CN111868230A - 干细胞的扩增和分化 - Google Patents

干细胞的扩增和分化 Download PDF

Info

Publication number
CN111868230A
CN111868230A CN201980018475.4A CN201980018475A CN111868230A CN 111868230 A CN111868230 A CN 111868230A CN 201980018475 A CN201980018475 A CN 201980018475A CN 111868230 A CN111868230 A CN 111868230A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tropoelastin
gly
mscs
cell culture
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980018475.4A
Other languages
English (en)
Inventor
安东尼·史蒂文·韦斯
吉塞尔·杨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Elastagen Pty Ltd
Allergan Pharmaceuticals International Ltd
Original Assignee
Elastagen Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2018900663A external-priority patent/AU2018900663A0/en
Application filed by Elastagen Pty Ltd filed Critical Elastagen Pty Ltd
Publication of CN111868230A publication Critical patent/CN111868230A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/80—Hyaluronan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及间充质干细胞和骨髓细胞的扩增和分化，包括在干细胞的扩增和分化以产生中胚层谱系的骨细胞、软骨细胞和其他细胞期间保持干细胞可塑性。

Description

干细胞的扩增和分化
交叉引用
本申请要求于2018年3月1日提交的澳大利亚临时专利申请号2018900663的权益，其全部公开内容通过该具体引用并入本文。
技术领域
本公开涉及间充质干细胞和骨髓细胞的扩增和分化，包括在干细胞的扩增和分化以产生中胚层谱系的骨细胞、软骨细胞和其他细胞期间保持干细胞可塑性。
背景技术
在说明书中对任何现有技术的引用不是承认或暗示该现有技术在任何权限范围内构成公知常识的一部分，或者该现有技术可以合理地预期为被本领域技术人员理解、认为是相关的和/或与其他现有技术进行组合。
间充质干细胞(MSC)以及诸如骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等来源于间充质干细胞的分化细胞由于它们固有的分化和再生潜能、免疫调节性质以及向损伤和疾病部位迁移的能力而越来越多地用于骨骼组织损伤、心肌梗死、退行性疾病和器官衰竭的治疗性干预。然而，阻碍广泛地转化到临床实践中的重大障碍是这些细胞的有限的天然利用率。例如，人骨髓源MSC仅占骨髓单核细胞群体的0.001％至0.01％。相比之下，用于单个患者的治疗剂量通常需要至少一百万至两百万个细胞/千克体重，部分原因是由于施用的MSC的归巢效率低。为了产生骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞，离体培养可能需要分离大约1×105至106个MSC，这取决于待治疗的症状的性质。显然，强烈需要成本有效地扩增MSC、同时保持与治疗功效密切相关的干细胞性质的能力。还需要无论是否进行先前的离体扩增，均能够离体分化MSC的能力。
MSC和其他附着型治疗性干细胞的扩增和分化通常依赖于与培养基、周围细胞和底层基质(underlying substrate)中的可溶性成分的相互作用。这些因素被公认为协同地且不是冗余地起到作用，因而不期望底层基质蛋白替换可溶性成分。因此，已经通过用外源可溶性因子强化培养基和/或通过用血清覆盖培养表面来增强MSC离体扩增。例如，MSC增殖可以通过向基础培养基中补充额外的血清蛋白、激素或生长因子来进行扩增。在这些生长因子中有转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和最常见的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。特别地，bFGF对MSC具有有效的促有丝分裂作用，并且经常用于补充具有全血清含量或最低血清含量的干细胞培养基。
纤连蛋白、胶原蛋白IV、玻连蛋白和层粘连蛋白形式的细胞外基质成分主要用作培养基质以将细胞保留在基质表面上，并且通常与补充有血清或生长因子的培养基协同使用，补充有血清或生长因子的培养基促进了MSC粘附、铺展和扩增。
Holst等(Nat Biotech 28,1123-1128(2010))用弹性蛋白原培养了小鼠骨髓细胞和人造血干细胞，并描述了需要单分子弹性蛋白原的增殖作用。基质的弹性和张拉性被描述为对于增殖作用的观察是重要的。添加扩增细胞因子与弹性蛋白原产生了加性效应。
Hu等(Biomaterials 31 8121-8131)描述了基于蚕丝素蛋白和重组人弹性蛋白原的结构蛋白共混物系统，其可形成不溶性膜。该系统促进了人间充质干细胞的附着和增殖。纯丝或纯弹性蛋白原培养物产生的细胞数量少于该系统产生的细胞数量。
Hu(Biomaterials 32,8979-8989(2011))描述了相同的系统以促进MSC的附着、增殖和成肌或成骨分化的能力。MSC的增殖和成骨分化需要具有微米/纳米级表面图案的高表面粗糙度。弹性蛋白原浓度不影响hMSC增殖的量。
Hu(Adv.Funct.Mater.23,3875-3884(2013))进一步描述了相同的系统作为“蛋白质合金”，其中正是合金本身和不溶性β-折叠晶体网络提供了影响细胞形态和生长所需的构象和稳定性。
Calabrese(J.Tissue Eng Regen Med 11:2549-2564(2017))进一步研究了水凝胶形式的蛋白质合金，其中将合金用于封装MSC。与Hu的早期工作相对比，发现合金中高含量的弹性蛋白原抑制了MSC的分化潜能，即使在分化培养基存在下也是如此。上述Calabrese描述了弹性蛋白原下调了hMSC分化。
发明内容
在第一方面中，提供了一种由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法包括以下步骤：使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子；以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中所述第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。
在第二方面中，提供了一种细胞的组合物，其中所述细胞通过根据本文任一项实施方案的方法而形成。通过由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法来形成细胞的组合物。该方法包括以下步骤：使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子；以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在组合物的一些实施方案中，组合物为基本上纯的骨细胞形式。在组合物的一些实施方案中，组合物包含弹性蛋白原和/或透明质酸。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在第三方面中，提供了一种治疗患有骨病或骨折的个体的方法。该方法包括向个体提供根据本文提供的任一项实施方案的组合物，从而治疗个体的骨病或骨折的步骤。通过由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法来形成细胞的组合物。该方法包括以下步骤：使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子；以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在组合物的一些实施方案中，组合物为基本上纯的骨细胞形式。在组合物的一些实施方案中，组合物包含弹性蛋白原和/或透明质酸。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，向个体提供组合物，其中提供给个体的组合物中的MSC的总量为至少一百万至两百万个细胞/千克个体的体重。在一些实施方案中，向个体提供组合物，其中将至少一百万至两百万个细胞施用至局部部位。
在第四方面中，提供了一种包含弹性蛋白原的细胞培养基，其中细胞培养基不包含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2％至约10％的血清。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，血清为胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，细胞培养基不含血清。在一些实施方案中，细胞培养基包含最低必需培养基(MEM)。在一些实施方案中，细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在第五方面中，提供了一种包含弹性蛋白原的细胞培养基，其中培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的因子。在一些实施方案中，细胞培养基不含TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，细胞培养基不含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2％至约10％的血清。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，血清为胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，细胞培养基不含血清。在一些实施方案中，细胞培养基包含最低必需培养基(MEM)。在一些实施方案中，细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在第六方面中，提供了一种细胞培养物，其中细胞培养物包含：间充质干细胞；以及包含弹性蛋白原的培养基，其中培养基不包含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，间充质干细胞为人间充质干细胞。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约10％的血清或约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
在第七方面中，提供了一种细胞培养基，其中细胞培养基包含：至少一种分化因子；以及弹性蛋白原。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在第八方面中，提供了一种细胞培养物，其包含：间充质干细胞；以及包含弹性蛋白原的培养基，其中培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的因子。在一些实施方案中，用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，间充质干细胞为人间充质干细胞。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约10％的血清或约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
在第九方面中，提供了一种细胞培养物，其中细胞培养物包含：间充质干细胞；以及包含弹性蛋白原和至少一种分化因子的培养基。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在第十方面中，提供了一种培养间充质干细胞的方法，该方法包括：a)在细胞培养基中培养间充质干细胞，其中培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的因子；以及b)在存在弹性蛋白原的情况下，对间充质干细胞进行扩增。在一些实施方案中，从七天扩增期的第1至7天、第2至5天或第4至7天，使间充质干细胞暴露于弹性蛋白原。在一些实施方案中，用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，间充质干细胞为人间充质干细胞。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约10％的血清。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，该方法还包括：在包含至少一种分化因子的培养基中分化间充质干细胞。
在一些实施方案中，提供了一种由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法，该方法包括使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子；以及(ii)弹性蛋白原；其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，培养物通常可包含至少一种分化因子，以用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，该方法包括：(i)使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以用于诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下，使MSC与弹性蛋白原进行接触。在一些实施方案中，在没有IGF-1或bFGF的情况下，使MSC与弹性蛋白原进行接触。在一些实施方案中，培养物通常可包含至少一种分化因子，以用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，该方法包括(i)提供具有细胞培养表面的细胞培养容器，细胞培养表面具有布置在其上的弹性蛋白原，当在细胞培养表面上培养细胞时，所述布置使得细胞能够在细胞培养期间接触布置在细胞培养表面上的弹性蛋白原；以及(ii)在能够在细胞培养表面上培养细胞的条件下，在培养容器中培养MSC，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括提供至少一种分化因子以诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，所述至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，培养物通常可包含至少一种分化因子，以用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：(i)提供具有细胞培养表面的细胞培养容器，细胞培养表面具有布置在其上的弹性蛋白原，所述布置使得弹性蛋白原能够至少部分地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中；以及(ii)在培养容器中培养MSC，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括提供至少一种分化因子以诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β甘油磷酸酯。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，培养物通常可包含至少一种分化因子，以用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：在含有溶解的弹性蛋白原的细胞培养基中培养MSC，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括将至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，培养物通常可包含至少一种分化因子，以用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。
在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。
在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：在含有溶解的弹性蛋白原和至少一种用于诱导MSC分化的分化因子的细胞培养基中培养MSC，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及之后，(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，第二培养基包含至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下，在第一培养基中对MSC进行培养。在一些实施方案中，在没有IGF-1或bFGF的情况下，在第一培养基对MSC进行培养。在一些实施方案中，弹性蛋白原改进了MSC增殖，并且可用于替代IGF-1和/或bFGF，并且可用于维持细胞扩增的扩增水平。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：在含有透明质酸和弹性蛋白原的复合物的细胞培养基中培养MSC，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。培养物可包含至少一种分化因子，该分化因子用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括使MSC与弹性蛋白原接触，以诱导MSC的增殖，其中存在弹性蛋白原时形成的MSC的数目大于不存在弹性蛋白原时形成的MSC的数目，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行该方法。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行该方法。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括：(i)提供具有细胞培养表面的细胞培养容器，细胞培养表面具有布置在其上的弹性蛋白原，当在细胞培养表面培养细胞时，所述布置使得细胞能够在细胞培养期间接触布置在细胞培养表面上的弹性蛋白原；以及(ii)在能够在细胞培养表面上培养细胞的条件下，在培养容器中培养MSC，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，该方法还包括提供至少一种增殖因子。在一些实施方案中，至少一种增殖因子为弹性蛋白原和/或胎牛血清。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括：提供具有细胞培养表面的细胞培养容器，细胞培养表面具有布置在其上的弹性蛋白原，所述布置使得弹性蛋白原能够至少部分地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中；以及在培养容器中培养MSC，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，该方法还包括提供至少一种增殖因子。在一些实施方案中，至少一种增殖因子为弹性蛋白原和/或胎牛血清。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括：在含有溶解的弹性蛋白原的细胞培养基中培养MSC，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，该方法还包括提供至少一种增殖因子。在一些实施方案中，至少一种增殖因子包括弹性蛋白原和/或胎牛血清。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括：在含有溶解的弹性蛋白原和至少一种用于诱导MSC的增殖的因子的细胞培养基中培养MSC，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，至少一种增殖因子包括弹性蛋白原和/或胎牛血清。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及之后，(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC增殖的增殖因子，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，至少一种增殖因子包括弹性蛋白原和/或胎牛血清。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行该方法。在一些实施方案中，在没有IGF-1或bFGF的情况下进行该方法。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，其中该方法包括：在含有复合物的细胞培养基中培养MSC，其中复合物包含透明质酸和弹性蛋白原，从而诱导MSC的增殖。
在与诱导MSC的增殖相关的上述实施方案中，细胞培养基通常可不包含用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的因子。
在上述实施方案中，应当理解，用于培养的弹性蛋白原不是以不溶性复合物的形式或以与另一种分子(丝蛋白为一个实例)的不溶性复合物或组合物的形式提供。
在上述实施方案中，应当理解，通常以使弹性蛋白原能够至少部分地或完全地溶解于形成细胞培养基的溶剂中的形式来提供弹性蛋白原。在一些实施方案中，以弹性蛋白原部分地溶解于溶剂中的浓度来提供弹性蛋白原。
在上述实施方案中，应当理解，可弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在另一个实施方案中，提供了一种细胞培养物，其包含通过实施上述由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法中的任一种而形成的中胚层谱系的细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗患有以下病症的个体的方法，该病症需要MSC或中胚层谱系的细胞以用于治疗，该方法包括实施上述方法中的任一种，以形成MSC的组合物或中胚层谱系的细胞的组合物，并且向个体提供所述组合物以使得能够治疗病症，从而治疗患有以下症状的个体，该症状需要MSC或中胚层谱系的细胞以用于治疗。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：(i)使MSC与弹性蛋白原接触以形成MSC和弹性蛋白原的组合物；以及(ii)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用组合物，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：(i)使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC和弹性蛋白原的组合物；以及之后，(ii)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用组合物，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行接触。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行接触。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括：(i)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用弹性蛋白原，从而在个体中形成弹性蛋白原的储库
(depot)；以及(ii)向个体施用MSC，使得MSC接触弹性蛋白原的储库，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。
通过以示例方式并参照附图给出的以下描述，在前述段落中描述的方面的其他方面将变得明显。
附图说明
图1A至图1B.在空白的或包被有弹性蛋白原的组织培养板(TCP)上、在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(图1A)或7％(v/v)FBS(图1B)、具有和没有胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)生长因子的培养基中的MSC增殖。图示出了在接种后的不同天数的相对净细胞增长。柱正上方的星号表示各培养基配方中的空白TCP和包被有弹性蛋白原的TCP之间的统计学差异。如图1A和图1B所示，图上的条形从左到右交替为：空白TCP而后是包被有弹性蛋白原(TE)的TCP。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；ns，不显著。
图2A至图2B.在减少量的血清中的MSC增殖。在正常培养基中，细胞在空白的、包被有弹性蛋白原(TE)的或包被有纤连蛋白(FN)的TCP上生长(图2A)。如图2A所示，图中的条形从左到右交替为：空白TCP、包被有TE的TCP和包被有FN的TCP。在正常培养基中的包被有弹性蛋白原的TCP上、在含有IGF-1和bFGF生长因子(GF)的培养基中的TCP上、或在补充有GF的培养基中的包被有弹性蛋白原的TCP上培养细胞(图2B)。如图2B所示，图上的条形从左到右交替为：包被有TE的TCP、具有包含IGF-1和bFGF生长因子的培养基的TCP、补充有GF的培养基中的包被有TE的TCP。图示出了接种后第3天、第5天和第7天的相对净细胞增长，其根据第1天的初始细胞数目进行归一化。柱正上方的星号表示与正常培养基中的包被有弹性蛋白原的TCP上的细胞的统计学比较。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图3A至图3C.在具有弹性蛋白原溶液的培养基中的MSC增殖。细胞在补充有浓度渐增的可溶性弹性蛋白原(TE)的培养基中的TCP上、或在正常培养基中的包被有TE的TCP上生长(图3A)。图示出了接种后第3天、第5天和第7天的相对净细胞增长。各柱形图上方的星号描述了与无弹性蛋白原对照的统计学差异。在正常培养基中、或在补充有弹性蛋白原或(一种或多种)生长因子的培养基中的TCP上培养细胞(图3B)。图示出了接种后第3天、第5天和第7天的相对净细胞增长。数据柱正上方的星号表示与正常培养基对照的统计学差异。在正常培养基中、或在补充有κ弹性蛋白(κELN)、α弹性蛋白(αELN)或弹性蛋白原的培养基中，7天的细胞增殖(图3C)。星号表示与正常培养基对照的统计学差异。在正常培养基、或补充有纤连蛋白或弹性蛋白原溶液的培养基中，细胞生长长达7天(图3D)。星号表示与正常培养基对照的统计学差异。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；ns，不显著。
图4A至图4I.MSC附着并铺展在弹性蛋白原上。在EDTA的存在下，细胞附着至与基质结合的弹性蛋白原(图4A)。在无阳离子的缓冲液中、并随着外源Mg2+、Ca2+和Mn2+二价阳离子的剂量增加，细胞与弹性蛋白原的结合(图4B)。随着抗αvβ5(图4C)、抗αvβ3(图4D)或泛抗αv整联蛋白抗体(图4E)的浓度增加，细胞在弹性蛋白原上的铺展。在具有和没有抗αv整联蛋白抗体的情况下，示出了细胞在纤连蛋白上的铺展作为对照。在最佳抑制浓度的抗αvβ3、抗αvβ5、组合的抗αvβ3和抗αvβ5以及抗αv整联蛋白抗体的存在下，细胞在弹性蛋白原上的铺展(图4F)。还包括下列作为对照：细胞在TCP上的铺展；以及当不存在抗体时、或具有非特异性小鼠IgG抗体时，细胞在弹性蛋白原上的铺展。数据柱上方的星号是指与无抗体对照的统计学差异。具有和没有整联蛋白阻断抗体的情况下，MSC在弹性蛋白原上的铺展的代表性图像(图4G)。附着在包被有弹性蛋白原或包被有BSA的TCP上的MSC的共聚焦显微镜图像，将粘着斑蛋白(focal adhesion vinculin)(绿色)和细胞核(蓝色)染色(图4H)。示出了粘着斑染色/细胞的相对密度。标尺：20μm。在FAK抑制剂(FAK抑制剂14或PKB/AKT抑制剂(哌立福新))的存在下，7天后的MSC增殖。相对于未经抑制的样品将细胞数目归一化。各个柱上方的星号表示与无抑制剂对照的比较(图4I)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；ns，不显著。
图5A至图5B.在成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(图5A)和整联蛋白抑制剂(图5B)的存在下的MSC增殖。细胞在正常培养基中、在具有20μg/mL弹性蛋白原的培养基中或在补充有bFGF的培养基中的TCP上生长7天。在增殖期间，将剂量渐增的FGFR抑制剂SU-5402添加到培养基中(图5A)。将每天的细胞数目相对于没有SU-5402的样品进行归一化。在各抑制剂浓度下，将含有弹性蛋白原或bFGF的培养基中的细胞数目与正常培养基中的细胞数目进行比较，以说明SU-5402的非特异性毒性。在7天内，将最佳抑制浓度的抗αvβ3、抗αvβ5、抗αvβ5和抗αvβ3、或抗αv添加到培养基中(图5B)。如图5B所示，图上的条形从左到右交替为：正常培养基、具有TE的培养基和具有bFGF的培养基。包括没有抗体的对照、或具有针对非表达整联蛋白的抗体(抗β8)的对照。条形图的条形上方的绿色箭头示出了在弹性蛋白原和αv整联蛋白亚基抗体的存在下的细胞生长。各柱形图上方的星号表示在各抗体条件下与正常培养基中的细胞的显著差异。
图6A至图6G.MSC向弹性蛋白原的迁移。图像示出了迁移试验的设置(图6A)。将细胞接种在中间室中，中间室与含有基质结合的弹性蛋白原或PBS的两侧室等距。将孔表面分为标记区域，测量标记区域内的细胞数目作为位置细胞迁移的指示。标记区域5天内的二进制图像示出了细胞迁移的铺展(图6B)。如在荧光显微镜下所观察到的，每个黑点代表一个细胞核。与包被有弹性蛋白原或PBS的区域相邻的区域内的比较细胞丰度(图6C)。包被有弹性蛋白原或PBS的区域内的比较细胞丰度(图6D)。在实验期间所有区域内的总细胞丰度(图6E)。在博伊登室试验的底部室中，细胞向作为扩散性趋化剂的弹性蛋白原浓度增加的方向迁移(图6F)。在顶部室中，将细胞与或不与5μg/mL抗αv整联蛋白抗体一起培养。将细胞迁移归一化为由无弹性蛋白原对照所示出的未受刺激迁移的水平。数据点上方的星号表示与无弹性蛋白原对照的显著差异。在整联蛋白阻断抗体的存在下，细胞对正常培养基或补充有弹性蛋白原的培养基的趋化性(图6G)。包括没有抗体或具有针对非表达整联蛋白的抗体(抗β8)的对照。如图6G所示，图上的条形从左到右交替为：无抗体、具有抗αv、具有抗αvβ3、具有抗αvβ5、具有抗αvβ3/抗αvβ5以及具有抗αvβ8。星号代表与无抗体对照的显著差异。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；ns，不显著；RFU，相对荧光单位。
图7.弹性蛋白原调节MSC行为的模型。基质结合的弹性蛋白原或可溶性弹性蛋白原可吸引MSC向其迁移。MSC粘附并铺展至弹性蛋白原基质，这触发了快速的细胞扩增，同时保留了MSC表面标志物表达和三系分化潜能。与大多数锚定依赖性基质蛋白不同，可溶形式的弹性蛋白原同样促进了MSC增殖和表型维持。这些来自弹性蛋白原的信号通过细胞表面整联蛋白受体(特别是αvβ3和αvβ5)进行传递，以诱导有效的促细胞运动和促有丝分裂MSC应答，其反映了对于诸如bFGF之类的可溶性生长因子的应答。
图8A至图8F.弹性蛋白原对MSC成骨分化(图8A至图8B)、成脂肪分化(图8C至图8D)和成软骨分化(图8E至图8F)的作用。在具有或没有弹性蛋白原的情况下，对细胞进行扩增，然后转移至具有或没有弹性蛋白原的诱导培养基或非诱导培养基。在成脂肪分化实验中，在没有弹性蛋白原的情况下，对细胞进行扩增；在具有弹性蛋白原的情况下，对细胞进行扩增直至融合，此时在融合后的过程中除去弹性蛋白原；或在具有弹性蛋白原的情况下，对细胞进行扩增直至融合后，然后进行诱导。如图8A所示，图上的条形从左到右交替为：没有TE且不诱导、具有TE且不诱导、没有TE且诱导以及具有TE且诱导。如图8C所示，图上的条形从左到右交替为：不诱导、没有TE且诱导以及具有TE且诱导。如图8E所示，图上的条形从左到右交替为：没有TE且不诱导、具有TE且不诱导、没有TE且诱导以及具有TE且诱导。
图9A至图9F.在MSC成骨分化(图9A至图9B)、成脂肪分化(图9C至图9D)和成软骨分化(图9E至图9F)期间，对弹性蛋白原的剂量响应。在没有或具有2μg/mL或20μg/mL弹性蛋白原的情况下，对细胞进行扩增，然后转移至具有或没有2μg/mL或20μg/mL弹性蛋白原的诱导培养基或非诱导培养基。在成脂肪分化实验中，在诱导之前，将在弹性蛋白原中扩增的细胞群体在不具有弹性蛋白原的条件下培养至融合后。如图9A所示，图上的条形从左到右交替为：不诱导、诱导、用2μg/mL TE诱导以及用20μg/mL TE诱导。如图9C所示，图上的条形从左到右交替为：不诱导、诱导、用2μg/mL TE诱导以及用20μg/mL TE诱导。如图9E所示，图上的条形从左到右交替为：不诱导、诱导、用2μg/mL TE诱导以及用20μg/mL TE诱导。
图10A至图10F.在MSC成骨分化(图10A至图10B)、成软骨分化(图10D至图10D)和成脂肪分化(图10E至图10F)期间，细胞的弹性蛋白原记忆的持续时间。在7天增殖期的第2至5天、第3至6天或第4至7天期间，在没有弹性蛋白原或具有弹性蛋白原的情况下，对细胞进行扩增，然后转移至具有或没有弹性蛋白原的分化培养基。
图11A至图11F.整联蛋白对弹性蛋白原对MSC成骨分化的作用的抑制。TE记忆的抑制(图11A)。如图11A所示，图上的条形从左到右交替为：没有TE、没有TE且具有抗av、没有TE且具有抗a5、没有TE且具有抗av/a5、加上TE、TE且具有抗av、TE且具有抗a5以及TE且具有抗av/a5。没有TE的扩增(图11B)。具有TE的扩增(图11C)。具有TE加上抗av的扩增(图11D)。具有TE和抗a5的扩增(图11E)。具有TE、具有抗av/a5的扩增(图11F)。如图11B至图11F所示，图上的条形从左到右交替为：没有TE的诱导和具有TE的诱导。
图12A至图12B.弹性蛋白原和透明质酸对MSC成骨分化的作用。柱状图示出了弹性蛋白原和透明质酸对MSC的作用。(图12A)。(图12B)。与组织培养塑料板对照相比，浓度高达500μg/mL的三种不同分子量的透明质酸(30kDa至50kDa、90kDa至110kDa以及300kDa至500kDa)没有提高MSC的成骨分化。向每种透明质酸制剂中添加弹性蛋白原促进了MSC的成骨分化。这些结果表明弹性蛋白原是弹性蛋白原-透明质酸复合材料中的主要促成骨剂。
图13A至图13C.用酶联免疫吸附测定法检测表面结合的弹性蛋白原(图13A)。将弹性蛋白原(TE)添加至空白TCP、用递增浓度的牛血清白蛋白(BSA)预培养的TCP、或用正常含血清培养基预培养的TCP。在图13A中，图上的条形从左到右表示图示(key)中从上到下列出的样品的顺序。将与BSA或培养基一起培养但未添加弹性蛋白原的样品用作阴性对照。在含有增加量的弹性蛋白原溶液的培养基中的TCP上、或在正常培养基中的包被有弹性蛋白原的TCP上，MSC增殖持续7天(图13B)。图示出了在接种后第3天、第5天和第7天的相对净细胞增长。数据柱正上方的星号表示与无弹性蛋白原对照的统计学差异。在具有和没有可溶性弹性蛋白原的正常培养基中的TCP上，MSC增殖持续7天(图13C)。在接种当天(D0)或接种后第3天(D3)添加弹性蛋白原的20μg/mL溶液。补充有弹性蛋白原的培养基中的细胞丰度提高超过了正常培养基中的细胞丰度，这与添加弹性蛋白原的时间相一致。
图14A至图14B.利用弹性蛋白原扩增的MSC的表面标志物表达。在具有或没有IGF-1和/或bFGF生长因子的正常(10％(v/v)FBS)或低血清(6％(v/v)FBS)培养基中、在空白TCP或包被有弹性蛋白原的TCP上培养细胞(图14A)；或者在正常培养基中或含有20μg/mL可溶性弹性蛋白原(TE)的培养基中的TCP上培养细胞(图14B)。(i)培养5天或7天后，表达阳性MSC标志物CD90、CD105、CD73以及阴性标志物CD34、CD45、CD11b、CD79a和HLA-DR的混合物的细胞群体的百分率。将标志物表达定量为从门控单线态活细胞检测到的阳性事件的百分率。(ii)在接种后7天，在各种培养条件下生长的细胞的代表性流式细胞术散点图。第一行描述了没有表达阴性标志物的细胞的选择门控。第二行示出了表达阳性标志物CD90和CD105两者的谱系阴性细胞群。第三行示出了CD90+和CD105+细胞群，它们还表达了MSC标志物CD73。对于所有标志物，还示出了同种型抗体染色的细胞对照。
图15.利用弹性蛋白原扩增的MSC的三系分化。在补充有弹性蛋白原或IGF-1和bFGF生长因子的正常培养基(NM)或低血清培养基(RSM)中的TCP或包被有弹性蛋白原(TE)的TCP上，培养细胞7天，然后收集并分化为成脂细胞系、成骨细胞系和成软骨细胞系。用油红O对诱导的和未诱导的细胞进行细胞内脂滴染色，用茜素红对矿化钙结节进行染色，用阿尔新蓝对糖胺聚糖进行染色。标尺：50μm。
图16A至图16B.MSC的趋化行为。在博伊登室试验的底部室中，细胞向作为扩散性趋化剂的弹性蛋白原浓度增加的方向迁移(图16A)。在顶部室中，将细胞与或不与5μg/mL抗β8整联蛋白抗体一起培养。将细胞迁移归一化为由无弹性蛋白原对照所示出的未受刺激迁移的水平。在整联蛋白阻断抗体的存在下，细胞对于正常培养基或补充有生长因子的培养基的趋化性(图16B)。包括没有抗体或具有针对非表达整联蛋白的抗体(抗β8)的对照。如图16B所示，图上的条形从左到右交替为：无抗体、加抗αv、加抗αvβe、加抗αvβ5以及加抗β8。
图17A至图17B.在(A)成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和(B)整联蛋白抑制剂的存在下，接种后一天的MSC丰度。细胞在正常培养基中、在具有20μg/mL弹性蛋白原(TE)的培养基中、或在补充有bFGF的培养基中的TCP上生长。(I)将剂量渐增的FGFR抑制剂SU-5402添加到培养基中。相对于没有SU-5402的样品将细胞数目归一化。在各抑制剂浓度下，将含有弹性蛋白原或bFGF的培养基中的细胞数目与正常培养基中的细胞数目进行比较，以说明SU-5402的非特异性毒性。(B)将最佳抑制浓度的抗αvβ3、抗αvβ5、抗αvβ5和抗αvβ3、或抗αv添加到培养基中。包括没有抗体或具有针对非表达整联蛋白的抗体(抗β8)的对照。绿色箭头示出了在弹性蛋白原和αv整联蛋白亚单元抗体的存在下的细胞生长。各柱形图上方的星号表示在各抗体条件下，与正常培养基中的细胞的显著差异。
具体实施方式
如本文实施方案中所述，已经确定了弹性蛋白原的未知性质以及基于这些性质在MSC的细胞培养中使用弹性蛋白原的方法。
如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包括(comprise)”和该术语的变体(如“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised)”)不旨在排除另外的添加物、成分、整体或步骤。
术语“扩增阶段”或“增殖阶段”是指这样的细胞培养过程，其中在具有或没有用于诱导MSC的产生的其他增殖因子的情况下，将MSC与弹性蛋白原一起培养。在该阶段完成时没有产生分化的细胞。剩余的细胞仅是MSC，即具有MSC表型和/或可塑性的那些细胞。
术语“扩增”或“细胞扩增”是指增加细胞数量以便在诸如临床用途之类的用途前对细胞进行体外扩增的方法。如一些实施方案中所述，可在培养基的存在下，在组织培养容器或板中对细胞进行扩增。培养基可补充有生长因子、血清和特定添加剂，但不限于此。在本文的一些实施方案中，在存在弹性蛋白原的情况下对细胞进行扩增。
在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下，对细胞进行扩增。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下，对细胞进行扩增。
术语“分化阶段”是指这样的细胞培养过程，其中将MSC与用于诱导分化细胞的产生的因子一起培养。
术语“分化”或“细胞分化”是指细胞改变为特定类型的细胞的过程。在一些情况下，细胞可在尺寸、形状方面以及响应于外部信令而改变。
在本文的一些实施方案中，在存在弹性蛋白原和分化因子的情况下，细胞发生分化。在一些实施方案中，弹性蛋白原的存在提高了细胞分化效率。
术语“弹性蛋白原”是指形成弹性蛋白的单体蛋白。弹性蛋白原通常不以共价或其他方式交联。弹性蛋白可以可逆地团聚。因此，弹性蛋白原与弹性蛋白不同，因为弹性蛋白由共价交联的弹性蛋白原组成，弹性蛋白原不能可逆地团聚。弹性蛋白原可为合成的，例如弹性蛋白原可来源于重组表达或其他合成；或者弹性蛋白原可从诸如猪主动脉之类的天然来源获得。如本领域通常已知的，弹性蛋白原可以多种片段的形式存在。
术语“中胚层谱系的细胞”是指来源于MSC分化的细胞，包括已确定的细胞(如骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞)以及已确定的细胞的前体。“中胚层谱系的细胞”不是指MSC。
术语“间充质干细胞(MSC)”是指多能成体干细胞。这些细胞可发现于多种组织来源，如脐带、骨髓和脂肪组织，但不限于此。MSC为非造血基质细胞，其可通过分裂而自我更新，并且能够分化成多种类型的组织，例如骨(成骨细胞)、软骨(软骨细胞)、肌肉(肌细胞)、脂肪细胞(脂细胞)和结缔组织。非限制性地，可通过CD105(SH2)和CD73(SH3/4)的表达来鉴定MSC。非限制性地，对于诸如CD34、CD45和CD14之类的造血标志物，细胞可呈阴性。
术语“骨髓细胞”是指在骨的海绵状中心或松质位点(cancellous site)内发现的半固态组织。该组织由(例如)造血细胞、骨髓脂肪组织和支持性基质细胞组成。在本文所述的一些实施方案中，为骨髓细胞的扩增和分化的方法。
“干细胞可塑性”或“转分化”指细胞产生了被认为在它们所处位置的正常分化谱之外的细胞类型的能力。其也可以被认为是细胞转化为其他类型的组织的细胞的能力。
“部分溶解”或“部分可溶”是指溶质会以小浓度溶解在溶剂内，但在超过某一浓度时将不完全溶解的描述。首先，可将弹性蛋白原的部分溶解描述为弹性蛋白原在溶剂中的浓度依赖性溶解度，其被限制在低于300mg/mL。可使用低于该量的浓度。其次，弹性蛋白原的溶解是弹性蛋白原已经从表面或另一储库上溶解的部分，其中一些弹性蛋白原尚未溶解。
弹性蛋白原的已确认的性质表明弹性蛋白原为用于中胚层谱系的细胞(尤其是骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞)的商业生产、并且特别是细胞(尤其是自体细胞)的离体或体内生产的有用候选物。在分化阶段之前或期间将弹性蛋白原用于驱动或诱导MSC的增殖的情况下，可提高一些细胞的分化产率。
更详细地，已经发现在扩增阶段中将弹性蛋白原用于诱导MSC的增殖以及在涉及那些MSC的成骨分化、成软骨分化或成脂肪分化的分化阶段中，弹性蛋白原使骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞具有更高产率。因此，根据本公开，对于骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的产生，可在扩增阶段和分化阶段使用弹性蛋白原。
在一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法包括：使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子；以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
可将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。
弹性蛋白原可部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。
该方法可包括以下步骤：(i)使MSC与至少一种用于诱导MSC的增殖的因子接触，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。该方法包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在特别优选的实施方案中，提供了由MSC形成骨细胞的方法。该方法包括：(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触，以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原接触。优选地，扩增阶段包括使用至少一种因子以诱导MSC的扩增或增殖。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行步骤(i)。分化阶段优选包括使用因子以诱导由MSC形成骨细胞。这些因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。扩增阶段更优选为独立于分化阶段完成。
在一些实施方案中，在扩增阶段，当存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞的数目大于当扩增阶段不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞的数目。在一些实施方案中，弹性蛋白原促进了干细胞扩增和募集。
在特别优选的实施方案中，提供了由MSC形成脂肪细胞的方法。该方法包括：(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触，以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原接触。优选地，扩增阶段包括使用至少一种因子以诱导MSC的扩增或增殖。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行步骤(i)。分化阶段优选包括使用因子以诱导由MSC形成脂肪细胞。这些因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。扩增阶段更优选为独立于分化阶段完成。在一些实施方案中，在扩增阶段，当存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞的数目大于当扩增阶段不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞的数目。在一些实施方案中，弹性蛋白原促进了干细胞扩增和募集。
在特别优选的实施方案中，提供了由MSC形成软骨细胞的方法。该方法包括：(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触，以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与至少一种用于诱导由MSC形成软骨细胞的因子接触。优选地，扩增阶段包括使用因子以诱导MSC的扩增或增殖。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行步骤(i)。分化阶段优选包括使用因子以诱导由MSC形成软骨细胞。这些因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠、脯氨酸。在一些实施方案中，至少一种因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。扩增阶段更优选为独立于分化阶段完成。
应当理解，在上述方法中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，在扩增阶段，当存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞的数目大于当扩增阶段不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞的数目。在一些实施方案中，弹性蛋白原促进了干细胞扩增和募集。弹性蛋白原可维持细胞发育成不同类型的细胞的能力。
弹性蛋白原可以以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
通过该方法产生的中胚层谱系的细胞可为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。
在一些实施方案中，MSC为人MSC。
在另一个实施方案中，提供了由上述方法形成的细胞组合物。
组合物可为基本上纯的骨细胞形式。
组合物可包含弹性蛋白原和/或透明质酸。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗患有骨病或骨折的个体的方法。该方法包括向个体提供上述组合物，从而治疗个体的骨病或骨折。组合物可包含弹性蛋白原和MSC。组合物可另外包含一种或多种因子以用于MSC的分化以形成骨细胞或骨细胞的前体。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处，其中局部部位为骨病或骨折的区域。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗具有由疾病或创伤引起的脂肪损失或萎缩的区域的个体、或由手术或疾病引起的需要手术增强的个体的方法。该方法包括向个体提供上述组合物，从而对该个体进行治疗。组合物可包含弹性蛋白原和MSC。组合物可另外包含一种或多种因子以用于MSC的分化以形成脂肪细胞或脂肪细胞前体。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处，其中局部部位为脂肪损失或萎缩的区域。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗患有软骨病的个体的方法，该方法包括向个体提供上述组合物，从而治疗个体的软骨疾病。组合物可包含弹性蛋白原和MSC。组合物可另外包含一种或多种因子以用于MSC的分化以形成软骨细胞或软骨细胞的前体。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处，其中局部部位为软骨病的区域。
如本文实施方案中所述，已经确定了弹性蛋白原的性质，这启发了弹性蛋白原可作为MSC的商业化生产的有用候选物。特别地，已经发现弹性蛋白原，无论以结合至固相的形式提供还是以溶液提供，都能够以保留MSC固有的干细胞特性(stemness)或可塑性的方式来诱导MSC的增殖。“干细胞特性”具有其普通和通常的含义，并且可指干细胞的基本特征，这些特征将干细胞与普通细胞区分开来。在将弹性蛋白原添加至溶液中的一些实施方案中，防止弹性蛋白原粘附至固相，其中固相是用于保持细胞的媒介物。这可以在含有显著减少的血清成分的培养基中，并且在缺乏通常用于MSC增殖和生产的某些因子(如IGF-1和bFGF)的情况下实现。不希望受到假设的束缚，至少就MSC的附着和铺展的作用机制而言，看起来似乎需要弹性蛋白原与细胞表面之间的直接接合或相互作用。更详细地，应当将相互作用或接合理解为发生在弹性蛋白原与MSC上的αvβ5和αvβ3分子之间，并且当MSC受到空间位阻或被阻碍与弹性蛋白原接触时，会使该机制消除。在将弹性蛋白原添加至溶液中的一些实施方案中，防止弹性蛋白原粘附至固体基质，其中固体基质是用于保持细胞的媒介物。
在一个实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法。该方法包括使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，其中当存在弹性蛋白原时形成的MSC的数量大于当不存在弹性蛋白原时形成的MSC的数量，从而诱导MSC的增殖。
可将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。优选地，将弹性蛋白原布置为使MSC能够经由位于MSC质膜上的αvβ5和αvβ3分子结合至弹性蛋白原。
弹性蛋白原可部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。
该方法包括：在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC以形成经弹性蛋白原培养的MSC群，然后在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含用于诱导MSC的增殖的因子。
在一个实施方案中，在存在弹性蛋白原以及在没有诱导MSC的扩增或增殖的因子的情况下，特别是在没有IGF1和或bFGF的情况下，进行扩增阶段。
在一个实施方案中，在存在弹性蛋白原以及在没有诸如血清之类的蛋白源的情况下，进行扩增阶段。
应当理解，在上述方法中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。
可弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。
在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在一些实施方案中，MSC为人MSC。
在另一个实施方案中，提供了由上述方法形成的MSC的组合物。
组合物可为基本上纯的MSC形式。
组合物可包含弹性蛋白原和/或透明质酸。
如本文实施方案中所述，已经建立了弹性蛋白原在MSC的体外扩增和分化中的用途。弹性蛋白原被确定为促进MSC有丝分裂的因子，使得MSC能够在没有其他增殖因子的情况下增殖，使得在存在其他增殖因子并且不存在弹性蛋白原的情况下获得更高的MSC产量。当提供有间充质分化因子时，也将弹性蛋白原确定为引起中胚层前体细胞和目标细胞的扩增提高的因子，从而提供了数量增加的前体细胞和目标细胞。由于MSC的分化以形成中胚层谱系的细胞的因子天然存在于哺乳动物组织中，因此离体获得的弹性蛋白原/MSC组合物可以用于在体内产生中胚层谱系的细胞。预示了三种应用：(i)使在手术或活检期间收集的MSC与弹性蛋白原接触，并且几乎立即施用至个体的需要中胚层谱系的细胞的组织部位处；(ii)使在手术或活检期间收集的MSC与弹性蛋白原离体接触一段时间，从而使得MSC细胞数目能够扩增，然后将包含扩增的MSC和弹性蛋白原的组合物施用至个体的需要中胚层谱系的细胞的组织部位处；以及(iii)使在手术或活检期间收集的MSC与弹性蛋白原离体接触一段时间，从而使得MSC细胞数目能够扩增，然后使组合物与一种或以上用于诱导分化的因子接触，然后施用至个体的需要中胚层谱系的细胞的组织部位处。
因此，在另一个实施方案中，提供了一种在个体中由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法包括(i)使MSC与弹性蛋白原接触以形成MSC和弹性蛋白原的组合物，以及(ii)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用组合物，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处。
根据该实施方案，当施用至个体时，个体的内源性分化因子提供了MSC的分化。
根据该实施方案，MSC可与弹性蛋白原接触，并且在从个体分离后数小时内，例如1小时至6小时，优选少于1小时内施用至个体，使得在单个手术过程内完成例如MSC的分离、与弹性蛋白原接触和施用至个体的步骤。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法包括(i)使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC和弹性蛋白原的组合物；以及之后，(ii)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用组合物，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。根据该实施方案，当施用至个体时，个体的内源性分化因子提供了MSC的分化。
在上述实施方案中，通常以包含弹性蛋白原和MSC的组合物的形式施用弹性蛋白原和MSC。在这些实施方案中，组合物可包含用于MSC的增殖或分化的其他因子，或者可将这些其他因子单独地施用于个体。在一些实施方案中，增殖因子包括弹性蛋白原。在一些实施方案中，增殖因子包括血清。在一些实施方案中，一种或多种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β甘油磷酸酯。在一些实施方案中，一种或多种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，一种或多种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在另一个实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法包括(i)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用弹性蛋白原，从而在个体中形成弹性蛋白原的储库；以及(ii)向个体施用MSC，使得MSC接触弹性蛋白原的储库，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。该方法的一个优点是其避免了在施用至个体之前使弹性蛋白原与MSC接触的步骤。具体地，在从个体分离MSC之前，可以在需要产生MSC或来源于MSC的中胚层细胞的部位处向个体施用弹性蛋白原。在一些实施方案中，将弹性蛋白原施用至个体的局部部位处，其中局部部位为骨病或骨折的区域。在一些实施方案中，将弹性蛋白原施用至个体的局部部位处，其中局部部位为脂肪损失或萎缩的区域。在一些实施方案中，将弹性蛋白原施用至个体的局部部位处，其中局部部位为软骨病的区域。分离后，将MSC简单地注射至先前已建立弹性蛋白原的部位。这使得能够由MSC形成中胚层细胞。
在上述实施方案中，通常通过公认的技术从个体获取MSC。
通常，MSC是自体的。
在上述实施方案中，在扩增阶段使用的细胞数目通常为约103至105个细胞。
本文所述实施方案中使用的MSC可以来源于多种来源，例如，包括但不限于骨髓、脐带细胞、脂肪组织、臼齿细胞、羊水和外周血。在一些实施方案中，MSC来源于骨髓、脐带细胞、脂肪组织、臼齿细胞、羊水和外周血。
在培养中，MSC表达了CD73、CD90和CD105。它们可能缺乏CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a和HLA DR。
在上述实施方案中，弹性蛋白原的浓度通常可在约0.01μg/mL至约200mg/mL、更优选约1μg/mL至约100mg/mL、更优选约1μg/mL至约75mg/mL、约1μg/mL至约50mg/mL、或约10μg/mL至约100mg/mL、约10μg/mL至约75mg/mL、约10μg/mL至约50mg/mL的范围内。
可通过从合适的来源(例如从人或其他动物)进行纯化来获得弹性蛋白原，或者通过标准重组DNA技术(如在例如马尼亚蒂斯技术中所述)来产生弹性蛋白原。
重组弹性蛋白原可引入修饰(例如，异源氨基酸序列的氨基酸置换、缺失和添加)，从而形成弹性蛋白原类似物，这些弹性蛋白原类似物可(例如)增强相应蛋白的生物活性或表达。在一些实施方案中，弹性蛋白原包括SEQ ID NO：1中所示的序列。
在优选的实施方案中，该方法将SHELδ26A类似物(WO1999/03886)用于本文所述的各种应用，包括用于MSC的增殖和/或分化。SHELδ26A(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列为：
(SEQ ID NO：1；
GGVPGAIPGGVPGGVFYPGAGLGALGGGALGPGGKPLKPVPGGLAGAGLGAGLGAFPAVTFPGALVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)
在可供选择的实施方案中，弹性蛋白原同种型为SHEL同种型(WO 1994/14958；通过引用将其全部内容并入本文)(SEQ ID NO：2；
SMGGVPGAIPGGVPGGVFYPGAGLGALGGGALGPGGKPLKPVPGGLAGAGLGAGLGAFPAVTFPGALVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAGADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)或者SHEL或SHELδ26A同种型的蛋白酶抗性衍生物(WO 2000/04043；通过引用将其全部内容并入本文)。如WO2000/04043中所述，弹性蛋白原的蛋白质序列可具有突变的序列，其使得对蛋白水解消化的易感性降低或消除。非限制性地，弹性蛋白原氨基酸序列降低或消除了对(例如)丝氨酸蛋白酶、凝血酶、激肽释放酶、金属蛋白酶、明胶酶A、明胶酶B、血清蛋白、胰蛋白酶或弹性蛋白酶的易感性。在一些实施方案中，弹性蛋白原包含SEQ ID NO：3(SHELδ26A同种型)中所示的序列(SEQ ID NO：3：
GGVPGAIPGGVPGGVFYPGAGLGALGGGALGPGGKPLKPVPGGLAGAGLGAGLGAFPAVTFPGALVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)在一些实施方案中，弹性蛋白原包含SEQ ID NO：4(SHELδmod同种型)中所示的序列(SEQ ID NO：4：
GGVPGAVPGGVPGGVFYPGAGFGAVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGFGAVPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGFGAVPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGFGAVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAGFGAVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAVPGALAAAKAAKYGAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)。
弹性蛋白原类似物通常具有与人弹性蛋白原序列同源的序列。可通过BESTFIT计算机程序中执行的算法来计算一对序列之间的同一性百分比。另一种计算序列差异的算法已经适用于快速数据库搜索并在BLAST计算机程序中执行。在氨基酸水平上，弹性蛋白原多肽序列与人的序列可仅具有约60％的同一性、约70％或以上的同一性、约80％或以上的同一性、约90％或以上的同一性、约95％或以上的同一性、约97％或以上的同一性、或大于约99％的同一性。
当进行比较时，还可考虑保守氨基酸置换(例如Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/Lys、Gln/Asn)，因为预期这些氨基酸残基对的化学相似性在许多情况下可实现功能等价。预期保留多肽生物学功能的氨基酸置换将保留置换的氨基酸残基的化学属性，如疏水性、亲水性、侧链电荷或尺寸。
通过采用宿主的密码子偏好，所用的密码子还可适用于异源宿主中的翻译。这将适应异源宿主的翻译机制，而多肽的化学结构没有实质性改变。密码子优化的用途先前已经描述过，并且可以被理解为用于蛋白质翻译水平的优化。
可以如WO 1999/03886中所示而产生弹性蛋白原的重组形式。这些序列为：SEQ IDNO：5(SEQ ID NO：5；
SMGGVPGAIPGGVPGGVFYPGAGLGALGGGALGPGGKPLKPVPGGLAGAGLGAGLGAFPAVTFPGALVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAGADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ ID NO：6(SEQ IDNO：6；
GGVPGAIPGGVPGGVFYPGAGLGALGGGALGPGGKPLKPVPGGLAGAGLGAGLGAFPAVTFPGALVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ ID NO：7(SEQ ID NO：7；
MGGVPGAVPGGVPGGVFYPGAGFGAVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGFGAVPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGFGAVPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGFGAVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAGFGAVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGFFPGFGVGVGGIPGVAGVPSVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGVGTPAAAAAKAAAKAAQFGLVPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGLAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGIGPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAVPGALAAAKAAKYGAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ ID NO：8(SEQID NO：8；
SAMGGVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ ID NO：9(SEQ ID NO：9；
SAMGALVGLGVPGLGVGAGVPGFGAGADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ ID NO：10(SEQ IDNO：10；
GIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ IDNO：11(SEQ ID NO：11；GAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQ IDNO：12(SEQ ID NO：12；
GADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRV)；SEQ ID NO：13(SEQ ID NO：13；GADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRF)；SEQ ID NO：14(SEQ ID NO：14；
AAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAGADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)；SEQID NO：15(SEQ ID NO：15；
AAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK)。
应当理解，以本文所述的实施方案的配方提供弹性蛋白原，以利用弹性蛋白原在诱导由MSC产生中胚层谱系的细胞中的生物活性。就此而言，弹性蛋白原是用于扩增或分化阶段的含有弹性蛋白原的组合物的活性成分。
如上文所讨论的，在一些实施方案中，细胞培养中使用的至少一些弹性蛋白原未附着于固相或水凝胶。这使得在扩增和/或分化阶段中，如果不是所提供的所有弹性蛋白原都能够适当地刺激MSC以用于MSC的产生或MSC的分化，那么也是至少一些弹性蛋白原能够适当地刺激MSC以用于MSC的产生或MSC的分化。
在一些实施方案中，弹性蛋白原处于这样的形式，其中弹性蛋白原连接至另一分子，如生物聚合物，一个实例为透明质酸。该连接可为共价连接。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，弹性蛋白原包括SEQ ID NO：1中所示的序列。
特别优选的是，当弹性蛋白原连接至另一分子时，该连接不阻碍或限制弹性蛋白原的未连接形式中固有的生物学性质。因此，当弹性蛋白原与另一分子连接时，弹性蛋白原保留了弹性蛋白原的生物学性质，尤其是在如本文所述的扩增或分化阶段中利用的能力。
将弹性蛋白原与另一分子连接的目的通常是使弹性蛋白原能够定位至特定区域，并且特别是使弹性蛋白原从该区域扩散或以其他方式迁移的可能性最小化。这在本文所述的体内实施方案中是特别相关的，其中将在个体中提供弹性蛋白原的储库，然后将MSC应用或施用至该个体。在一些实施方案中，在局部部位提供弹性蛋白原的储库，其中该局部部位为骨病或骨折的区域。在一些实施方案中，在局部部位提供弹性蛋白原的储库，其中该局部部位为脂肪损失或萎缩的区域。在一些实施方案中，在局部部位提供弹性蛋白原的储库，其中该局部部位为软骨病的区域。
应当理解，在弹性蛋白原经由戊二醛、或通过赖氨酰氧化酶(如在弹性蛋白中)共价连接的形式中，或在碱性聚合形式中，弹性蛋白原没有保留使其能够用于本文所述的扩增或分化阶段的生物活性。
在一个实施方案中，为细胞培养提供的弹性蛋白原的至少约50％与生物分子和/或生物聚合物连接，生物分子和/或生物聚合物如含糖分子，例如寡糖、多糖或它们的衍生物。在其他实施方案中，至少约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的弹性蛋白原或由任意两个上述值所限定的范围内的任何量的弹性蛋白原与另一分子连接。
在上述使用弹性蛋白原和透明质酸的复合物的实施方案中，使用透明质酸的浓度通常为约0.1mg/ml至30mg/ml，更优选约1mg/ml至约15mg/ml。
优选地，在弹性蛋白原和透明质酸的复合物中，弹性蛋白原与透明质酸之比为约100:1，更优选约50:1，更优选约10:1，更优选约1:1，更优选约1:10，更优选约1:100。
在某些实施方案中，在所使用的给定组合物中未连接至另一化合物的弹性蛋白原分子的数目优选为组合物中的弹性蛋白原的至少约5％、约10％、约15％或约20％、或任意两个上述值之间的范围内的任何量。
在某些实施方案中，对于用于细胞培养的组合物中的弹性蛋白原的量，与组合物中的其他蛋白或分子的量相比，弹性蛋白原具有指定的纯度。在一个实施方案中，组合物中的弹性蛋白原具有至少约75％的纯度、优选约85％的纯度、更优选大于约90％或约95％的纯度。就此而言，弹性蛋白原的片段，即通过弹性蛋白原制造无意中产生的弹性蛋白原同种型的截短形式，可能被认为是杂质。
还应理解，在某些实施方案中，可以组合物的形式提供弹性蛋白原，该组合物由弹性蛋白原、优选弹性蛋白原的全长同种型组成、或基本上由弹性蛋白原、优选弹性蛋白原的全长同种型组成。在可供选择的实施方案中，弹性蛋白原将为相关弹性蛋白原同种型的长度的至少约65％、多于全长的约80％、多于全长的约90％或多于全长的约95％。
在某些实施方案中，可以三维结构的形式提供弹性蛋白原以用于细胞培养。可将MSC接种在3D结构内，或者在使MSC能够迁移至3D结构的条件下在细胞培养物中提供MSC。
3D结构可为水凝胶。通常，根据一些实施方案使用的水凝胶包含形成支架并使水凝胶具有下述机械性质的聚合亲水性分子、水以及如本文所述的用于扩增和或诱导阶段的弹性蛋白原。
如下所述，聚合亲水性分子的实例包括羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、透明质酸、黄原胶、瓜尔胶、β-葡聚糖、藻酸盐、羧甲基葡聚糖。
在一个实施方案中，水凝胶可提供约100kPa至约2MPa的拉伸强度。拉伸强度通常定义为当对材料进行拉伸或牵拉时，在材料的截面开始显著拉伸之前能够承受的最大应力。本领域技术人员将知道测试材料的极限强度的合适方法。在一些实施方案中，水凝胶的极限强度可以为约10kPa至约45kPa(例如，约12kPa至约40kPa)。
在另一个实施方案中，水凝胶的抗压强度为50kPa至700kPa。抗压强度是材料或结构承受轴向推力的能力。抗压强度提供了在测试方法的条件下，力相对于形变的数据(或曲线)。根据定义，材料的抗压强度是当材料完全失效时达到的单轴向抗压应力值。通常在实验上，通过抗压试验获得抗压强度。用于该实验的装置与用于拉伸试验的装置相同。然而，不是施加单轴向拉伸载荷，而是施加单轴向压缩载荷。可以想象，不但使试样缩短，而且横向铺展。通常在万能试验机上测定抗压强度；这些范围从非常小的桌面系统到具有超过53MN容量的桌面系统。抗压强度的测定受具体试验方法和测量条件的影响。
可以使用在给定应变水平(例如，约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、60％、约65％、约70％或约75％的应变水平)下的循环载荷来测定水凝胶的抗压强度。在一些实施方案中，水凝胶的压缩模量为约1kPa、约10kPa、约20kPa、约30kPa、约40kPa、约50kPa、约60kPa、约70kPa、约80kPa、约90kPa、约100kPa、约110kPa、约120kPa、约130kPa、约140kPa、约150kPa、约160kPa、约170kPa、180kPa、约190kPa、约200kPa、210kPa、约220kPa、约230kPa、约240kPa、约250kPa、约260kPa、约270kPa、280kPa、290kPa、300kPa、约310kPa、320kPa、330kPa、340kPa、350kPa、约360kPa、约370kPa、约380kPa、约390kPa、约400kPa、约410kPa、约420kPa、约430kPa、约440kPa、约450kPa、约460kPa、约470kPa、约480kPa、约490kPa或约500kPa或在由任意两个上述值所限定的范围之间的任何压缩模量。水凝胶的压缩模量可以在约1kPa至约500kPa的范围内。
压缩时，水凝胶会损失能量。能量损失可以在约5％至约50％的范围内。在一些实施方案中，能量损失可以为约10％至约40％、约20％至约35％(例如，23±3.2％或24.1±7％)、或约25％至约30％(例如，30.5±6.4或26.9±2.3)。
在一个实施方案中，水凝胶的断裂应变在约130kPa和约420kPa之间。通过拉伸样品直到它们断裂并由应变/应力曲线确定断裂点处的应变，从而进行断裂应变试验。
在某些实施方案中，水凝胶或支架的弹性模量可在约500Pa至约50Pa之间、约450Pa至约100Pa之间、约400Pa至约125Pa之间；约400Pa至约150Pa之间、或约385Pa至约150Pa之间。弹性模量将根据所使用的水凝胶或支架的浓度和成分而变化。
在某些实施方案中，当通过25G针挤出时，水凝胶的可挤出长度(即基本上相连且基本上保持在一起而无需支撑)可为至少约5cm、约10cm、约12cm、约15cm、约18cm、约20cm或约25cm、或在由任意两个上述值所限定的范围之间的任意可挤出长度。当通过27G针挤出时，某些实施方案的可挤出长度(即基本上相连且基本上保持在一起而无需支撑)可为至少约5cm、约10cm、约12cm、约15cm、约18cm、约20cm或约25cm、或在由任意两个上述值所限定的范围之间的任意可挤出长度。当通过30G针或31G针挤出时，某些实施方案的可挤出长度(即基本上相连且基本上保持在一起而无需支撑)可为至少约5cm、约10cm、约12cm、约15cm、约18cm、约20cm或约25cm、或在由任意两个上述值所限定的范围之间的任意可挤出长度。
某些实施方案的通过细规格针的可挤出长度可为至少约5cm、约10cm、约12cm、约15cm、约18cm、约20cm、约或25cm、或在由任意两个上述值所限定的范围之间的任意可挤出长度。
在一些实施方案中，所用的水凝胶也可以是可溶胀的。术语“可溶胀”是指水凝胶基本上不溶于溶胀剂中，并且能够吸收大量的溶胀剂，从而当与溶胀剂接触时体积增大。如本文所用，术语“溶胀剂”就纸张而言具有其普通和通常的含义，并且不受限制地可指产生至少一定程度的溶胀的那些化合物或物质。通常，溶胀剂为水溶液或有机溶剂，然而溶胀剂也可以为气体。在一些实施方案中，溶胀剂为水或生理溶液，例如磷酸盐缓冲盐水或生长培养基。
在一些实施方案中，水凝胶包含溶胀剂。在一些实施方案中，水凝胶可以包含超过50％(w/v)、超过60％(w/v)、超过70％(w/v)、超过80％(w/v)、超过90％(w/v)、超过91％(w/v)、超过92％(w/v)、超过93％(w/v)、超过94％(w/v)、超过95％(w/v)、超过96％(w/v)、超过97％(w/v)、超过98％(w/v)、超过99％(w/v)或更多的溶胀剂。
本文所用的术语“溶胀比”是指溶胀的水凝胶中溶胀剂的重量/溶胀前水凝胶的干重。例如，溶胀比可以在约1克至约10克溶胀剂/水凝胶中的每克弹性蛋白原的范围内。在一些实施方案中，溶胀比可以为约1克至约5克溶胀剂/水凝胶中的每克弹性蛋白原。在一些实施方案中，溶胀比可以为约1.25克、约1.5克、约1.75克、约2克、约2.25克、约2.5克、约2.75克、约3克、约3.25克、约3.5克、约3.75克、约4克、约4.25克、约4.5克、约4.75克或约5克溶胀剂/水凝胶中的每克弹性蛋白原。在一些实施方案中，溶胀比可以为1.2±0.2克、2.3±0.3克或4.1±0.3克溶胀剂/水凝胶中的每克弹性蛋白原。
在某些优选的实施方案中，水凝胶包含用作支架的透明质酸(HA)。在这些情况下，HA的功能是向水凝胶提供某些机械性质，以使弹性蛋白原能够保持基本上游离(未交联)，使得弹性蛋白原具有作为生物因子而起作用的能力，从而刺激和诱导提供有水凝胶的部位处的成骨分化。
在某些实施方案中，当水凝胶包含弹性蛋白原和透明质酸时，弹性蛋白原与透明质酸的质量比为约0.1:1至约500:1，优选约0.2:1至约100:1。
还在其他的实施方案中，水凝胶可包含浓度在约0.1％至约15％之间的HA。在某些实施方案中，水凝胶可包含浓度在约0.1％至约10％之间的HA。
水凝胶可包含衍生的HA或非衍生的HA，以控制HA与其自身和/或单体蛋白交联的程度。
在某些实施方案中，HA可包括至少一个可连接部分，如至少一个可交联部分，例如羧基、羟基、胺、硫醇、醇、烯烃、炔烃、氰基或叠氮化物、和/或它们的修饰物、衍生物或组合。
在某些实施方案中，HA可包含间隔基团，使得间隔基团能够连接至相同的分子和/或第二分子，例如第二生物分子或生物聚合物。
水凝胶中使用的HA可在约50个至约4000个二糖单元或残基的范围内，例如约2000个至2500个二糖单元或残基。在其他实施方案中，可在200个至10,000个二糖单元或残基的范围内使用透明质酸。
在某些实施方案中，HA可为低分子量或高分子量的，并且HA的选择将根据技术人员改变水凝胶粘度的意图而变化。例如，使用较低分子量的透明质酸使得透明质酸能够被修饰、沉淀和洗涤，并且透明质酸保持了适度低粘度的溶液，其可容易地用作交联剂。使用较高分子量的多糖会产生额外的处理问题(例如，粘性溶液、混合问题、通气等)，但在某些实施方案中，可使用宽范围的分子量来实现所需结果。
在某些实施方案中，可利用诸如EDC或烯丙基缩水甘油醚之类的活化剂和/或诸如NHS、HOBt或溴之类的改性剂对HA进行活化和/或改性。
术语“透明质酸”或“HA”可包括透明质酸及其任意透明质酸盐，包括(例如)透明质酸钠(钠盐)、透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。本文可使用来自各种来源的透明质酸。例如，透明质酸可从动物组织中提取、作为细菌发酵的产物而收集、或通过生物加工技术而以商业量生产。
还可包含在水凝胶中的合适的多糖包括羧基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素羧甲基直链淀粉(“CMA”)、黄原胶、瓜尔胶、β-葡聚糖、藻酸盐、羧甲基葡聚糖、糖胺聚糖衍生物、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚乳酸(PLA)或生物材料，如聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、磷酸三钙(TCP)、1-羟基磷灰石(PAH)以及它们的药学上可接受的盐。
可供选择地，多糖可为果胶或其衍生物，包括直链多糖和支化多糖。
当弹性蛋白原水凝胶中使用的支架试剂为羧甲基纤维素或黄原胶时，可以约0.01％(w/v)至约10％(w/v)的量提供试剂，优选以约0.5％(w/v)至约3.5％(w/v)的量提供试剂。
支架可为交联或未交联的多糖，其通常具有取代或额外的侧链。
额外的支架可包括衍生自聚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇和具有聚乙二醇亚基的(嵌段)共聚物(例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407)的支架。水凝胶中包含的可供选择的试剂包括表面活性剂，如月桂基硫酸钠和聚山梨酸酯、或泛醇、聚乙二醇、黄原胶、瓜尔胶、聚山梨酸酯80、N-乙酰葡糖胺和它们的药学上可接受的盐。
附加实施方案
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法可以包括以下步骤：(i)提供具有细胞培养表面的细胞培养容器，细胞培养表面具有布置在其上的弹性蛋白原，所述布置使得弹性蛋白原能够至少部分地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中；以及(ii)在培养容器中培养MSC，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。
在一些实施方案中，由于在扩增状态下存在弹性蛋白原，成骨分化、成脂肪分化和软成骨分化得到促进。这种效果可与弹性蛋白原的促有丝分裂效果分开。在一些实施方案中，当细胞在扩增阶段暴露于弹性蛋白原时，成骨分化、成脂肪分化和成软骨分化得到促进。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在本文所述的实施方案的方法中，弹性蛋白原可在全血清培养基中替代增殖因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不仅改善了正常培养基或补充有生长因子的培养基中的MSC增殖，而且还可以替代IGF-1或bFGF，同时保持了细胞扩增的相同扩增水平。在一些实施方案中，弹性蛋白原可在低血清培养基中替代增殖因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原使培养基中的血清能够显著减少。弹性蛋白可用于降低MSC扩增期间对血清的依赖，这在临床上是有益的，并且可避免对于来自动物来源的制品的感染风险，例如不利的免疫应答。因此，弹性蛋白原可用于培养临床相关的细胞。在一些实施方案中，浓度为至少1μg/mL的弹性蛋白原也可显著增强MSC扩增。在一些实施方案中，与生长因子相比，弹性蛋白原可容许更大程度的血清减少。在一些实施方案中，与表面结合的弹性蛋白原相似，溶液中的弹性蛋白原促进了MSC增殖。在一些实施方案中，溶液中的弹性蛋白原可以在全血清培养基中替代IGF-1和bFGF。在一些实施方案中，在相当于基质包被浓度的弹性蛋白原的较高浓度下，溶液中的弹性蛋白原在功能上取代了表面结合蛋白，并且与全血清培养基中IGF-1和bFGF的协同效应相当。在一些实施方案中，弹性蛋白原改善了正常培养基或补充有生长因子的培养基中的MSC增殖。在一些实施方案中，弹性蛋白原改进了细胞扩增。本文实施方案中的弹性蛋白原使得MSC能够在弹性蛋白原介导的扩增期间保持细胞表型。在本文的一些实施方案中，弹性蛋白原通过αv整联蛋白调节MSC的附着和铺展。在本文的一些实施方案中，弹性蛋白原通过αv整联蛋白调节MSC的扩增。在本文所述方法的一些实施方案中，基质结合的弹性蛋白原和可溶性弹性蛋白原吸引了MSC。在一些实施方案中，其中将弹性蛋白原添加到溶液中，防止弹性蛋白原粘附至固相，其中固相是用于保持细胞的媒介物，如细胞培养容器。例如，可用蛋白包被诸如细胞培养容器之类的组织培养基质，以防止第二种蛋白(如溶液中的弹性蛋白原)粘附到组织培养基质上。例如，用于覆盖的蛋白可为血清蛋白。在进行细胞培养技术之前，可洗去过量的血清蛋白。在一些实施方案中，增殖因子和/或分化因子促进了成骨分化期间的MSC分化。在一些实施方案中，当MSC在扩增阶段暴露于弹性蛋白原时，成骨分化、成脂肪分化和成软骨分化的促进作用得到增强。在一些实施方案中，弹性蛋白原对MSC不具有促有丝分裂作用。在一些实施方案中，提供了一种治疗患有骨病或骨折的个体的方法，其中该方法包括向个体提供根据如本文所述的实施方案的任一种组合物，从而治疗个体的骨病或骨折。在一些实施方案中，通过本文实施方案中描述的任一种方法形成组合物。在一些实施方案中，形成细胞的方法包括使MSC与至少一种分化因子接触以用于诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞，其中在弹性蛋白原的存在下由MSC形成的中胚层谱系的细胞的数目大于当不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞的数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括(i)在含有弹性蛋白原的培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和bFGF的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在一些实施方案中，组合物为基本上纯的骨细胞形式。在一些实施方案中，组合物包含弹性蛋白原和/或透明质酸。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，向个体提供组合物，其中提供给个体的MSC总量为至少一百万至两百万个细胞/千克个体的体重。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原接触。在一些实施方案中，该方法还包括：在扩增阶段使MSC与至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子接触。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括IGF-1和/或bFGF。在一些实施方案中，该方法还包括：在分化阶段使MSC与分化因子接触。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，在MSC扩增和诱导期间暴露于弹性蛋白原可调节细胞功能性分化为骨(成骨分化)、脂肪(成脂肪分化)和软骨(成软骨分化)。在一些实施方案中，与未暴露于弹性蛋白原的细胞中的成骨分化相比，MSC扩增期间存在弹性蛋白原改进了成骨分化。在一些实施方案中，与在扩增和分化期间未暴露于弹性蛋白原的细胞相比，在扩增和分化期间添加弹性蛋白原提高了成骨分化。在一些实施方案中，与在MSC扩增和分化期间未暴露于弹性蛋白原的细胞相比，在MSC扩增或分化期间添加弹性蛋白原提高了成脂肪分化。在一些实施方案中，在弹性蛋白原不间断存在的情况下，观察到了益处。在一些实施方案中，与MSC扩增期间未暴露于弹性蛋白原的MSC细胞相比，MSC扩增期间存在弹性蛋白原改进了成软骨分化。在一些实施方案中，MSC从七天扩增期的第1至7天暴露于弹性蛋白原。在一些实施方案中，MSC从七天扩增期的第2至5天暴露于弹性蛋白原。在一些实施方案中，MSC从七天扩增期的第4至7天暴露于弹性蛋白原。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成骨细胞的方法，其中该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原和至少一种用于诱导由MSC形成骨细胞的因子接触。在一些实施方案中，该方法还包括：在扩增阶段，使MSC与至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子接触。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括IGF-1和/或bFGF。在一些实施方案中，至少一种用于诱导由MSC形成骨细胞的因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，扩增阶段独立于分化阶段完成。与在没有弹性蛋白原的情况下进行的方法相比，弹性蛋白原的存在获得了提高的成骨分化效率。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成脂肪细胞的方法，该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原和至少一种用于诱导由MSC形成脂肪细胞的因子接触。在一些实施方案中，该方法还包括：在扩增阶段，使MSC与至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子接触。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括IGF-1和/或bFGF。在一些实施方案中，至少一种用于诱导由MSC形成脂肪细胞的因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。在一些实施方案中，扩增阶段独立于分化阶段完成。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成软骨细胞的方法，该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原和至少一种用于诱导由MSC形成软骨细胞的因子接触。在一些实施方案中，该方法还包括：在扩增阶段，使MSC与至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子接触。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a。在一些实施方案中，至少一种用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括IGF-1和/或bFGF。在一些实施方案中，至少一种用于诱导由MSC形成软骨细胞的因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，扩增阶段独立于分化阶段完成。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供，其中透明质酸为部分或完全可溶的，并且其中弹性蛋白原为通过透明质酸连接在一起的单体形式。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成骨细胞的方法，其中该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原和至少一种用于诱导由MSC形成骨细胞的因子接触。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和/或bFGF的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，至少一种用于诱导由MSC形成骨细胞的因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，扩增阶段独立于分化阶段完成。与在没有弹性蛋白原的情况下进行的方法相比，弹性蛋白原的存在获得了提高的成骨分化功效。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成脂肪细胞的方法，该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原和至少一种用于诱导由MSC形成脂肪细胞的因子接触。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和/或bFGF的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，至少一种用于诱导由MSC形成脂肪细胞的因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。在一些实施方案中，扩增阶段独立于分化阶段完成。在一些实施方案中，与缺乏弹性蛋白原的培养物相比，在弹性蛋白原存在下，暴露于弹性蛋白原的细胞表现出提高的细胞内脂质形成。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成软骨细胞的方法，该方法包括(i)在扩增阶段，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成经扩增的MSC群；以及(ii)在分化阶段，使经扩增的MSC群与弹性蛋白原和至少一种用于诱导由MSC形成软骨细胞的因子接触。在一些实施方案中，在没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、bFGF、FGF-4、EGF、IGF-1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A和/或Wnt3a的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，在没有IGF-1和/或bFGF的情况下进行步骤(i)。在一些实施方案中，至少一种用于诱导由MSC形成软骨细胞的因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。在一些实施方案中，扩增阶段独立于分化阶段完成。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供，其中透明质酸为部分或完全可溶的，并且其中弹性蛋白原为通过透明质酸连接在一起的单体形式。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在一些实施方案中，与在没有弹性蛋白原的情况下扩增的细胞相比，在步骤(i)中暴露于弹性蛋白原的细胞表现出提高的糖胺聚糖水平。在一些实施方案中，在分化阶段，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。在一些实施方案中，在扩增和/或分化期间添加的弹性蛋白原改善了分化潜能。在一些实施方案中，在扩增和/或分化阶段添加的弹性蛋白原浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml或25ug/ml、或由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。
在一些实施方案中，提供了一种组合物，该组合物包含通过本文所述的任一项实施方案制造的细胞。在一些实施方案中，组合物包含基本上纯的骨细胞形式。在一些实施方案中，组合物包含基本上纯的脂肪细胞形式。在一些实施方案中，组合物包含基本上纯的软骨细胞形式。在一些实施方案中，组合物还包含弹性蛋白原和/或透明质酸。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有骨病或骨折的个体的方法，其中该方法包括向个体提供本文所述的任一项实施方案的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含弹性蛋白原。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种用于MSC分化以形成骨细胞或骨细胞前体的因子。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处，其中局部部位为骨病或骨折的区域。
在一些实施方案中，提供了一种治疗具有由疾病或创伤引起的脂肪损失或萎缩的区域的个体、或由手术或疾病引起的需要手术增强的个体的方法，其中该方法包括向个体提供本文所述的任一项实施方案的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含弹性蛋白原。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种用于MSC分化以形成脂肪细胞或脂肪细胞前体的因子。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处，其中局部部位为脂肪损失或萎缩的区域。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有软骨病的个体的方法，其中该方法包括向个体提供本文所述的任一项实施方案的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含弹性蛋白原。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种用于MSC分化以形成软骨细胞或软骨细胞前体的因子。在一些实施方案中，将组合物施用至个体的局部部位处，其中局部部位为软骨病的区域。
在一些实施方案中，提供了一种诱导MSC的增殖的方法，该方法包括使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，其中当存在弹性蛋白原时形成的MSC的数目大于当不存在弹性蛋白原时形成的MSC的数目，从而诱导MSC的增殖。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括(i)在含有弹性蛋白原的培养基中培养MSC以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在包含用于诱导MSC的增殖的因子的培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群。在一些实施方案中，在扩增阶段存在弹性蛋白原，并且不存在诱导MSC的扩增或增殖的因子。在一些实施方案中，在没有IGF1和/或bFGF的情况下进行该方法。在一些实施方案中，在没有弹性蛋白原且没有蛋白源的情况下进行扩增阶段。在一些实施方案中，蛋白源来自血清。
在一些实施方案中，提供了一种由MSC形成中胚层谱系的细胞的方法，其中该方法包括(i)向需要由MSC形成中胚层谱系的细胞的个体施用弹性蛋白原，从而在个体中形成弹性蛋白原的储库；以及(ii)向个体施用MSC，使得MSC接触弹性蛋白原的储库；从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。将MSC局部施用至需要细胞的区域。在一些实施方案中，个体患有由疾病或创伤引起的脂肪损失或萎缩。在一些实施方案中，个体患有骨病或骨折。在一些实施方案中，个体患有软骨病。
在一些实施方案中，提供了一种由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法。该方法包括使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原为单体形式。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。
在一些实施方案中，提供了一种根据本文的任一项实施方案的方法所形成的细胞组合物。形成细胞的方法包括使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原为单体形式。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在一些实施方案中，组合物为基本上纯的骨细胞形式。在一些实施方案中，组合物包含弹性蛋白原和/或透明质酸。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有骨病或骨折的个体的方法。该方法包括向个体提供根据本文任一项实施方案的组合物，从而治疗个体的骨病或骨折。细胞组合物由根据本文任一项实施方案的方法而形成。形成细胞的方法包括使MSC与下列物质接触：(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子以及(ii)弹性蛋白原，其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，将弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当MSC与细胞培养表面接触时，MSC能够接触弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及(ii)使MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。在一些实施方案中，弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。在一些实施方案中，弹性蛋白原为单体形式。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，中胚层谱系的细胞为骨细胞。在一些实施方案中，MSC为人MSC。在一些实施方案中，组合物为基本上纯的骨细胞形式。在一些实施方案中，组合物包含弹性蛋白原和/或透明质酸。在一些实施方案中，向个体提供组合物，其中提供给个体的组合物中的MSC的总量为至少一百万至两百万个细胞/千克个体的体重。在一些实施方案中，向个体提供组合物，其中提供给个体的组合物中的MSC的总量为至少一百万至两百万个细胞，并且其中将组合物施用至局部部位。因此，用弹性蛋白原预处理的细胞用于骨病的治疗。
在一些实施方案中，提供了一种包含弹性蛋白原的细胞培养基，其中培养基不包含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约10％的血清。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，血清为胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，培养基包含最低必需培养基(MEM)。在一些实施方案中，培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，提供了一种细胞培养基，其中细胞培养基包含弹性蛋白原，其中细胞培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的另外的因子。在一些实施方案中，细胞培养基没有胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，细胞培养基没有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2％至约10％的血清。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，血清为胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，细胞培养基不含血清。在一些实施方案中，细胞培养基包含最低必需培养基(MEM)。在一些实施方案中，培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。
在一些实施方案中，提供了一种细胞培养物，其中细胞培养物包含间充质干细胞；并且提供了一种包含弹性蛋白原的培养基，其中培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的另外的因子。在一些实施方案中，培养基不包含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，间充质干细胞为人间充质干细胞。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约10％的血清或约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，提供了一种细胞培养基，其中细胞培养基包含：至少一种分化因子；以及弹性蛋白原。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在一些实施方案中，提供了一种细胞培养物，其包含：间充质干细胞；并且提供了一种包含弹性蛋白原的培养基，其中培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的另外的因子。在一些实施方案中，用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括，其中用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，间充质干细胞为人间充质干细胞。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，培养基包含2％至约10％的血清或约2％至约6％的血清。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，提供了一种细胞培养物，其中细胞培养物包含间充质干细胞；并且提供了一种包含弹性蛋白原和至少一种分化因子的培养基。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。在一些实施方案中，至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
在一些实施方案中，提供了一种培养间充质干细胞的方法，该方法包括：a)在细胞培养基中培养间充质干细胞，其中培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的另外的因子；以及b)在存在弹性蛋白原的情况下，对间充质干细胞进行扩增。在一些实施方案中，从七天扩增期的第1至7天、第2至5天或第4至7天，使间充质干细胞暴露于弹性蛋白原。在一些实施方案中，用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。在一些实施方案中，用于诱导扩增或增殖的另外的因子包括IGF-1和bFGF。在一些实施方案中，间充质干细胞为人间充质干细胞。在一些实施方案中，培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。在一些实施方案中，弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。在一些实施方案中，弹性蛋白原与透明质酸交联。在一些实施方案中，培养基包含约2％至约10％的血清。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，该方法还包括：在包含至少一种分化因子的培养基中分化间充质干细胞。在一些实施方案中，弹性蛋白原的存在提高了分化效率。
实施例
实施例1：表面结合的弹性蛋白原可以在全血清培养基中替代IGF-1或bFGF
为了确定基质结合的弹性蛋白原对MSC增殖的作用，在具有和没有10％胎牛血清(FBS)并且任选地补充有IGF-1和/或bFGF的各种培养基配方中的空白或包被有弹性蛋白原的组织培养塑料板(TCP)上培养MSC(图1A)。细胞在除了不含血清的基础培养基之外的所有条件下增殖持续7天。在含有10％(v/v)血清的正常培养基中，包被有弹性蛋白原的TCP上的细胞数目比空白TCP上的细胞数目增加了39±3％。甚至在补充有IGF-1、bFGF或IGF-1和bFGF的培养基中也观察到弹性蛋白原介导的增殖分别显著增加了41±1％、16±2％和16±3％。在表面结合的弹性蛋白原和可溶性生长因子两者的存在下观察到了最高的细胞数目。
对弹性蛋白原和生长因子的促增殖活性进行比较，与在含有IGF-1和bFGF两者的培养基中的TCP上的细胞相比，在没有另外的因子的正常培养基中的弹性蛋白原基质上培养的MSC表现出了降低14±2％的扩增。然而，在正常培养基中的弹性蛋白原上生长的细胞比在具有IGF-1的培养基中的TCP上的细胞增殖多36±3％，并且类似于在具有bFGF的培养基中的细胞。这些发现表明，基质结合的弹性蛋白原不仅改进了正常培养基或补充有生长因子的培养基中的MSC增殖，而且还可以替代IGF-1或bFGF，同时保持了细胞扩增的相同扩增水平。
实施例2：基质结合的弹性蛋白原可以在低血清培养基中替代IGF-1和bFGF两者
在培养基中添加生长因子通常容许降低血清浓度而不阻碍MSC增殖。因此，进行实验以确定在通常由生长因子补偿的低血清环境中的基质结合的弹性蛋白原的促增殖益处(图1B)。在含有7％的FBS的培养基中，在TCP上生长的MSC也表现出了持续7天的增殖，尽管增殖程度低于先前在正常全血清培养基中观察到的程度。基质结合的弹性蛋白原在所有低血清条件下都显著促进了MSC增殖，不仅在未补充的培养基中(提高97±19％)，而且在已经含有IGF-1、bFGF或这两种生长因子的培养基中(分别提高49±1％、40±3％或29±3％)也如此。
更显著地，在这些低血清条件下，相对于在具有IGF-1或bFGF的培养基中的TCP上的细胞，在未补充的培养基中的弹性蛋白原上培养的MSC在7天内示出了显著更高的扩增(分别提高了59±15％和37±13％)，并且丰度与在具有这两种生长因子的培养基中的细胞相当。这些结果表明了表面包被的弹性蛋白原在低血清环境中替代IGF-1和bFGF两者以促进MSC增殖的能力。
实施例3：弹性蛋白原使培养基中的血清能够显著减少
由于弹性蛋白原的促增殖活性在具有7％(v/v)FBS的培养基中的持续性，研究了不影响弹性蛋白原介导的MSC扩增的血清减少的最大程度(图2A)。在TCP和包被有弹性蛋白原或纤连蛋白的TCP上，细胞在递减量的FBS(0至10％(v/v)的培养基溶液)中生长。在增殖的早期阶段，MSC可良好耐受血清减少。直到接种后3天，仅当培养基中完全没有血清时，空白表面或包被有纤连蛋白的表面上的MSC数目显著减少，并且当血清减少80％时，包被有弹性蛋白原的表面上的MSC数目显著减少。然而，随后，随着更大程度的血清减少，空白表面或包被有纤连蛋白的表面上的MSC数目逐渐下降。7天后，TCP或纤连蛋白上的MSC增殖分别减少了27±1％和15±0.1％，伴随的血清减少仅20％。相比之下，弹性蛋白原基质上的细胞扩增保持不受血清减少高达40％的影响。在该血清浓度下，与正常培养基中的MSC增殖相比，空白TCP和包被有纤连蛋白的TCP上的MSC增殖分别被抑制了35±1％和25±1％。
虽然纤连蛋白和弹性蛋白原同样促进了MSC在全血清培养基中的增殖，但是在血清减少时，纤连蛋白的益处显著减弱。在这些较低的血清浓度下，即培养基组成的2％(v/v)至8％(v/v)，包被有弹性蛋白原的表面始终且显著地使MSC增殖比空白表面增强了135±5％至309±12％，并且比包被有纤连蛋白的表面增强了76±4％至86±6％。这些发现强烈地表明了弹性蛋白原可以独特地在不损害MSC扩增水平的情况下补偿培养基中的大量血清减少。
实施例4：与生长因子相比，弹性蛋白原容许更大程度的血清减少
如由弹性蛋白原证明的，在低血清条件下促进高水平的干细胞生长的能力为通常归因于生长因子的性质。在此基础上，比较了基质结合的弹性蛋白原与IGF-1和bFGF的该功能性(图2B)。与先前的观察结果一致，后期增殖阶段，MSC对血清减少的作用更敏感。到接种后7天，在8％(v/v)FBS中、在含有生长因子的培养基中的TCP上的细胞数目不变，从而表明IGF-1和bFGF的组合存在可容许在培养期间轻微的(20％)血清减少。然而，在6％(v/v)FBS中，与在全血清培养基中的细胞数目相比，在具有生长因子的培养基中的细胞数目显著降低了25±2％。相比之下，当没有生长因子时，在血清减少40％后，弹性蛋白原上的细胞维持了未受损的增殖水平。在该血清浓度下，与IGF-1和bFGF联用相比，弹性蛋白原使MSC增殖改进了23±3％，从而表明在显著减少血清的条件下，在刺激MSC扩增方面，弹性蛋白原在功能上优于生长因子。
有趣的是，当在培养基中也存在生长因子时，类似地，表面结合的弹性蛋白原容许40％的血清减少，但仅在接种后5天时如此。在该时间点之后，细胞耐受最多20％的血清减少，而对增殖没有有害作用。这些结果暗示了血清补偿中涉及的替代途径的可能性，其可能取决于：相对于基质结合的弹性蛋白原，细胞暴露于可溶性生长因子。
实施例5：与表面结合的弹性蛋白原类似，溶液中的弹性蛋白原促进MSC增殖
为了确定弹性蛋白原的促有丝分裂活性是否取决于将其固定至培养基质和提供机械诱因，测试了溶液中的弹性蛋白原是否可实现与表面结合的蛋白相同的细胞扩增益处。当将弹性蛋白原添加到已经用正常培养基预培养的组织培养孔中时，蛋白没有粘附至孔表面，而是保留在溶液中，这很可能是由于诸如白蛋白之类的血清蛋白的表面阻断所致(图13A)。
与正常培养基相比，浓度低至1μg/mL的可溶性弹性蛋白原在7天内始终促进了MSC增殖(图13B)。然而，需要至少2.5μg/mL的弹性蛋白原浓度来刺激MSC增殖至与基质结合的弹性蛋白原相当的程度(图3A)。该浓度代表了基质包被有过量的(20μg/mL)弹性蛋白原期间，预期会粘附的蛋白的类似量。将弹性蛋白原溶液浓度提高至20μg/mL进一步在接种后7天使MSC增殖比基质结合的弹性蛋白原改进了80±8％。这些结果证明，溶液中高于阈值浓度的弹性蛋白原显著促进了MSC增殖。用弹性蛋白原补充培养基至少在功能上等同于用弹性蛋白原包被培养基质，并且能够暂时控制增殖水平的相关提高(图13C)。显然，类似于生长因子，弹性蛋白原在溶液中可以起到信号转导分子的作用，以主动增强MSC扩增。
实施例6溶液中的弹性蛋白原可以在全血清培养基中代替IGF-1和bFGF
进一步研究了溶液中的弹性蛋白原是否能够像基质结合的弹性蛋白原那样起到生长因子在诱发MSC的增殖反应中的作用(图3B)。先前观察到，在全血清培养基中，基质结合的弹性蛋白原可以替代IGF-1或bFGF。与正常培养基相比，单独添加IGF-1的培养基未提高MSC数目。因此，与正常培养基或含有IGF-1的培养基相比，1μg/mL或高于1μg/mL的弹性蛋白原溶液在7天内显著地引起提高的细胞增殖。这种提高水平是剂量依赖性的，从具有1μg/mL弹性蛋白原的18±5％至具有20μg/mL弹性蛋白原的69±7％。
可溶性弹性蛋白原同样可以替代培养基中的bFGF。在早期增殖期间(接种后3天)，在促进MSC扩增中，1μg/mL或高于1μg/mL的可溶性弹性蛋白原超过bFGF高达74±2％。对于MSC增殖，在随后的时间点直至接种后7天，5μg/mL的可溶性弹性蛋白原与bFGF相当；并且在20μg/mL时比bFGF的效力强18±5％。
此外，虽然在全血清培养基中，基质结合的弹性蛋白原在功能上劣于IGF-1和bFGF的累加益处，但是20μg/mL的可溶性弹性蛋白原支持的MSC扩增相当于含有两种生长因子的培养基中的MSC扩增。这些发现说明，溶液中的弹性蛋白原接近地起到了生长因子的促增殖能力。在5μg/mL时，弹性蛋白原可以替代IGF-1或bFGF，而20μg/mL的更高浓度可以在不丧失MSC增殖潜力的情况下充分替代两种生长因子。
实施例7：可溶性弹性蛋白片段或纤连蛋白不促进MSC增殖
为了确定溶液中的弹性蛋白原的有效促有丝分裂能力是否类似地被捕获在交联蛋白的片段内，使细胞在下列培养基中生长：正常培养基、补充有弹性蛋白原的培养基、或含有增加量的可溶性κ-弹性蛋白(κELN)或α-弹性蛋白(αELN)的培养基，其中可溶性κ-弹性蛋白或α-弹性蛋白是从天然弹性蛋白的局部碱或酸水解获得的肽(图3C)。κELN和αELN都未能刺激MSC增殖而超过正常培养基中的MSC增殖。相反地，20μg/mL至50μg/mL的较高浓度的αELN对细胞扩增的抑制高达14±1％。显然，溶液中的弹性蛋白原的促增殖作用需要完整的全长分子。
弹性蛋白原在溶液中繁殖细胞的这种能力对于基质蛋白是独特的。当将纤连蛋白以低至2μg/mL的浓度包被在底基上时，促进了MSC扩增，但当纤连蛋白以高达20μg/mL的浓度存在于溶液中时，则不会引发任何增殖反应(图3D)。这些结果强调了弹性蛋白原作为底部基质和作为可溶因子来调节MSC增殖的双重能力的稀有性。
实施例8：在弹性蛋白原介导的扩增期间，MSC保持细胞表型
诱导MSC扩增时的必要考虑是维持天然干细胞表型。流式细胞术分析表明，在具有和没有生长因子的全血清培养基或低血清培养基中，在包被有弹性蛋白原的表面上培养5天或7天的细胞表现出了特征性MSC标志物分布(图14A)。根据国际细胞治疗协会制定的MSC鉴定标准，在接种后5天，所有培养基配方中超过95％的细胞表达了阳性MSC标志物CD90、CD105和CD73，而超过98％的细胞不表达造血干细胞标志物CD34、CD45、CD11b、CD79a和HLA-DR。
在接种后7天，当在仅含有IGF-1或bFGF的培养基中的空白TCP上生长时，表达所有三种MSC标志物的细胞比例降低。在补充有IGF-1的培养基中仅有83.9±0.7％的细胞为CD105阳性，并且在补充有bFGF的培养基中有92.9±5.9％的细胞为CD105阳性。同样地，在含有IGF-1的培养基中仅有89.1±0.1％的细胞表达CD73。这些结果表明，在长期细胞扩增期间，IGF-1和bFGF在维持MSC表型方面起到组合作用。
值得注意的是，用弹性蛋白原包被的基质将这些次优培养基制剂中的细胞的MSC标志物表达水平恢复至必需的阈值。在所有情况下，均完全保留了MSC表型，其中基质结合的弹性蛋白原用于在全血清培养基或低血清培养基中替代一种或两种生长因子。类似地，在含有20μg/mL可溶性弹性蛋白原的培养基中生长的细胞也表现出特征性CD90+、CD105+、CD73+和谱系阴性表达谱(图14B)。
伴随细胞表面标志物的保留，在作为正常培养基或低血清培养基中的生长因子的替代物的基质结合的弹性蛋白原或可溶性弹性蛋白原的存在下扩增的MSC也表现出了多谱系分化的能力(图15)。当用成脂培养基诱导时，这些MSC产生了特征性细胞内脂滴，将脂滴用油红O染色时呈现亮红色。当用成骨培养基诱导时，这些MSC形成了矿化钙沉积物，通过茜素红S染色可显现为红色结节。当在微团团块培养物中用成软骨培养基诱导时，MSC示出了被阿尔新蓝染成蓝绿色的富含糖胺聚糖的区域，这是软成骨分化的指示。在非诱导样品中不存在这些组织学特征。总之，这些发现强烈地支持了弹性蛋白原在整个扩增过程中保持MSC表型和多能行为的能力。
实施例9：弹性蛋白通过αv整联蛋白调节MSC附着和铺展
为了确定整联蛋白受体参与弹性蛋白原对MSC行为的调节，分析了弹性蛋白原-MSC相互作用的二价阳离子依赖性。螯合剂EDTA的添加以剂量依赖性方式显著抑制了MSC对基质结合的弹性蛋白原的附着(图4A)。在5mM EDTA的存在下，结合至弹性蛋白原的MSC最大程度地降低了48.9±0.5％。此外，在无阳离子环境中，MSC显示出对弹性蛋白原的最小(20.0±2.1％)粘附(图4B)。随后添加多达0.5mM的Ca2+未改善MSC结合(13.7±1.0％)；Mg2+促进了适度的(51.8±2.6％)细胞附着，而Mn2+恢复了(76.1±3.2％)细胞与弹性蛋白原的粘附。这种选择性阳离子依赖性是整联蛋白介导的细胞结合机制的特征。
作为整联蛋白在MSC与弹性蛋白原相互作用中的角色的进一步证实，特异性整联蛋白阻断抗体阻碍了MSC在弹性蛋白原基质上的铺展(图4C至图4G)。抗αvβ5和抗αvβ3整联蛋白抗体以剂量依赖性方式抑制了细胞在弹性蛋白原上的铺展，直至达到最佳阻断浓度(图4C至图4D)。用泛抗αv整联蛋白亚基抗体可提高这种抑制(图4E)。通过与无抗体(92.5±2.6％)或IgG(90.1％)对照相比，纤连蛋白上最小程度抑制的铺展(78.8±2.3％)来验证抗体特异性，已知纤连蛋白可选择性地与α5和αv整联蛋白接合。在最佳抗体浓度下，抗αvβ5和抗αvβ3抗体将MSC在弹性蛋白原上的铺展分别显著降低了24.9±2.7％和22.7±2.8％(图4F)。抗αvβ5和抗αvβ3的组合添加进一步将铺展抑制了46.0±2.5％，这与被抗αv抗体抑制53.6±5.6％相似。细胞在弹性蛋白原上的铺展不受非特异性IgG抗体的影响，或在没有抗体的情况下不受影响。接种在弹性蛋白原上的MSC的代表性图像显示，在没有整联蛋白阻断抗体的情况下，大多数细胞具有以扁平、相暗(phase-dark)细胞体为特征的铺展形态(图4G)。相比之下，在抗整联蛋白抗体的存在下，明显更高比例的细胞表现出圆形、相亮(phase-bright)的未铺展形态。此外，基质结合的MSC的粘着斑蛋白染色显示了细胞中心和外周处的许多点状焦点复合物和条纹状焦点粘附。与粘附至牛血清白蛋白(BSA)上的细胞相比，粘附至弹性蛋白原的细胞的粘着斑增加了1.5±0.7倍/细胞(图4H)。总之，这些结果支持了αv整联蛋白在介导MSC与弹性蛋白原相互作用中的角色。
实施例10：弹性蛋白原通过αv整联蛋白调节MSC扩增
已经发现，是通过整联蛋白阻断而不是通过生长因子受体抑制减弱了可溶性弹性蛋白原介导的MSC扩增。生长因子的增殖优势主要归因于bFGF而不是IGF-1；因此，将bFGF选为功能上与弹性蛋白原相当。添加成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂SU-5402以剂量依赖性方式和时间依赖性方式阻碍了7天内的MSC增殖(图5A和图17A)。在正常培养基、含有bFGF的培养基或含有弹性蛋白原溶液的培养基中培养的细胞中，抑制程度显著不同。与无抑制剂对照相比，最显著的抑制始终发生在补充有bFGF的培养基中生长的细胞中，总的细胞数目减少高达78.9±0.7％。相比之下，补充有弹性蛋白原的培养基中细胞增殖的降低类似于正常培养基中的细胞增殖的降低，并且可能归因于SU-5402的非特异性作用。这些结果表明，与bFGF不同，可溶性弹性蛋白原通过FGFR非依赖性途径刺激MSC增殖。
还探究了7天内阻断整联蛋白受体(特别是αvβ3、αvβ5或所有αv亚基整联蛋白)的细胞增殖后果(图5B和图17B)。无论培养基的组成如何，抗体对αv整联蛋白活性的抑制普遍不同程度地减少了MSC增殖。然而，补充有弹性蛋白原的培养基中的细胞扩增的减少始终大于补充有bFGF的培养基或正常培养基中的细胞扩增的减少。与无抗体对照相比，包含抗αvβ3或抗αvβ5抗体将弹性蛋白原介导的MSC增殖分别显著抑制了30±1.3％和18.1±0.9％。添加抗αvβ3和抗-αvβ5抗体两者使细胞扩增减少了58.9±4.2％，这与通过泛抗αv抗体使细胞数目减少54.1±3.7％的量级相似。针对不被MSC表达的β8整联蛋白的对照抗体不影响细胞增殖。这些发现强烈表明，与基质结合的蛋白类似，溶液中的弹性蛋白原通过整联蛋白与MSC相互作用。此外，αv整联蛋白，特别是联用的αvβ3和αvβ5，参与了MSC扩增期间来自弹性蛋白原的促增殖信号的传播。因此，对下游信号转导分子的特异性抑制，即由FAK抑制剂14抑制粘着斑激酶(FAK)和由哌立福新抑制蛋白激酶B(PKB/AKT)，可将弹性蛋白原介导的增殖分别显著降低50.7±2.0％和21.3±0.5％(图4I)。这种降低远比由这些抑制剂的非特异性作用引起的降低更为显著，并且证实了整联蛋白FAK-PKB/AKT途径在转导MSC中的弹性蛋白原激活的促有丝分裂信号中的作用。
有趣的是，补充有bFGF的培养基中MSC增殖也受到存在整联蛋白阻断抗体的负面影响，尽管没有达到与在具有弹性蛋白原的培养物中观察到的相同程度。相对于正常培养基中的细胞，只有在存在抗αV抗体、或抗-αVβ3和抗-αVβ5抗体两者的情况下，才发生显著的抑制。这些结果进一步表明，bFGF介导的MSC增殖至少也部分依赖于αv整联蛋白信号转导。
实施例11：基质结合的弹性蛋白原和可溶性弹性蛋白原吸引MSC
还研究了弹性蛋白原吸引MSC的潜力，其可促进弹性蛋白原-细胞相互作用以用于细胞扩增。接种在中央区域的细胞的两侧等距离地为任选地用弹性蛋白原包被的区域(图6A)。与无蛋白对照相比，MSC在5天内优先向表面结合的弹性蛋白原迁移(图6B)。甚至在早期时间点(接种后1至3天)也显现出这种对弹性蛋白原的趋触性引力，其中细胞和弹性蛋白原之间的区域的细胞增加显著多于细胞和PBS对照之间的相应区域(图6C)。在接种后5天，与对照相比，45±8％的更多细胞已经迁移至包被有弹性蛋白原的区域(图6D)。如通过实验期间相似的总的细胞数目所示，与弹性蛋白原相关的较高的细胞丰度不是由于迁移细胞的增殖增加所致(图6E)。
类似地，在博伊登室设置中，MSC也向弹性蛋白原以扩散性梯度迁移。溶液中的弹性蛋白原诱导了剂量依赖性趋化反应，该趋化反应在抗αv整联蛋白抗体存在时消失(图6F)。阻断所有αv、αvβ3或αvβ5、或αvβ3和αvβ5整联蛋白的抗体有效地将弹性蛋白原导向的MSC迁移降低至可归因于随机细胞迁移率的水平(图6G)。相比之下，对照的抗β8抗体不影响MSC对弹性蛋白原的趋化性(图16A)。此外，αv抑制性抗体不改变无定向细胞迁移的水平，无定向细胞迁移中不存在化学引诱物；αv抑制性抗体也不抑制对IGF-1或bFGF生长因子的趋化性(图16B)。
这些结果表明了基质结合的弹性蛋白原和可溶性弹性蛋白原的强促细胞运动能力以及αvβ3和αvβ5整联蛋白在该过程中的必要和特异性参与。这种整联蛋白依赖性还涉及一种MSC归巢方法，该方法不同于趋化生长因子所使用的方法。
实施例12：弹性蛋白原对MSC的作用
探究了弹性蛋白原对MSC的成骨分化、成脂肪分化和成软骨分化的作用。如图8A所示，使细胞在扩增条件下生长，以研究成骨分化中的作用。扩增条件包括具有和没有弹性蛋白原的生长培养基。矿化钙的增加是成骨分化的指示。如图所示，诱导并暴露于TE的细胞显示出矿化钙浓度的提高。这些结果表明，与缺乏弹性蛋白原的培养物相比，可溶性弹性蛋白原诱导成骨分化的能力强。图8B也示出了用TE处理的细胞的成骨分化。如图所示，在TE的存在下诱导的细胞中显示出成骨分化。
图8C和图8D证实了弹性蛋白原在成脂分化中的作用。如图8C所示，与缺乏TE的培养物相比，在TE的存在下，被诱导进行成脂分化的细胞表现出细胞内脂质形成的增加。
图8E和图8F证实了弹性蛋白原在成软骨分化中的作用。如图8E和图8F所示，与在没有TE的情况下扩增的细胞相比，在TE的存在下扩增的细胞表现出提高的糖胺聚糖水平，条件是分化阶段不存在TE。在诱导阶段添加TE抑制了成软骨分化。
实施例13：弹性蛋白原对MSC的剂量响应
探究了弹性蛋白原的给药对MSC的成骨分化、成脂肪分化和成软骨分化的作用。如图9A和图9B所示，使细胞在不同浓度的TE中生长和分化，以研究TE浓度对成骨分化的影响。扩增条件包括不含TE、含有2μg/mL TE和含有20μg/mL TE的生长培养基。矿化钙的增加是成骨分化的指示。当使细胞在至少2μg/mL TE中生长并在20μg/mL TE中诱导时，观察到最大程度的成骨分化。
图9C和9D证实了在成脂分化中，弹性蛋白原浓度在扩增和诱导阶段的作用。如图9C所示，在扩增和诱导两个阶段，当TE以浓度为20μg/ml TE存在时，被诱导进行成脂肪分化的细胞表现出细胞内脂质形成的增加。
图9E和图9F证实了弹性蛋白原在成软骨分化中的作用。如图9E和图9F所示，在20μg/ml TE中扩增但在没有TE的情况下诱导的细胞表现出最高程度的糖胺聚糖生成。在诱导阶段存在低至2μg/ml的TE显著抑制了成软骨分化。
实施例14：细胞弹性蛋白原记忆的持续时间
在MSC成骨分化、成脂肪分化和成软骨分化期间，探索弹性蛋白原记忆的作用。在扩增条件下(无TE、第2至5天有TE，第3至6天有TE以及第4至7天有TE)对细胞进行扩增。如图10A至图10B所示，示出了成骨分化，当在增殖期间的所有天暴露于TE时，细胞表现出矿化钙，具有与在扩增后期阶段中弹性蛋白原暴露相关的最大作用。相比之下，只有当弹性蛋白原存在于扩增的早期阶段时才观察到弹性蛋白原的促成软骨分化作用(图10C至图10D)。
实施例15：整联蛋白抑制弹性蛋白原对MSC成骨的作用
还探究了整联蛋白抑制弹性蛋白原对成骨的作用。如图所示，使细胞在下列分化条件下生长：在没有TE的情况下进行诱导以及在具有TE的情况下进行诱导。扩增条件包括：没有TE；抗av；抗a5、抗av/a5；TE；TE与抗av；TE与抗a5；以及TE与抗av/a5(图11A)。如所示，在分化期间存在弹性蛋白原的细胞具有较高水平的矿化钙。在抗av、抗a5或上述两者以及弹性蛋白原的存在下扩增的细胞丧失了这种较高的成骨倾向(图11A)。然后在扩增条件下不使用TE时，对细胞进行检验。在下列分化条件下：无ab；抗av、抗a5和抗av/a5，使细胞在没有TE的情况下进行扩增。如所示，在没有抗av、抗a5或抗av/a5的情况下分化的细胞具有增加的矿化钙。然而，在分化期间，在具有或没有抗av的条件下，用TE诱导的细胞具有更多的矿化钙(图11B)。然后在TE的存在下对细胞进行扩增(图11C)。如所示，当用TE扩增细胞并用TE进行诱导时，用无Ab或用具有抗av的TE处理的细胞具有提高的矿化钙水平(图11C)。然后在TE和抗av的存在下对细胞进行扩增(图11D)。如所示，然后在无Ab、存在抗av、抗a5或抗av/a5的情况下对细胞进行分化。在抗a5的存在下、或抗av和抗a5两者的存在下分化的细胞具有减少的矿化钙。然而，用TE和抗av两者进行扩增并在TE和抗av两者的存在下分化的细胞具有增加的矿化钙(图11D)。然后在扩增阶段，用TE和抗a5对细胞进行处理。然后在无Ab、具有抗av、抗a5和抗av/a5的情况下，对细胞进行分化。如所示，在具有或没有TE(扩增)的情况下对细胞进行诱导。如所示，在存在或不存在抗av的情况下用TE处理的细胞显示出矿化钙的增加(图11E)。然后用TE和抗av/a5对细胞进行扩增(图11F)。如所示，细胞在抗av的存在下进行分化，并用TE进行诱导获得了矿化钙的增加。
实施例16：弹性蛋白原和透明质酸对MSC成骨分化的作用。
在缺乏或存在弹性蛋白原的情况下，使细胞在不同分子量透明质酸(HA)的存在下生长。如所示，在弹性蛋白原和HA的存在下、而不是仅有HA的存在下生长的细胞获得了矿化钙的增加(图12A)。如图12A和图12B所示，示出了成骨分化，当暴露于弹性蛋白原时，细胞显示出矿化钙。
讨论
高效且成本有效地扩增诸如MSC之类的治疗性细胞的能力具有显著的临床和商业利益。与大多数哺乳动物细胞一样，MSC增殖受细胞与ECM的粘附以及与诸如细胞因子、激素和生长因子之类的可溶性因子的相互作用的调节。因此，离体MSC增殖的策略通常将基质蛋白移植在培养基上和/或将生长因子掺入培养基中。
弹性蛋白本身不仅显著增加了MSC增殖，而且相当于或超过了特定生长因子的性能。在MSC培养中使用的生长因子为IGF-1和bFGF，这两者也是市售可得的MSC生长培养基的一部分。作为表面包被层，弹性蛋白原比IGF-1显著更好地促进了细胞增殖，与正常培养基相比，单独的IGF-1不增加细胞数目。该发现与IGF-1促进MSC迁移和早期生长但不改进长期MSC增殖的报告相一致。此外，在全血清培养基中，基质结合的弹性蛋白原在功能上与bFGF相当，并且在低血清培养基中，基质结合的弹性蛋白原在刺激增殖反应方面优于bFGF。弹性蛋白原刺激增殖的高能力能够在全血清培养基中代替IGF-1或bFGF，并且能够在低血清培养基中代替IGF-1和bFGF两者，而不损害MSC的扩增潜力。此外，用诸如弹性蛋白原之类的稳定重组蛋白代替生长因子还减轻了与使用生长因子相关的一些挑战，如来自动物组织的生长因子的有限可用率9、高成本以及在培养基中的相对不稳定性。
甚至在低血清培养基中观察到的弹性蛋白原的效力也表明了弹性蛋白原在MSC培养期间替代一部分血清的潜力。MSC生长培养基中包含血清，因为血清不仅由于存在诸如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白之类的基底膜蛋白而促进细胞附着，而且由于生长因子、激素和脂质5,8而诱导增殖。因此弹性蛋白原补偿血清减少的能力与其已知的细胞粘附功能以及其相当于生长因子的高促有丝分裂活性相一致。弹性蛋白原使培养基中的血清含量显著降低了40％，这是其他ECM蛋白所不能表现出的独特性质。已经表明，在全血清培养基中，通常在干细胞培养中用作粘附分子的纤连蛋白可类似于弹性蛋白原而刺激MSC增殖，但即使在减少20％的血清培养基中，纤连蛋白的益处也会减弱。
弹性蛋白原的实质性血清补偿反映了通常与生长因子相关的另一益处。如实例中所证实的，弹性蛋白原的能力超过了IGF-1和bFGF组合的能力。在没有弹性蛋白原的情况下，在含有8％(v/v)FBS的补充有生长因子的培养基中可维持MSC增殖，但在6％(v/v)FBS时MSC增殖显著降低，这与在市售可得的生长培养基(ATCC)中使用bFGF和IGF-1与7％(v/v)FBS的情况相一致。有趣的是，包含弹性蛋白原以及两种生长因子可以将该最小血清阈值降低至6％(v/v)FBS，但仅到接种后5天为止。据推测，来源于基质结合的弹性蛋白原和可溶性生长因子的信号经由替代途径传播，该替代途径如对各配体的相对暴露所定义。
使用弹性蛋白原以降低MSC扩增期间对血清的依赖性在临床上也是有益的。血清通常可能携带造成感染风险的污染物，并且作为动物来源的制品，可能触发不利的免疫应答29。因此，美国食品和药品管理局以及欧洲药品管理局建议避免使用血清来培养临床相关的细胞。
如同其他基质蛋白一样，弹性蛋白原的功能通常归因于细胞粘附至分子时触发的信号，诸如整联蛋白之类的细胞表面受体将机械刺激转换成化学信号以产生细胞应答。与这种范例一致，弹性蛋白原的促增殖潜力仅归因于分子的弹性、糙度和细胞粘附性。因此，弹性蛋白原交联为更硬的材料减弱了其增殖益处。与这种想法相反，在此示出了溶液中高于1μg/mL浓度的弹性蛋白原也显著增强了MSC扩增。在相当于基质包被浓度的较高浓度下，溶液中的弹性蛋白原在功能上取代了表面结合蛋白，并且与全血清培养基中IGF-1和bFGF的协同效应相当。这些发现表明，弹性蛋白原的促有丝分裂活性可以独立于其对基质弹性和形态的影响。虽然MSC在整个细胞周期中的进展都是锚定依赖性的，但是细胞不需要特异性地附着和铺展在诸如弹性蛋白原之类的效应蛋白上以发生促增殖信号转导。
此外，溶液中的弹性蛋白原的调节行为很可能不依赖于机械转导过程。作为单个分子，弹性蛋白原在～20nm的长度将排除与多个细胞的机械连接。在本文所述的实验设置中，弹性蛋白原也不能组装成更大的细胞连接结构体，因为7天增殖试验的时间尺度显著短于形成弹性纤维所需的最少12至14天。此外，在这些试验中使用的可溶性弹性蛋白原的最高浓度(20μg/mL)比弹性蛋白原自组装的临界浓度阈值低50倍。
弹性蛋白原为全长粘附基质蛋白的罕见实例，其可作为可溶性因子调节细胞行为。相比之下，在本文的实例中显示，溶液中的纤连蛋白没有促进MSC增殖，这可能是由于纤连蛋白的细胞受体结合位点仅在吸附至诸如胶原基质之类的表面时才暴露，因此细胞识别性差。溶液中的弹性蛋白原的作用可能是通过其细胞结合区域的固有可接近性实现的。在这项工作之前，来源于ECM蛋白的可溶性信号转导因子，包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，被认为局限于由部分蛋白水解释放的肽，称为外基质活化素(matrikines)。据推测，这些外基质活化素通过蛋白水解暴露的细胞结合基序与细胞相互作用。如本文实例中所述，已经发现弹性蛋白原的MSC调节性质明显不同于弹性蛋白片段的MSC调节性质，并且可能需要全长分子内多个细胞相互作用区域的协同参与。
体外产生MSC可影响细胞表型，这进而会影响功能和治疗潜力。因此，重要的是弹性蛋白原介导的MSC增殖的扩增不损害干细胞性质。如本文实例中所示，已经发现在基质结合的弹性蛋白原或基于溶液的弹性蛋白原的存在下扩增的细胞表达了特征性表面标志物，并且可以进行三系分化，这与国际细胞治疗协会对MSC的定义标准相一致。弹性蛋白原在扩增期间维持MSC表型的这种能力相当于联用的生长因子的能力。在足够高的浓度下，单独的bFGF可保留MSC标志物表达并延迟与增殖相关的向干细胞特性的变化；然而，长期使用可提高分化而降低包括CD105在内的表面标志物的表达。与这一发现一致，在本文所述的实例中显示，仅补充有IGF-1或bFGF的培养基降低了预期由MSC组成性表达的CD105和/或CD73的水平。包含弹性蛋白原可显著防止MSC群内的这种表型变异。
干细胞的表型维持是从可溶性因子或粘附蛋白中发出信号的。在这项工作之前，已经提出弹性蛋白原可通过MSC感测基质弹性来促进干细胞特性。然而，溶液中的弹性蛋白原的类似保护功能再次强烈地表明了一种可供选择的锚定非依赖性信号传导机制，其类似于生长因子的信号转导机制。
从本文所述的实验中发现，弹性蛋白原可以通过细胞表面整联蛋白αvβ3和αvβ5直接与MSC相互作用。这些整联蛋白由骨髓衍生的MSC表达，被弹性蛋白原内的不同区域识别，并且涉及弹性蛋白原与其他细胞类型如成纤维细胞的相互作用。当被激活时，整联蛋白聚集为粘着斑的一部分，在我们的研究中通过对核心粘着斑蛋白的染色来进行检测。粘着斑将细胞外基质蛋白与肌动蛋白细胞骨架连接，并且不仅传递来自细胞环境的机械信号，而且还传递化学信号。
虽然弹性蛋白原可以通过整联蛋白直接介导MSC附着和铺展，但是进一步探究了另一种假设，即弹性蛋白原可间接引起MSC增殖，特别是当在溶液中时；或虽然通过非整联蛋白途径，但是可直接引起MSC增殖。例如，弹性蛋白原可增强内源性生长因子或血清衍生的生长因子(如bFGF)的促有丝分裂活性，因为许多ECM蛋白可以结合生长因子并增强对生长因子受体的定位。可供选择地，弹性蛋白原本身可激活FGFR，因为一些ECM蛋白内的固有结构域可以充当生长因子受体的非常规配体。在这些情况中，添加FGFR抑制剂SU-5402会抵消弹性蛋白原和bFGF的促增殖功能。然而，与bFGF不同，弹性蛋白原对MSC的扩增不受与SU-5402毒性相关的非特异性抑制的影响，因此可以通过FGFR非依赖性途径进行。在此基础上，可以排除bFGF作为效应蛋白、或FGFR作为弹性蛋白原介导的MSC增殖中的信号转导受体的单独参与。此外，抗体对弹性蛋白原介导的细胞增殖的抑制表明，αv整联蛋白，即αvβ3和αvβ5参与了该过程。已经显示整联蛋白结合固定的配体和可溶的配体两者足以引发信号转导事件，从而表明基质结合的弹性蛋白原和可溶性弹性蛋白原导向MSC事件的共同机制。然而，不能忽视诸如弹性蛋白结合蛋白之类的其他细胞受体参与了介导溶液中的弹性蛋白原的调节作用。
在弹性蛋白原导向的MSC迁移中观察到类似的双重作用模式，其中表面弹性蛋白原具有粘附ECM蛋白的趋触性质，而可溶性弹性蛋白原相当于趋化因子和生长因子的趋化能力。虽然这些信号被认为是独立的并且可能是冲突的，但是弹性蛋白原可以独特地提供生物物理和生物化学两种定向刺激以引发可能更强的MSC归巢响应。也已在其他细胞类型报道的弹性蛋白原的这种促细胞运动能力可以在生物医学应用中被开发，以募集驻留MSC或施用的MSC从而改善治疗效果。
弹性蛋白原介导的MSC募集也依赖于蛋白与αv整联蛋白的相互作用。阻断αvβ3或αvβ5的抗体取消了该过程，这强烈表明两种整联蛋白都必需参与。先前在MSC归巢中涉及的整联蛋白亚基限于α4、α5或β1，并且主要受同源受体的趋化因子激活的调节。弹性蛋白原-αv整联蛋白相互作用代表了新发现的支持MSC迁移的机制。此外，αv阻断抗体对生长因子介导的趋化性的非抑制作用表明了弹性蛋白原和生长因子募集MSC的不同的、特定的模式，至少在细胞表面水平上如此。
通过配体占据的整联蛋白激活启动了多个信号转导级联，包括介导细胞存活、粘附、铺展、增殖和迁移的丝氨酸/苏氨酸激酶、小GTP酶和肌醇脂质途径。bFGF结合至MSC中的其FGF受体后，也可激活这些途径中的一些途径。此外，据信，αv整联蛋白与生长因子受体的结合是下游增殖信号的持续生长因子激活所必需的。作为支持，即使存在生长因子，阻断αv整联蛋白也可抑制细胞生长，这反映了我们的发现，即αv整联蛋白抑制也减弱了bFGF介导的MSC扩增。整联蛋白和FGF受体共有的细胞内信号转导级联的重叠代表了与弹性蛋白原相当的可能机制，因此可以替代诸如bFGF之类的生长因子的促有丝分裂、保护和促细胞运动功能(图7)。
虽然其他ECM蛋白具有类似的结合整联蛋白的能力，但是弹性蛋白原的功能似乎是该蛋白所独有的，特别是在MSC迁移、增殖、生长因子替代和血清补偿方面。据信，虽然细胞粘附和细胞骨架组织的能力相似，但并非所有ECM-整联蛋白相互作用都同样地促进细胞周期进程。例如，αvβ3整联蛋白可以与生长因子受体下游的衔接蛋白特异性结合，并且协同地激活并维持长期的促有丝分裂途径，从而使得诸如弹性蛋白原之类的αvβ3配体比非配体更有效地增强细胞增殖。此外，诸如纤连蛋白之类的基质蛋白可粘附多达20种类型的整联蛋白，这可以驱动对细胞增殖的相反作用并减弱或避免靶细胞应答。因此，弹性蛋白原狭窄的整联蛋白选择性可能有助于弹性蛋白原对MSC行为的特定结果。
弹性蛋白原对MSC的强促有丝分裂和促细胞运动作用是令人惊讶的，因为这不像bFGF那样天然存在于干细胞微环境中。有人提出，在以下情况中，弹性蛋白原的这种生长因子样行为变得生物相关：需要快速MSC归巢和提高MSC增殖；即胚胎发育和伤口修复期间，这与游离弹性蛋白原在细胞外环境中积聚的唯一时期相一致。在胎儿至新生儿阶段，峰值弹性蛋白原合成与广泛的bFGF表达共存，这可募集MSC并驱动MSC的增殖以进行正常发育。在发育期间，bFGF对弹性蛋白原产生的已知抑制作用可能确实是预防由bFGF和弹性蛋白原的累积作用所引起的不受控制的干细胞数目的调节机制。在损伤期间，上调的弹性蛋白原分泌可补充组织中低水平的bFGF，以快速刺激伤口愈合所必需的MSC迁移和增殖。
材料和方法
细胞培养
在37℃下，在加湿的常氧培养箱中，将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的人骨髓衍生的MSC在正常培养基中培养至最多10次群体倍增，其中正常培养基由具有10％(v/v)FBS(Life Technologies)和2.4mM L-谷氨酰胺(Lonza)的α最低必需培养基(α-MEM)(Lonza)组成。如所指出的，在正常培养基中补充15ng/mL IGF-1(Life Technologies)和/或125pg/mL bFGF(Life Technologies)，相当于ATCC推荐培养基中的生长因子浓度。一旦细胞达到70％至80％融合，就对细胞进行传代。
用ECM蛋白包被基质
如所指出的，在4℃时用20μg/mL重组人弹性蛋白原(Elastagen)或2μg/mL纤连蛋白(Sigma-
Figure BDA0002675591370000772
)的PBS(10mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.4)溶液对组织培养塑料孔进行包被处理过夜。除去蛋白溶液，并在细胞接种前用PBS洗涤孔三次以除去未结合的蛋白。
补充有ECM蛋白的培养基
如所指出的，对正常培养基补充2.5μg/mL至20μg/mL弹性蛋白原(Elastagen)、2.5μg/mL至50μg/mL的κELN(来自Elastin Products Company的可溶性人皮肤弹性蛋白)或2.5μg/mL至50μg/mLαELN(来自Elastin Products Company的可溶性人肺弹性蛋白)。为了防止蛋白粘附在组织培养基质上，在补充培养基中接种细胞之前，用正常培养基将孔预培养5小时以使表面能够被血清蛋白阻断。
为了确认表面阻断，将弹性蛋白原添加到预培养的或空白孔表面，在室温下保持1小时。用PBS洗涤三次以除去过量的蛋白。通过酶联免疫吸附试验检测结合的弹性蛋白原的水平，使用1:2000小鼠抗弹性蛋白BA4第一抗体(Sigma-
Figure BDA0002675591370000771
)，在室温下保持1小时，使用1:5000山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶-缀合的第二抗体(Sigma-
Figure BDA0002675591370000781
)，在室温下保持1小时，并且使用40mM 2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(Sigma-
Figure BDA0002675591370000782
)溶液在含有0.01％(v/v)H2O2的0.1mM乙酸钠、0.05mM NaH2PO4、pH 5中可视化，在室温保持1小时。读取405nm处的样品吸光度。
细胞增殖
将MSC的亚融合烧瓶用0.05％(v/v)胰蛋白酶-EDTA(Sigma-
Figure BDA0002675591370000783
)在37℃处理5分钟，以从培养容器中剥离(lift off)粘附细胞。用两体积的含血清生长培养基来中和胰蛋白酶。将细胞以270g离心5分钟，并重新悬浮于所需培养基中。在正常培养基或补充培养基中，以5000细胞/cm2的密度将细胞接种在空白组织培养塑料孔或包被有蛋白的组织培养塑料孔中。每2天更换培养基。在特定时间点后，用3％(v/v)甲醛在室温下将细胞固定20分钟，用PBS洗涤，然后用0.1％(w/v)结晶紫的0.2M MES缓冲液染色1小时。用反渗透水洗掉过量的染色剂四次。用10％(v/v)乙酸溶解保留的染色剂，并且读取指示细胞丰度的570nm处的样品吸光度值。将样品吸光度值减去基线值(对应于无血清培养基中的细胞数目、或接种后第1天的细胞数目)，并表示为接种后第7天所有样品中的最高吸光度的分数。
EDTA抑制
将MSC以1.5×105个细胞/cm2的密度接种在含有0至9mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma-
Figure BDA0002675591370000784
)的无血清α-MEM中的包被有弹性蛋白原的孔中。将细胞在37℃培养1小时，然后用PBS洗涤以除去未结合的细胞。将结合的细胞固定、染色并测定570nm处的吸光度，如增殖试验中所述的那样。相对于一组具有已知细胞数目的标准物来确定细胞附着的百分率。
阳离子反向添加
用无阳离子的PBS洗涤MSC，以270g离心5分钟，并重悬于无阳离子的PBS中。在0至0.5mM阳离子(Mg2+、Ca2+或Mn2+)的存在下，将细胞以1.5×105个细胞/cm2的密度接种在包被有弹性蛋白原的孔上，并在37℃培养45分钟。如前所述，将结合的细胞固定并染色，并对细胞附着进行定量。
细胞铺展
将MSC以7.5×104个细胞/cm2的密度接种于无血清α-MEM中的包被有弹性蛋白原的孔上，在37℃保持1.5小时。将细胞固定，并使用Zeiss Axio Vert.A1显微镜通过相差显微镜法进行观察。在AxioCam ICm1单色照相机上拍摄图像。将细胞分类为铺展的(即，表现出相暗、扁平形态的细胞)或未铺展的(即，呈现圆形且相亮的细胞)。通过计数每个视野中铺展的细胞的百分率来对细胞铺展进行量化。对于每个样品重复获得三个视野。
免疫荧光染色
将MSC接种在包被有20μg/mL弹性蛋白原或10mg/mL BSA的TCP上，保持1天。用荧光标记的抗粘着斑蛋白单克隆抗体检测粘着斑，同时使用粘着斑染色试剂盒(MerckMillipore)用DAPI对细胞核进行染色。在悉尼大学的澳大利亚显微镜学和显微分析中心，用Olympus FV1000共焦显微镜观察样品并成像。通过将每个视野中的对应于经染色的粘着斑的像素数除以细胞数目，然后对每个样品求平均值，从而计算每个细胞的粘着斑密度。
整联蛋白和FGFR抑制
为了阻断特异性整联蛋白活性，在MSC铺展或增殖试验期间向培养基中添加高达20μg/mL的抗αv或抗αvβ3整联蛋白抗体
Figure BDA0002675591370000792
或高达1:250稀释的抗αvβ5整联蛋白抗体
Figure BDA0002675591370000793
选择抗αv(5μg/mL)、抗αvβ3(5μg/mL)和抗αvβ5(1:500稀释)整联蛋白抗体的最佳抑制浓度。还包括抗β8整联蛋白(5μg/mL)
Figure BDA0002675591370000791
或非特异性小鼠IgG(5μg/mL)(Sigma-
Figure BDA0002675591370000794
)作为阴性抗体对照。为了阻断FGFR活性，在MSC增殖期间向培养基中添加至多20μM的SU-5402 FGFR抑制剂。在每次培养基更换期间补充整联蛋白和FGFR抑制剂。
通过趋触性的细胞迁移
将聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注到3D打印的模具中，以产生具有三个矩形开口的圆形形状，其中中间的矩形与两侧矩形等距。将PDMS模板置于孔板内，并紧紧压在孔表面上，以形成不透水的密封。分别用弹性蛋白原溶液(20μg/mL)或PBS填充顶部和底部的矩形室，并经空气干燥过夜。将MSC(1.2×106个细胞/cm2)接种到中间腔室中并使其附着至少2小时。除去PDMS模板，用正常培养基覆盖培养孔。在长达5天中，每天用NucBlueTM LiveReadyProbesTM试剂(Life Technologies)将细胞染色15分钟，用PBS洗涤一次，用正常培养基覆盖，并使用Nikon Ti-E活细胞显微镜在360/460nm荧光下成像。使用ImageJ软件通过相对荧光区域对细胞迁移到由弹性蛋白原或PBS覆盖物限定的区域中进行定量。
通过趋化性的细胞迁移
根据供应商的说明书，使用荧光96孔博伊登室试验系统(QCM趋化性细胞迁移试验，Millipore)来测量趋化性。将正常培养基、补充有弹性蛋白原的培养基或补充有生长因子的培养基添加到孔板的下部腔室，而在正常培养基中，将MSC以14,300个细胞/cm2接种至上部腔室。如所指出的，将整联蛋白阻断抗体以优化的浓度添加到具有细胞的上部腔室中。对迁移通过渗透膜进入下部腔室的细胞进行分离和定量。通过从每个实验结果中减去无定向细胞迁移的程度(其中没有向下部腔室添加化学引诱物)来计算归一化的细胞迁移。
流式细胞术
对在各种培养基配方中并在空白或包被有蛋白的组织培养孔上培养5天或7天的MSC进行胰蛋白酶化并沉淀细胞团。用0.22μm过滤的FACS缓冲液(5％v/v FBS的PBS溶液)洗涤细胞团块，并以270g再离心5分钟。将细胞重悬于FACS缓冲液中，至100μL总体积中100,000个细胞的浓度，并使用人间充质干细胞验证流式试剂盒(R&D
Figure BDA0002675591370000801
)探查MSC标记物表达。使用在组织培养塑料板上的标准生长培养基中培养的MSC制备同种型和未染色的对照样品。使用BDTM Biosciences LSR II流式细胞仪系统对细胞进行分析。通过细胞前向散射与侧向散射的比率以及散射高度与宽度的比率来确定单态(singlet)细胞，而通过1:20碘化丙啶的排除来鉴定活细胞。仅对单态活细胞的标志物表达进行分析。
细胞分化
在各种培养基配方中并在空白或包被有蛋白的组织培养孔上，使MSC生长7天。对经扩增的细胞进行收集，在TCP上重新接种，并按照制造商的说明书，使用hMSC Adipogenic
Figure BDA0002675591370000811
(Lonza)分化为成脂细胞系、使用hMSC Osteogenic
Figure BDA0002675591370000812
(Lonza)分化为成骨细胞，并使用hMSC Chondrogenic
Figure BDA0002675591370000813
(Lonza)分化为成软骨细胞系。
为了证实成脂肪分化，将已经诱导25天的细胞用PBS洗涤，用10％(v/v)福尔马林固定30分钟，然后用水洗涤。将细胞与60％(v/v)异丙醇一起培养5分钟，并用1.8mg/mL油红O的异丙醇溶液对细胞内脂滴染色20分钟。用水洗涤5次以除去过量的染色剂。
为了证实成骨分化，如前所述，对已经诱导14天的细胞进行固定，并用茜素红S染色矿化钙沉积物。用Zeiss Axio Vert.A1显微镜，使用AxioCam 105彩色照相机对来自成脂实验和成骨实验的细胞进行成像。
为了证实成软骨分化，将已经诱导14天的细胞团块用PBS洗涤，包埋在含有0.85％(w/v)NaCl的1.5％(w/v)琼脂中，并用10％(v/v)福尔马林固定过夜。将样品在70％(v/v)乙醇中脱水1天，然后进行石蜡包埋、切片、安装在载玻片上，用阿尔新蓝(pH 2.5)染色1小时，并用核固红(Nuclear Fast Red)复染。用Olympus VS120载玻片扫描仪对样品进行成像。
统计分析
将所有数据报告为平均值±平均值的标准误差(n＝3)。使用方差分析(ANOVA)来计算统计比较。将显著性设定为p<0.05。在图中由星号表示统计学显著性：*(p<0.05)，**(p<0.01)或***(p<0.001)。
结果总结
弹性蛋白原对间充质干细胞(MSC)分化的作用
在MSC扩增和诱导期间暴露于弹性蛋白原调节了细胞成为骨、脂肪和软骨的功能分化。
在MSC扩增期间，弹性蛋白原的存在将成骨潜力提高了42％。在分化期间添加弹性蛋白原，使成骨分化提高了55％。在扩增和分化阶段都添加弹性蛋白原，使成骨分化进一步提高了多达131％。
在MSC扩增期间添加弹性蛋白原，使成脂肪分化提高了33％，而在MSC分化期间添加弹性蛋白原，使成脂肪分化提高了19％。在扩增和分化阶段都添加弹性蛋白原，使成脂肪分化提升了69％至85％，具有与不间断的弹性蛋白原存在相关的更大益处。
类似地，在MSC扩增期间添加弹性蛋白原，使成软骨分化提高了134％。相比之下，无论在扩增阶段是否存在弹性蛋白原，在成软骨分化期间添加弹性蛋白原都有效地抑制了该过程。在分化期间添加弹性蛋白，使MSC成软骨分化降低了63％(当细胞在没有弹性蛋白原的情况下扩增时)至80％(当细胞在具有弹性蛋白原的情况下扩增时)。
弹性蛋白原记忆
在MSC扩增期间，在先暴露于弹性蛋白原对三系分化具有延迟作用。
对于成骨分化，在扩增和分化期间的弹性蛋白原暴露之间存在较小的时间间隙(最多2天)获得了更好的结果。与从七天扩增期的第2至5天暴露的细胞相比，从七天扩增期的第4至7天暴露于弹性蛋白原的MSC显示出提高了24％的成骨分化。
对于成软骨分化，在扩增的早期阶段暴露于弹性蛋白原改善了结果。与从扩增期的第4至7天暴露的细胞相比，从扩增期的第2至5天暴露于弹性蛋白原的MSC显示出提高了71％的成软骨分化。
对弹性蛋白原作用的抑制
弹性蛋白原在MSC扩增期间的促成骨作用是由αv和α5整联蛋白介导的。在MSC扩增期间，当在没有弹性蛋白原的情况下诱导细胞时，包含抗αv整联蛋白抗体以及弹性蛋白原使成骨分化的促进作用减弱了28％；包含抗α5整联蛋白抗体以及弹性蛋白原使成骨分化的促进作用减弱了41％；并且包含抗αv和抗α5整联蛋白抗体以及弹性蛋白原使成骨分化的促进作用减弱了40％；当在具有弹性蛋白原的情况下诱导细胞时，则分别减弱了26％、39％和50％。
在MSC分化期间，包含一种或两种抗整联蛋白抗体阻碍了细胞进行成骨分化的能力。然而，当在弹性蛋白原的存在下诱导细胞时，添加抗αv整联蛋白抗体不影响MSC成骨分化，从而表明在MSC分化期间，弹性蛋白原的促成骨作用不需要αv整联蛋白。
弹性蛋白原与透明质酸的促成骨作用
在含有弹性蛋白原和透明质酸的配方中，弹性蛋白原是MSC成骨分化的主要促进剂。与在TCP上生长的细胞相比，在90％弹性蛋白原和10％透明质酸的包被层上生长的细胞显示出提高了60％至88％的成骨分化。在单独的弹性蛋白原上生长的细胞显示出113％的较高成骨分化，而在单独的透明质酸上生长的细胞显示出与在TCP上生长的细胞相似水平的成骨分化。
应当理解，本说明书中公开和限定的实施方案可扩展到文本或附图中提到或显而易见的两个或以上单独特征的所有可供选择的组合。所有这些不同的组合构成了所公开的实施方案的各种可供选择的方面。
序列表
<110> 艾尔建制药国际有限公司
<120> 干细胞的扩增和分化
<130> P6083311PCT
<150> AU 2018900663
<151> 2018-03-01
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 698
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala
50 55 60
Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro
100 105 110
Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
115 120 125
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val
165 170 175
Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val
210 215 220
Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val
260 265 270
Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
275 280 285
Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly
290 295 300
Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
305 310 315 320
Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala
325 330 335
Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile
355 360 365
Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly
370 375 380
Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val
385 390 395 400
Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val
435 440 445
Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly
450 455 460
Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
465 470 475 480
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly
485 490 495
Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala
500 505 510
Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly
515 520 525
Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly
530 535 540
Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala
545 550 555 560
Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val
565 570 575
Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val
580 585 590
Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
595 600 605
Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu
610 615 620
Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile
625 630 635 640
Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu
645 650 655
Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala
660 665 670
Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys
675 680 685
Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
690 695
<210> 2
<211> 733
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Ser Met Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly
1 5 10 15
Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu
20 25 30
Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly
35 40 45
Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro
50 55 60
Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
85 90 95
Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val
100 105 110
Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly
115 120 125
Gly Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly
130 135 140
Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly
145 150 155 160
Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro
165 170 175
Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly
180 185 190
Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro
195 200 205
Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr
210 215 220
Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
225 230 235 240
Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala
260 265 270
Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
275 280 285
Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly
290 295 300
Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
305 310 315 320
Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro
325 330 335
Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly
355 360 365
Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly
370 375 380
Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly
385 390 395 400
Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu
405 410 415
Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr
420 425 430
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly
435 440 445
Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
450 455 460
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala
465 470 475 480
Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly
485 490 495
Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala
500 505 510
Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly
515 520 525
Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val
530 535 540
Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala
545 550 555 560
Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp
565 570 575
Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val
580 585 590
Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val
595 600 605
Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro
610 615 620
Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
625 630 635 640
Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu
645 650 655
Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu
660 665 670
Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala
675 680 685
Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly
690 695 700
Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly
705 710 715 720
Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
725 730
<210> 3
<211> 698
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala
50 55 60
Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro
100 105 110
Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
115 120 125
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val
165 170 175
Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val
210 215 220
Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val
260 265 270
Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
275 280 285
Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly
290 295 300
Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
305 310 315 320
Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala
325 330 335
Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile
355 360 365
Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly
370 375 380
Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val
385 390 395 400
Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val
435 440 445
Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly
450 455 460
Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
465 470 475 480
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly
485 490 495
Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala
500 505 510
Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly
515 520 525
Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly
530 535 540
Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala
545 550 555 560
Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val
565 570 575
Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val
580 585 590
Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
595 600 605
Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu
610 615 620
Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile
625 630 635 640
Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu
645 650 655
Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala
660 665 670
Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys
675 680 685
Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
690 695
<210> 4
<211> 660
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Gly Gly Val Pro Gly Ala Val Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val
35 40 45
Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln
50 55 60
Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro
65 70 75 80
Gly Val Tyr Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly
85 90 95
Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys
100 105 110
Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro
115 120 125
Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala
130 135 140
Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu
145 150 155 160
Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala
165 170 175
Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Phe Gly
195 200 205
Ala Val Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala
210 215 220
Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala
245 250 255
Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val
260 265 270
Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile
275 280 285
Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Gly Phe Gly Ala
290 295 300
Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr
305 310 315 320
Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val
325 330 335
Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro
340 345 350
Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
355 360 365
Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val
405 410 415
Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val
420 425 430
Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro
435 440 445
Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala
465 470 475 480
Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val
485 490 495
Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala
500 505 510
Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys
515 520 525
Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala
530 535 540
Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly
565 570 575
Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly
580 585 590
Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala
595 600 605
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly
610 615 620
Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly
625 630 635 640
Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly
645 650 655
Arg Lys Arg Lys
660
<210> 5
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 5
Ser Met Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly
1 5 10 15
Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu
20 25 30
Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly
35 40 45
Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro
50 55 60
Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
85 90 95
Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val
100 105 110
Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly
115 120 125
Gly Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly
130 135 140
Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly
145 150 155 160
Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro
165 170 175
Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly
180 185 190
Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro
195 200 205
Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr
210 215 220
Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
225 230 235 240
Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala
260 265 270
Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
275 280 285
Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly
290 295 300
Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
305 310 315 320
Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro
325 330 335
Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly
355 360 365
Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly
370 375 380
Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly
385 390 395 400
Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu
405 410 415
Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr
420 425 430
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly
435 440 445
Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
450 455 460
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala
465 470 475 480
Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly
485 490 495
Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala
500 505 510
Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly
515 520 525
Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val
530 535 540
Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala
545 550 555 560
Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp
565 570 575
Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val
580 585 590
Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val
595 600 605
Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Val Gly Ile Pro Gly
610 615 620
Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala
625 630 635 640
Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly
645 650 655
Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
660 665 670
Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala
675 680 685
Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly
690 695 700
Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly
705 710 715 720
Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
725 730
<210> 6
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人供序列的说明:合成多肽"
<400> 6
Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala
50 55 60
Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro
100 105 110
Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val
115 120 125
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe
145 150 155 160
Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val
165 170 175
Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val
210 215 220
Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val
260 265 270
Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala
275 280 285
Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly
290 295 300
Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
305 310 315 320
Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala
325 330 335
Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
340 345 350
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile
355 360 365
Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly
370 375 380
Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val
385 390 395 400
Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val
435 440 445
Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly
450 455 460
Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
465 470 475 480
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly
485 490 495
Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala
500 505 510
Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly
515 520 525
Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly
530 535 540
Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala
545 550 555 560
Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val
565 570 575
Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val
580 585 590
Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
595 600 605
Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu
610 615 620
Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile
625 630 635 640
Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu
645 650 655
Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala
660 665 670
Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys
675 680 685
Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
690 695
<210> 7
<211> 660
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 7
Met Gly Gly Val Pro Gly Ala Val Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Gly Val Ala Asp
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly
35 40 45
Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro
50 55 60
Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu
65 70 75 80
Pro Gly Val Tyr Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala Arg Phe Pro
85 90 95
Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro
100 105 110
Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly
115 120 125
Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys
130 135 140
Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys
145 150 155 160
Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Gly Lys Ala
165 170 175
Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Phe Gly
195 200 205
Ala Val Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala
210 215 220
Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala
245 250 255
Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val
260 265 270
Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile
275 280 285
Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Gly Phe Gly Ala
290 295 300
Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr
305 310 315 320
Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val
325 330 335
Gly Ala Gly Phe Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro
340 345 350
Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
355 360 365
Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val
405 410 415
Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val
420 425 430
Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro
435 440 445
Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala
465 470 475 480
Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val
485 490 495
Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala
500 505 510
Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys
515 520 525
Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala
530 535 540
Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly
565 570 575
Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly
580 585 590
Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala
595 600 605
Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly
610 615 620
Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly
625 630 635 640
Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly
645 650 655
Arg Lys Arg Lys
660
<210> 8
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 8
Ser Ala Met Gly Gly Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu
20 25 30
Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu
50 55 60
Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val
65 70 75 80
Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys
85 90 95
Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu
115 120 125
Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg
130 135 140
Lys Arg Lys
145
<210> 9
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 9
Ser Ala Met Gly Ala Leu Val Gly Leu Gly Val Pro Gly Leu Gly Val
1 5 10 15
Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg
20 25 30
Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln
35 40 45
His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala
50 55 60
Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly
65 70 75 80
Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly
85 90 95
Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala
100 105 110
Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val
115 120 125
Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly
145 150 155 160
Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg
165 170 175
Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly
180 185 190
Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
195 200
<210> 10
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 10
Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly
20 25 30
Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly
35 40 45
Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
50 55 60
<210> 11
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 11
Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro
1 5 10 15
Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe
20 25 30
Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
35 40 45
<210> 12
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 12
Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu
1 5 10 15
Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro
20 25 30
Arg Val
<210> 13
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 13
Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu
1 5 10 15
Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro
20 25 30
Arg Phe
<210> 14
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 14
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val
1 5 10 15
Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val
20 25 30
Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg
35 40 45
Arg Ser Leu Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln
50 55 60
His Leu Pro Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly
85 90 95
Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly
100 105 110
Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala
115 120 125
Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val
130 135 140
Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly
165 170 175
Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg
180 185 190
Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly
195 200 205
Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
210 215
<210> 15
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 15
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val
1 5 10 15
Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val
20 25 30
Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala
35 40 45
Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly
50 55 60
Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala
65 70 75 80
Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala
85 90 95
Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly
100 105 110
Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val
130 135 140
Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro
145 150 155 160
Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys
165 170 175
Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys
180
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<221> 来源
<223> /note="未知的说明:弹性蛋白原基序"
<400> 16
Gly Arg Lys Arg Lys
1 5

Claims (81)

1.一种由间充质干细胞(MSC)形成中胚层谱系的细胞的方法，所述方法包括：
使MSC与下列物质接触：
(i)至少一种用于诱导由MSC形成中胚层谱系的细胞的分化因子；以及
(ii)弹性蛋白原，
其中存在弹性蛋白原时由MSC形成的中胚层谱系的细胞数目大于不存在弹性蛋白原时形成的中胚层谱系的细胞数目，
从而由MSC形成中胚层谱系的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述弹性蛋白原布置在细胞培养容器的细胞培养表面上，以使得当所述MSC与所述细胞培养表面接触时，所述MSC能够接触所述弹性蛋白原。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述弹性蛋白原部分地或完全地溶解在用于培养MSC的细胞培养基中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
(i)当不存在诱导分化的因子时，使MSC与弹性蛋白原接触以诱导MSC的增殖，从而形成MSC群；以及
(ii)使所述MSC群与至少一种分化因子接触，以诱导由MSC和弹性蛋白原形成中胚层谱系的细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
(i)在含有弹性蛋白原的第一培养基中培养MSC，以形成经弹性蛋白原培养的MSC群；以及
(ii)在第二培养基中培养所述经弹性蛋白原培养的MSC群，其中所述第二培养基包含至少一种用于诱导MSC分化的分化因子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述弹性蛋白原不与丝蛋白一起提供。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述弹性蛋白原以部分或完全可溶的、与透明质酸的复合物的形式提供，其中通过透明质酸将弹性蛋白原单体连接在一起。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中胚层谱系的细胞为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MSC为人MSC。
11.一种细胞的组合物，所述细胞通过根据前述权利要求中任一项所述的方法而形成。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物为基本上纯的骨细胞形式。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含弹性蛋白原和/或透明质酸。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
15.一种治疗患有骨病或骨折的个体的方法，所述方法包括：
向所述个体提供根据权利要求11至14中任一项所述的组合物，从而治疗所述个体的骨病或骨折。
16.根据权利要求15所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，其中提供给所述个体的所述组合物中的MSC的总量为至少一百万至两百万个细胞/千克所述个体的体重。
17.根据权利要求15所述的方法，其中向所述个体提供所述组合物，其中提供给所述个体的所述组合物中的MSC的总量为至少一百万至两百万个细胞，并且其中将所述组合物施用至局部部位。
18.一种包含弹性蛋白原的细胞培养基，其中所述细胞培养基不包含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
19.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。
20.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2％至约10％的血清。
21.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2％至约6％的血清。
22.根据权利要求20或21中任一项所述的细胞培养基，其中所述血清为胎牛血清(FBS)。
23.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基不含血清。
24.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含最低必需培养基(MEM)。
25.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含L-谷氨酰胺。
26.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
27.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
28.根据权利要求27所述的细胞培养基，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
29.一种包含弹性蛋白原的细胞培养基，其中所述培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的因子。
30.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基不含TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。
31.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基不含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
32.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。
33.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2％至约10％的血清。
34.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2％至约6％的血清。
35.根据权利要求33或34中任一项所述的细胞培养基，其中所述血清为胎牛血清(FBS)。
36.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基不含血清。
37.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含最低必需培养基(MEM)。
38.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含L-谷氨酰胺。
39.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
40.根据权利要求29所述的细胞培养基，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
41.根据权利要求40所述的细胞培养基，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
42.一种细胞培养物，其包含：
-间充质干细胞；以及
-包含弹性蛋白原的培养基，其中所述培养基不包含胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
43.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述间充质干细胞为人间充质干细胞。
44.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。
45.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
46.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
47.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述培养基包含2％至约10％的血清或约2％至约6％的血清。
48.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述培养基不含血清。
49.根据权利要求42所述的细胞培养物，其中所述培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
50.一种细胞培养基，其包含：
至少一种分化因子；以及
弹性蛋白原。
51.根据权利要求50所述的细胞培养基，其中所述至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。
52.根据权利要求50所述的细胞培养基，其中所述至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。
53.根据权利要求50所述的细胞培养基，其中所述至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
54.根据权利要求50所述的细胞培养基，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
55.根据权利要求50所述的细胞培养基，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
56.一种细胞培养物，其包含：
-间充质干细胞；以及
-包含弹性蛋白原的培养基，其中所述培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的因子。
57.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。
58.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述间充质干细胞为人间充质干细胞。
59.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。
60.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
61.根据权利要求60所述的细胞培养物，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
62.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述培养基包含2％至约10％的血清或约2％至约6％的血清。
63.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述培养基不含血清。
64.根据权利要求56所述的细胞培养物，其中所述培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原、约2％至约10％的FBS、最低必需培养基(MEM)和L-谷氨酰胺。
65.一种细胞培养物，其包含：
-间充质干细胞；以及
-包含弹性蛋白原和至少一种分化因子的培养基。
66.根据权利要求65所述的细胞培养物，其中所述至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐和/或β-甘油磷酸盐。
67.根据权利要求65所述的细胞培养物，其中所述至少一种分化因子包括h-胰岛素、地塞米松、吲哚美辛和/或3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。
68.根据权利要求65所述的细胞培养物，其中所述至少一种分化因子包括地塞米松、抗坏血酸盐、胰岛素-转铁蛋白-硒、丙酮酸钠和/或脯氨酸。
69.根据权利要求65所述的细胞培养物，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
70.根据权利要求65所述的细胞培养物，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
71.一种培养间充质干细胞的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养基中培养间充质干细胞，其中所述培养基不包含用于诱导MSC的扩增或增殖的因子；以及
b)在存在弹性蛋白原的情况下，对所述间充质干细胞进行扩增。
72.根据权利要求71所述的方法，其中在七天扩增期的第1至7天、第2至5天或第4至7天，使所述间充质干细胞暴露于弹性蛋白原。
73.根据权利要求71所述的方法，其中用于诱导MSC的扩增或增殖的因子包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-4、EGF、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、HGF、VEGF、VEGF-A或Wnt3a。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述间充质干细胞为人间充质干细胞。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述培养基包含约2.5μg/mL至约20μg/mL的弹性蛋白原。
76.根据权利要求71所述的方法，其中所述弹性蛋白原以与透明质酸的复合物的形式提供。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述弹性蛋白原与所述透明质酸交联。
78.根据权利要求71所述的方法，其中所述培养基包含约2％至约10％的血清。
79.根据权利要求71所述的方法，其中所述培养基包含约2％至约6％的血清。
80.根据权利要求71所述的方法，其中所述培养基不含血清。
81.根据权利要求71所述的方法，其中所述方法还包括：在另一种包含至少一种分化因子的培养基中分化所述间充质干细胞。
CN201980018475.4A 2018-03-01 2019-03-01 干细胞的扩增和分化 Pending CN111868230A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2018900663 2018-03-01
AU2018900663A AU2018900663A0 (en) 2018-03-01 Expansion and differentiation of stem cells
PCT/EP2019/055186 WO2019166643A1 (en) 2018-03-01 2019-03-01 Expansion and differentiation of stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111868230A true CN111868230A (zh) 2020-10-30

Family

ID=65686842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980018475.4A Pending CN111868230A (zh) 2018-03-01 2019-03-01 干细胞的扩增和分化

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20190275087A1 (zh)
EP (1) EP3759214A1 (zh)
JP (1) JP2021514676A (zh)
CN (1) CN111868230A (zh)
AU (1) AU2019228726A1 (zh)
BR (1) BR112020017494A2 (zh)
CA (1) CA3091946A1 (zh)
MX (1) MX2020008897A (zh)
WO (1) WO2019166643A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574436A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司 一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996162B (zh) * 2020-09-08 2022-03-04 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种成软骨分化培养基及其应用
CN112920995A (zh) * 2021-03-31 2021-06-08 赵峻岭 一种间充质干细胞培养血清加油包及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120238020A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-20 Mitchell W Beau Megakaryocyte and Platelet Production from Stem Cells
US20140140950A1 (en) * 2011-03-28 2014-05-22 John S. Arnone Business methods, processes and systems for collection, cryogenic storage and distribution of cosmetic formulations from an obtained stem cell based biological material
CN103841990A (zh) * 2011-09-30 2014-06-04 悉尼大学 弹性纤维的体内合成

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2151883C (en) 1992-12-22 2009-04-07 Anthony Steven Weiss Synthetic tropoelastin
AUPO811797A0 (en) 1997-07-18 1997-08-14 University Of Sydney, The Tropoelastin derivatives
AUPP472398A0 (en) 1998-07-17 1998-08-13 University Of Sydney, The Protease susceptibility II
JP4388483B2 (ja) * 2004-12-27 2009-12-24 株式会社ツーセル 間葉系幹細胞の骨化及び／又は軟骨化促進剤と骨化及び／又は軟骨化促進方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120238020A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-20 Mitchell W Beau Megakaryocyte and Platelet Production from Stem Cells
US20140140950A1 (en) * 2011-03-28 2014-05-22 John S. Arnone Business methods, processes and systems for collection, cryogenic storage and distribution of cosmetic formulations from an obtained stem cell based biological material
CN103841990A (zh) * 2011-09-30 2014-06-04 悉尼大学 弹性纤维的体内合成

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAO HU 等: ""The Influence of Elasticity and Surface Roughness on Myogenic and Osteogenic-Differentiation of Cells on Silk-Elastin Biomaterials"" *
冯颖: ""大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究"" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574436A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司 一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3759214A1 (en) 2021-01-06
US20190275087A1 (en) 2019-09-12
CA3091946A1 (en) 2019-09-06
MX2020008897A (es) 2021-01-08
JP2021514676A (ja) 2021-06-17
BR112020017494A2 (pt) 2020-12-22
AU2019228726A1 (en) 2020-09-10
WO2019166643A1 (en) 2019-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rothrauff et al. Tissue-specific bioactivity of soluble tendon-derived and cartilage-derived extracellular matrices on adult mesenchymal stem cells
Bian et al. Enhanced MSC chondrogenesis following delivery of TGF-β3 from alginate microspheres within hyaluronic acid hydrogels in vitro and in vivo
Guo et al. In vitro generation of an osteochondral construct using injectable hydrogel composites encapsulating rabbit marrow mesenchymal stem cells
Ansari et al. Alginate/hyaluronic acid hydrogel delivery system characteristics regulate the differentiation of periodontal ligament stem cells toward chondrogenic lineage
Lin et al. Influence of decellularized matrix derived from human mesenchymal stem cells on their proliferation, migration and multi-lineage differentiation potential
Wang et al. Self-assembling peptide hydrogel scaffolds support stem cell-based hair follicle regeneration
Carvalho et al. Cultured cell‐derived extracellular matrices to enhance the osteogenic differentiation and angiogenic properties of human mesenchymal stem/stromal cells
Zha et al. Recent developed strategies for enhancing chondrogenic differentiation of MSC: impact on MSC-based therapy for cartilage regeneration
Alshehri et al. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells
CA2533422C (en) Skin regeneration system
CN111868230A (zh) 干细胞的扩增和分化
Yaylaci et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells on glycosaminoglycan-mimetic peptide nanofibers
Hung et al. Multi-peptide presentation and hydrogel mechanics jointly enhance therapeutic duo-potential of entrapped stromal cells
Chang et al. The promotion of chondrogenesis in adipose-derived adult stem cells by an RGD-chimeric protein in 3D alginate culture
Yang et al. Differentiated adipose‐derived stem cell cocultures for bone regeneration in RADA16‐I in vitro
Noh et al. A dual delivery of substance P and bone morphogenetic protein-2 for mesenchymal stem cell recruitment and bone regeneration
CN107001488B (zh) 硫酸乙酰肝素
Casanova et al. Chondrogenesis-inductive nanofibrous substrate using both biological fluids and mesenchymal stem cells from an autologous source
Ning et al. Enhancement of migration and tenogenic differentiation of Macaca mulatta tendon-derived stem cells by decellularized tendon hydrogel
Huang et al. Enhanced migration of wharton’s jelly mesenchymal stem cells grown on polyurethane nanocomposites
Zhang et al. A novel approach via surface modification of degradable polymers with adhesive DOPA-IGF-1 for neural tissue engineering
JPWO2006112390A1 (ja) 脂肪由来前駆細胞およびその利用
CN113383068A (zh) 可植入性构建体及其制造方法和用途
US20170252411A1 (en) Compositions Derived from Platelet Lysates and Uses in Vascularization
He et al. Stem Cell Differentiation Mediated by Biomaterials/Surfaces

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201030

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication