた。図６Ｇで、グラフの棒は、左から右に、抗体なし、抗αｖ、抗αｖβ３、抗αｖβ５、抗αｖβ３／αｖβ５、および抗αｖβ８のように並んでいる。アスタリスクは、抗体なしの対照との有意な差異を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし；ＲＦＵ、相対蛍光単位。
トロポエラスチンのＭＳＣ挙動調節のモデル。基材結合、または可溶性トロポエラスチンは、ＭＳＣをトロポエラスチン向かって遊走するように誘引する。ＭＳＣは、トロポエラスチン基材に付着および拡散し、これが、ＭＳＣ表面マーカーの発現および三系統分化の可能性を同時に維持しながら、急速な細胞拡大を引き起こす。大多数の足場依存性マトリックスタンパク質とは異なり、その可溶形態のトロポエラスチンは、同様にＭＳＣの増殖および表現型の維持を促進する。トロポエラスチンからのこれらのシグナルは、細胞表面インテグリン受容体、具体的にはαｖβ３およびαｖβ５を介して伝達され、ｂＦＧＦなどの可溶性成長因子に反映させる、強力な運動源性および分裂促進性ＭＳＣ反応を誘導する。
ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンの効果。 ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンの効果。 脂肪生成に対するトロポエラスチンの効果。 脂肪生成に対するトロポエラスチンの効果。 軟骨形成に対するトロポエラスチンの効果。 軟骨形成に対するトロポエラスチンの効果。 細胞をトロポエラスチンあり、またはなしで拡大し、その後トロポエラスチンを含む、または含まない誘導培地、または非誘導培地に移した。脂肪生成実験では、細胞は、トロポエラスチンなしで拡大され、コンフルエントまでトロポエラスチンで拡大され、コンフルエントに達した時点でポストコンフルエント（ｐｏｓｔ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）期間中にトロポエラスチンが除去されるか、または誘導前にポストコンフルエント（ｐｏｓｔ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）までトロポエラスチンで拡大された。図８Ａで、グラフの棒は、左から右に、ＴＥなし非誘導、ＴＥあり非誘導、ＴＥなし誘導、ＴＥあり誘導、のように並ぶ。図８Ｃに示すように、グラフの棒は、左から右に非誘導、ＴＥなし誘導、ＴＥあり誘導、のように並ぶ。図８Ｅに示すように、グラフの棒は、左から右に、ＴＥなし非誘導、ＴＥあり非誘導、ＴＥなし誘導、ＴＥあり非誘導、のように並ぶ。
ＭＳＣの骨形成中のトロポエラスチンに対する用量反応。 ＭＳＣの骨形成中のトロポエラスチンに対する用量反応。 ＭＳＣの脂肪生成中のトロポエラスチンに対する用量反応 ＭＳＣの脂肪生成中のトロポエラスチンに対する用量反応。 ＭＳＣの軟骨形成中のトロポエラスチンに対する用量反応。 ＭＳＣの軟骨形成中のトロポエラスチンに対する用量反応。 細胞をトロポエラスチンなし、または２μｇ／ｍＬもしくは２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンで拡大し、その後２μｇ／ｍＬもしくは２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン含有またはトロポエラスチン非含有の誘導、または非誘導培地に移した。脂肪生成実験では、トロポエラスチンで拡大させた細胞集団を、誘導前にトロポエラスチンなしでポストコンフルエント（ｐｏｓｔ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで培養した。図９Ａで、グラフの棒は、左から右に、非誘導、誘導、２μｇ／ｍＬ ＴＥで誘導、２０μｇ／ｍＬ ＴＥで誘導、のように並ぶ。図９Ｃに示すように、グラフの棒は、左から右に、非誘導、誘導、２μｇ／ｍＬ ＴＥで誘導、２０μｇ／ｍＬ ＴＥで誘導、のように並ぶ。図９Ｅに示すように、グラフの棒は、左から右に、非誘導、誘導、２μｇ／ｍＬ ＴＥで誘導、２０μｇ／ｍＬ ＴＥで誘導、のように並ぶ。
ＭＳＣ骨形成中の細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間。 ＭＳＣ骨形成中の細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間。 ＭＳＣ軟骨形成中の細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間。 ＭＳＣ軟骨形成中の細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間。 ＭＳＣ脂肪生成中の細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間。 ＭＳＣ脂肪生成中の細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間。 細胞は、トロポエラスチンなしで、またはトロポエラスチンを使用して、７日間の増殖期間の２〜５、３〜６、または４〜７日間拡大させ、その後トロポエラスチン含有または非含有分化培地に移した。
ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果を示す。ＴＥ記憶の阻害。図１１Ａで、グラフの棒は、左から右に、ＴＥなし、ＴＥなし抗ａｖあり、ＴＥなし抗ａ５あり、ＴＥなし抗ａｖ／ａ５あり、ＴＥあり、ＴＥおよび抗ａｖあり、ＴＥおよび抗ａ５あり、ＴＥおよび抗ａｖ／ａ５あり、のように並んでいる。 ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果を示す。ＴＥ非存在下での拡大 ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果を示す。ＴＥ存在下での拡大 ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果を示す。ＴＥおよび抗ａｖ存在下での拡大 ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果を示す。ＴＥおよび抗ａ５存在下での拡大 ＭＳＣ骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果を示す。ＴＥおよび抗ａｖ／ａ５存在下での拡大 図１１Ｂから図１１Ｆで、グラフの棒は左から右に、ＴＥなしで誘導、ＴＥで誘導、のように交互に繰り返す。
トロポエラスチンおよびヒアルロン酸のＭＳＣ骨形成への効果を示す。トロポエラスチンおよびヒアルロン酸の、ＭＳＣへの効果を示す棒グラフ。 トロポエラスチンおよびヒアルロン酸のＭＳＣ骨形成への効果を示す。最大５００μｇ／ｍＬの濃度の３つの異なる分子量（３０−５０、９０−１１０、および３００−５００ｋＤａ）のヒアルロン酸は、組織培養プラスチック対照と比べてＭＳＣ骨形成を増加させなかった。ヒアルロン酸配合のそれぞれにトロポエラスチンを添加すると、ＭＳＣ骨形成が促進された。これらの結果は、トロポエラスチンが、トロポエラスチン−ヒアルロン酸複合材料における主要な骨形成促進剤であることを示している。
酵素結合免疫吸着アッセイによる表面結合トロポエラスチンの検出。トロポエラスチン（ＴＥ）を、被覆なしのＴＣＰ、濃度を上げたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレインキュベートしたＴＣＰ、または通常の血清含有培地とプレインキュベートしたＴＣＰに添加した。図１３Ａのグラフの棒は、記号表に上から下に列挙されているサンプルの順序で、左から右に表示される。トロポエラスチンを添加せずに、ＢＳＡまたは培地とインキュベートしたサンプルを陰性対照として使用した。 ＴＣＰ上の、溶液中の増量したトロポエラスチンを含む培地、またはトロポエラスチン被覆ＴＣＰ上の通常培地での７日間にわたるＭＳＣ増殖。パネルは、播種後３、５、および７日での相対的な正味細胞の増加を示す。データ柱の真上のアスタリスクは、トロポエラスチンなしの対照との統計的な差異を示す。 ＴＣＰ上の、可溶性トロポエラスチン含有、および非含有通常培地での７日にわたるＭＳＣ増殖。播種の日（Ｄ０）、または播種の３日後（Ｄ３）に、トロポエラスチンを２０μｇ／ｍＬで溶液中に添加した。トロポエラスチン補充培地の細胞存在度は、トロポエラスチン添加の時間に対応して、通常培地よりも増加する。
トロポエラスチンで拡大したＭＳＣの表面マーカー発現を示す。被覆なしまたはトロポエラスチン被覆ＴＣＰ上の、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦ成長因子を含む、および含まない通常培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）または血清低減培地（６％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）で細胞を培養した。 トロポエラスチンで拡大したＭＳＣの表面マーカー発現を示す。ＴＣＰ上の通常培地、または２０μｇ／ｍＬの可溶性トロポエラスチン（ＴＥ）含有培地で細胞を培養した。（ｉ）５または７日間の培養後の、陽性ＭＳＣマーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ならびに陰性マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａおよびＨＬＡ−ＤＲのカクテルを発現する細胞集団のパーセンテージ。マーカー発現は、ゲーティングされた一重項生存細胞（ｓｉｎｇｌｅｔ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ）から検出された陽性イベントのパーセンテージとして定量化された。（ｉｉ）様々な培養条件で成長した細胞の播種後７日目の代表的なフローサイトメトリードットプロット。１段目は、陰性マーカーを発現しない細胞セルの選択ゲーティングを示す。２段目は、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の両方の陽性マーカーを発現する系統陰性細胞の集団を示す。３段目は、ＭＳＣマーカーＣＤ７３も発現するＣＤ９０＋およびＣＤ１０５＋細胞の集団を示す。すべてのマーカーについて、アイソタイプ抗体対照で染色された細胞も示される。
トロポエラスチンで拡大したＭＳＣの三系統分化。ＴＣＰまたはトロポエラスチン（ＴＥ）で被覆したＴＣＰ上で、トロポエラスチンまたはＩＧＦ−１およびｂＦＧＦ成長因子を補充した通常培地（ＮＭ）または血清低減培地（ＲＳＭ）で細胞を７日間培養し、採取して脂肪生成、骨形成、および軟骨形成系統に分化させた。誘導および非誘導細胞を、細胞内脂質滴用にオイルレッドＯで、ミネラル化カルシウム結節用にアリザリンレッドで、グリコサミノグリカン用にアルシアンブルーで染色した。スケールバー：５０μｍ
ＭＳＣの化学走性挙動を示す。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイの下部チャンバーでの、拡散性化学誘引物質としてのトロポエラスチンの濃度上昇に対する細胞遊走。５μｇ／ｍＬの抗β８インテグリン抗体を含む、または含まない細胞を、上部チャンバー内でインキュベートした。細胞遊走は、トロポエラスチンなしの対照で示された無刺激遊走のレベルに正規化された。 ＭＳＣの化学走性挙動を示す。インテグリン遮断抗体の存在下での、通常または成長因子補充培地に対する細胞の化学走性。抗体を含まない対照、または発現していないインテグリンに対する抗体（抗β８）を含む対照を含めた。図１６Ｂで、グラフの棒は、左から右へ、抗体なし、抗αｖ添加、抗αｖβｅ添加、抗αｖβ５添加、および抗β８添加、のように並んでいる。
線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）存在下での、播種１日後ＭＳＣ存在度。 インテグリン阻害剤存在下での、播種１日後ＭＳＣ存在度。 細胞は、ＴＣＰ上の通常培地、２０μｇ／ｍＬトロポエラスチン（ＴＥ）含有培地、またはｂＦＧＦ補充培地で増殖させた。（Ｉ）ＦＧＦＲ阻害剤であるＳＵ−５４０２を、漸増的な量で培地に添加した。細胞数は、ＳＵ−５４０２なしのサンプルに対して正規化した。各阻害剤濃度において、トロポエラスチンまたはｂＦＧＦを含む培地の細胞数と、通常培地の細胞数とを比較して、ＳＵ−５４０２の非特異的毒性を説明した。（Ｂ）抗αｖβ３、抗αｖβ５、抗αｖβ５および抗αｖβ３、または抗αｖを最適阻害濃度で培地に添加した。抗体を含まない対照、または発現していないインテグリンに対する抗体（抗β８）を含む対照を含めた。緑色の矢印は、トロポエラスチンおよびαｖインテグリンサブユニット抗体の存在下で増殖した細胞を示す。個々の柱の上のアスタリスクは、各抗体条件での通常培地の細胞との有意な差異を示す。
本明細書の実施形態に記載されているように、トロポエラスチンの未知の特性、ならびにそれらの特性に基づいた、ＭＳＣの細胞培養におけるトロポエラスチンの使用方法が特定された。
文脈で特に必要とされている場合を除き、本明細書で使用される「含む」という用語、ならびに「含んでいる」、「含む」および「含んだ」などの用語の変形は、さらなるの添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。
「拡大期」または「増殖期」という用語は、ＭＳＣの産生を誘導するための他の増殖因子の有無にかかわらず、ＭＳＣがトロポエラスチンとともに培養される細胞培養プロセスを指す。分化細胞は、この段階の完了時に産生されない。残っている唯一の細胞は、ＭＳＣである、すなわちＭＳＣ表現型および／または可塑性を有する細胞である。
「拡大」または「細胞拡大」という用語は、臨床使用などの使用の前に細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大されるように、細胞の数を増やす方法を指す。いくつかの実施形態に記載されるように、細胞は、培地の存在下で、組織培養容器またはプレート内で拡大され得る。限定するものではないが、培地は、成長因子、血清および特定の添加物を補充され得る。本明細書のいくつかの実施形態では、細胞は、トロポエラスチンの存在下で拡大される。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で拡大される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で拡大される。
「分化期」という用語は、分化細胞の産生を誘導するための因子とともにＭＳＣが培養される、細胞培養プロセスを指す。
「分化」または「細胞分化」という用語は、細胞が特定のタイプの細胞に変化するプロセスを指す。場合によっては、細胞は、サイズ、形状、および外部のシグナルに対する反応が変化してもよい。
本明細書のいくつかの実施形態では、細胞は、トロポエラスチンおよび分化因子の存在下で分化する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンの存在により、細胞分化の効力が増大する。
「トロポエラスチン」という用語は、エラスチンが形成されるモノマータンパク質を指す。トロポエラスチンは一般に、共有結合またはその他の方法で架橋されていない。トロポエラスチンは、可逆的にコアセルベートであり得る。したがって、トロポエラスチンはエラスチンとは区別される。エラスチンは、可逆的にコアセルベートになり得ない、共有結合で架橋されたトロポエラスチンからなるためである。トロポエラスチンは合成され得、例えば、組換え発現もしくは他の合成から得られてもよく、またはブタ大動脈などの天然源から得られてもよい。当技術分野で一般に知られているように、トロポエラスチンは、様々な断片の形態で存在し得る。
「中胚葉系細胞」という用語は、ＭＳＣ分化に由来する細胞を指し、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などの決定された細胞および決定された細胞の前駆細胞が含まれる。「中胚葉系細胞」は、ＭＳＣを指すものではない。
「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」という用語は、多能性成体幹細胞を指す。これらの細胞は、限定はされないが、臍帯、骨髄および脂肪組織などの複数の組織源から見出され得る。ＭＳＣは、分裂することで自己再生でき、複数のタイプの組織、例えば骨（骨芽細胞）、軟骨（軟骨細胞）、筋肉（筋細胞）、脂肪細胞（脂肪細胞）、および結合組織などに分化することができる、非造血系間質細胞である。ＭＳＣは、限定はされないが、ＣＤ１０５（ＳＨ２）およびＣＤ７３（ＳＨ３／４）の発現によって識別できる。限定するものではないが、該細胞は、造血マーカー、例えばＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１４などに対して陰性であり得る。
「骨髄細胞」という用語は、骨の海綿状中心部または海綿状部位内に見られる半固形組織を指す。この組織は、例えば、造血細胞、骨髄脂肪組織、および支持間質細胞で構成されている。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、骨髄細胞の拡大および分化の方法である。
「幹細胞の可塑性」または「分化転換」とは、細胞が見つかった場所では分化の正常のレパートリーの範囲外であると考えられる細胞タイプを生じさせる、細胞の能力を指す。他のタイプの組織の細胞に変換する細胞の能力、と考えることもできる。
「部分的に溶解する」または「部分的に可溶性」とは、溶媒中に低濃度で溶解するが、特定の濃度を超えると完全には溶解しない溶質の説明を指す。トロポエラスチンの部分溶解は、まず溶媒中のトロポエラスチンの濃度依存性溶解度として記載され得、それは、３００ｍｇ／ｍＬ未満に制限される。この量より低い濃度が使用されてもよい。次に、トロポエラスチンの溶解は、表面または別のデポ（ｄｅｐｏｔ）から溶解したトロポエラスチンの一部であり、一部のトロポエラスチンは、未だ溶解していない。
特定されたトロポエラスチンの特性は、トロポエラスチンが中胚葉系細胞、特に骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞の商業的産生、詳細には細胞、特に自家細胞のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ産生において有用な候補であることを示唆している。分化期の前または最中に、トロポエラスチンを利用してＭＳＣの増殖を促進または誘導する場合、いくつかの細胞の分化収率が増強されることがある。
より詳細には、ＭＳＣの増殖を誘導する拡大期、およびそれらのＭＳＣの骨形成、軟骨形成または脂肪生成分化を伴う分化期にトロポエラスチンを使用すると、トロポエラスチンが骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞の、より高い収率をもたらすことが見出されている。したがって、本開示によれば、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞の産生に関して、トロポエラスチンは、拡大期および分化期中に使用され得る。
一実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供される。その方法は、ＭＳＣを、（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための少なくとも１つの分化因子、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させ、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。ここでトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置され得る。
トロポエラスチンは、ＭＳＣの培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化され得る。
この方法は、（ｉ）ＭＳＣを、ＭＳＣの増殖を誘導する少なくとも１つの因子と接触させ、それによりＭＳＣの集団を形成する工程、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させる工程を含む。この方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含む第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養されたＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養されたＭＳＣ集団を第２の培地で培養することを含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導する少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４ ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
特に好ましい実施形態では、ＭＳＣから骨細胞を形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＭＳＣの増殖を誘導するために、拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させ、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）分化期中に、拡大されたＭＳＣの集団をトロポエラスチンと接触させることを含む。好ましくは、拡大期は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子の使用を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。好ましくは、分化期は、ＭＳＣからの骨細胞の形成を誘導する因子の使用を含む。これらには、デキサメタゾン、アスコルバート、ベータグリセロホスファートが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータ−グリセロホスファートを含む。より好ましくは、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。
いくつかの実施形態では、拡大期中にトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、拡大期中にトロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数よりも多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、幹細胞の拡大および動員を促進する。
特に好ましい実施形態では、ＭＳＣから脂肪細胞を形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＭＳＣの増殖を誘導するために、拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させ、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）分化期中に、拡大されたＭＳＣの集団をトロポエラスチンと接触させることを含む。好ましくは、拡大期は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子の使用を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。好ましくは、分化期は、ＭＳＣからの脂肪細胞の形成を誘導する因子の使用を含む。これらには、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む。より好ましくは、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。いくつかの実施形態では、拡大期中にトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、拡大期中にトロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数よりも多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、幹細胞の拡大および動員を促進する。
特に好ましい実施形態では、ＭＳＣから軟骨細胞を形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＭＳＣの増殖を誘導するために、拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させ、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）分化期中に、拡大されたＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの軟骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と接触させることを含む。好ましくは、拡大期は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子の使用を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。好ましくは、分化期は、ＭＳＣからの軟骨細胞の形成を誘導する因子の使用を含む。これらには、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウム、プロリンが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。より好ましくは、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。
上記の方法において、トロポエラスチンは絹タンパク質を供給されていないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、拡大期中にトロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、拡大期中にトロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数よりも多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、幹細胞の拡大および動員を促進する。トロポエラスチンは、細胞の、異なるタイプの細胞へと発達する能力を維持することができる。
トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され得、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
この方法により産生される中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。
別の実施形態では、上記の方法から形成された細胞の組成物が提供される。
組成物は、骨細胞の実質的に純粋な形態であり得る。
組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含み得る。
別の実施形態では、骨障害または骨折を有する個体を治療する方法が提供される。この方法は、上記の組成物を個体に提供すること、それにより、骨障害または骨折について個体を治療することを含む。組成物は、トロポエラスチンおよびＭＳＣを含み得る。組成物は、骨細胞または骨細胞の前駆細胞を形成するＭＳＣの分化のための１つ以上の因子を、さらに含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、骨障害または骨折の領域である。
別の実施形態では、疾患もしくは外傷に起因する脂肪喪失もしくは脂肪萎縮の領域を有する個体、または手術もしくは疾患に起因する外科的増強を必要とする個体を治療する方法が提供される。この方法は、上記の組成物を個体に提供し、それにより個体を治療することを含む。組成物は、トロポエラスチンおよびＭＳＣを含み得る。組成物は、脂肪細胞または脂肪細胞の前駆細胞を形成するＭＳＣの分化のための１つ以上の因子を、さらに含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、脂肪喪失または萎縮の領域である。
別の実施形態では、軟骨障害を有する個体を治療する方法が提供され、この方法は、上記の組成物を個体に提供し、それにより、軟骨障害について個体を治療することを含む。組成物は、トロポエラスチンおよびＭＳＣを含み得る。組成物は、軟骨細胞または軟骨細胞の前駆細胞を形成するＭＳＣの分化のための１つ以上の因子を、さらに含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、軟骨障害の領域である。
本明細書の実施形態で説明するように、トロポエラスチンがＭＳＣの商業的産生の有用な候補であることを示唆する、トロポエラスチンの特性が特定されている。特に、トロポエラスチンは、固相に結合した形態で提供されても、溶液で提供されても、ＭＳＣに固有の幹細胞性または可塑性を保持する方法でＭＳＣの増殖を誘導できることが見出されている。「幹細胞性」は、その平易な通常の意味を有し、一般の細胞から幹細胞を識別する、幹細胞の本質的な特徴を指す場合がある。トロポエラスチンが溶液に添加されるいくつかの実施形態では、細胞を保持するためのビヒクルである固相への、トロポエラスチンの付着が防止される。これは、大幅に減少した血清成分を含む培地で、ＭＳＣの増殖および産生に通常使用される、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦなどの特定の因子の非存在下で達成できる。仮説にとらわれることなく、少なくともＭＳＣの付着および拡散に関する限り、作用の機構には、トロポエラスチンと細胞表面との間の直接的な関与または相互作用が必要であると思われる。より詳細には、相互作用または関与は、トロポエラスチンとＭＳＣ上のαｖβ５およびαｖβ３分子との間にあると理解されており、ＭＳＣがトロポエラスチンとの接触を立体的に妨害または遮断される場合、この機構は、除去される。トロポエラスチンが溶液に添加されるいくつかの実施形態では、細胞を保持するためのビヒクルである固体基材への、トロポエラスチンの付着が防止される。
一実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供される。この方法は、ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによってＭＳＣの増殖を誘導することを含む。ここで、トロポエラスチンの存在下で形成されるＭＳＣの数は、トロポエラスチンの非存在下で形成されるＭＳＣの数よりも多い。
トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置され得る。好ましくは、トロポエラスチンは、ＭＳＣがＭＳＣ原形質膜上に位置するαｖβ５およびαｖβ３分子を介して、トロポエラスチンに結合できるように配置される。
トロポエラスチンは、ＭＳＣの培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化され得る。
この方法は、トロポエラスチンを含む第１の培地でＭＳＣを培養してトロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成し、その後、ＭＳＣの増殖を誘導する因子を含む第２の培地で、前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を培養することを含む。
一実施形態では、拡大期は、トロポエラスチンの存在下で、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子の非存在下で、特にＩＧＦ１および／またはｂＦＧＦの非存在下で実施される。
一実施形態では、拡大期は、トロポエラスチンの存在下で、血清などのタンパク質源の非存在下で実施される。
上記の方法において、トロポエラスチンは絹タンパク質を供給されていないことが理解されるであろう。
トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され得、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。
いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。
別の実施形態では、上記の方法から形成されたＭＳＣの組成物が提供される。
組成物は、実質的に純粋な形態のＭＳＣであり得る。
組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含み得る。
本明細書の実施形態に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＳＣの拡大および分化におけるトロポエラスチンの使用が、確立されている。トロポエラスチンは、ＭＳＣの分裂促進因子として確立されており、他の増殖性因子の非存在下でのＭＳＣ増殖を可能にし、他の増殖性因子の存在下およびトロポエラスチンの非存在下での、より多いＭＳＣの産生を可能にする。トロポエラスチンはまた、間葉系分化因子が提供されると、中胚葉前駆細胞および決定された細胞の拡大をもたらす因子として確立され、前駆細胞および決定された細胞の数を増加させる。中胚葉系細胞を形成するＭＳＣの分化因子は、哺乳類の組織で自然に見出だされるため、ｅｘ ｖｉｖｏで得られたトロポエラスチン／ＭＳＣ組成物を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで中胚葉系細胞を創出することができる。３つの適用性、すなわち（ｉ）手術または生検中に採取されたＭＳＣをトロポエラスチンと接触させ、程度の差はあれ、直ちに中胚葉系細胞を必要とする個体の組織部位に投与、（ｉｉ）手術または生検中に採取されたＭＳＣを、ＭＳＣ細胞数の拡大が可能になる期間ｅｘ ｖｉｖｏでトロポエラスチンと接触させて、その後、拡大したＭＳＣおよびトロポエラスチンを含む組成物を、中胚葉系細胞を必要とする個体の組織部位に投与、および（ｉｉｉ）手術または生検中に採取されたＭＳＣを、ＭＳＣ細胞数の拡大が可能になる期間ｅｘ ｖｉｖｏでトロポエラスチンと接触させ、その後、組成物を分化を誘導する１つ以上の因子と接触させて、中胚葉系細胞を必要とする個体の組織部位に投与、が予示される。
したがって、さらなる実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を個体において形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣおよびトロポエラスチンの組成物を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体に組成物を投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与される。
この実施形態によれば、個体に投与されたときにＭＳＣの分化をもたらすのは、個体の内因性分化因子である。
この実施形態によれば、例えばＭＳＣの分離工程、トロポエラスチンとの接触工程、および個体への投与工程が、１つの外科的処置内で達成されるように、ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、個体からの分離後数時間以内、例えば１〜６時間以内、好ましくは１時間未満で個体に投与してもよい。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣおよびトロポエラスチンの組成物を形成すること、およびその後、（ｉｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体に組成物を投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系統の細胞を形成することを含む。この実施形態によれば、個体に投与されたときにＭＳＣの分化をもたらすのは、個体の内因性分化因子である。
上記の実施形態では、トロポエラスチンおよびＭＳＣは、一般に、トロポエラスチンおよびＭＳＣの両方を含有する組成物の形態で投与される。これらの実施形態では、この組成物が、ＭＳＣの増殖もしくは分化のためのさらなる因子を含んでもよく、またはこれらのさらなる因子を個別に個体に投与してもよい。いくつかの実施形態では、増殖因子はトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、増殖因子は血清を含む。いくつかの実施形態では、分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
別の実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体にトロポエラスチンを投与し、それによって個体にトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣがトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）に接触するようにＭＳＣを個体に投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。この方法の１つの利点は、個体への投与前にトロポエラスチンとＭＳＣとを接触させる工程を回避することである。具体的には、個体は、個体からＭＳＣを単離する前に、ＭＳＣまたはそれに由来する中胚葉細胞の産生を必要とする部位にトロポエラスチンを投与されることができる。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、骨障害または骨折の領域である。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、脂肪の喪失または萎縮の領域である。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、軟骨障害の領域である。分離後、ＭＳＣは、トロポエラスチンが既に定着している部位に注入されるだけである。これにより、ＭＳＣからの中胚葉細胞の形成が可能になる。
上記の実施形態では、ＭＳＣは、一般に、確立された技術によって個体から採取される。
通常、ＭＳＣは自己由来である。
上述の実施形態では、拡大期で利用される細胞の数は、一般に約１０３〜１０５細胞である。
本明細書に記載の実施形態で使用するためのＭＳＣは、これらに限定されないが、例えば、骨髄、臍帯細胞、脂肪組織、臼歯細胞、羊水および末梢血を含む、様々な供給源に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、骨髄、臍帯細胞、脂肪組織、臼歯細胞、羊水および末梢血に由来する。
培養では、ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現する。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７９ａ、およびＨＬＡ ＤＲが欠けてもよい。
上記の実施形態では、トロポエラスチンの濃度は、一般に、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。
トロポエラスチンは、適切な供給源から（例えば、ヒトまたは他の動物から）精製することにより入手しても、または例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載されているような標準的な組換えＤＮＡ技術により産生してもよい。
組換えトロポエラスチンは、改変（例えば、アミノ酸置換、欠失、および異種アミノ酸配列の付加）を組み込んでもよく、それにより、例えば、それぞれのタンパク質の生物活性または発現を増強し得るトロポエラスチン類似体を形成する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、配列番号１に示される配列を含む。
好ましい実施形態では、方法は、ＭＳＣの増殖および／または分化を含む、本明細書に記載される様々な用途のためにＳＨＥＬδ２６Ａ類似体（ＷＯ１９９９／０３８８６）を利用する。ＳＨＥＬδ２６Ａ（配列番号：１）のアミノ酸配列は、次のとおりである。
（配列番号：１；
Figure 2021514676
）
代替の実施形態では、トロポエラスチンアイソフォームは、ＳＨＥＬアイソフォーム（ＷＯ １９９４／１４９５８；参照によりその全体が本明細書に含まれる）（配列番号２；
Figure 2021514676
）、
またはＳＨＥＬのプロテアーゼ耐性誘導体、またはＳＨＥＬδ２６Ａアイソフォームである（ＷＯ ２０００／０４０４３；参照によりその全体が本明細書に含まれる）。ＷＯ ２０００／０４０４３に記載されているように、記載されたトロポエラスチンのタンパク質配列は、タンパク質分解による消化に対する感受性の低下または排除をもたらす、変異した配列を有し得る。限定するものではないが、トロポエラスチンアミノ酸配列は、例えば、セリンプロテアーゼ、トロンビン、カリクレイン、メタロプロテアーゼ、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢ、血清タンパク質、トリプシンまたはエラスターゼに対する感受性が低下または排除されている。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、配列番号３に示される配列を含む。（ＳＨＥＬδ２６Ａアイソフォーム）（配列番号３：
Figure 2021514676
）。
いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、配列番号４に示される配列を含む（ＳＨＥＬδｍｏｄアイソフォーム）（配列番号：４：
Figure 2021514676
）。
トロポエラスチン類似体は、一般にヒトのトロポエラスチン配列に相同な配列を有する。一対の配列間の同一性の割合は、ＢＥＳＴＦＩＴコンピュータプログラムに実装されたアルゴリズムによって計算され得る。配列の相違を計算する別のアルゴリズムは、迅速なデータベース検索用に構成され、ＢＬＡＳＴコンピュータプログラムに実装されている。ヒト配列と比較して、トロポエラスチンポリペプチド配列は、アミノ酸レベルで約６０％のみ同一、約７０％以上同一、約８０％以上同一、約９０％以上同一、約９５％以上同一、約９７％以上同一、または約９９％超同一であり得る。
比較すると、保存的アミノ酸置換（例えば、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｖａｌ／ｌｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｇｌｎ／Ａｓｎ）も考慮されてもよい。これらのアミノ酸残基の対の化学的類似性は、多くの場合、機能的同等性をもたらすと予想されるからである。ポリペプチドの生物学的機能を保存すると予想されるアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸残基の化学的属性、例えば疎水性、親水性、側鎖電荷、またはサイズなどを保存するであろう。
使用されるコドンはまた、宿主のコドン優先性を利用することにより、異種宿主における翻訳に適合させることができる。これは、ポリペプチドの化学構造を実質的に変化させることなく、異種宿主の翻訳機構に適応するであろう。コドン最適化の使用は以前に説明されており、翻訳されたタンパク質のレベルの最適化での使用において、認識することができる。
トロポエラスチンの組換え型は、ＷＯ １９９９／０３８８６に示されているように産生することができる。これらの配列は、配列番号：５（配列番号：５；
Figure 2021514676
）；配列番号：６（配列番号：６；
Figure 2021514676
）；配列番号：７（配列番号：７；
Figure 2021514676
）；配列番号：８（配列番号：８：
Figure 2021514676
）；配列番号：９（配列番号：９；
Figure 2021514676
）；配列番号：１０（配列番号：１０；
Figure 2021514676
）；配列番号：１１（配列番号：１１；
Figure 2021514676
）；配列番号：１２（配列番号：１２；
Figure 2021514676
）；配列番号：１３（配列番号：１３；
Figure 2021514676
）；配列番号：１４（配列番号：１４；
Figure 2021514676
）；配列番号：１５（配列番号：１５；
Figure 2021514676
）である。
ＭＳＣからの中胚葉系細胞の産生の誘導においてトロポエラスチンの生物活性を利用するために、トロポエラスチンは本明細書に記載の実施形態の製剤で提供されることが、理解されるであろう。この文脈において、トロポエラスチンは、拡大または分化期で使用するための、トロポエラスチン含有組成物の活性成分である。
上記のように、いくつかの実施形態では、細胞培養で利用される少なくともいくつかのトロポエラスチンは、固相またはヒドロゲルに付着されていない。これにより、拡大および／または分化期に提供される全てのトロポエラスチンではないにしても、少なくとも一部のトロポエラスチンが、ＭＳＣの産生またはＭＳＣの分化のためにＭＳＣを適切に刺激できるようになる。
いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、生体ポリマー、一例としてヒアルロン酸などの別の分子に結合した形態である。結合は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、配列番号１に示される配列を含む。
トロポエラスチンが別の分子に連結されている場合、その連結は、トロポエラスチンの非連結形態に固有の生物学的特性を妨害または制限しないことが、特に好ましい。したがって、トロポエラスチンが別の分子と結合している場合、トロポエラスチンは、トロポエラスチンの生物学的特性、特に本明細書に記載されるような拡大または分化期で利用される能力を保持する。
トロポエラスチンを別の分子と連結する目的は、通常、トロポエラスチンを特定の領域に局在化させること、特にトロポエラスチンがその領域から拡散または移動する可能性を最小限に抑えることである。これは、ＭＳＣが適用または投与される個体にトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）が提供される、本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｖｏ実施形態に特に関連する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）は、局所部位に提供され、ここで局所部位とは、骨障害または骨折の領域である。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）は、局所部位に提供され、ここで局所部位とは、脂肪喪失または萎縮の領域である。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）は、局所部位に提供され、ここで局所部位とは、軟骨障害の領域である。
トロポエラスチンがグルタルアルデヒドを介して、もしくはリシルオキシダーゼによって（エラスチンのように）共有結合している形態、またはアルカリ性重合形態では、トロポエラスチンは、本明細書で記載される、拡大または分化期でトロポエラスチンの使用を可能にする生物学的活性を保持していないことは、理解されるであろう。
一実施形態では、細胞培養のために提供されるトロポエラスチンの少なくとも約５０％は、例えば、オリゴ糖、多糖、またはそれらの誘導体などの糖類含有分子などの、生体分子および／または生体ポリマーと結合している。他の実施形態では、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％のトロポエラスチン、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲内の任意の量のトロポエラスチンは、別の分子と連結している。
トロポエラスチンとヒアルロン酸との複合体が利用される上記の実施形態では、ヒアルロン酸は、一般に約０．１〜３０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で利用される。
好ましくは、トロポエラスチンとヒアルロン酸との複合体では、トロポエラスチンのヒアルロン酸に対する比率は、約１００：１、より好ましくは約５０：１、より好ましくは約１０：１、より好ましくは約１：１、より好ましくは約１：１０、より好ましくは約１：１００である。
特定の実施形態では、使用のための所与の組成物中の別の化合物に連結されていないトロポエラスチン分子の数は、好ましくは、トロポエラスチンの少なくとも約５％、約１０％、約１５％、もしくは約２０％、または組成物中の、前述の値の任意の２つの間の任意の量である。
特定の実施形態では、トロポエラスチンは、細胞培養用の組成物中のトロポエラスチンの量に関して、組成物中の他のタンパク質または分子の量と比較して、規定された度合いの純度を有する。一実施形態では、少なくとも約７５％の純度、好ましくは約８５％の純度、より好ましくは約９０％または約９５％を超える純度を有するトロポエラスチンが組成物中に存在する。トロポエラスチンの断片、すなわちトロポエラスチンの製造を通じて非意図的に生じるトロポエラスチンアイソフォームの切断型は、この文脈では不純物と見なされ得る。
特定の実施形態においてトロポエラスチンは、トロポエラスチン、好ましくはトロポエラスチンの全長アイソフォームからなるか、または本質的にそれからなる組成物の形態で提供され得ることが、さらに理解されるであろう。代替の実施形態では、トロポエラスチンは、関連するトロポエラスチンアイソフォームの長さの少なくとも約６５％、全長の約８０％超、全長の約９０％超または約９５％超であろう。
特定の実施形態では、トロポエラスチンは、３次元構造の形態で細胞培養に提供されてもよい。ＭＳＣは、３次元構造内に播種されるか、またはＭＳＣが３次元構造に移動できる条件で細胞培養に提供される。
３次元構造は、ヒドロゲルであってもよい。典型的には、いくつかの実施形態に従って使用するためのヒドロゲルは、足場を形成し、ヒドロゲルに下記の機械的特性、本明細書に記載の拡大および／または誘導期で使用するための水およびトロポエラスチンを注入する高分子親水性分子を含む。
以下に記載するように、高分子親水性分子の例には、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸、キサンタンガム、グアーガム、β−グルカン、アルギナート、カルボキシメチルデキストランが含まれる。
一実施形態では、ヒドロゲルは、約１００ｋＰａ〜約２ＭＰａの引張強度を提供することができる。引張強度は、通常、材料の断面が大幅に伸び始める前に、材料が伸ばされ、または引っ張られながら耐えることができる最大応力として定義される。当業者は、材料の極限強度を試験するための適切な方法を知っているであろう。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、約１０ｋＰａ〜約４５ｋＰａ（例えば、約１２ｋＰａ〜約４０ｋＰａ）の範囲の極限強度を有することができる。
別の実施形態では、ヒドロゲルは、５０ｋＰａ〜７００ｋＰａの圧縮強度を有する。圧縮強度は、軸方向の押圧力に耐える材料または構造の能力である。それは、圧力対変形のデータ（またはプロット）を試験方法の条件に提供する。定義により、材料の圧縮強度は、材料が完全に破損したときに到達する一軸圧縮応力の値である。圧縮強度は、通常、圧縮試験によって実験的に得られる。この実験に使用した装置は、引張試験で使用したものと同じである。しかしながら、一軸引張荷重をかけるのではなく、一軸圧縮荷重がかけられる。想像できるように、試料は縮むだけでなく、横に広がる。多くの場合、圧縮強度は万能試験機で測定され、これらは、非常に小さな卓上用システムから５３ＭＮを超える容量のシステムにわたる。圧縮強度の測定は、特定の試験方法および測定条件に影響される。
ヒドロゲルの圧縮強度は、所与のひずみレベル（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、６０％、約６５％、約７０％または約７５％のひずみレベル）での周期的負荷を使用して測定できる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルの圧縮弾性率は、約１ｋＰａ、約１０ｋＰａ、約２０ｋＰａ、約３０ｋＰａ、約４０ｋＰａ、約５０ｋＰａ、約６０ｋＰａ、約７０ｋＰａ、約８０ｋＰａ、約９０ｋＰａ、約１００ｋＰａ、約１１０ｋＰａ、約１２０ｋＰａ、約１３０ｋＰａ、約１４０ｋＰａ、約１５０ｋＰａ、約１６０ｋＰａ、約１７０ｋＰａ、１８０ｋＰａ、約１９０ｋＰａ、約２００ｋＰａ、２１０ｋＰａ、約２２０ｋＰａ、約２３０ｋＰａ、約２４０ｋＰａ、約２５０ｋＰａ、約２６０ｋＰａ、約２７０ｋＰａ、２８０ｋＰａ、２９０ｋＰａ、３００ｋＰａ、約３１０ｋＰａ、３２０ｋＰａ、３３０ｋＰａ、３４０ｋＰａ、３５０ｋＰａ、約３６０ｋＰａ、約３７０ｋＰａ、約３８０ｋＰａ、約３９０ｋＰａ、約４００ｋＰａ、約４１０ｋＰａ、約４２０ｋＰａ、約４３０ｋＰａ、約４４０ｋＰａ、約４５０ｋＰａ、約４６０ｋＰａ、約４７０ｋＰａ、約４８０ｋＰａ、約４９０ｋＰａ、または約５００ｋＰａ、または前述の任意の２つの値で定義された範囲内の任意の圧縮弾性率である。ヒドロゲルの圧縮弾性率は、約１ｋＰａ〜約５００ｋＰａの範囲で変動し得る。
圧縮下では、ヒドロゲルは、エネルギーを失う可能性がある。エネルギー損失は、約５％〜約５０％の範囲で変動し得る。いくつかの実施形態では、エネルギー損失は、約１０％〜約４０％、約２０％〜約３５％（例えば、２３±３．２％または２４．１±７％）、または約２５％〜約３０％（例えば、３０．５±６．４または２６．９±２．３）であり得る。
一実施形態では、ヒドロゲルの破壊時のひずみは、約１３０ｋＰａ〜約４２０ｋＰａの間である。破壊試験でのひずみは、破壊するまで試料を伸ばし、破壊点でのひずみを、ひずみ／応力曲線から判定することによって実施される。
特定の実施形態では、ヒドロゲルまたは足場は、約５００Ｐａ〜約５０Ｐａ、約４５０Ｐａ〜約１００Ｐａ、約４００Ｐａ〜約１２５Ｐａ、約４００Ｐａ〜約１５０Ｐａ、または約３８５Ｐａ〜約１５０Ｐａの弾性率を有し得る。弾性率は、使用される濃度および成分に応じて変動するだろう。
特定の実施形態では、ヒドロゲルは、２５Ｇの針から押し出される場合、少なくとも約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１２ｃｍ、約１５ｃｍ、約１８ｃｍ、約２０ｃｍ、または約２５ｃｍの押出可能な長さ、または前述の任意の２つの値で定義された範囲内の、任意の押し出し可能な長さを有し、実質的に凝集性であり、実質的に支持なしでまとまっている。特定の実施形態は、２７Ｇ針で押し出される場合、少なくとも約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１２ｃｍ、約１５ｃｍ、約１８ｃｍ、約２０ｃｍ、または約２５ｃｍの押出可能な長さ、または前述の２つの任意の値で定義された範囲内の、任意の押し出し可能な長さを有し得、実質的に凝集性であり、実質的に支持なしでまとまっている。特定の実施形態は、３０Ｇ針または３１Ｇ針で押し出される場合、少なくとも約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１２ｃｍ、約１５ｃｍ、約１８ｃｍ、約２０ｃｍ、または約２５ｃｍの押出可能な長さ、または前述の２つの任意の値で定義された範囲内の、任意の押し出し可能な長さを有し得、実質的に凝集性であり、実質的に支持なしでまとまっている。
特定の実施形態は、微細なゲージの針を通して、少なくとも約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１２ｃｍ、約１５ｃｍ、約１８ｃｍ、約２０ｃｍ、約または２５ｃｍの押出可能な長さ、または前述の２つの任意の値で定義された範囲内の、任意の押し出し可能な長さを有し得る。
いくつかの実施形態では、使用するヒドロゲルは、膨潤性であってもよい。「膨潤性」という用語は、膨潤剤に実質的に不溶性であり、相当量の膨潤剤を吸収することができ、それにより、膨潤剤と接触したときに体積が増加するヒドロゲルを指す。本明細書で使用する場合、「膨潤剤」という用語は、文書に鑑みてその平易で通常の意味を有し、限定することなく、少なくともある程度の膨潤をもたらす化合物または物質を指すこともできる。典型的には、膨潤剤は水溶液または有機溶媒であるが、膨潤剤は気体であることもできる。いくつかの実施形態では、膨潤剤は、水または生理学的溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、または増殖培地である。
いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは膨潤剤を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、５０％（ｗ／ｖ）超、６０％（ｗ／ｖ）超、７０％（ｗ／ｖ）超、８０％ｖ超、９０％（ｗ／ｖ）超、９１％（ｗ／ｖ）超、９２％（ｗ／ｖ）超、９３％（ｗ／ｖ）超、９４％（ｗ／ｖ）超、９５％（ｗ／ｖ）超、９６％（ｗ／ｖ）超、９７％ｖ超、９８％（ｗ／ｖ）超、９９％（ｗ／ｖ）超、またはそれを超える膨潤剤を含むことができる。
用語「膨潤比」は、本明細書では、膨潤前のヒドロゲルの乾燥重量あたりの、膨潤したヒドロゲル中の膨潤剤の重量を意味するために使用される。例えば、膨潤比は、ヒドロゲル中のトロポエラスチン１グラム当たり、膨潤剤約１〜約１０グラムの間で変動し得る。いくつかの実施形態では、膨潤比は、ヒドロゲル中のトロポエラスチン１グラムあたり、約１〜約５グラムの膨潤剤であり得る。いくつかの実施形態では、膨潤比は、ヒドロゲル中のトロポエラスチン１グラム当たり、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．２５、約２．５、約２．７５、約３、約３．２５、約３．５、約３．７５、約４、約４．２５、約４．５、約４．７５または約５グラムの膨潤剤であり得る。いくつかの実施形態では、膨潤比は、ヒドロゲル中のトロポエラスチン１グラム当たり、１．２±０．２、２．３±０．３、または４．１±０．３グラムの膨潤剤であり得る。
特定の好ましい実施形態では、ヒドロゲルは、足場として使用するためのヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。これらの状況では、ＨＡは特定の機械的特性をヒドロゲルに提供するように機能し、トロポエラスチンが、ヒドロゲルが提供される部位を刺激して骨形成を誘導する生物学的因子として機能する能力を有するように、トロポエラスチンは実質的に遊離（非架橋）に保たれる。
ヒドロゲルがトロポエラスチンおよびヒアルロン酸を含む特定の実施形態では、トロポエラスチンとヒアルロン酸との質量比は、約０．１：１〜約５００：１、好ましくは約０．２：１〜約１００：１である。
さらなる実施形態では、ヒドロゲルは、約０．１％〜約１５％の濃度のＨＡを含み得る。特定の実施形態では、ヒドロゲルは、約０．１％〜約１０％の濃度のＨＡを含み得る。
ヒドロゲルは、ＨＡがそれ自体および／またはモノマータンパク質と架橋する度合いを制御するために、誘導体化ＨＡまたは非誘導体化ＨＡを含み得る。
特定の実施形態では、ＨＡは、少なくとも１つの連結可能部分、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミン、チオール、アルコール、アルケン、アルキン、シアノ基、またはアジド、および／またはそれらの修飾体、誘導体、もしくは組み合わせなどの、少なくとも１つの架橋性部分を含み得る。
特定の実施形態では、ＨＡは、スペーサー基が同じ分子および／または第２の分子、例えば、第２の生体分子または生体ポリマーに連結できるように、スペーサー基を含むことができる。
ヒドロゲルで使用されるＨＡは、約５０〜約４０００の二糖単位または残基、例えば、約２０００〜２５００の二糖単位または残基であり得る。他の実施形態では、ヒアルロン酸は、２００〜１０，０００の二糖単位または残基で使用されてもよい。
特定の実施形態では、ＨＡは低分子量または高分子量であり得、その選択は、当業者のヒドロゲルの粘度を改変する意図に応じて変動するだろう。例えば、より分子量の低いのヒアルロン酸を使用すると、ヒアルロン酸を修飾、沈殿、洗浄することができ、ヒアルロン酸は、架橋剤として容易に使用できる、適度に低粘度の溶液のままである。より分子量の高い多糖類を使用すると、さらなるの取り扱い上の問題（例えば、粘性溶液、混合、曝気などの問題）が発生し得るが、特定の実施形態では、幅広い分子量を使用して、所望の結果を達成することができる。
特定の実施形態では、ＨＡは、ＥＤＣまたはアリルグリシジルエーテルなどの活性化剤、および／またはＮＨＳ、ＨＯＢｔまたは臭素などの修飾剤で活性化および／または修飾することができる。
「ヒアルロン酸」または「ＨＡ」という用語は、ヒアルロン酸およびそのヒアルロン酸塩のいずれか、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム（ナトリウム塩）、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、およびヒアルロン酸カルシウムを含み得る。本明細書では、様々な供給源からのヒアルロン酸を使用することができる。例えば、ヒアルロン酸は、動物組織から抽出されるか、細菌発酵の産物として採取されるか、またはバイオプロセス技術により商業的量で生成され得る。
ヒドロゲルに含めてもよい適切な多糖類には、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロースカルボキシメチルアミロース（「ＣＭＡ」）、キサンタンガム、グアーガム、β−グルカン、アルギナート、カルボキシメチルデキストラン、グリコサミノグリカン誘導体、コンドロイチン６硫酸、デルマチン硫酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはポリグリコール酸（ＰＧＡ）などの生体材料、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、１−ヒドロキシアパタイト（ＰＡＨ）、およびそれらの薬学的に許容される塩が含まれる。
あるいは、多糖は、ペクチンまたはその誘導体（直鎖および分枝多糖類を含む）であり得る。
トロポエラスチンヒドロゲルで使用される足場剤が、カルボキシメチルセルロースまたはキサンタンガムである場合、薬剤は、約０．０１〜約１０パーセント（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．５〜約３．５パーセント（ｗ／ｖ）の量で提供され得る。
足場は、置換または付加側鎖を典型的に有する、架橋または非架橋多糖であり得る。
さらなる足場は、ポリメタクリラート、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールサブユニットとの（ブロック）コポリマー（例えば、ポロキサマー１８８およびポロキサマー４０７）に由来する足場を含み得る。ヒドロゲルに含まれる代替剤には、ラウリル硫酸ナトリウムおよびポリソルベートなどの界面活性剤、またはパントテノール、ポリエチレングリコール、キサンタンガム、グアーガム、ポリソルベート８０、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびそれらの薬学的に許容される塩が含まれる。
追加の実施形態
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供される。この方法は、（ｉ）細胞培養物表面を有する細胞培養容器であって、細胞培養物表面上にトロポエラスチンが配置され、前記配置によって、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地にトロポエラスチンを少なくとも部分的に溶解できる、細胞培養容器を準備する工程、および（ｉｉ）ＭＳＣを培養容器内で培養し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する工程を含むことができる。
いくつかの実施形態では、骨形成、脂肪生成および軟骨形成は、拡大状態のトロポエラスチンの存在により促進される。この効果は、トロポエラスチンの分裂促進効果とは区別され得る。いくつかの実施形態では、細胞が拡大期にトロポエラスチンに曝露されると、骨形成、脂肪生成および軟骨形成が促進される。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
本明細書に記載の実施形態の方法では、トロポエラスチンは、完全血清培地中の増殖因子に代わることができる。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、通常培地または成長因子補充培地におけるＭＳＣ増殖を改善するだけでなく、細胞拡大の同じ増幅レベルを維持しながら、ＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのいずれかに代わることもできる。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、血清低減培地中の増殖因子に代わることができる。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、培地中の実質的な血清削減を可能にする。トロポエラスチンは、ＭＳＣ拡大中の血清への依存を減らすために使用でき、これは臨床的に有益であり、例えば、有害な免疫反応などの動物由来の産物による感染リスクを回避できる。そのため、トロポエラスチンは、臨床的に適切な細胞の培養のために使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度のトロポエラスチンも、ＭＳＣ拡大を著しく増強する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、成長因子と比較して、より多くの血清の削減を可能にする。いくつかの実施形態では、溶液中のトロポエラスチンは、表面結合トロポエラスチンと同様に、ＭＳＣ増殖を促進する。いくつかの実施形態では、溶液中のトロポエラスチンは、完全血清培地中のＩＧＦ−１およびｂＦＧＦに代わることができる。いくつかの実施形態では、溶液中のトロポエラスチンは、基材コーティング濃度に相当する、より高いトロポエラスチン濃度で、機能的に表面結合タンパク質に取って代わり、完全血清培地におけるＩＧＦ−１とｂＦＧＦとの相乗効果に匹敵する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、通常培地または成長因子補充培地におけるＭＳＣ増殖を改善する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、細胞拡大を改善する。本明細書の実施形態のトロポエラスチンによって、ＭＳＣは、トロポエラスチンを介した拡大中、細胞表現型を保持できる。本明細書のいくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、αｖインテグリンを介してＭＳＣの付着および拡散を調節する。本明細書のいくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、αｖインテグリンを介してＭＳＣの拡大を調節する。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、基材結合および可溶性トロポエラスチンは、ＭＳＣを引き付ける。トロポエラスチンが溶液に添加されるいくつかの実施形態では、トロポエラスチンの固相への付着が防止され、ここで固相は、細胞培養容器など、細胞を保持するためのビヒクルである。細胞培養容器などの組織培養基材は、例えば、溶液中のトロポエラスチンなどの第２のタンパク質が組織培養基材に付着するのを防ぐために、タンパク質でコーティングすることができる。コーティングに使用されるタンパク質は、例えば、血清タンパク質であり得る。細胞培養技術の実施前に、過剰な血清タンパク質を洗い流してもよい。いくつかの実施形態では、増殖因子および／または分化因子は、骨形成中にＭＳＣ分化を促進する。いくつかの実施形態では、骨形成、脂肪生成および軟骨形成の促進は、ＭＳＣが拡大段階でトロポエラスチンに曝露されると増強される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣへの分裂促進効果を有さない。いくつかの実施形態では、骨障害または骨折を有する個体を治療する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の実施形態の組成物のいずれか１つによる組成物を個体に提供し、それにより個体の骨障害または骨折を治療することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書の実施形態に記載されている方法のいずれか１つによって形成される。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＳＣを、ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと触させ、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含み、トロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多いいくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）トロポエラスチンを含む培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を培地で培養することを含み、ここで培地は、ＭＳＣの分化を誘導する少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４ ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の骨細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、個体に組成物が提供され、ここで個体に提供されるＭＳＣの総量は、個体の体重１キログラムあたり少なくとも１００万〜２００万細胞である。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、その方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を分化期中にトロポエラスチンと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、拡大期中にＭＳＣを、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子と接触させることを、さらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、方法は、分化期中にＭＳＣを分化因子と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大および誘導中にトロポエラスチンへ曝露すると、細胞の骨（骨形成）、脂肪（脂肪形成）および軟骨（軟骨形成）への機能性分化が調節され得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ拡大中にトロポエラスチンが存在すると、トロポエラスチンに曝露されていない細胞における骨形成と比較して、骨形成が向上する。いくつかの実施形態では、拡大および分化中にトロポエラスチンを添加すると、拡大および分化段階中にトロポエラスチンに曝露されていない細胞と比較して、骨形成が増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または分化中にトロポエラスチンを添加すると、ＭＳＣの拡大および分化中にトロポエラスチンに曝露されていない細胞と比較して、脂肪形成が増加する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンの絶え間ない存在により、有益性が見られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ拡大中にトロポエラスチンが存在すると、ＭＳＣ拡大中にトロポエラスチンに曝露されていないＭＳＣ細胞と比較して、軟骨形成が向上する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、７日間の拡大期間の１〜７日目からトロポエラスチンに曝露される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、７日間の拡大期間の２〜５日目からトロポエラスチンに曝露される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、７日間の拡大期間の４〜７日目からトロポエラスチンに曝露される。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから骨細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を、トロポエラスチン、およびＭＳＣからの骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と分化期中に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、拡大期中にＭＳＣを、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子と接触させることを、さらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣから骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、拡大期は、分化期とは無関係に実施され、完了する。トロポエラスチンの存在により、トロポエラスチンの非存在下で行われる方法と比較して、骨形成分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから脂肪細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を、トロポエラスチン、およびＭＳＣからの脂肪細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と分化期中に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、拡大期中にＭＳＣを、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子と接触させることを、さらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣからの脂肪細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む。いくつかの実施形態では、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから軟骨細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を、トロポエラスチン、およびＭＳＣからの軟骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と分化期中に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、拡大期中にＭＳＣを、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子と接触させることを、さらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する少なくとも１つの因子は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣからの軟骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでヒアルロン酸は、部分的または完全に可溶性であり、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸によって互いに結合したモノマー形態である。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから骨細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を、トロポエラスチン、およびＭＳＣからの骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と分化期中に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣから骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、拡大期は、分化期とは無関係に実施され、完了する。トロポエラスチンの存在により、トロポエラスチンの非存在下で行われる方法と比較して、骨形成分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから脂肪細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を、トロポエラスチン、およびＭＳＣからの脂肪細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と分化期中に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣからの脂肪細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む。いくつかの実施形態では、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンに曝露された細胞は、トロポエラスチンを欠く培養物と比較して、トロポエラスチンの存在下で細胞内脂質形成が増加することを示す。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから軟骨細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）拡大期中にＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それにより拡大されたＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）拡大されたＭＳＣの集団を、トロポエラスチン、およびＭＳＣからの軟骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子と分化期中に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａおよび／またはＷｎｔ３ａの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、ＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣからの軟骨細胞の形成を誘導する少なくとも１つの因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。いくつかの実施形態では、拡大期は、分化期とは無関係に完了する。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでヒアルロン酸は、部分的または完全に可溶性であり、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸によって互いに結合したモノマー形態である。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）でトロポエラスチンに曝露された細胞は、トロポエラスチンなしで拡大された細胞と比較して、グリコサミノグリカンレベルの増加を示す。いくつかの実施形態では、分化期中のトロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。いくつかの実施形態では、拡大および／または分化中に添加されたトロポエラスチンにより、分化の可能性が向上する。いくつかの実施形態では、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１５ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、または２５ｕｇ／ｍｌの濃度、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲の任意の濃度のトロポエラスチンが、拡大および／または分化期中に添加される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている実施形態のいずれかによって製造された細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の脂肪細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の軟骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
いくつかの実施形態では、骨障害または骨折を有する個体を治療する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかの組成物を個体に提供することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＭＳＣを分化させて骨細胞または骨細胞の前駆細胞を形成するための、少なくとも１つの因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、骨障害または骨折の領域である。
いくつかの実施形態では、疾患または外傷に起因する脂肪喪失または萎縮の領域を有する個体、または手術または疾患に起因する外科的増強を必要とする個体を治療する方法が提供され、方法は、本明細書に記載される実施形態の組成物のいずれかを個体に提供することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＭＳＣを分化させて脂肪細胞または脂肪細胞の前駆細胞を形成するための、少なくとも１つの因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、脂肪喪失または萎縮の領域である。
いくつかの実施形態では、軟骨障害を有する個体を治療する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの組成物を個体に提供することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＭＳＣを分化させて軟骨細胞または軟骨細胞の前駆細胞を形成するための、少なくとも１つの因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の局所部位に投与され、ここで局所部位とは、軟骨障害の領域である。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣの増殖を誘導する方法が提供され、その方法は、ＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによってＭＳＣの増殖を誘導することを含み、トロポエラスチンの存在下で形成されるＭＳＣの数は、トロポエラスチンの非存在下で形成されるＭＳＣの数よりも多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣの培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含む培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を、ＭＳＣの増殖を誘導する因子を含む培地で培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣの拡大期中、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子の非存在下で存在する。いくつかの実施形態では、方法は、ＩＧＦ１および／またはｂＦＧＦの非存在下で実施される。いくつかの実施形態では、拡大期は、トロポエラスチンの非存在下、およびタンパク質源の非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、タンパク質源は血清に由来する。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成する方法が提供され、この方法は、（ｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を必要とする個体にトロポエラスチンを投与し、それによって個体にトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣがトロポエラスチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）に接触するようにＭＳＣを個体に投与し、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む。ＭＳＣは、細胞を必要とする領域に局所的に投与される。いくつかの実施形態では、個体は、疾患または外傷から生じる脂肪の喪失または萎縮を患っている。いくつかの実施形態では、個体は、骨障害または骨折を患っている。いくつかの実施形態では、個体は、軟骨障害を患っている。
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法が提供される。この方法は、ＭＳＣを、（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための少なくとも１つの分化因子、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させ、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含み、トロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはモノマーである。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。
いくつかの実施形態では、本明細書の実施形態のいずれか１つによる方法から形成された細胞の組成物が提供される。細胞を形成する方法は、ＭＳＣを、（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための少なくとも１つの分化因子、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させ、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含み、トロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはモノマーである。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の骨細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含む。
いくつかの実施形態では、骨障害または骨折を有する個体を治療する方法が提供される。この方法は、本明細書の実施形態のいずれか１つによる組成物を個体に提供し、それにより、骨障害または骨折について個体を治療することを含む。細胞の組成物は、本明細書の実施形態のいずれか１つによる方法から形成される。細胞を形成する方法は、ＭＳＣを、（ｉ）ＭＳＣから中胚葉系細胞の形成を誘導するための少なくとも１つの分化因子、および（ｉｉ）トロポエラスチンと接触させ、それによりＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含み、トロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数は、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣが細胞培養物表面と接触すると、ＭＳＣがトロポエラスチンと接触できるように、細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させて、ＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および（ｉｉ）ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および（ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、ここで第２の培地は、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、絹タンパク質を供給されない。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、部分的または完全に可溶なヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、ここでトロポエラスチンモノマーは、ヒアルロン酸によって互いに結合される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはモノマーである。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、中胚葉系細胞は、骨細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に純粋な形態の骨細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、個体に組成物が提供され、個体に提供される組成物中のＭＳＣの総量は、個体の体重１キログラムあたり少なくとも１００万〜２００万細胞である。いくつかの実施形態では、個体に組成物が提供され、個体に提供される組成物中のＭＳＣの総量は、少なくとも１００万〜２００万細胞であり、組成物は局所部位に投与される。このように、トロポエラスチンで前処理された細胞は、骨障害の治療に使用される。
いくつかの実施形態では、トロポエラスチンを含む細胞培養培地が提供され、培地は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約１０％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、培地は最小必須培地（ＭＥＭ）を含む。いくつかの実施形態では、培地はＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地が提供され、細胞培養培地はトロポエラスチンを含み、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する追加因子を含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２％〜約１０％の血清を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は無血清である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、最小必須培地（ＭＥＭ）を含む。いくつかの実施形態では、培地はＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。
いくつかの実施形態では、細胞培養物が提供され、細胞培養物は、間葉系幹細胞、およびトロポエラスチン含有培地を含み、培地は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導するための追加因子を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約１０％の血清または約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンを含む細胞培養培地が提供されるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞、およびトロポエラスチン含有培地を含み、培地が、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導するための追加因子を含まない、細胞培養物が提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導するための因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、培地は、２％〜約１０％の血清または約２％〜約６％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養物が提供され、細胞培養物は、間葉系幹細胞、ならびにトロポエラスチンおよび少なくとも１つの分化因子を含有する培地を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータグリセロホスファートを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分化因子は、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む。
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞を培養する方法が提供され、その方法は、ａ）間葉系幹細胞を細胞培養培地で培養すること、およびｂ）トロポエラスチンの存在下で間葉系幹細胞を拡大することを含み、培地は、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する追加の因子を含まない。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、７日間の拡大期間中の１〜７日目、２〜５日目、または４〜７日目から、トロポエラスチンに曝露される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、拡大または増殖を誘導する追加の因子は、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、培地は、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンは、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンはヒアルロン酸に架橋されている。いくつかの実施形態では、培地は、約２％〜約１０％の血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は無血清である。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの分化因子を含む培地中で、間葉系幹細胞を分化させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、トロポエラスチンの存在により、分化の効力が増大する。
例１
表面結合トロポエラスチンは、完全血清培地においてＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのいずれかと代わることができる。
ＭＳＣ増殖に対する基材結合トロポエラスチンの効果を判定するために、被覆なしまたはトロポエラスチン被覆した組織培養プラスチック（ＴＣＰ）上で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、および含まない、選択的にＩＧＦ−１および／またはｂＦＧＦを補充した種々の培地配合で、ＭＳＣを培養した（図１Ａ）。細胞は、無血清基本培地を除く、すべての条件において７日にわたり増殖した。通常の１０％（ｖ／ｖ）血清含有培地では、トロポエラスチン被覆ＴＣＰの細胞数は、被覆なしＴＣＰの細胞数より３９±３％増加した。ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、またはＩＧＦ−１およびｂＦＧＦを補充した培地でも、トロポエラスチンを介した有意な増殖増加、４１±１％、１６±２％、１６±３％がそれぞれ確認された。最も多い細胞数は、表面結合トロポエラスチンおよび可溶性成長因子の両方の存在下で確認された。
トロポエラスチンおよび成長因子の増殖促進活性を比較すると、トロポエラスチン基材上で、さらなる因子を含まない通常培地で培養されたＭＳＣは、ＴＣＰ上で、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの両方を含む培地の細胞と比較して、拡大が１４±２％減少することを示した。しかしながら、トロポエラスチン上の通常培地で成長した細胞は、ＴＣＰ上のＩＧＦ−１を含む培地での細胞よりも３６±３％多く増殖し、ｂＦＧＦを含む培地の細胞でも同様であった。これらの調査結果は、基材結合トロポエラスチンが、通常培地または成長因子補充培地でのＭＳＣ増殖を改善するだけでなく、細胞拡大の同じ増幅レベルを維持しながら、ＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのいずれかに代わり得ることを示している。
例２
基材結合トロポエラスチンは、血清低減培地において、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの両方に代わることができる。
培養培地に成長因子を添加すると、典型的には、ＭＳＣの増殖を遅らせることなく、血清濃度を下げることができる。したがって、実験を実施して、通常は成長因子によって補われる血清低減環境における、基材結合トロポエラスチンの増殖促進効果を判定した（図１Ｂ）。７％ＦＢＳを含む培地では、ＴＣＰ上で増殖したＭＳＣも、７日にわたる増殖を示したが、通常の完全血清培地で以前に確認されたものより、程度が低くなっている。基材結合トロポエラスチンは、成長因子を補充しない培地だけでなく（９７±１９％増加）、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、または両方の成長因子を既に含む培地でも（それぞれ４９±１％、４０±３％、または２９±３％増加）、すべての血清低減状況でＭＳＣ増殖を劇的に促進した。
さらに注目すべきことに、これらの血清低減状況では、トロポエラスチン上の、補充しない培地で培養されたＭＳＣは、ＴＣＰ上のＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのいずれかを含む培地の細胞と比較して、非常に大きな拡大を７日にわたり示し（それぞれ５９±１５％および３７±１３％増加）、両方の成長因子を含む培地中の細胞と同等の存在度であった。これらの結果は、表面に被覆したトロポエラスチンの、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの両方に代わって、血清低減環境でのＭＳＣ増殖を促進する能力を示している。
例３
トロポエラスチンは、培地中の実質的な血清の低減を可能にする。
７％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含む培地でのトロポエラスチンの増殖促進活性が持続するため、トロポエラスチンを介したＭＳＣ拡大に影響を及ぼさないであろう血清低減の最大限度を調査した（図２Ａ）。細胞は、ＴＣＰ、およびトロポエラスチンまたはフィブロネクチンで被覆したＴＣＰ上で、ＦＢＳの量を減らして（培地中、０−１０％（ｖ／ｖ））増殖させた。増殖の初期段階では、血清低減はＭＳＣによって十分に許容をされた。播種の３日後まで、被覆なしまたはフィブロネクチンで被覆した表面では、培地に血清が全く存在しない場合のみ、トロポエラスチンで被覆した表面では、血清を８０％低減した場合、ＭＳＣ数は著しく減少した。しかしながら、その後、被覆なしまたはフィブロネクチンで被覆した表面のＭＳＣ数は、血清の低減が進むにつれて次第に減少した。７日後、ＴＣＰまたはフィブロネクチン上のＭＳＣ増殖は、ほんの２０％の血清低減後、それぞれ２７±１％、１５±０．１％減少した。対照的に、トロポエラスチン基材上の細胞拡大は、最大で４０％の血清低減に影響されずにいた。この血清濃度での、被覆なしおよびフィブロネクチンで被覆したＴＣＰ上のＭＳＣ増殖は、通常培地と比較して、それぞれ３５±１％、２５±１％抑制された。
フィブロネクチンおよびトロポエラスチンは、完全血清培地でのＭＳＣ増殖を同等に促進したが、フィブロネクチンの有益性は、血清低減により大幅に低下した。これらの低下した血清濃度、すなわち培地組成の２−８％（ｖ／ｖ）で、トロポエラスチン被覆表面は、被覆なしまたはフィブロネクチン被覆表面と比較して、それぞれ１３５±５〜３０９±１２％、７６±４〜８６±６％、一貫して有意にＭＳＣ増殖を増強した。これらの調査結果は、トロポエラスチンが、ＭＳＣの拡大レベルを落とすことなく、培地中の実質的な血清減少を独自に補えることを強く示す。
例４
トロポエラスチンは成長因子と比較して、さらに大幅な血清低減を可能にする。
トロポエラスチンによって実証されるような、低血清状況で高レベルの幹細胞増殖を促進する能力は、典型的には成長因子に起因する特性である。これに基づき、この機能性を、基材結合トロポエラスチンと、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦとで比較した（図２Ｂ）。前の所見と一致して、ＭＳＣは、後期の増殖期中に血清削減の影響をより受けやすかった。播種後７日まで、ＴＣＰ上の成長因子含有培地の細胞数は、８％（ｖ／ｖ）ＦＢＳでは変化せず、培養中にＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの両方が存在すると、わずかな（２０％）血清低減が可能であることを示す。６％（ｖ／ｖ）ＦＢＳでは、しかしながら、成長因子含有培地の細胞数は、完全血清培地の細胞数と比較して大幅に、２５±２％減少した。対照的に、成長因子の非存在下でのトロポエラスチン上の細胞は、４０％の血清低減後も、損なわれない増殖レベルを維持した。この血清濃度で、トロポエラスチンは、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦのタンデムと比較してＭＳＣ増殖を２３±３％改善し、実質的な血清低減状況下でのＭＳＣ拡大の刺激において、トロポエラスチンが成長因子よりも機能的に優れていることを示す。
興味深いことに、表面結合トロポエラスチンは、成長因子が培地に存在する場合にも、播種後５日までではあるが、同様に４０％の血清低減を可能にした。この時点の後、細胞は、増殖への有害な影響を受けずに、最大２０％の血清低減を許容した。これらの結果は、血清補填に関与する代替経路の可能性を示唆しており、それは、基材結合トロポエラスチンに関連する可溶性成長因子への細胞の曝露に依存する可能性がある。
例５
溶液中のトロポエラスチンは、表面結合トロポエラスチンと同様にＭＳＣ増殖を促進する。
トロポエラスチンの分裂促進活性が、培養基材への固定化および機械的なきっかけの付与を条件とするかどうかを判断するために、溶液中のトロポエラスチンが、表面結合タンパク質と同様の細胞拡大の有益性を達成するかどうか試験した。通常培地でプレインキュベートした組織培養ウェルにトロポエラスチンを添加した場合、タンパク質はウェル表面に付着せず、溶液に残ったが、これはおそらくアルブミンなどの血清タンパク質による表面遮断が原因である（図１３Ａ）。
可溶性トロポエラスチンは、１μｇ／ｍＬほどの低い濃度で、通常培地と比較して、７日間にわたり一貫してＭＳＣ増殖を促進した（図１３Ｂ）。しかしながら、ＭＳＣ増殖を基材結合トロポエラスチンと同等の程度に刺激するには、少なくとも２．５μｇ／ｍＬのトロポエラスチン濃度が必要であった（図３Ａ）。この濃度は、過剰（２０μｇ／ｍＬ）のトロポエラスチンで基材を被覆する間に付着すると予想されるタンパク質の近似量を表す。トロポエラスチンの溶液濃度を２０μｇ／ｍＬに上げると、播種後７日目に、基材結合トロポエラスチンよりもＭＳＣ増殖が８０±８％さらに向上した。これらの結果は、溶液中の閾値濃度を超えるトロポエラスチンが、ＭＳＣ増殖を著しく促進することを実証する。トロポエラスチンによる培地の補充は、培養基材をトロポエラスチンで被覆することと、少なくとも機能的に同等であり、関連する増殖レベルの上昇を一時的に制御できる（図１３Ｃ）。トロポエラスチンが、成長因子と同様に、溶液中のシグナル伝達分子として機能して、ＭＳＣ拡大を積極的に増強できることは、明らかである。
例６
溶液中のトロポエラスチンは、完全血清培地中のＩＧＦ−１およびｂＦＧＦに代わることができる。
さらに、溶液中のトロポエラスチンが、ＭＳＣから増殖反応を誘発する際、基材結合トロポエラスチンと同様に、成長因子の影響を反映できるかどうかを調査した（図３Ｂ）。基材結合トロポエラスチンは、完全血清培地でＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのいずれかに代わることができると、以前に確認された。ＩＧＦ−１のみによる培地補充では、ＭＳＣ数は、通常培地と比較して増加しなかった。このように、溶液中の１μｇ／ｍＬ以上のトロポエラスチンは、通常培地またはＩＧＦ−１を含む培地と比較して、細胞増殖の著しい上昇を７日間にわたり引き起こした。この増加のレベルは用量依存性であり、１μｇ／ｍＬトロポエラスチンで１８±５％〜２０μｇ／ｍＬトロポエラスチンで６９±７％の間で変動する。
可溶性トロポエラスチンは、同様に培地中のｂＦＧＦに代わることができる。初期増殖中（播種後３日）、１μｇ／ｍＬ以上の可溶性トロポエラスチンは、ＭＳＣ拡大の促進において、ｂＦＧＦを最大７４±２％上回った。播種後７日の時点で、５μｇ／ｍＬの可溶性トロポエラスチンは、ＭＳＣ増殖においてｂＦＧＦと同等であり、２０μｇ／ｍＬでは、ｂＦＧＦよりも１８±５％効力が増加した。
さらに、基材結合トロポエラスチンは、完全血清培地でＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの累加的な有益性に機能的に劣っていたが、２０μｇ／ｍＬの可溶性トロポエラスチンは、両方の成長因子を含む培地と同等にＭＳＣ拡大をサポートした。これらの調査結果は、溶液中のトロポエラスチンが、成長因子の増殖促進能力を厳密に反映していることを示す。トロポエラスチンは、５μｇ／ｍＬでは、ＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのいずれかに代わることができ、２０μｇ／ｍＬの高濃度では、ＭＳＣの増殖能力を失うことなく両方の成長因子に適切に代わることができる。
例７
可溶性エラスチン断片またはフィブロネクチンは、ＭＳＣ増殖を促進しない。
溶液中のトロポエラスチンの強力な分裂促進能力が、同様に架橋タンパク質の断片内に捕捉されるかどうかを判定するために、細胞を通常培地、トロポエラスチン補充培地、または可溶性κ−エラスチン（κＥＬＮ）もしくはα−エラスチン（αＥＬＮ）含有量を増加させた培地で培養した。両エラスチンは、天然エラスチンの部分的な塩基または酸加水分解から得られるペプチドである（図３Ｃ）。κＥＬＮまたはαＥＬＮのいずれも、通常培地での上記ＭＳＣ増殖を刺激しなかった。逆に、２０〜５０μｇ／ｍＬの高濃度のαＥＬＮは、細胞拡大を最大１４±１％抑制した。溶液中のトロポエラスチンの増殖促進効果が無傷の完全長分子を必要とすることは、明らかである。
この、溶液中で細胞を増殖させるトロポエラスチンの能力は、マトリックスタンパク質に特有である。フィブロネクチンは、２μｇ／ｍＬほどの低濃度で基層を被覆した場合にＭＳＣ拡大を促進したが、溶液中に最大２０μｇ／ｍＬで存在しても増殖反応を全く引き起こさなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、ＭＳＣ増殖を調節するためのトロポエラスチンの二重の能力の特異性を、基礎となる基材および可溶性因子として強調する。
例８
ＭＳＣは、トロポエラスチンを介した拡大の間、細胞表現型を保持する。
ＭＳＣ拡大の誘導時の重要な考慮事項は、ネイティブの幹細胞表現型の維持である。フローサイトメトリー分析では、トロポエラスチンで被覆した表面上で、成長因子を含むおよび含まない、完全血清または血清低減培地で５日間または７日間培養した細胞が、特徴的なＭＳＣマーカープロファイルを示した（図１４Ａ）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙによって設定されたＭＳＣ識別基準に従い、播種後５日で、すべての培地配合における９５％超の細胞が、陽性のＭＳＣマーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ７３を発現する一方、９８％超は、造血幹細胞マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａおよびＨＬＡ−ＤＲの発現がなかった。
被覆なしＴＣＰ上のＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのみを含む培地で成長させた場合、播種後７日で、３つすべてのＭＳＣマーカーを発現する細胞の割合が減少した。ＩＧＦ−１補充培地の細胞の８３．９±０．７％、およびｂＦＧＦ補充培地の細胞の９２．９±５．９％のみが、ＣＤ１０５に陽性であった。同様に、ＩＧＦ−１含有培地の細胞の８９．１±０．１％のみが、ＣＤ７３を発現した。これらの結果は、長期の細胞拡大中のＭＳＣ表現型維持における、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの協同的な役割を示す。
注目すべきことに、トロポエラスチンで被覆した基材により、これらの準最適培地調製物での細胞のＭＳＣマーカー発現レベルが、必要な閾値に回復した。ＭＳＣ表現型は、基材結合トロポエラスチンを使用して、完全血清または血清低減培地において成長因子の一方または両方を交換したすべての例で、完全に保持された。同様に、２０μｇ／ｍＬの可溶性トロポエラスチンを含む培地で培養された細胞も、特徴的なＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ７３＋および系統陰性発現プロファイルを示した（図１４Ｂ）。
細胞表面マーカーの保持と同時に、ＭＳＣは、通常または血清低減培地での成長因子の代替としての基材結合または可溶性トロポエラスチンの存在下で拡大し、多系統分化の能力も示した（図１５）。脂肪生成培地で誘導されると、これらのＭＳＣは、オイルレッドＯ染色で鮮やかな赤色に見える、特徴的な細胞内脂質滴を発生させた。骨形成培地で誘発されると、それらは、アリザリンレッドＳ染色により赤い結節として可視化される、ミネラル化カルシウム沈着物を形成した。マイクロマスペレット培養で軟骨形成培地で誘導すると、ＭＳＣは、アルシアンブルーで青緑色に染色された、グリコサミノグリカンに富む領域を示し、これは軟骨の形成を示す。これらの組織学的特徴は、非誘導サンプルには存在しなかった。まとめると、これらの調査結果は、増幅された拡大過程全体でＭＳＣ表現型および多能性挙動を維持するトロポエラスチンの能力を強力に支持している。
例９
トロポエラスチンは、αｖインテグリンによってＭＳＣの付着および拡散を調節する
トロポエラスチンのＭＳＣ挙動調節におけるインテグリン受容体の関与を判定するために、トロポエラスチン−ＭＳＣ相互作用の二価カチオン依存性を分析した。キレート剤ＥＤＴＡを添加すると、ＭＳＣの基材結合トロポエラスチンへの付着が、用量依存的に著しく阻害された（図４Ａ）。５ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、トロポエラスチンへのＭＳＣ結合は、最大で４８．９±０．５％減少した。さらに、ＭＳＣは、カチオンを含まない環境では、トロポエラスチンへの最低限（２０．０±２．１％）の付着を示した（図４Ｂ）。その後の最大０．５ｍＭのＣａ２＋の添加で、ＭＳＣ結合は改善されず（１３．７±１．０％）、Ｍｇ２＋で細胞接着が緩やかに促進され（５１．８±２．６％）、Ｍｎ２＋でトロポエラスチンへの細胞接着が回復した（７６．１±３．２％）。この選択的カチオン依存性は、インテグリンを介した細胞結合機構の特徴である。
ＭＳＣとトロポエラスチンとの相互作用におけるインテグリンの役割のさらなる確証として、特定のインテグリン遮断抗体が、トロポエラスチン基材上でのＭＳＣの拡散を妨げた（図４Ｃ〜図４Ｇ）。抗αｖβ５および抗αｖβ３インテグリン抗体は、最適な遮断濃度に達するまで、用量依存的にトロポエラスチン上の細胞拡散を阻害した（図４Ｃ〜図４Ｄ）。この阻害は、汎抗αｖインテグリンサブユニット抗体で増強された（図４Ｅ）。抗体特異性は、フィブロネクチン上の拡散が、抗体なし（９２．５±２．６％）またはＩｇＧ（９０．１％）対照と比較して、最小限に抑制された（７８．８±２．３％）ことによって実証された。フィブロネクチンは、α５およびαｖインテグリンと二者択一的に相互作用することが知られている。最適な抗体濃度では、抗αｖβ５および抗αｖβ３抗体は、トロポエラスチン上のＭＳＣ拡散を大幅に、それぞれ２４．９±２．７％、２２．７±２．８％減少させた（図４Ｆ）。抗αｖβ５および抗αｖβ３を組み合わせて添加すると、拡散がさらに４６．０±２．５％抑制され、これは抗αｖ抗体による５３．６±５．６％の抑制と同等であった。トロポエラスチン上の細胞拡散は、非特異的ＩｇＧ抗体には、または抗体の非存在下では、影響を受けなかった。トロポエラスチンに播種されたＭＳＣの代表的な画像は、インテグリン遮断抗体の非存在下では、細胞の大部分が、平らな暗期の細胞体に特徴付けられる広がった形態を有していることを示した（図４Ｇ）。対照的に、抗インテグリン抗体の存在下では、著しく高い割合の細胞が、丸みを帯びた明期の形態で、収束しているように見える。さらに、基材に結合したＭＳＣのビンキュリン染色により、細胞の中心および周辺に、いくつかの点状の焦点複合体および筋状の焦点接着が現れた。トロポエラスチンに接着した細胞は、細胞あたりの焦点接着が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）上の細胞と比べて１．５±０．７倍に増加した。（図４Ｈ）。まとめると、これらの結果は、トロポエラスチンとＭＳＣとの相互作用の媒介における、αｖインテグリンの役割を支持している。
例１０
トロポエラスチンは、αｖインテグリンによってＭＳＣ拡大を調節する
可溶性トロポエラスチンを介したＭＳＣ拡大は、インテグリンの遮断によって減衰するが、成長因子受容体の阻害によって減衰しないことが発見された。成長因子の増殖上の有益性は、主にＩＧＦ−１ではなくｂＦＧＦに起因していたので、ｂＦＧＦが、トロポエラスチンと機能的に同等のものとして選択された。線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤であるＳＵ−５４０２の添加により、ＭＳＣ増殖が、用量依存的かつ時間依存的に７日間にわたって妨げられた（図５Ａおよび図１７Ａ）。阻害の程度は、通常培地、ｂＦＧＦを含む培地、または溶液中のトロポエラスチンを含む培地で培養した細胞間で大幅に変動した。全体の細胞数が阻害剤なしの対照と比較して最大７８．９±０．７％減少した、最も重大な阻害は、一貫して、ｂＦＧＦを補充した培地で培養した細胞で生じた。対照的に、トロポエラスチン補充培地での細胞増殖の減少は、通常培地のものと同様であり、ＳＵ−５４０２の非特異的効果によるものと考えられる。これらの結果は、ｂＦＧＦとは異なり、可溶性トロポエラスチンが、ＦＧＦＲ非依存性経路を介してＭＳＣ増殖を刺激することを示唆する。
インテグリン受容体、具体的にはαｖβ３、αｖβ５、またはすべてのαｖサブユニットインテグリンを７日間遮断した場合の細胞増殖への影響も調査した（図５Ｂおよび図１７Ｂ）。αｖインテグリン活性の抗体阻害により、培地の組成に関係なく、ＭＳＣ増殖は、様々な程度に全般的に減少した。しかしながら、細胞増殖の減少は、トロポエラスチン補充培地の細胞の方が、通常培地またはｂＦＧＦ補充培地の細胞よりも一貫して大きかった。抗体なしの対照と比較して、抗αｖβ３または抗αｖβ５抗体の包含は、トロポエラスチンを介したＭＳＣ増殖を有意に、それぞれ３０±１．３％、１８．１±０．９％阻害した。抗αｖβ３抗体および抗αｖβ５抗体の両方を添加すると、細胞拡大が５８．９±４．２％減少し、これは、汎抗αｖ抗体による細胞数の５４．１±３．７％減少と同等の規模であった。ＭＳＣによって発現されないβ８インテグリンに対する対照抗体は、細胞増殖に影響を与えなかった。これらの調査結果は、基材結合タンパク質と同様に、溶液中のトロポエラスチンが、インテグリンを介してＭＳＣと相互作用することを強く示す。さらに、αｖインテグリン、特にαｖβ３とαｖβ５とのタンデムは、ＭＳＣ拡大中、トロポエラスチンからの増殖促進シグナルの伝播に関与する。したがって、下流シグナル伝達分子、すなわち、ＦＡＫ阻害剤１４による焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）およびペリフォシンによるタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ／ＡＫＴ）の特異的阻害により、トロポエラスチンを介した増殖が、大幅にそれぞれ、５０．７±２．０％、２１．３±０．５％減少した（図４Ｉ）。この減少は、これらの阻害剤の非特異的効果によって引き起こされるものよりもかなり大きく、ＭＳＣでのトロポエラスチン活性化分裂促進シグナルの伝達における、インテグリン−ＦＡＫ−ＰＫＢ／ＡＫＴ経路の役割を確証する。
興味深いことに、トロポエラスチンを含む培養で見られたものと程度は異なるが、ｂＦＧＦ補充培地でのＭＳＣ増殖も、インテグリン遮断抗体の存在によって悪影響を受けた。通常培地中の細胞と比較した有意な阻害は、抗αｖ抗体、または抗αｖβ３および抗αｖβ５抗体の両方の存在下でのみ発生した。これらの結果は、ｂＦＧＦを介したＭＳＣ増殖が、少なくとも部分的にαｖインテグリンシグナル伝達にも依存していることを、さらに示唆している。
例１１
基材結合および可溶性トロポエラスチンはＭＳＣを誘引する
細胞拡大のためのトロポエラスチン−細胞相互作用を促進する、ＭＳＣを誘引するトロポエラスチンの能力も調査する。中央領域に播種した細胞に、選択的にトロポエラスチンで被覆した領域を等間隔で隣接させた（図６Ａ）。ＭＳＣは、５日間にわたって、無タンパク質対照よりも、表面結合トロポエラスチンに向かって優先的に遊走した（図６Ｂ）。このトロポエラスチンへの走触性の引力は、初期の時点（播種後１〜３日）でも明らかであり、細胞とトロポエラスチンとの間の領域には、細胞とＰＢＳ対照との間の対応する領域よりも、はるかに多くの細胞が存在した（図６Ｃ）。播種後５日までに、対照と比較して４５±８％多い細胞が、トロポエラスチン被覆領域に遊走した（図６Ｄ）。トロポエラスチンに関連する細胞存在度の増加は、実験期間中の総細胞数が相似であることから示唆されるように、遊走した細胞の増殖の増加によるものではなかった（図６Ｅ）。
同様に、ＭＳＣも、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー装置で、トロポエラスチンの拡散性勾配に向かって遊走した。溶液中のトロポエラスチンは、用量依存的な化学走性反応を誘発し、これは抗αｖインテグリン抗体の存在下では無効化された（図６Ｆ）。すべてのαｖ、αｖβ３もしくはαｖβ５のいずれか、またはαｖβ３およびαｖβ５の両方のインテグリンを遮断する抗体は、トロポエラスチンへ向かうＭＳＣの遊走を、ランダムな細胞移動に起因するレベルまで効果的に減少させた（図６Ｇ）。対照的に、対照の抗β８抗体は、ＭＳＣのトロポエラスチンへの化学走性に影響を与えなかった（図１６Ａ）。さらに、αｖ阻害抗体は、化学誘引物質が存在しない無向細胞遊走のレベルを変更せず、ＩＧＦ−１またはｂＦＧＦ成長因子に向かう化学走性も阻害しなかった（図１６Ｂ）。
これらの結果は、基材結合および可溶性トロポエラスチンの強力な運動源性能力、ならびにαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの両方の、このプロセスでの必要かつ特異的な関与を実証する。このインテグリン依存性は、さらに化学走性成長因子が使用される方法とは異なる、ＭＳＣ帰巣の方法に関与する。
例１２
ＭＳＣに対するトロポエラスチンの効果
ＭＳＣの骨形成、脂肪生成、軟骨形成に対するトロポエラスチンの効果を調査した。図８Ａに示されているように、骨形成における効果を研究するために、細胞を拡大条件で成長させた。拡大条件は、トロポエラスチン含有および非含有増殖培地を含んだ。ミネラル化カルシウムの増加は、骨形成を示す。示されているように、ＴＥに誘導および曝露された細胞は、ミネラル化カルシウム濃度の増加を示した。これらの結果は、トロポエラスチンを欠く培養物と比較して、可溶性トロポエラスチンの、骨形成を誘導する強力な能力を証明する。図８Ｂは、同様にＴＥで処理された細胞の骨形成分化を示す。示されるように、骨形成分化は、ＴＥの存在下で誘導された細胞で示された。
図８Ｃおよび図８Ｄは、脂肪生成分化におけるトロポエラスチンの効果を示している。図８Ｃに示すように、脂肪生成分化を被るように誘導された細胞は、ＴＥの存在下ではＴＥを欠く培養物と比較して、細胞内脂質形成の増加を示した。
図８Ｅおよび図８Ｆは、軟骨形成分化におけるトロポエラスチンの効果を示している。図８Ｅおよび図８Ｆに示すように、ＴＥが分化段階中に存在しないという条件で、ＴＥの存在下で拡大した細胞は、ＴＥなしで拡大した細胞と比較して、グリコサミノグリカンレベルの増加を示した。誘導段階でのＴＥの添加は、軟骨形成分化を阻害した。
例１３
ＭＳＣに対するトロポエラスチンの用量反応
ＭＳＣの骨形成、脂肪生成および軟骨形成に対するトロポエラスチンの用量の効果を調査した。図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、細胞を、骨形成に対するＴＥ濃度の影響を研究するために、異なる濃度のＴＥで増殖および分化させた。拡大条件は、ＴＥ非含有、２μｇ／ｍＬ ＴＥ含有、および２０ｕｇ／ｍＬ ＴＥ含有の増殖培地を含んだ。ミネラル化カルシウムの増加は、骨形成を示す。最大の骨形成は、細胞が、少なくとも２μｇ／ｍＬのＴＥで増殖し、２０μｇ／ｍＬのＴＥで誘導された場合に確認された。
図９Ｃおよび図９Ｄは、脂肪生成分化における拡大および誘導段階中のトロポエラスチン濃度の効果を示している。図９Ｃに示すように、脂肪生成分化を被るように誘導された細胞は、濃度２０μｇ／ｍｌのＴＥの存在下で、拡大および誘導段階の両方で、細胞内脂質形成の増加を示した。
図９Ｅおよび図９Ｆは、軟骨形成分化におけるトロポエラスチンの効果を示している。図９Ｅおよび図９Ｆに示すように、２０μｇ／ｍｌのＴＥで拡大したが、ＴＥの非存在下で誘導された細胞は、グリコサミノグリカン産生の程度が最高であった。誘導段階中に２μｇ／ｍｌほどの低濃度ＴＥが存在すると、軟骨形成分化が著しく阻害された。
例１４
細胞のトロポエラスチン記憶の持続時間
ＭＳＣの骨形成、脂肪生成および軟骨形成中のトロポエラスチン記憶の効果を調査した。細胞を拡大条件下で拡大させた（ＴＥなし、ＴＥ ２〜５日、ＴＥ ３〜６日およびＴＥ ４〜７日）。図１０Ａ〜図１０Ｂに示すように、骨形成では、細胞は、増殖期間中のすべての日にＴＥに曝露すると、ミネラル化カルシウムを示し、トロポエラスチン曝露に関連する効果は、拡大段階後期において最大であった。対照的に、トロポエラスチンの軟骨形成促進効果は、トロポエラスチンが拡大の初期段階に存在する場合にのみ確認された（図１０Ｃ−図１０Ｄ）。
例１５
ＭＳＣの骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害効果
骨形成に対するトロポエラスチンのインテグリン阻害の効果も調査した。示されるように、細胞は、ＴＥなしで誘導、ＴＥで誘導、の分化条件下で増殖させた。拡大条件は、ＴＥなし、ＴＥなし抗ａｖあり、ＴＥなし抗ａ５あり、ＴＥなし抗ａｖ／ａ５あり、ＴＥあり、ＴＥおよび抗ａｖあり、ＴＥおよび抗ａ５あり、ＴＥおよび抗ａｖ／ａ５あり、を含んだ（図１１Ａ）。示されているように、分化中にトロポエラスチンの存在下にあった細胞は、高レベルのミネラル化カルシウムを有していた。抗ａｖ、抗ａ５、またはその両方を含むトロポエラスチンの存在下で増殖させた細胞は、この骨形成が高くなる傾向を喪失した（図１１Ａ）。次に、細胞を拡大条件下でＴＥを使用せずに検査した。ａｂなし、抗ａｖあり、抗ａ５あり、および抗ａｖ／ａ５あり、の分化条件の下、細胞をＴＥなしで拡大した。示されるように、抗ａｖ、抗ａ５または抗ａｖ／ａ５なしで分化した細胞は、ミネラル化カルシウムが増加した。しかしながら、ＴＥで誘導された細胞は、分化中の抗ａｖの有無にかかわらず、より多くのミネラル化カルシウムを有した（図１１Ｂ）。次に、ＴＥの存在下で細胞を拡大させた（図１１Ｃ）。示されているように、細胞をＴＥで拡大し、ＴＥで誘導した場合、ＴＥで処理された細胞は、Ａｂなし、または抗ａｖありの場合にミネラル化カルシウムのレベルが増加した（図１１Ｃ）。次に、細胞をＴＥおよび抗ａｖの存在下で拡大させた（図１１Ｄ）。示されるように、次いで細胞を、Ａｂの非存在下、抗ａｖ、抗ａ５、または抗ａｖ／ａ５の存在下で分化させた。抗ａ５、または抗ａｖおよび抗ａ５の両方の存在下で分化した細胞は、ミネラル化カルシウムが減少した。しかしながら、ＴＥおよび抗ａｖの両方で拡大し、ＴＥおよび抗ａｖの存在下で分化した細胞では、ミネラル化カルシウムが増加した（図１１Ｄ）。その後拡大期中に、細胞をＴＥおよび抗ａ５で処理した。それらを次に、Ａｂなし、抗ａｖあり、抗ａ５あり、および抗ａｖ／ａ５あり、に区別した。示されているように、細胞はＴＥあり、またはなしで誘導された（拡大）。示されるように、抗ａｖの存在下または非存在下でＴＥで処理された細胞は、ミネラル化カルシウムの増加を示した（図１１Ｅ）。次に、細胞をＴＥおよび抗ａｖ／ａ５で拡大させた（図１１Ｆ）。示されているように、細胞は抗ａｖの存在下で分化し、ＴＥで誘導され、ミネラル化カルシウムの増加につながった。
例１６
トロポエラスチンおよびヒアルロン酸のＭＳＣ骨形成への効果。
細胞は、異なる分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）の存在下で、トロポエラスチンの非存在下または存在下で増殖させた。示されるように、ＨＡのみではなく、トロポエラスチンおよびＨＡの存在下で成長した細胞は、ミネラル化カルシウムの増加をもたらした（図１２Ａ）。図１２Ａおよび図１２Ｂで、骨形成について示されるように、細胞は、トロポエラスチンに曝露された場合、ミネラル化カルシウムを示した。
考察
ＭＳＣなどの治療用細胞を効率的かつ費用対効果の高い方法で拡大できることは、臨床上および商業上の重要な関心事でである。ほとんどの哺乳動物細胞と同様に、ＭＳＣの増殖は、ＥＣＭへの細胞接着、およびサイトカイン、ホルモン、成長因子などの可溶性因子との相互作用によって調節される。その結果、ｅｘ ｖｉｖｏでのＭＳＣ増殖のための方策は、典型的には、マトリックスタンパク質の培養基材への移植、および／または成長因子の培養培地内への組み込みである。
トロポエラスチン自体は、ＭＳＣの増殖を著しく増大させるだけでなく、特定の成長因子と同等またはそれを上回る性能も有する。ＭＳＣ培養で使用される成長因子には、ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦがあり、どちらも市販のＭＳＣ成長培地の一部でもある。表面に被覆すると、トロポエラスチンは、ＩＧＦ−１よりも細胞増殖を大幅に促進し、ＩＧＦ−１だけでは、通常培地と比較して細胞数は増加しない。この調査結果は、ＩＧＦ−１は、ＭＳＣの遊走およびと初期段階の成長を促進するが、ＭＳＣの増殖を長期的に改善しないという報告と一致する。さらに、基材結合トロポエラスチンは、完全血清培地ではｂＦＧＦと機能的に同等であり、血清低減培地では増殖反応の刺激の点で優れている。トロポエラスチンは、増殖を刺激する能力が高いため、ＭＳＣの拡大能力を損なうことなく、完全血清培地ではＩＧＦ−１またはｂＦＧＦと、血清低減培地ではＩＧＦ−１およびｂＦＧＦの両方との交換が可能である。さらに、トロポエラスチンなどの安定した組換えタンパク質を成長因子に代えることは、動物組織９からのそれらの限られた入手性、高コスト、および培地での相対的不安定性など、成長因子の使用に関連するいくつかの課題も軽減する。
血清低減培地中でも、確認されたトロポエラスチンの効力は、ＭＳＣ培養中、ある程度の血清に代わる可能性を示している。血清は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンなどの基底膜タンパク質の存在による細胞付着を促進するだけでなく、成長因子、ホルモンおよび脂質による増殖も誘導するため、ＭＳＣ成長培地に含まれている５，８。したがって、血清低減を補うトロポエラスチンの能力は、成長因子を反映する高い分裂促進活性と相まって、その既知の細胞接着機能と調和する。トロポエラスチンは、培養培地の血清含有量の最大４０％の大幅な低減を可能にし、これは、他のＥＣＭタンパク質には見られない独特の特性である。幹細胞培養で接着分子としてよく使用されるフィブロネクチンは、完全血清培地でトロポエラスチンと同様にＭＳＣ増殖を刺激することが示されたが、その有益性は、２０％血清低減培地でも減少した。
トロポエラスチンによる実質的な血清補填は、成長因子に通常関連する別の有益性を映し出す。例で実証されているように、トロポエラスチンの能力は、ＩＧＦ−１とｂＦＧＦとを組み合わせた場合の能力を上回る。トロポエラスチンの非存在下では、ＭＳＣ増殖は、８％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含む成長因子補充培地で維持されるが、６％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで大幅に減少し、これは、市販の増殖培地（ＡＴＣＣ）において、７％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１を使用する場合と一致する。興味深いことに、両方の成長因子にトロポエラスチンを含めると、播種後５日までではあるが、この最小血清閾値を６％（ｖ／ｖ）ＦＢＳに下げることができる。おそらくは、基材結合トロポエラスチンおよび可溶性成長因子に由来するシグナルは、各リガンドへの相対的な曝露によって定義される、代替経路を介して伝播される。
トロポエラスチンを使用して、ＭＳＣ拡大中の血清への依存を減らすことも、臨床的に有益である。血清は、しばしば感染リスクをもたらす汚染物質を有する可能性があり、動物由来の製品として、有害な免疫反応を引き起こし得る２９。したがって、米国食品医薬品局および欧州医薬品庁は、臨床的に重要な細胞の培養について、血清を避けることを推奨している。
トロポエラスチンの機能は、他のマトリックスタンパク質と同様に、従来から、分子への細胞接着時に引き起こされるシグナルに起因しており、それによりインテグリンなどの細胞表面受容体は、力学的な刺激を化学シグナルに変換して細胞反応をもたらす。このパラダイムと一致して、トロポエラスチンの増殖促進能力は、分子の弾性、粗さ、および細胞接着性にのみ起因するとされている。したがって、トロポエラスチンのより堅い材料への架橋は、その増殖の有益性を弱める。この考え方とは逆に、濃度が１μｇ／ｍＬを超える溶液中のトロポエラスチンも、ＭＳＣの拡大を大幅に向上させることが示されている。溶液中のトロポエラスチンは、基材被覆濃度に相当する、より高い濃度で、機能的に表面結合タンパク質に取って代わり、完全血清培地におけるＩＧＦ−１とｂＦＧＦとの相乗効果に匹敵する。これらの調査結果は、トロポエラスチンの分裂促進活性が、基材の弾性およびトポグラフィーへのその影響とは無関係であり得ることを示す。細胞周期を通じたＭＳＣの進行は足場依存性であるが、細胞は、増殖促進シグナル伝達のために、トロポエラスチンなどのエフェクタータンパク質に特異的に付着して拡散する必要はない。
さらに、溶液中のトロポエラスチンの調節挙動は、機械的情報変換プロセスとはおそらく無関係である。個々の分子として、長さが約２０ｎｍのトロポエラスチンは、複数の細胞との機械的接続を妨げる。本明細書に記載されている実験設定内では、トロポエラスチンは、７日という増殖アッセイの時間スケールが、弾性繊維の形成に最低限必要な１２−１４日よりも大幅に短いため、より大きな細胞結合構造に組み立てることもできない。また、これらのアッセイで使用される可溶性トロポエラスチンの最高濃度（２０μｇ／ｍＬ）は、トロポエラスチンの自己組織化の臨界濃度の閾値より５０倍低い。
トロポエラスチンは、可溶性因子として細胞の挙動を調節できる、完全長接着マトリックスタンパク質の珍しい例である。対照的に、本明細書の例では、溶液中のフィブロネクチンがＭＳＣの増殖を促進しないことが示された。これは、おそらくコラーゲンマトリックスなどの表面に吸着したときにのみ細胞受容体結合部位が露出するため、細胞認識が不十分であることに起因する。溶液中のトロポエラスチンの効果は、おそらくその細胞結合領域の固有の接触性によって可能になる。この研究に先立ち、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびエラスチンを含むＥＣＭタンパク質に由来する可溶性シグナル伝達因子は、マトリキンと呼ばれる部分的なタンパク質分解によって放出されるペプチドに限定されていると考えられている。おそらく、これらのマトリキンは、タンパク質分解的に露出した細胞結合モチーフを介して細胞と相互作用する。本明細書の例に記載されているように、トロポエラスチンのＭＳＣ調節特性は、エラスチン断片のＭＳＣ調節特性とは明らかに異なり、完全長分子内の複数の細胞相互作用領域の相乗的関与を、おそらくは必要とすることがわかった。
ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成は、細胞の表現型に影響を与え得、その結果、機能および治療的能力に影響を与える得る。したがって、ＭＳＣ増殖のトロポエラスチン介在増幅が、幹細胞の特性を損なわないことが不可欠である。本明細書の例に示されているように、基材結合または溶液ベースのトロポエラスチンの存在下で拡大した細胞は、特徴的な表面マーカーを発現し、国際細胞療法学会のＭＳＣに関する定義基準と一致する三系統分化を被ることができることが分かった。拡大中にＭＳＣ表現型を維持する、このトロポエラスチンの能力は、タンデムの成長因子のその能力と同等である。十分に高い濃度では、ｂＦＧＦのみでＭＳＣマーカーの発現が維持され、幹細胞性への増殖関連の変化が遅延するが、長期の使用で分化が増加し、ＣＤ１０５を含む表面マーカーの発現が減少する。この調査結果と一致して、本明細書に記載される例では、ＩＧＦ−１またはｂＦＧＦのみによる培地補充は、ＭＳＣによって構成的に発現されると予想される、ＣＤ１０５および／またはＣＤ７３のレベルを低下させることが示された。トロポエラスチンを含めることで、ＭＳＣ集団内のこの表現型変化を有意に防ぐ。
幹細胞の表現型の維持は、可溶性因子または接着タンパク質のいずれかからシグナル伝達される。この研究以前は、トロポエラスチンは、ＭＳＣの基材弾性の感知を介して幹細胞性を促進すると主張されてきた。しかしながら、溶液中のトロポエラスチンの同様の保護機能は、成長因子のそれに類似した代替の、足場に依存しないシグナル伝達機構を再び強く示す。
本明細書に記載される実験から、トロポエラスチンは、細胞表面インテグリンαｖβ３およびαｖβ５を介して、ＭＳＣと直接相互作用できることが発見された。これらのインテグリンは、骨髄由来のＭＳＣによって発現され、トロポエラスチン内の異なる領域によって認識され、トロポエラスチンと、線維芽細胞などの他の細胞型との相互作用に関与している。活性化されると、インテグリンは焦点接着の一部としてクラスター化し、我々の研究では、コアの焦点接着タンパク質であるビンキュリンを染色することで検出される。焦点接着は、細胞外マトリックスタンパク質をアクチン細胞骨格に連結し、細胞環境からの機械的シグナルだけでなく化学的シグナル信号も伝達する。
トロポエラスチンは、インテグリンを介してＭＳＣの付着および拡散を直接実現できるが、特に溶液中の場合、ＭＳＣの増殖を間接的に、または非インテグリン経路を介してではあるが、直接誘発できるという対立仮説が、さらに調査された。例えば、トロポエラスチンは、内因性成長因子またはｂＦＧＦなどの血清由来成長因子の分裂促進活性を強化できる。それは、多くのＥＣＭタンパク質が成長因子に結合し、それらの受容体への局在化増やすことができるからである。あるいは、いくつかのＥＣＭタンパク質内の固有の領域が、成長因子受容体用の非正規リガンドとして機能できるので、トロポエラスチン自体が、ＦＧＦＲを活性化し得る。これらの例では、ＦＧＦＲ阻害剤ＳＵ−５４０２を添加すると、トロポエラスチンとｂＦＧＦの両方の増殖促進機能が無効になるはずである。しかしながら、ｂＦＧＦとは異なり、トロポエラスチンによるＭＳＣ拡大は、ＳＵ−５４０２毒性に関連する非特異的阻害を超える影響を受けなかったため、ＦＧＦＲに依存しない経路を介して進行できる。これに基づいて、エフェクタータンパク質としてのｂＦＧＦの、またはトロポエラスチンを介したＭＳＣ増殖におけるシグナル伝達受容体としてのＦＧＦＲの、唯一の関与を除外することができる。さらに、トロポエラスチンを介した細胞増殖の抗体阻害は、このプロセスにおけるαｖインテグリン、すなわちαｖβ３およびαｖβ５の関与を示している。インテグリンは、固定されたリガンドおよび可溶性リガンドの両方に十分に結合してシグナル伝達イベントを開始することが示され、基材結合トポロエラスチンおよび可溶性トロポエラスチンがＭＳＣイベントを誘導する、一般的な機構を示唆している。しかしながら、エラスチン結合タンパク質など、他の細胞受容体が、溶液中のトロポエラスチンの調節効果の実現に関与していることは、無視できない。
可溶性トロポエラスチンが、ケモカインおよび成長因子の走化性能力を映し出す間、トロポエラスチン誘導のＭＳＣ遊走でも同様の二重様式の作用が確認され、そこで表面トロポエラスチンは、接着性ＥＣＭタンパク質の走触性を有している。これらのシグナルは独立しており、競合する可能性があると考えられているが、トロポエラスチンは生物物理学的および生化学的方向刺激の両方を独自に提供して、潜在的により強力なＭＳＣの帰巣反応を引き出すことができる。他の細胞タイプでも報告されているこのトロポエラスチンの運動源性能力は、常在ＭＳＣまたは治療結果改善のために投与されたＭＳＣを動員するために生物医学的用途で活用することができる。
トロポエラスチンを介したＭＳＣの動員は、αｖインテグリンとのタンパク質相互作用にも依存している。αｖβ３またはαｖβ５のいずれかを遮断する抗体によって、このプロセスが消滅することは、両方のインテグリンの関与が必須であることを強く示唆している。以前にＭＳＣの帰巣に関係していたインテグリンサブユニットは、α４、α５またはβ１に限定されており、主に同族受容体のケモカイン活性化によって調節されている。トロポエラスチン−αｖインテグリン相互作用は、ＭＳＣ遊走を支える新たに発見された機構を表す。さらに、成長因子を介した化学走性に対するαｖ遮断抗体の非阻害効果は、少なくとも細胞表面レベルでは、トロポエラスチンおよび成長因子によるＭＳＣ動員の個別の、特定の様式を示唆している。
リガンド占有によるインテグリンの活性化は、セリン／スレオニンキナーゼ、低分子量ＧＴＰアーゼ、ならびに細胞の生存、接着、拡散、増殖および遊走を媒介するイノシトール脂質経路を含む、複数のシグナル伝達カスケードを開始する。これらの経路のいくつかは、ＭＳＣのＦＧＦ受容体に結合するｂＦＧＦによっても活性化される。さらに、αｖインテグリンと成長因子受容体との関連は、下流の増殖シグナルの持続的な成長因子活性化に必要であると考えられる。裏付けでは、αｖインテグリンを遮断すると、成長因子の存在下でも細胞の増殖が阻害され、これは、αｖインテグリンの阻害がｂＦＧＦを介したＭＳＣ拡大も減衰させるという我々の調査結果を反映している。インテグリンおよびＦＧＦ受容体が共有する細胞内シグナル伝達カスケードの重複部分は、それによってトロポエラスチンが、ｂＦＧＦなどの成長因子の分裂促進、保護および運動源性機能に対応し、したがって代わることができる一つの可能性のある機構を表す（図７）。
トロポエラスチンの機能は、特にＭＳＣ遊走、増殖、成長因子の置換、および血清補填の点で、他のＥＣＭタンパク質の、インテグリンを結合する同様の能力にもかかわらず、このタンパク質に独特であるように見える。細胞接着および細胞骨格組織の類似機能にもかかわらず、すべてのＥＣＭ−インテグリン相互作用が細胞周期の進行を等しく促進するとは限らない、と考えられている。例えば、αｖβ３インテグリンは、成長因子受容体の下流のアダプタータンパク質と特異的に結合し、長期の分裂促進経路を協調的に活性化および維持し、トロポエラスチンなどのαｖβ３リガンドが、非リガンドよりも強力に細胞増殖を増強できるようにする。さらに、フィブロネクチンなどのマトリックスタンパク質は、最大２０種類のインテグリンを接着でき、これにより、細胞増殖に反対の作用を引き起こし、標的細胞の反応を減衰または回避することができる。トロポエラスチンのインテグリン選択性は狭いので、ＭＳＣ挙動に関する、その特定の結果に寄与し得る。
ＭＳＣに対するトロポエラスチンの強力な分裂促進および運動源性効果は、ｂＦＧＦとは異なり、幹細胞ニッチには本来存在しないため、驚くべきことである。トロポエラスチンの、この成長因子のような挙動は、急速なＭＳＣ帰巣および向上したＭＳＣ増殖を必要とする場合、すなわち、遊離トロポエラスチンが細胞外環境に豊富に存在する唯一の期間と一致する、胚発生および創傷修復の間、生物学的に重要になることが提案される。胎児から新生児の段階では、トロポエラスチン合成のピークが広範囲なｂＦＧＦ発現と一緒に発生し、これがＭＳＣを動員し、正常な発達のために、それらの増殖を促進する可能性がある。発達中のトロポエラスチン産生に対するｂＦＧＦの既知の阻害効果は、実際に、ｂＦＧＦおよびトロポエラスチンの累積効果に起因する無制御な幹細胞数に対する調節機構である。負傷中、上方制御されたトロポエラスチン分泌は、組織内の低レベルのｂＦＧＦを補充して、創傷治癒に不可欠なＭＳＣの遊走および増殖を急速に刺激し得る。
材料および方法
細胞培養
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手したヒト骨髄由来ＭＳＣを、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２．４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を含むＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ）からなる通常培地で、３７℃の加湿された正常酸素圧インキュベーター内で、最大集団倍加数１０まで培養した。指示された場合、通常培地には、ＡＴＣＣ推奨培地の成長因子濃度に相当する、１５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および／または１２５ｐｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。細胞が７０〜８０％のコンフルエントに達したら継代した。
ＥＣＭタンパク質による基材被覆
指示された場合、組織培養プラスチックウェルを４°ＣのＰＢＳ（１０ｍＭホスファート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で、２０μｇ／ｍＬの組換えヒトトロポエラスチン（Ｅｌａｓｔａｇｅｎ）または２μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で一晩被覆した。タンパク質溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄して、細胞播種前に未結合のタンパク質を除去した。
ＥＣＭタンパク質による培地補充
指示された場合、通常培地には、２．５−２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン（Ｅｌａｓｔａｇｅｎ）、２．５−５０μｇ／ｍＬのκＥＬＮ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙの可溶性ヒト皮膚エラスチン）、または２．５−５０μｇ／ｍＬのαＥＬＮ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙの可溶性ヒト肺エラスチン）を補充した。組織培養基材へのタンパク質の付着を防ぐために、ウェルを通常培地と５時間プレインキュベートし、補充培地での細胞播種前に、血清タンパク質による表面ブロッキングを可能にした。
表面ブロッキングを確認するために、プレインキュベートした、または被覆なしのウェル表面に室温で１時間、トロポエラスチンを添加した。３回のＰＢＳ洗浄で、過剰なタンパク質を除去した。結合したトロポエラスチンのレベルを、１：２０００マウス抗エラスチンＢＡ４一次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を室温で１時間、１：５０００ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ共益二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を室温で１時間使用した、酵素結合免疫吸着検定法によって検出し、４０ｍｍの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の０．１ｍＭ酢酸ナトリウム溶液、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含む、ｐＨ５の０．０５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４で、室温で１時間、可視化した。サンプルの吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
細胞増殖
サブコンフルエントなＭＳＣのフラスコを０．０５％（ｖ／ｖ）のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で３７℃で５分間処理し、付着細胞を培養容器から剥離した。トリプシンを、２倍量の血清含有増殖培地で中和した。細胞を２７０ｇで５分間遠心分離し、必要な培地に再懸濁した。細胞は、被覆なしまたはタンパク質で被覆した組織培養プラスチックウェル上の通常培地または補充培地に、５０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地は、２日毎に交換した。特定の時点の後、細胞を３％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．２ＭのＭＥＳバッファー中の０．１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで１時間染色した。過剰な染料を、逆浸透水で４回洗い流した。保持された染料を１０％（ｖ／ｖ）酢酸で可溶化し、細胞の存在度を示すサンプルの吸光度値を５７０ｎｍで読み取った。サンプルの吸光度値をベースライン値（無血清培地の細胞数、または播種後１日目の細胞数に対応）で差し引き、播種後７日目のすべてのサンプルの中で最も高い吸光度の割合として表した。
ＥＤＴＡ阻害
トロポエラスチン被覆ウェル上の０−９ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含む無血清α−ＭＥＭに、ＭＳＣを１．５ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄して未結合の細胞を除去した。結合した細胞を固定し、染色し、増殖アッセイについて記載したように、５７０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞付着のパーセンテージは、既知の細胞数を持つ一連の基準に対して決定した。
カチオンの加減
カチオンを含まないＰＢＳでＭＳＣを洗浄し、２７０ｇで５分間遠心分離し、カチオンを含まないＰＢＳに再懸濁した。細胞を、０〜０．５ｍＭカチオン（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋またはＭｎ２＋）の存在下で、トロポエラスチンで被覆したウェルに１．５ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃で４５分間インキュベートした。結合した細胞を固定および染色し、細胞付着を前述のように定量化した。
細胞の拡散
トロポエラスチンで被覆したウェルの無血清α−ＭＥＭに、ＭＳＣを７．５ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で、３７℃で１．５時間播種した。細胞を固定し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１顕微鏡を用いた位相差顕微鏡法で可視化した。画像は、ＡｘｉｏＣａｍ ＩＣｍ１モノクロームカメラで撮影した。細胞は、広がった、すなわち暗期の平らな形態を示す細胞、または広がっていない、すなわち丸く、明期に見える細胞として分類された。細胞の拡散は、各視野内に拡散した細胞のパーセンテージを計算することによって定量化した。各サンプル複製について３つの視野を得た。
免疫蛍光染色
２０μｇ／ｍＬトロポエラスチンまたは１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡで被覆したＴＣＰに、ＭＳＣを１日間播種した。焦点接着を、蛍光タグ付き抗ビンキュリンモノクローナル抗体で検出し、一方、細胞核を焦点接着染色キット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＤＡＰＩで染色した。サンプルは、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ＆Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｙｄｎｅｙで、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いて可視化および画像化した。細胞あたりの焦点接着密度を、染色されたビンキュリンに対応するピクセルの数を、各視野内の細胞の数で割ることによって計算し、次に各サンプルについて平均化した。
インテグリンおよびＦＧＦＲ阻害
特定のインテグリン活性を遮断するために、最大２０μｇ／ｍＬの抗αｖもしくは抗αｖβ３インテグリン抗体（Ａｂｃａｍ（登録商標））、または最大１：２５０希釈の抗αｖβ５インテグリン抗体（Ａｂｃａｍ（登録商標））を、ＭＳＣ拡散または増殖アッセイ中に培地に添加した。抗αｖ（５μｇ／ｍＬ）、抗αｖβ３（５μｇ／ｍＬ）、および抗αｖβ５（１：５００希釈）インテグリン抗体に最適な阻害濃度を選択した。抗β８インテグリン（５μｇ／ｍＬ）（Ａｂｃａｍ（登録商標））または非特異的マウスＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））も、陰性抗体対照として含めた。ＦＧＦＲ活性を遮断するために、ＭＳＣ増殖中に最大２０μＭのＳＵ−５４０２ ＦＧＦＲ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を培地に添加した。インテグリンおよびＦＧＦＲ阻害剤は、培地を交換するごとに補充した。
走触性による細胞遊走
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を３Ｄ印刷された金型に流し込み、３つの長方形の切り欠きを有する円形を作成した。その中央の長方形は、側面に位置する長方形から等距離にあった。ＰＤＭＳステンシルをウェルプレート内に配置し、ウェル表面にしっかりと押し付けて、水密化した。上部および下部の長方形チャンバーに、それぞれトロポエラスチン溶液（２０μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを充填し、一晩風乾した。ＭＳＣ（１．２ｘ１０６細胞／ｃｍ２）を中央チャンバーに播種し、少なくとも２時間付着させた。ＰＤＭＳステンシルを除去し、培養ウェルを通常培地で覆った。最大５日間、細胞をＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１５分間毎日染色し、ＰＢＳで１回洗浄し、通常培地で覆い、Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ−Ｅ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ顕微鏡を使用して３６０／４６０ｎｍの蛍光下で画像化した。トロポエラスチンまたはＰＢＳ被覆によって定義された領域への細胞遊走は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して相対蛍光領域を介して定量化した。
化学走性による細胞遊走
化学走性を、蛍光測定の９６ウェルＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイシステム（ＱＣＭ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、サプライヤーの指示に従って測定した。通常培地、トロポエラスチン補充培地または成長因子補充培地をウェルプレートの下部チャンバーに追加し、上部チャンバー内の通常培地に、１４，３００細胞／ｃｍ２でＭＳＣを播種した。指示された場合、インテグリン遮断抗体を最適化された濃度で、細胞と共に上部チャンバーに添加した。透過性膜を通過して下部チャンバーに遊走する細胞を分離し、定量化した。正規化された細胞遊走は、各実験結果から無向細胞遊走の範囲（化学誘引物質が下部チャンバーに添加されていない場合）を差し引くことで計算した。
フローサイトメトリー
様々な培地配合で、被覆なしまたはタンパク質で被覆した組織培養ウェル上で５または７日間培養したＭＳＣを、トリプシン処理してペレット化した。細胞ペレットを０．２２μｍで濾過されたＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の５％ｖ／ｖ ＦＢＳ）で洗浄し、２７０ｇで５分間再遠心分離した。細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、総容量１００μＬで１００，０００細胞の濃度にし、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を使用して、ＭＳＣマーカーの発現を精査した。アイソタイプおよび未染色の対照サンプルは、組織培養プラスチック上の標準的な成長培地で培養されたＭＳＣを使用して調製した。細胞は、ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して分析した。一重項細胞（ｓｉｎｇｌｅｔ ｃｅｌｌｓ）は、前方散乱対側方散乱、および散乱の高さ対幅の比によって決定したが、生存細胞は、１：２０ヨウ化プロピジウムの除去によって識別した。一重項（ｓｉｎｇｌｅｔ）の生存細胞のみを、マーカー発現について分析した。
細胞分化
ＭＳＣは、様々な培地配合で、被覆なしまたはタンパク質で被覆した組織培養ウェル上で７日間培養した。拡大した細胞を採取し、ＴＣＰに再播種し、それぞれメーカーの指示に従って、ｈＭＳＣ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）、ｈＭＳＣ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）、およびｈＭＳＣ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ）を使用して、脂肪形成、骨形成および軟骨形成系統に分化させた。
脂肪形成を確認するために、２５日間誘導された細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで３０分間固定した後、水で洗浄した。細胞を６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで５分間インキュベートし、細胞内脂質滴について、イソプロパノール中１．８ｍｇ／ｍＬのオイルレッドＯで２０分間染色した。水で５回洗浄して、余分な染料を除去した。
骨形成を確認するために、１４日間誘導された細胞を固定し、前述のように、アリザリンレッドＳでミネラル化カルシウムの沈着を染色した。脂肪生成および骨形成実験からの細胞は、ＡｘｉｏＣａｍ １０５カラーカメラを使用したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１顕微鏡で画像化された。
軟骨形成を確認するために、１４日間誘導された細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む１．５％（ｗ／ｖ）寒天に包埋し、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで一晩固定した。サンプルを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１日脱水した後、パラフィン包埋し、切片化し、スライドに装着して、アルシアンブルー（ｐＨ２．５）で１時間染色し、ヌクレアファストレッドで対比染色した。サンプルは、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０スライドスキャナーで画像化した。
統計分析
すべてのデータは、平均±標準誤差として報告される（ｎ＝３）。統計的比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して計算した。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。統計的有意性は、図中にアスタリスクで、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、または＊＊＊（ｐ＜０．００１）のように示す。
結果の概要
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）分化に対するトロポエラスチンの効果
ＭＳＣの拡大および誘導中にトロポエラスチンへ曝露すると、細胞の骨、脂肪、軟骨への機能的分化が調節される。
ＭＳＣ拡大中のトロポエラスチンの存在により、骨形成能力が４２％向上した。分化中のトロポエラスチンの添加により、骨形成が５５％向上した。拡大および分化の両方の段階でトロポエラスチンを添加すると、骨形成がさらに最大１３１％増加した。
ＭＳＣの拡大または分化中のトロポエラスチン添加により、脂肪生成が、それぞれ３３％、１９％増加した。拡大および分化の両方の段階でトロポエラスチンを添加すると、脂肪生成が６９〜８５％促進され、トロポエラスチンの絶え間ない存在に関連するより大きな有益性が得られた。
同様に、ＭＳＣ拡大中のトロポエラスチンの添加により、軟骨形成が１３４％改善された。対照的に、軟骨形成中にトロポエラスチンを添加すると、拡大段階中のトロポエラスチンの存在に関係なく、このプロセスを効果的に阻害した。分化中のトロポエラスチンの添加により、ＭＳＣの軟骨形成が６３％（トロポエラスチンなしで細胞が拡大した場合）〜８０％（トロポエラスチン存在下で細胞が拡大した場合）減少した。
トロポエラスチンの記憶
ＭＳＣ拡大中に、先にトロポエラスチンへ曝露すると、三系統分化への影響を長引かせる。
骨形成では、拡大中のトロポエラスチン曝露と分化との間の時間的ギャップがより短いと（最大２日）、より良い結果をもたらす。７日間の拡大期間の４〜７日目にトロポエラスチンに曝露されたＭＳＣは、２〜５日目に曝露された細胞と比較して、２４％の骨形成の増加を示した。
軟骨形成では、拡大の初期段階でトロポエラスチンへ曝露すると、結果が改善される。拡大期間の２〜５日目からトロポエラスチンに曝露されたＭＳＣは、４〜７日目から曝露された細胞と比較して、７１％の軟骨形成の増加を示した。
トロポエラスチン効果の阻害
ＭＳＣ拡大中のトロポエラスチンの骨形成促進効果は、アルファｖおよびアルファ５インテグリンによって媒介される。ＭＳＣ拡大中に抗アルファｖ、アルファ５、またはアルファｖおよびアルファ５インテグリン抗体をトロポエラスチンに含めると、トロポエラスチンなしで細胞を誘導した場合、骨形成の促進が、それぞれ２８％、４１％、４０％減衰し、細胞をトロポエラスチンで誘導した場合、それぞれ２６％、３９％、５０％減衰した
ＭＳＣ分化中に一方または両方の抗インテグリン抗体が含まれると、細胞の、骨形成を被る能力が妨げられた。しかしながら、細胞がトロポエラスチンの存在下で誘導された場合、抗アルファｖインテグリン抗体の添加は、ＭＳＣ骨形成に影響を与えなかった。これは、ＭＳＣ分化中のトロポエラスチンの骨形成促進効果が、アルファｖインテグリンを必要としないことを示している。
ヒアルロン酸と対比したトロポエラスチンの骨形成促進効果
トロポエラスチンおよびヒアルロン酸を含む製剤では、トロポエラスチンは、ＭＳＣ骨形成の主要な促進因子である。９０％トロポエラスチンと１０％ヒアルロン酸の被覆で増殖した細胞は、ＴＣＰで成長した細胞と比較して６０〜８８％の骨形成の増加を示した。トロポエラスチンのみで増殖した細胞は、１１３％高い骨形成を示したが、ヒアルロン酸のみで増殖した細胞は、ＴＣＰで増殖したものと同様のレベルの骨形成を示した。
本明細書で開示および定義された実施形態は、言及された、または本文もしくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の、すべての代替組み合わせに及ぶことが理解されよう。これらすべての異なる組み合わせは、開示された実施形態の様々な代替の態様を構成する。
配列表５〜１５ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１６ ＜２２３＞未知の記載：トポロエラスチンモチーフ

Claims (81)

  1. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から中胚葉系細胞を形成する方法であって、
    ＭＳＣを
    （ｉ）ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導するための少なくとも１つの分化因子、および
    （ｉｉ）トロポエラスチン
    と接触させ、
    トロポエラスチンの存在下でＭＳＣから形成された中胚葉系細胞の数が、トロポエラスチンの非存在下で形成された中胚葉系細胞の数よりも多く、
    それにより、ＭＳＣから中胚葉系細胞を形成することを含む、方法。
  2. 前記トロポエラスチンが細胞培養容器の細胞培養物表面上に配置されて、前記ＭＳＣが前記細胞培養物表面と接触すると、前記ＭＳＣが前記トロポエラスチンと接触できる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記トロポエラスチンが、ＭＳＣの培養用の細胞培養培地に部分的または完全に可溶化される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）分化を誘導する因子の非存在下でＭＳＣをトロポエラスチンと接触させてＭＳＣの増殖を誘導し、それによりＭＳＣの集団を形成すること、および
    （ｉｉ）前記ＭＳＣの集団を、ＭＳＣからの中胚葉系細胞の形成を誘導する少なくとも１つの分化因子、およびトロポエラスチンと接触させることをさらに含む、方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）トロポエラスチンを含有する第１の培地でＭＳＣを培養して、トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を形成すること、および
    （ｉｉ）前記トロポエラスチン培養ＭＳＣ集団を第２の培地で培養することをさらに含み、前記第２の培地が、ＭＳＣの分化を誘導するための少なくとも１つの分化因子を含む、方法。
  6. 前記トロポエラスチンが、絹タンパク質を供給されない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記トロポエラスチンが、部分的または完全に可溶性であるヒアルロン酸との複合体の形態で提供され、前記トロポエラスチンのモノマーが、ヒアルロン酸によって一緒に連結される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸に架橋されている、請求項７記載の方法。
  9. 前記中胚葉系細胞が、骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ＭＳＣが、ヒトＭＳＣである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により形成された、細胞の組成物。
  12. 実質的に純粋な形態の骨細胞である、請求項１１に記載の組成物。
  13. トロポエラスチンおよび／またはヒアルロン酸を含む、請求項１１または請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項１３に記載の組成物。
  15. 骨障害または骨折を有する個体を治療する方法であって、
    請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物を個体に提供し、それにより、骨障害または骨折について前記個体を治療することを含む、方法。
  16. 前記個体に前記組成物が提供され、前記個体に提供される前記組成物中のＭＳＣの総量が、前記個体の体重１キログラムあたり少なくとも１００万〜２００万細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記個体に前記組成物が提供され、前記個体に提供される前記組成物中のＭＳＣの総量が、少なくとも１００万〜２００万細胞であり、前記組成物が、局所部位に投与される、請求項１５に記載の方法。
  18. トロポエラスチンを含む細胞培養培地であって、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない、細胞培養培地。
  19. 約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  20. 約２％〜約１０％の血清を含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  21. 約２％〜約６％の血清を含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  22. 前記血清が、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  23. 無血清である、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  24. 最小必須培地（ＭＥＭ）を含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  25. Ｌ−グルタミンを含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  26. 約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  27. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項１８に記載の細胞培養培地。
  28. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項２７に記載の細胞培養培地。
  29. トロポエラスチンを含む細胞培養培地であって、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子を含まない細胞培養培地。
  30. ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含まない、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  31. インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  32. 約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  33. 約２％〜約１０％の血清を含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  34. 約２％〜約６％の血清を含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  35. 前記血清が、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  36. 無血清である、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  37. 最小必須培地（ＭＥＭ）を含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  38. Ｌ−グルタミンを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  39. 約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  40. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  41. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項４０に記載の細胞培養培地。
  42. 細胞培養物であって、
    −間葉系幹細胞、および
    −トロポエラスチンを含む培地であって、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）および／または塩基性線維芽細胞成長因子成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない培地、
    を含む、細胞培養物。
  43. 前記間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項４２に記載の細胞培養物。
  44. 前記培地が、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む、請求項４２に記載の細胞培養物。
  45. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項４２に記載の細胞培養物。
  46. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項４２に記載の細胞培養物。
  47. 前記培地が、２％〜約１０％の血清または約２％〜約６％の血清を含む、請求項４２に記載の細胞培養物。
  48. 前記培地が無血清である、請求項４２に記載の細胞培養物。
  49. 前記培地が、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む、請求項４２に記載の細胞培養物。
  50. 少なくとも１つの分化因子、および
    トロポエラスチン
    を含む、細胞培養培地。
  51. 前記少なくとも１つの分化因子が、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータ−グリセロホスファートを含む、請求項５０に記載の細胞培養培地。
  52. 前記少なくとも１つの分化因子が、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む、請求項５０に記載の細胞培養培地。
  53. 前記少なくとも１つの分化因子が、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む、請求項５０に記載の細胞培養培地。
  54. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項５０に記載の細胞培養培地。
  55. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項５０に記載の細胞培養培地。
  56. 細胞培養物であって
    −間葉系幹細胞、および
    −トロポエラスチンを含み、ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子を含まない培地
    を含む、細胞培養物。
  57. 前記ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む、請求項５６に記載の細胞培養物。
  58. 前記間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項５６に記載の細胞培養物。
  59. 前記培地が、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む、請求項５６に記載の細胞培養物。
  60. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項５６に記載の細胞培養物。
  61. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項６０に記載の細胞培養物。
  62. 前記培地が、２％〜約１０％の血清または約２％〜約６％の血清を含む、請求項５６に記載の細胞培養物。
  63. 前記培地が無血清である、請求項５６に記載の細胞培養物。
  64. 前記培地が、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチン、約２％〜約１０％のＦＢＳ、最小必須培地（ＭＥＭ）、およびＬ−グルタミンを含む、請求項５６に記載の細胞培養物。
  65. 細胞培養物であって
    −間葉系幹細胞、ならびに
    −トロポエラスチンおよび少なくとも１つの分化因子を含む培地
    を含む、細胞培養物。
  66. 前記少なくとも１つの分化因子が、デキサメタゾン、アスコルバートおよび／またはベータ−グリセロホスファートを含む、請求項６５に記載の細胞培養物。
  67. 前記少なくとも１つの分化因子が、ｈ−インスリン、デキサメタゾン、インドメタシンおよび／または３−イソブチル−１−メチル−キサンチンを含む、請求項６５に記載の細胞培養物。
  68. 前記少なくとも１つの分化因子が、デキサメタゾン、アスコルバート、インスリン−トランスフェリン−セレン、ピルビン酸ナトリウムおよび／またはプロリンを含む、請求項６５に記載の細胞培養物。
  69. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項６５に記載の細胞培養物。
  70. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項６５に記載の細胞培養物。
  71. 間葉系幹細胞を培養する方法であって、
    ａ）間葉系幹細胞を細胞培養培地で培養すること、ここで、前記培地がＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子を含まない、および
    ｂ）前記間葉系幹細胞をトロポエラスチンの存在下で拡大すること
    を含む、方法。
  72. 前記間葉系幹細胞が、７日間の拡大期間の１〜７日目、２〜５日目、または４〜７日目からトロポエラスチンに曝露される、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ＭＳＣの拡大または増殖を誘導する因子が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＡまたはＷｎｔ３ａを含む、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項７１に記載の方法。
  75. 前記培地が、約２．５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトロポエラスチンを含む、請求項７１に記載の方法。
  76. 前記トロポエラスチンが、ヒアルロン酸との複合体の形態で提供される、請求項７１に記載の方法。
  77. 前記トロポエラスチンが、前記ヒアルロン酸に架橋されている、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記培地が、約２％〜約１０％の血清を含む、請求項７１に記載の方法。
  79. 前記培地が、約２％〜約６％の血清を含む、請求項７１に記載の方法。
  80. 前記培地が、無血清である、請求項７１に記載の方法。
  81. 少なくとも１つの分化因子を含む別の培地中で前記間葉系幹細胞を分化させることをさらに含む、請求項７１に記載の方法。

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