JPWO2006112390A1 - 脂肪由来前駆細胞およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
また、虚血性心疾患(狭心症や心筋梗塞)は冠動脈の狭窄や閉塞によって心筋が虚血や壊死に陥った状態であり、陳旧性心筋梗塞は、慢性心不全の原因として重要である。慢性心不全に対しては不整脈や心筋梗塞の再発、動脈硬化の進展の防止等を目的とした薬物治療が行われるが、壊死した心筋を回復させる有効な治療法は存在しない。近年、顆粒球コロニー刺激因子を用いて骨髄細胞を心筋障害部位に動員し、血管や心筋の再生を促すことで心機能を改善させる試みがなされ始めたが、副作用の問題などから治療薬としては定着していない。
しかしながら、従来の幹細胞移植法において移植されてきた血管内皮前駆細胞は、増殖能が低いため体外での培養による細胞数確保が難しいとされてきた。また、虚血性心疾患・末梢動脈閉塞症・肺高血圧症などの炎症性疾患を持つ患者においては、患者体内の血管内皮前駆細胞機能や細胞生存能・分化能が低下していると報告されている。
脂肪組織は近年、多能性幹細胞の供給源として大きな注目を集めている(非特許文献9)。脂肪組織は成熟脂肪細胞および脂肪間質細胞からなり、後者は多様な細胞系譜に分化しうることがわかっている(非特許文献10〜17)。脂肪間質細胞には接着性があり、培養下で増殖可能なため、脂肪組織の小塊から培養により大量の脂肪間質細胞を得ることは容易である(非特許文献18)。しかしながら、脂肪細胞から効率よく血管内皮前駆細胞を誘導する培養技術は確立していない。
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次に、脂肪間質細胞由来の前駆細胞の細胞性機能を調べた所、マトリゲルアッセイでは、AMおよびVEGFはいずれも単独で脂肪間質細胞の血管新生促進能力を増強し、AMとVEGFとの併用は、AMまたはVEGFのいずれか単独の場合と比べて、脂肪間質細胞の血管新生促進能力をさらに増強することが明らかとなった。
また、本発明者らは、モノクロタリン(MCT)による肺高血圧症モデルラットに対する、本発明の前駆細胞の効果について検討を行った。MCT注射から3日後に脂肪由来前駆細胞を静脈内に投与したところ、前駆細胞の一部は肺血管に組み込まれ、肺での血管生成に加わることが明らかとなった。さらに、本発明の細胞をMCTラットに投与することによって、肺毛細血管密度の低下は減弱し、MCT誘発性肺高血圧症を有意に回復させるとともに、MCTラットの生存期間を改善することも明らかとなった。
また、本発明の前駆細胞を心筋梗塞モデルラットに投与することによって、心筋梗塞域の縮小と血行動態の改善がみられることが明らかとなった。また本発明の前駆細胞は、新生児ラットの心筋細胞と共培養することにより、自己拍動を起こすことを確認した。さらに、心筋特異的マーカーを用いることで、本発明の前駆細胞が心筋細胞へ分化していることを明らかにした。
即ち、本発明は、以下の〔1〕〜〔15〕を提供するものである。
〔1〕多分化能を有する細胞を以下の(i)〜(iii)のいずれかに記載の増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法。
(i)アドレノメデュリン(AM)
(ii)血管内皮増殖因子(VEGF)
(iii)アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子(VEGF)
〔2〕多分化能を有する細胞が、脂肪間質細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞である、〔1〕に記載の方法。
〔3〕多分化能を有する細胞が、脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞である、〔1〕に記載の方法。
〔4〕多分化能を有する細胞が、哺乳類動物由来の細胞である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法により製造された前駆細胞。
〔6〕〔5〕に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法。
〔7〕〔5〕に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させる方法。
〔8〕〔5〕に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の細胞を新生または再生させる方法。
〔9〕増殖因子を前駆細胞と同時に対象に投与する工程を含む、〔6〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕増殖因子が以下の(i)〜(iii)のいずれかに記載の増殖因子である、〔9〕に記載の方法。
(i)アドレノメデュリン(AM)
(ii)血管内皮増殖因子(VEGF)
(iii)アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子(VEGF)
〔11〕障害組織が、虚血性心疾患、または肺高血圧症における障害組織である、〔6〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕〔5〕に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤。
〔13〕〔5〕に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤。
〔14〕〔5〕に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤。
〔15〕障害組織が、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、または肺高血圧症における障害組織である、〔12〕〜〔14〕のいずれかに記載の薬剤。
本発明において、「多分化能を有する細胞」としては、例えば脂肪間質細胞、胚性幹細胞(ES細胞)、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞が挙げられるが、種々の種類の細胞に分化する能力を有している細胞であれば、本発明の多分化能を有する細胞に含まれる。本発明の多分化能を有する細胞としては、好ましくは脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞を挙げることが出来る。また、成熟脂肪細胞から分化された脂肪間質細胞も、脂肪間質細胞として本発明に使用することが出来る。本発明の多分化能を有する細胞は、好ましくは哺乳動物由来の細胞が挙げられるが、特に由来は限定されるものではない。「人為的に多分化能を獲得した細胞」としては、例えば遺伝子操作を含むクローン技術により多分化能を獲得した体細胞を挙げることができる。
本発明において「アドレノメデュリン」とは、血小板中のcAMPの増加活性を指標にヒト褐色細胞腫組織抽出液より発見された強力な降圧作用を有する生理活性ペプチドである。「アドレノメデュリン」の前駆体のcDNAの塩基配列を配列番号:1に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。
活性型の「アドレノメデュリン」は、該「アドレノメデュリン」前駆体の一部分であり、配列番号:3に示すアミノ酸配列を有する。本発明において用いられるアドレノメデュリンは、好ましくは配列番号:3に示すアミノ酸配列を有するが、それらに限定されず、配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も挙げることが出来る。また、配列番号:1に記載の塩基配列の447位から602位に相当するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、活性型「アドレノメデュリン」として挙げることができる。
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「アドレノメデュリン」の塩基配列(配列番号:1)もしくはその一部をプローブとして、また「アドレノメデュリン」の塩基配列(配列番号:1)に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、「アドレノメデュリン」と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる「アドレノメデュリン」と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
上記、アドレノメデュリンおよび血管内皮増殖因子の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。
本発明の培養方法において、脂肪間質細胞を用いる場合、分化誘導前に、実施例のように前培養を行ってもよいが、この工程を省略することもできる。この前培養工程において、多分化能を維持した状態で、未分化脂肪間質細胞を増殖させることが可能である。
前培養における、培地条件は特に制限されるものではなく、当業者に公知の培地および添加物(好ましくはヘパリンまたは抗生物質)を用いることが出来る。前培養の期間は特に制限されるものではなく、好ましくは7日〜28日の期間を挙げることが出来る。
また、本発明の方法において、脂肪間質細胞以外の多分化能を有するヒト由来の細胞を用いる場合は、実施例の脂肪間質細胞の例を参考に、適宜、培養皿を選択することが出来る。
また、本発明の実施例において、前培養工程および分化誘導後の培養工程の詳細な培養条件が開示されているが、本発明の方法の培養条件はこれら特定の条件に限定されるものではなく、一般的に許容される条件を取りうる。
本発明の方法における培養期間は、特に制限はないが、本発明の方法において、脂肪間質細胞を用いる場合、好ましくは7日〜28日の期間を挙げることが出来る。
本発明において製造させた分化細胞が、前駆細胞であることは、各組織の細胞マーカー、または各細胞の機能を指標に確認できる。
各組織の細胞マーカーとして、好ましくは血管内皮細胞マーカー、心筋細胞マーカーを用いることが出来る。血管内皮細胞マーカーとしては、モノクローナル抗体: CD31(クローンTLD-3A12、Becton Dickinson)、血管内皮(VE)-カドヘリン(クローンF-8、Santa Cruz)、CD45(クローンOX-1、Becton Dickinson)、CD34(クローンICO115、Santa Cruz)およびフォンビルブラント因子(vWF)に対するウサギポリクローナル抗体(Dako)を挙げることが出来る。心筋細胞マーカーとしては、troponin I, ANP, connexin43を挙げることが出来る。
心筋前駆細胞の機能は、心筋細胞新生を誘導するか否かをインビトロまたはインビボで確認することによって確認が出来る。例えば、実施例のように、新生児ラットの心筋細胞と共培養することにより、培養細胞が自己拍動を行うかどうか確認してもよいし、心筋梗塞モデルラットに本発明の細胞を投与して、心筋細胞が新生されるかどうかを確認してもよい。
本発明の方法において、脂肪間質細胞以外の多分化能を有するヒト由来の細胞を用いる場合でも、当業者に公知の検出方法(各細胞のマーカーを用いた検出方法や、各細胞特有のアッセイ方法)により、製造された前駆細胞の確認を行うことができる。
本発明において、「対象」とは、本発明の方法によって処置されるべき生物体、該生物体の体内の一部分(例えば脳、肺、心臓、肝臓、腎蔵等の臓器、およびそれらの臓器中の血管または一組織)、または生物体より摘出または排出されたその一部分をいう。生物体は、動物(例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物)であれば特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。本発明において、「対象」とは、障害を受けている組織(障害組織)そのものを示すこともできる。
非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。注射剤を投与する方法としては、対象となる生物体の体内の一部分(臓器等の一組織)を標的として局所的に投与を行っても良いし、血管に投与することにより、生物体全体に本発明の細胞を循環させてもよい。また、複数箇所の標的に同時に投与を行ってもよい。また、本発明の細胞を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用により投与することも可能である。
また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発明の細胞を生物体の一部に「接触」させてもよい。
また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本発明の細胞の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本発明の細胞の添加等を挙げることができるが、これらの方法に制限されない。
本発明の方法を実践する際に、本発明の細胞は、少なくとも1つの既知の化学療法剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。一つの態様において、本発明の細胞および既知の化学療法剤は、実質的に同時に投与されてもよい。
また、本発明の細胞は、少なくとも1つの既知の増殖因子と供に同時に投与されてもよい。同時に投与される増殖因子は特に制限されないが、好ましくはアドレノメデュリンまたは血管内皮増殖因子を挙げることが出来る。アドレノメデュリンおよび血管内皮増殖因子はそれぞれ単独で投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。
また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に本発明の細胞を投与し、摘出または排出を行った生物体または他の生物体に、該生物体の一部分を戻すことも可能である。
本発明において、障害組織における「変性」とは、可逆性細胞障害として普遍的に認められる細胞・組織変化のことを表す。変性の際に蓄積する物質は生体に正常に存在するものと存在しない病的なものがあり、蓄積した物質によって蛋白変性または脂肪変性と呼ばれる。変性状態としては、粘液変性、アミロイド変性、α1アンチトリプシン欠損症における変性、尿酸代謝障害における変性、硝子滴変性、水腫様変性、空胞変性、フィブリノイド変性、または角質変性等を挙げることが出来る。
本発明において、「壊死」とは、細胞・組織の不可逆的変化のことを表す。壊死状態としては、凝固壊死(循環障害)、融解壊死、壊疽(壊死に細菌感染が合併した状態)、または枯死(細胞障害による病的死ではなく組織内で生じる生理的な死)等を挙げることが出来る。
上記の疾患としては、心筋梗塞、不整脈、動脈硬化、血液攣縮、虚血再循環障害、肺炎、感染症、肺線維症(制ガン剤副作用)、ARDS、パラコート中毒、喫煙障害、肺気腫、高酸素療法、インフルエンザ、脳浮腫、脳梗塞、脳出血、てんかん、脳欠陥攣縮、パーキンソン病、自律神経障害(Reilly現象)、遅発性神経障害、脊髄損傷、神経原性肺浮腫、急性胃粘膜障害、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、肺炎、肝硬変、薬物性肝障害、肝移植病態、各種の黄疸病態、膵炎、糸球体腎炎、溶血性腎障害、薬物性腎障害、火傷、日光皮膚炎、アトピー性皮膚炎、皮膚漬瘍、網膜変症、白内障、角膜腫瘍等を挙げることができ、好ましくは、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患、より好ましくは、肺高血圧症または虚血性心疾患(心筋梗塞または狭心症)を挙げることができる。
本発明の「対象における障害組織」として、より具体的には肺胞、肺血管における障害組織、または心筋細胞を挙げることが出来る。
障害組織の再生または修復が起こる期間は特に限定されないが、一時的な再生または修復であってもよいし、一定期間の再生または修復であってもよい。また、再生または修復が完全に進む、すなわち組織が元の状態に完全に戻ることが好ましいが、組織の部分的な再生または修復であってもよい。
「再生または修復」の、より具体的な例としては、肺気腫状態の肺胞または肺血管における、変性した末梢血管の修復、また壊死した末梢血管に置き換わる新たな血管の再生を挙げることが出来る。結果として、肺高血圧症が改善された場合にも、肺組織の修復・再生が行われたと解釈することが出来る。また、心筋梗塞や狭心症における、変性した心筋細胞または末梢血管の修復を挙げることもできる。結果として、心筋梗塞または狭心症の症状が改善された場合にも、心臓組織の修復・再生が行われたと解釈することが出来る。
本発明の薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
体重90〜110gの雄性Wistarラットを本実施例に用いた。ラットの手術を行い、両側腹部の小切開により皮下脂肪組織を摘出した。脂肪組織を破砕して、0.1mg/mlの1型コラゲナーゼ(Worthington Biochemical)を含むリン酸緩衝食塩水に入れ、静かに攪拌しながら37℃で1時間消化処理を行った。未消化断片を25μmのフィルターによる濾過によって除去し、遠心処理(2000rpm、10分間)によって成熟脂肪細胞を脂肪間質細胞のペレットから分離した。以前の報告の通りに(Bjorntorp P, et al. J Lipid Res. 1978;19:316-324.)、上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁した上で通常の培養皿に播き、10%ウシ胎仔血清(FCS)、ヘパリンおよび抗生物質を含むα培地中で培養した。
培養第7日の脂肪間質細胞は紡錘状の形態を呈し、対照培地中では第28日まで不変のまま保たれた(図1)。これに対して、AMおよびVEGFとともに培養した脂肪間質細胞は第28日には敷石様の外観を示した(図1)。
培養細胞の内皮表現型は、VE-カドヘリン、CD31およびvWFといった内皮細胞特異的マーカーの存在を実証することによって確認した。具体的には、培養第7日、第14日、第21日および第28日の時点で、各群の脂肪間質細胞を蛍光活性化細胞分取法(FACS;FACS SCANフローサイトメーター、Becton Dickinson)により分析した。これらの脂肪間質細胞を、以下のそれぞれに対するマウスモノクローナル抗体:CD31(クローンTLD-3A12、Becton Dickinson)、血管内皮(VE)-カドヘリン(クローンF-8、Santa Cruz)、CD45(クローンOX-1、Becton Dickinson)、CD34(クローンICO115、Santa Cruz)およびフォンビルブラント因子(vWF)に対するウサギポリクローナル抗体(Dako)とともに4℃で30分間インキュベートした。VE-カドヘリンの細胞内染色のために透過化処理用緩衝液(Santa Cruz)を用いた。アイソタイプが同一な抗体を対照として用いた。
培養下でVE-カドヘリンまたはCD31の発現が増加するという以上の結果より、AMはVEGFと同様に、脂肪間質細胞の内皮細胞系譜への分化を増強する能力があることが分かった。
さらに、分化シグナル伝達へのAMの関与に関しては、以前の報告の通りに(Kim W, et al. FASEB J. 2003;17:1937-1939.)、脂肪間質細胞を第21日から第28日まで、PI3K阻害剤であるウォルトマンニン(Sigma)30nmol/lの存在下または非存在下で、培地を24時間毎に交換しながら培養することで検討した。VE-カドヘリンの発現は、FACSにより第28日目に分析した。
以前の研究により、PI3Kシグナル伝達における下流因子が、胚性幹細胞におけるVEGF誘導性内皮分化に重要な役割を果たすことが示されている(Miyashita H, et al. Blood. 2002;99:3241-3249., Yamazaki T, et al. Blood. 2004;104:2345-2352.)。本発明においては、PI3K阻害剤との培養により、AMまたはVEGFの存在下でのVE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞数の増加が抑制された。これらの結果から、PI3Kシグナル伝達がAMまたはVEGFで誘導される脂肪間質細胞の内皮細胞への分化に重要な役割を果たすものと示唆される。
また、比較的高濃度のVEGF(20ng/mlを上回る)でもVE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞の数は増加しなかったのに対し、AMとVEGFの併用はAMまたはVEGFのいずれか単独に比べて脂肪間質細胞の内皮細胞系譜への分化をより強力に誘導した。これらの結果は、脂肪間質細胞のVEGF誘導性内皮分化の増強にAMが重要な役割を果たすことを示唆している。
脂肪間質細胞による血管様構造の形成、すなわち脂肪間質細胞が血管新生を誘導するか否かを、基底膜マトリックス調製物(マトリゲル)上で評価した。各群の培養脂肪間質細胞を、マトリゲル(Becton Dickinson)をコーティングした12ウェルプレートに2.0×105個/ウェルとして播き、37℃で6時間インキュベートした。管形成を光学顕微鏡を用いて観察し、コンピュータシステムを用いて画像を取り込んだ。管形成領域のピクセル解析は以前の報告の通りに行った(Miura S, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:802-808.)。簡潔に述べると、この領域の画像をモノクロスケール(black-scale)に変換し、ピクセルの総数を算出するための画像処理を行った。各試料に関してピクセル数を5つの異なる領域で計測し、平均値を求めた。
以上の結果より、AMおよびVEGFはいずれも単独で脂肪間質細胞の血管新生促進能力を増強し、AMとVEGFの併用はAMまたはVEGF単独に比べて、さらに血管新生促進能力を増強することが明らかとなった。
脂肪細胞形成に対するAMの阻害作用について検討を行った。
各群の第7日および第28日の脂肪間質細胞を、10%FCSおよび抗生物質を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM:標準培地)中に再懸濁し、直径22mmのウェル1つ当たり1.2×105個を播いた。0.5mmol/lの3-イソブチル-1-メチルキサンチンおよび1μmol/lのデキサメタゾンを含む標準培地中で48時間培養した後に、10μg/mlのインスリンを含む標準培地中で48時間培養することにより、脂肪間質細胞は脂肪細胞に分化した。添加物質を含まない標準培地中に48時間保った後に、細胞をオイルレッドO溶液によって染色した。オイルレッドO染色の定量によって脂質蓄積を計測するために、以前の報告の通りに(Landsberg RL, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:2456-2461., Selvarajan S, et al. Nat Cell Biol. 2001;3:267-275.)、染色処理を行った培養皿にイソプロピルアルコールを添加し、抽出された色素を穏やかなピペッティングによって直ちに採取した上で、その490nmでの吸光度を分光光度計によってモニターした。
脂肪細胞形成評価により、AMおよび/またはVEGFとともに培養した脂肪間質細胞は脂肪細胞形成を誘導しても脂肪細胞に分化しないことが示されたが、脂肪間質細胞の脂肪細胞化の能力は長時間の培養を通じて維持された。以上の結果より、脂肪由来前駆細胞はインビボで脂肪細胞化を伴わずに血管新生を誘導する可能性が示唆された。
肺高血圧症誘発剤であるモノクロタリン(MCT)は肺内皮損傷を誘導するとともに肺毛細血管の数を減少させ(Rosenberg H, et al. Am J Physiol. 1988;255:H1484-H1491., Schraufnagel DE, et al. Am Rev Respir Dis. 1989;140:1405-1409.)、これはMCT誘発性肺高血圧症が発症する一因となる。そこで、本発明者らは、MCTを投与し擬似的に肺高血圧症を発症させたラットに対する、脂肪由来前駆細胞の効果について検討を行った。
脂肪由来前駆細胞を投与したMCTラット(脂肪由来前駆細胞群、n=10)、培地のみを投与したMCTラット(賦形剤群、n=10)および培地のみを投与した偽処置ラット(偽処置群、n=10)。
60mg/kgのMCT注射から3日後に、赤色蛍光色素(PKH26、Sigma)で標識した1.5×106個の自己脂肪由来前駆細胞を静脈内投与した。MCT注射から3週後に肺を摘出して凍結した。凍結切片に対する免疫蛍光染色を、vWFモノクローナル抗体(Dako)および対応するFITC標識二次抗体(Dako)を用いて行った。
その結果、毛細血管密度はMCT注射後に有意に低下したが、MCTラットへの脂肪由来前駆細胞移植後に有意に上昇することが明らかとなった(図7AおよびB)。
上記の結果より、導入した脂肪由来前駆細胞の一部が成熟内皮細胞に分化して内皮細胞を誘導することが示唆された。
MCT注射から3週間後に血行動態試験を行った。心拍数および平均動脈圧を測定するためにポリエチレン製カテーテル(PE-50)を右頸動脈に挿入し、RV圧の測定のためにポリエチレン製カテーテル(PE-50)を右頸静脈から右室(RV)に挿入した。その後、2mmolの塩化カリウムをカテーテルを介して注入することによって心停止を誘導した。心室および肺を摘出して単離した。以前の報告の通りに(Nagaya N, et al. Circulation. 2000;102:2005-2012.)、RV重量と体重との比(RV/BW)、左室+中隔の重量と体重との比(LV+S/BW)を心室肥大の指標として算出した。プロトコールはいずれも、国立循環器病センター研究所(大阪、日本)の動物管理倫理委員会の指針に準拠して行った。
4μm厚のパラフィン切片を右肺の中央部から入手し、光学顕微鏡による検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。肺細動脈の外径および内壁厚を20本の筋性動脈(外径25〜100μmの範囲)で測定した。内壁厚は以下の通りに表した:壁厚=([内壁厚×2]/外径)×100。以前の報告(Itoh T, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169:34-38.)の通りに、肺切片を3つの群の個々のラット(それぞれn=5)から入手した。
これらの結果、代表的な写真により、脂肪由来前駆細胞群では賦形剤群に比してMCT注射肺血管壁の肥厚化が減弱していることが示された(図8C)。定量分析でMCT注射後に壁厚百分率の有意な増加が示されたが、この変化は脂肪由来前駆細胞群では改善することが明らかとなった(図8D)。
MCT注射から3日後に、ラット20匹に対して、自己脂肪組織由来の1.5×106個の脂肪由来前駆細胞(脂肪由来前駆細胞群、n=10)または培地(賦形剤群、n=10)の静脈内注射を行った。生存期間の評価はMCT注射日からラットの死亡日またはMCT注射から6週後まで行った。
これらの結果、Kaplan-Meier生存曲線からは、脂肪由来前駆細胞を移植したMCTラットの方が培地を投与した群よりも生存率が有意に高いことが示された(図8E)。
上記のことより、脂肪由来前駆細胞の導入によって誘導される血管内皮細胞は肺血管再生の調節に重要な役割を果たし、肺高血圧症の改善をもたらすことが考えられる。
ラットに対して開胸術後に冠動脈前下降枝を結さつして心筋梗塞を作成した。心筋梗塞作成数分後に梗塞境界域の心筋に5×106個の脂肪由来前駆細胞を注入した(脂肪由来前駆細胞群)。また対照群として同様に心筋梗塞を作成後にPBS100μLを梗塞境界域の心筋に注入した(対照群)。偽処置群には開胸術後に心筋梗塞を作成せずにPBS100μLを心筋注入した(偽処置群)。
心筋梗塞作成日より4週間後に脂肪由来前駆細胞による治療効果を評価した。
対象群および脂肪由来前駆細胞群のラットの左心室の心筋梗塞部位(各群n=5)を10%ホルマリンで固定してパラフィン包埋し、マッソントリクロム染色を行った。また心筋梗塞域の大きさを測定した(図9AおよびB)。
次に、対象群および脂肪由来前駆細胞群のラットの冠動脈の結さつ4週間後の血行動態を検討するため、血行動態パラメータとなる、LV拡張終期圧(LVEDP)、LV短縮率(FS%)、LV最大dP/dt (Max dP/dt)および最小dP/dt (Min dP/dt)を測定した(図10A-D)。1.5−Frマイクロナノメーターチップを付けたカテーテル(ミラーインスツルメント社)を右頚動脈より挿入し、平均動脈圧を測定した。次に、カテーテルを左心室まで進めてLV圧を測定した。測定は圧ドランスデューサーをポリグラフに連結して記録した。梗塞サイズは既報(Chien YW. Et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 254:R185-91, 1988)の通り測定を行った。
上記結果より、脂肪由来前駆細胞群では対照群と比較し心筋梗塞域の縮小と血行動態の改善を認めた。また、心エコー検査では脂肪由来前駆細胞群では心機能の改善を認めた。
EGFP-transgenicラットの末梢脂肪組織から入手した脂肪間質細胞を初期培養1週間後から10−7mol/lのAM添加培地にて1週間培養して脂肪由来前駆細胞を作製した。また、生後1〜2日の新生児ラットから心筋細胞を分離培養して、培養2日目に脂肪由来前駆細胞を加え共培養を開始した。共培養開始5日目には脂肪由来前駆細胞は自己拍動を始めた。自己拍動は心筋細胞に特異的な現象であるため、新生児ラットの心筋細胞との共培養によって脂肪由来前駆細胞が心筋細胞に分化したことが確認された。脂肪由来前駆細胞が自己拍動を行う様子をビデオ画像に収めることに成功した。
共培養5日目に培養皿上の細胞をパラホルムアルデヒドにて固定後に、心筋特異的マーカーであるtroponin I, ANP, connexin43の蛍光免疫染色を施行した。troponin I, ANP, connexin43を赤色に染色することにより、緑色の脂肪由来前駆細胞との重染色を認めた。そのため、脂肪由来前駆細胞が心筋細胞へ分化したことが示唆された。
EGFP-transgenicラットの末梢脂肪組織から入手した脂肪間質細胞を初期培養1週間後から10−7mol/lのAM添加培地にて1週間培養して脂肪由来前駆細胞を作製した。脂肪由来前駆細胞を心筋梗塞作成後のラットに移植して2週間後に心臓を摘出した。心臓をホルマリンにて固定後にパラフィン切片を作成して、 troponin I, connexin43, desmin, vWFを染色した。troponin Iを染色した結果を図11A-Cに、vWFを染色した結果を図11D-Fに示す。心筋梗塞後の移植により脂肪由来前駆細胞が心筋細胞や血管内皮細胞へ分化していることが示唆された。
本発明の前駆細胞を、障害組織等に移植導入することにより、虚血下肢や虚血心筋における血流増加、血管新生増加、または心筋再生が期待できる。また、難治性の脳・肺・肝・腎疾患等に対して本発明の前駆細胞を用いることにより、血管再生または細胞再生を介して組織の修復が促進されることで、病変の縮小と機能改善が図れるものと考えられる。さらに、本発明の方法は自己由来の細胞を用いるため、免疫応答による拒絶反応の心配や倫理的な問題も少なく、画期的な治療法となる。
Claims (15)
- 多分化能を有する細胞を以下の(i)〜(iii)のいずれかに記載の増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法。
(i)アドレノメデュリン(AM)
(ii)血管内皮増殖因子(VEGF)
(iii)アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子(VEGF) - 多分化能を有する細胞が、脂肪間質細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞である、請求項1に記載の方法。
- 多分化能を有する細胞が、脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞である、請求項1に記載の方法。
- 多分化能を有する細胞が、哺乳類動物由来の細胞である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の方法により製造された前駆細胞。
- 請求項5に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法。
- 請求項5に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させる方法。
- 請求項5に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の細胞を新生または再生させる方法。
- 増殖因子を前駆細胞と同時に対象に投与する工程を含む、請求項6〜8のいずれかに記載の方法。
- 増殖因子が以下の(i)〜(iii)のいずれかに記載の増殖因子である、請求項9に記載の方法。
(i)アドレノメデュリン(AM)
(ii)血管内皮増殖因子(VEGF)
(iii)アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子(VEGF) - 障害組織が、虚血性心疾患、または肺高血圧症における障害組織である、請求項6〜10のいずれかに記載の方法。
- 請求項5に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤
- 請求項5に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤。
- 請求項5に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤。
- 障害組織が、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、または肺高血圧症における障害組織である、請求項12〜14のいずれかに記載の薬剤。
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110912 |
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A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120119 |