JP2004083570A - 低酸素応答誘導剤およびその製法 - Google Patents
低酸素応答誘導剤およびその製法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】Ｈｉｆ−１誘導活性を有する、新規な化合物、該化合物を有効成分として含有する医薬、および、該化合物の合成中間体を提供することを目的とする。
【解決手段】
【化１】
［式中、Ｒ１は、塩素原子又は水酸基を示し、Ｒ２は、水酸基又はメタンスルホニルオキシ基を示す。］で表される化合物又はその塩等。
【選択図】なし。
【解決手段】
【化１】
［式中、Ｒ１は、塩素原子又は水酸基を示し、Ｒ２は、水酸基又はメタンスルホニルオキシ基を示す。］で表される化合物又はその塩等。
【選択図】なし。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低酸素応答誘導活性を有する化合物、該化合物を有効成分とする医薬、特に血管新生誘導、嫌気的糖代謝活性化、エネルギー代謝改善・賦活等の活性によって治療または予防できる疾患の治療薬または予防薬、虚血性心疾患、潰瘍、火傷、創傷、糖尿病性神経障害、赤血球生産低下・貧血、肥満・脂肪組織形成、糖尿病、脳虚血、腫瘍・転移、悪液質の治療薬または予防薬、遺伝子治療制御剤、並びに、該化合物の製造法及びその原料化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体・細胞は、低酸素、低栄養または低糖濃度等の刺激に暴露されると、低酸素応答エレメント（ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、以下「ＨＲＥ」という。）を介して低酸素応答をすることが知られている。ＨＲＥは、例えば５’−ＲＣＧＴＧ−３’（Ｒはプリン塩基）等の、転写因子ハイポキシアインデューシブルファクター（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）（以下、「ＨＩＦ」という。）が結合する塩基配列である。ＨＲＥは、上記刺激により転写が活性化する遺伝子群（以下、「低酸素応答遺伝子」という。）の発現調節部位に存在し、本配列に転写因子ＨＩＦが結合することにより低酸素応答遺伝子の転写が誘導される。
【０００３】
ＨＩＦは、ハイポキシアインデューシブルファクター−１（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ−１）（以下、「ＨＩＦ−１」という。）およびハイポキシアインデューシブルファクター−２（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−２）（以下、「ＨＩＦ−２」という。）の総称であり、上記の刺激に応答して蛋白量および生物活性が増加すると考えられている。ＨＩＦ−１またはＨＩＦ−２は、それぞれ、ハイポキシアインデューシブルファクター−１α（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）（以下、「ＨＩＦ−１α」という。）またはハイポキシアインデューシブルファクター−２α（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−２α）（以下、「ＨＩＦ−２α」という。）（ＥＰＡＳ）と、Ａｒｎｔ（ハイポキシアインデューシブルファクターβ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒβ）（以下、「ＨＩＦβ」という。））との複合体からなる。
【０００４】
低酸素応答遺伝子としては、血管内皮増殖因子（以下、「ＶＥＧＦ」という。）、エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」という。）、血管内皮増殖因子レセプターＦＬＴ−１ （以下、「ＶＥＧＦＲ−１」という。）、α１Ｂアドレナジックレセプター（α１Ｂ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アドレノメジュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、エンドセリン１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）、ヘムオキシゲナーゼ（ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ １、以下、「ＨＯ−１」という。）、ニトリックオキシドシンターゼ２（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １、以下、「ＰＡＩ１」という。）、グルコーストランスポーター１（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、グルコーストランスポーター３（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）１、ヘキソキナーゼ２、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）などが報告されている（非特許文献１参照）。またＨＩＦはＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３を誘導することでペルオキソームプロリファレーターアクティベイティッドレセプター（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ（以下、「ＰＰＡＲγ」という。）の発現を抑制することが報告されている（非特許文献２参照）。また、ＨＩＦは６−ホスホフルクト２−キナーゼ／フルクトース２，６−ビスホスファターゼ３（６−ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏ−２−ｋｉｎａｓｅ／ｆｒｕｃｔｏｓｅ−２，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ３、以下、「ＰＦＫＢＦ３」という。）を誘導する。ＰＦＫＢＦ３はフルクトース２，６−ビスホスフェート（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−２，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産することでホスホフルクトキナーゼ１（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ １）を活性化、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を阻害する（非特許文献３参照）。さらにＨＩＦはｐ５３、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、以下、「ｉＮＯＳ」という。）を誘導する（非特許文献４参照）。
【０００５】
上記低酸素応答遺伝子のうち、ＶＥＧＦおよびＦＬＴ−１は血管新生において主要な役割を果たすことが報告されている（非特許文献５、非特許文献６参照）。このほかにもα１Ｂアドレナジックレセプター、アドレノメジュリン、エンドセリン１、ＨＯ−１、誘導性一酸化窒素合成酵素２、ＰＡＩ１は血管新生に働くと考えられている（非特許文献１参照）。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、血管新生誘導剤として有用である。
【０００６】
また、解糖系は細胞におけるエネルギー生産に重要な役割を果たしており、特に低酸素時には必須のエネルギー供給経路となる。グルコーストランスポーター１およびグルコーストランスポーター３の誘導はグルコースの細胞への取り込みを促進すると考えられており、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、乳酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＰＦＫＢＦ３などの発現はグルコースを原料とする解糖系を活性化すると考えられている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、嫌気的糖代謝活性化剤、エネルギー代謝改善・賦活剤として有用である。
【０００７】
さらに、虚血状態にある心筋に血管新生を誘導または嫌気的糖代謝を促進すると、梗塞部位を含む心筋の血流を改善し、酸素および栄養源補給を増大し、または虚血状態の細胞のエネルギー代謝を改善することにより、心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患の予防、進行・発症の抑制、回復促進活性を示すことが期待されている。また、虚血性心疾患の動物モデルである、ラット心臓冠状動脈虚血再環流試験においてＨＯ−１を発現させる遺伝子治療が組織破壊保護作用を示すことが報告されている（非特許文献７参照）。従って、低酸素応答誘導能を有し、血管新生を誘導または嫌気的糖代謝を促進する化合物は、虚血性心疾患治療薬として有用である。
【０００８】
潰瘍、火傷、創傷部位においては血管新生誘導活性および嫌気的糖代謝促進活性を通じ、損傷を受けた組織の細胞死抑制および組織再生促進効果が期待されている。また、低酸素応答遺伝子の一つであるＶＥＧＦは、消化管潰瘍モデル動物実験系において治療効果を有することが報告されている（非特許文献８参照）。また、火傷および創傷を負った患者において、ＶＥＧＦ誘導と治癒との相関が報告され、ＶＥＧＦの治癒促進活性が示唆されている（非特許文献９参照）。従って、低素応答誘導能を有する化合物は、潰瘍、火傷、創傷治癒薬として有用である。
【０００９】
糖尿病性神経障害においては、末梢組織が虚血状態に起因する損傷を受けることが主要な病態である。組織に血管新生を誘導または嫌気的糖代謝を促進することで、組織損傷の抑制・予防・治療効果が期待される。また、低酸素応答遺伝子の一つであるＶＥＧＦは、動物実験系において糖尿病性神経障害治療効果を発揮することが報告されている（非特許文献１０参照）。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、糖尿病性神経障害治療薬として有用である。
【００１０】
上記低酸素応答遺伝子のうち、ＥＰＯは赤血球生産において不可欠な役割を果たし、様々なタイプの貧血の治療に用いられている（非特許文献１１参照）。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、赤血球生産増強薬・貧血治療薬として有用である。
【００１１】
また、上記低酸素応答遺伝子のうち、ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化促進活性を有する。嫌気的糖代謝を活性化すること、およびＰＰＡＲγの発現を低下させて脂肪細胞の分化を抑制することで、抗肥満活性が期待される。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、抗肥満薬・脂肪組織形成抑制剤として有用である。
【００１２】
さらに、上記低酸素応答遺伝子のうちグルコーストランスポーターは、高発現により、細胞内へのグルコース取り込みが促進する。また解糖系の活性化により、グルコース消費が促進される。さらにＰＦＫＢＦ３高発現によって生じたフルクトース２，６−二リン酸は解糖系を活性化すると共にフルクトース１，６−ビスホスファターゼを阻害し、糖新生を抑制する。低酸素応答誘導能を有する化合物は、これらの現象により達成される、血中からのグルコース取り込み、消費の活性化、および血中へのグルコース供給の抑制を通じ、血糖低下作用および糖尿病予防・治療効果を発揮することが期待されている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、抗糖尿病剤として有用である。
【００１３】
脳梗塞をはじめとする脳虚血時には、低酸素に暴露された神経細胞の細胞死が観察される。ＨＩＦは、血管新生または嫌気的糖代謝活性化または赤血球増強活性を通じて脳虚血時の組織傷害を抑制することが期待される。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、抗脳虚血薬として有用である。
【００１４】
腫瘍細胞の原発巣および転移巣においては、ＨＩＦの活性化によりＶＥＧＦが発現することで腫瘍組織に血管新生を誘導する。全身性にＨＩＦ誘導を通じてＶＥＧＦ濃度を上昇させることで腫瘍組織周辺のＶＥＧＦ濃度勾配を破壊し、腫瘍組織における血管新生を阻害することが期待される。低酸素刺激で誘導されたＨｉｆ−１は、ｐ５３の産生量および生物活性を増大させることが知られている（非特許文献１２参照）また、ｐ５３は細胞周期停止、細胞死誘導活性があることが知られている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は抗腫瘍薬・抗転移薬として有用である。
【００１５】
癌に伴って発症する悪液質は糖代謝をはじめとする代謝異常によりエネルギー枯渇を生じる病態である（非特許文献１３参照）。低酸素応答誘導能を有する化合物は、細胞内へのグルコース取り込み、解糖系によるエネルギー産生によってこの症状を緩和することが期待されている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は悪液質治療薬として有用である。
【００１６】
遺伝子治療において導入遺伝子の発現を制御することは治療の有効性と安全性の見地から非常に重要である（非特許文献１４参照）。ＨＲＥで発現制御されるトランスジーンを体内に導入した場合、ＨＲＥは常酸素状態では遺伝子発現を誘導しないが、活性化された場合にのみどの組織においても迅速に遺伝子を発現誘導することが期待される。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は遺伝子治療制御剤として有用である。
【００１７】
低酸素応答誘導剤は、上述の通り種々の薬理活性が期待されているが、このような化合物としては、現在のところデフェロキサミン（Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）などの鉄キレーター、コバルトイオンなどの金属イオンが知られているのみである。これら、キレーター類や金属イオンは生体内では選択的な薬効を発現しない可能性が高いのみでなく、他の生体機能に影響を与えて副作用が発現する危険性があり、未だ満足すべき低酸素応答誘導剤は存在しない。
【００１８】
また、下記式
【００１９】
【化１０】
で表されるビラントマイシン（以下、「Ｃ物質」という。）は、抗ウイルス剤として使用できることは知られているが（非特許文献１５参照）、本発明の低酸素応答誘導能を有することは知られていなかった。
【００２０】
【非特許文献１】
Ｇｒｅｇｇ Ｌ． Ｓｅｍｅｎｚａ、「Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」 １４， ｐ．１９８３−１９９１ （２０００）
【非特許文献２】
Ｚ． Ｙｕｎら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ」 ２， ｐ．３３１−３４１ （２００２）
【非特許文献３】
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｍｉｎｃｈｅｎｋｏら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ２７７， ｐ．６１８３−６１８７ （２００２）
【非特許文献４】
Ｖ． Ｃｈｉａｒｕｇｉら、「Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．」 １２５， ｐ．５２５−５２８ （１９９９）
【非特許文献５】
Ｍａｓａｂｕｍｉ Ｓｈｉｂｕｙａ、「Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」 ２６， ｐ．２５−３５ （２００１）
【非特許文献６】
Ｎａｐｏｌｅｏｎｅ Ｆｅｒｒａｒａ、「Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｉｓｉｏｌ．」 ２８０， Ｃ１３５８−Ｃ１３６６（２００１）
【非特許文献７】
Ｌ． Ｇ． Ｍｅｌｏら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」 １０５， ｐ．６０２−６０７ （２００２）
【非特許文献８】
Ｓ． Ｓｚａｂｏら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｉｓ」 ９５， ｐ．３２５−３３５ （２００１）
【非特許文献９】
Ｓ． Ｇｒａｄら、「Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ．」 ３６， ｐ．３７９−８３， （１９９８）
【非特許文献１０】
Ｐｅｔｅ Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒら， 「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」 １０７， ｐ．１０８３−１０９２ （２００１）
【非特許文献１１】
Ｋａｉ−Ｕｗｅ Ｅｃｋａｒｄｔ、「Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」 １６， ｐ．１７４５−１７４９ （２００１）
【非特許文献１２】
Ｗ． Ｇ． Ａｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」 ３９２， ｐ．４０５−４０８ （１９９８）
【非特許文献１３】
Ｊ． Ｍ． Ａｒｇｉｌｅｓら、「Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．」 ２１， ｐ．８３−１０１ （２００１）
【非特許文献１４】
Ｐｈｉｌｉｐ Ｗ． Ｚｏｌｔｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｍ． Ｗｉｌｓｏｎ、「Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」 ９５３， ｐ．５３−６３ （２００１）
【非特許文献１５】
Ａ． Ｎａｋａｇａｗａら、「Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」 ３４， ｐ．４０８−４１５ （１９８１）
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らはこのような観点から新たな低酸素応答誘導活性を有する物質を探索した結果、土壌より分離した、ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＲＲＭ ＢＰ−８０１６）株の培養液中に生産される化合物が低酸素応答の誘導活性を有すること、および同一培養液中に含まれる化合物が低酸素応答の誘導活性を有する化合物の合成中間体になり得る事を見出して本発明を完成した。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１） 下記一般式（Ｉ）又は下記一般式（ＩＩ）
【００２３】
【化１１】
【００２４】
［式中、Ｒ１は、塩素原子又は水酸基を示し、Ｒ２は、水酸基又はメタンスルホニルオキシ基を示す。］
で表される化合物又はその塩、
（２） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋７０．６°（ｃ ０．５，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３５１．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３２８５０）、２２７（１１９５０）、３０８（２４０７０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０２、２９８３、２９２４、１６７２、１６１０、１５０３、１４５５、１４３１、１２７１、１１２０、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６２ （３Ｈ， ｓ） １．６９ （１Ｈ， ｍ）， １．７９ （１Ｈ， ｍ）， ２．１２， （２Ｈ， ｍ）， ３．０１ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ） ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， １０．５ Ｈｚ）， ３．３４ （３Ｈ， ｓ）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ３．６２ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ４．２８ （１Ｈ，ｍ）， ６．４６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ６．７３ （１Ｈ， ｄ， ２．０ Ｈｚ）， ７．５１ （１Ｈ， ｓ）， ７．５６ （１Ｈ，ｄｄ， ８．５ Ｈｚ， １．５ Ｈｚ）， １１．９５ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．２， １９．６， ２０．３， ２８．４， ３０．４， ３３．３， ５８．６， ６３．４， ７３．９， ７８．５， １０６．０， １１８．１， １２４．０， １２５．２， １２６．５， １２７．２， １３０．３， １５５．６， １６７．４
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）（ワイエムシィ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝６：４
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分
（３） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋３０．２°（ｃ０．５，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２７ＮＯ４（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３３３．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０４（３０３４０）、２２６（１１４６０）、３０７（１９１８０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４１１、３３５３、２９８３、２９２４、１６７１、１６１０、１５０３、１４５５、１４３３、１２７０、１１１３、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．３７ （２Ｈ， ｍ）， １．５７ （３Ｈ， ｓ）， １．５７ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．９７ （１Ｈ， ｍ）， ２．０６ （１Ｈ， ｍ）， ２．８９ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， １０．０ Ｈｚ）， ２．９７ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， ９．０ Ｈｚ）， ３．２９ （３Ｈ， ｓ）， ３．３０ （２Ｈ， ｍ）， ３．９７ （１Ｈ， ｍ）， ４．２６ （１Ｈ， ｓ）， ６．３４ （１Ｈ， ｓ）， ６．４３ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４８ （１Ｈ， ｓ）， ７．５３ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， １．０ Ｈｚ）， １１．８７ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．２， １９．６， ２０．３， ２７．６， ２８．８， ３１．８， ５８．６， ６４．２， ７３．２， ７５．０， １０５．９， １１７．５， １２２．８， １２５．２， １２７．７， １２８．０， １３０．２， １５６．３， １６７．５
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分
（４） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：白色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝−１３．９°（ｃ ０．５１、ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２７ＮＯ４（ＴＯＦ−ＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３３３．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３１３００）、２２９（１０３６０）、３０９（２４３１０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４０４、２９８１、２９２６、１６７２、１６０７、１５１７、１２８８、１２５４、１１０８、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．５３ （１Ｈ， ｍ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６３ （３Ｈ， ｓ）， １．８２ （１Ｈ， ｍ）， ２．０７ （２Ｈ， ｍ）， ２．８６ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， ６．０ Ｈｚ）， ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １７．０ Ｈｚ， ４．０ Ｈｚ）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．４９ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ３．６７ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．９９ （１Ｈ， ｍ）， ４．５０ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ６．５０ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， ２．０ Ｈｚ）， ７．７８ （１Ｈ， ｄ， １．５ Ｈｚ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．４， ２０．０， ２０．６， ２７．７， ３２．７， ３３．３， ５７．６， ５９．５， ６７．４， ７５．０， １１３．４， １１７．０， １１７．８， １２４．６， １２６．８， １３０．２， １３３．２， １４７．４， １７１．７
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。
（５） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：白色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋１０．０°（ｃ ０．２８、ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ６Ｓ；
５）分子量：４１１ （ＡＰＣＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（２５９１０）、２２５（ｓｈ）、２９７（１３８４０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３３９１、２９２５、１６７３、１６０９、１５１８、１３３３、１１７４、１１１１９１６、９００；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．５６ （１Ｈ， ｍ）， １．５８ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．７１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０４ （２Ｈ， ｍ）， ３．０１ （３Ｈ， ｓ）， ３．１５ （１Ｈ， ｄｄ， １７．５ Ｈｚ， ３．０ Ｈｚ）， ３．２２ （１Ｈ， ｄｄ， １７．５ Ｈｚ， ３．０ Ｈｚ）， ３．４３ （３Ｈ， ｓ）， ３．４６ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．５９ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．６６ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ５．０７ （１Ｈ， ｔ， ３．５ Ｈｚ）， ６．５２ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ７．７７ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ７．７８ （１Ｈ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．４， １９．９， ２０．６， ２７．７， ３０．０， ３３．３， ３９．１， ５７．２， ５９．３， ７２．７， ７４．５， １１３．５，１１４．７， １１７．７， １２５．０， １２６．２， １３０．５， １３２．６， １４６．８， １７１．３
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．４０分
（６） ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する、（１）から（４）のいずれか１項に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）から（４）のいずれか１項に記載の化合物を回収することを特徴とする、（１）から（４）に記載の化合物の製造方法（ただし、式（ＩＩ）で表される化合物において、Ｒ２がメタンスルホニルオキシ基である化合物を製造する場合を除く。）、
（７） ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物の生産菌がストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６）株であることを特徴とする、請求項６に記載の製造法、
（８） ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６）、
（９） 下記式
【００２５】
【化１２】
【００２６】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物あるいはその塩を有効成分として含有する医薬、
（１０） 下記式
【００２７】
【化１３】
【００２８】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物あるいはその塩を有効成分として含有する血管新生誘導剤、
（１１） 下記式
【００２９】
【化１４】
【００３０】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する嫌気的糖代謝活性化剤またはエネルギー代謝改善・賦活剤、
（１２） 下記式
【００３１】
【化１５】
【００３２】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する虚血性心疾患の予防薬または治療薬、
（１３） 下記式
【００３３】
【化１６】
【００３４】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する潰瘍、火傷または創傷治癒剤、
（１４） 下記式
【００３５】
【化１７】
【００３６】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する糖尿病性神経障害の予防薬または治療薬、
（１５） 下記式
【００３７】
【化１８】
【００３８】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する赤血球生産増強剤または貧血の予防薬若しくは治療薬、
（１６） 下記式
【００３９】
【化１９】
【００４０】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する抗肥満薬または脂肪組織形成抑制剤、
（１７） 下記式
【００４１】
【化２０】
【００４２】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する糖尿病の予防薬または治療薬、
（１８） 下記式
【００４３】
【化２１】
【００４４】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する抗脳虚血剤、
（１９） 下記式
【００４５】
【化２２】
【００４６】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する腫瘍の治療薬若しくは予防薬または抗転移薬、
（２０） 下記式
【００４７】
【化２３】
【００４８】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する悪液質の予防薬または治療薬、
（２１） 下記式
【００４９】
【化２４】
【００５０】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する遺伝子治療制御剤、
（２２） 下記式
【００５１】
【化２５】
【００５２】
で表される化合物に塩素化剤を反応させることを特徴とする、下記式
【００５３】
【化２６】
【００５４】
で表される化合物の製造方法、
（２３） 下記式
【００５５】
【化２７】
【００５６】
で表される化合物にメタンスルホン化剤を反応させることを特徴とする、下記式
【００５７】
【化２８】
【００５８】
で表される化合物の製造方法。
（２４） 下記式
【００５９】
【化２９】
【００６０】
で表される化合物を塩基で処理した後、塩素イオンを反応させることを特徴とする、下記式
【００６１】
【化３０】
【００６２】
で表される化合物の製造方法に関する。
【００６３】
本明細書において「化合物Ａ」とは、下記式
【００６４】
【化３１】
【００６５】
で表される化合物または上記（２）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００６６】
本明細書において、「化合物Ｂ」とは、下記式
【００６７】
【化３２】
【００６８】
で表される化合物または上記（３）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００６９】
本明細書において「化合物Ｄ」とは、下記式
【００７０】
【化３３】
【００７１】
で表される化合物または上記（４）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００７２】
本明細書において「化合物Ｅ」とは、下記式
【００７３】
【化３４】
【００７４】
で表される化合物または上記（５）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００７５】
本発明の化合物のうち、Ａ物質、Ｅ物質及びＣ物質は低酸素応答誘導活性を有するため、血管新生誘導剤、嫌気的糖代謝活性化剤、エネルギー代謝改善・賦活剤、虚血性心疾患治療薬、潰瘍、火傷、創傷治癒薬、糖尿病性神経障害治療薬、赤血球生産増強薬・貧血治療薬、抗肥満薬・脂肪組織形成抑制剤、抗糖尿病剤、抗脳虚血薬、抗腫瘍薬・抗転移薬、悪液質治療薬または遺伝子治療制御剤あるいはこれらの疾患の予防剤として有用である。
【００７６】
上記Ｂ物質はＡ物質またはＣ物質の合成中間体として、Ｃ物質はＡ物質の合成中間体として、Ｄ物質はＥ物質の合成中間体として、それぞれ使用することができる。
【００７７】
本発明の化合物は、種々の異性体を有する。すなわち、本発明の化合物は不斉炭素原子を有するため光学異性体が存在し、各々がＳ配位、Ｒ配位である立体異性体が存在する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明はこれら各々の異性体およびこれらの異性体の混合物も全て含む。これらの異性体は、立体特異的合成法を使用し、または光学活性化合物を原料化合物として使用して、直接製造するか、または、異性体の混合物から常法により抽出することにより得ることができる。
【００７８】
本発明の化合物として好適には、以下の式で表される光学異性体である。
【００７９】
【化３５】
【００８０】
本発明の化合物は、塩基性の基及び酸性の基を有するので、酸または塩基と反応して塩になることができる。本発明はそのような化合物の塩も包含する。本発明の化合物が医薬として使用される場合、本発明の化合物の塩は、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。
【００８１】
酸との塩としては、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸の塩；酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩などのカルボン酸の塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸の塩；グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸の塩等が挙げられ、好適には無機酸の塩又はカルボン酸の塩であり、更に好適には塩酸塩、硝酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩又はシュウ酸塩である。
【００８２】
また、塩基との塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属の塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、コバルト等の金属塩；アンモニウム等の無機塩；ｔ−オクチルアミン、ジベンジルアミン、モルフォリン、グルコサミン、フェニルグリシンアルキルエステル、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、グアニジン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン、ピペラジン、テトラメチルアンモニウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩の塩等を挙げることができる。
【００８３】
本発明の塩として好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００８４】
また、本発明の化合物は、大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があり、そのような塩も本発明に包含される。
【００８５】
さらに、本発明の化合物は、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があるが、そのような塩も本発明に包含される。
【００８６】
周知のとおり、放線菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ ６０１０１株もこの点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ ６０１０１株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ちＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を生産する、ＳＡＮＫ ６０１０１株およびその変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ ６０１０１株に包含されるものである。
【００８７】
【発明の実施の形態】
１．生産菌について
本発明のＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質の製造法において用いられるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株としては、例えばストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１株を挙げることができる。ＳＡＮＫ ６０１０１株は茨城県岩井市で採集した土壌から土壌希釈法による希釈液から分離できる。ＳＡＮＫ ６０１０１株の菌学的特徴は、次のとおりである。
（１）形態学的特徴
ＳＡＮＫ ６０１０１株は、ＩＳＰ．〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕規定の寒天培地上２８℃、１４日間培養後、顕微鏡下観察では、ＳＡＮＫ ６０１０１株の基生菌糸は良好に伸長、分岐し、薄黄、薄黄味茶乃至黄味灰を示すが、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様の菌糸断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐し、薄青乃至は青味灰を示す。気菌糸の先端に３乃至１０個またはそれ以上の胞子連鎖を形成し、胞子連鎖の形態はフック乃至ループ状を示す。走査型電子顕微鏡による観察では、胞子の表面構造は平滑乃至しわ状を示す。胞子は楕円形で、その大きさは０．４〜０．６×１．５〜２．０μｍである。また、気菌糸の車軸分岐、菌核や胞子のうなどの特殊器官は観察されない。
（２）各種培養基上の諸性質
各種培養基上で２８℃、１４日培養後の性状は表１に示したとおりである。色調の表示はマンセル方式による日本色彩研究所版「標準色票」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。
【００８８】
【表１】
（３）生理学的性質
２８℃で培養後、２乃至２１日間に観察したＳＡＮＫ ６０１０１株の生理学的性質は表２に示したとおりである。
【００８９】
【表２】
また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ． ９）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ ６０１０１株の炭素源の資化性は表３に示すとおりである。
【００９０】
【表３】
（４）化学分類学的性質
ＳＡＮＫ ６０１０１株の化学分類学的性状は放線菌の分類と同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 〔日本放線菌学会編、日本学会事務センター、４９−８２頁（２００１）〕に従い検討した。その結果、細胞壁からＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出され、全細胞中の糖成分として特徴的なパターンは認められなかった。主要メナキノン分子種としてＭＫ−９（Ｈ２）， ＭＫ−９（Ｈ４）が検出された。
【００９１】
ＩＳＰ．〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕基準、ワックスマン著、ジ・アクチノミセテス（Ｓ．Ａ． Ｗａｋｓｍａｎ、Ｔｈｅ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻、ブキャナンとギボンズ編、バージーズ・マニュアル（Ｒ． Ｅ． Ｂｕｃｈａｎａｎ ａｎｄ Ｎ． Ｅ． Ｇｉｂｂｏｎｓ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９７４年）、バージーズ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第 ４ 巻（１９８９年）、放線菌の分類と同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 〔日本放線菌学会編、日本学会事務センター（２００１）〕およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に関する最近の文献によって同定を行い、本菌株が放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属すると判断した。そこで、本菌株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１株と同定した。なお、本菌株は２００２年４月１２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６を付与された。
【００９２】
また、Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を生産するＳＡＮＫ ６０１０１株の変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、生物化学の分野で通常使用される遺伝学的方法、例えば組み換え、形質導入、形質転換等により得ることができる。
【００９３】
２．培養について
Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を得るための、微生物の培養は、通常発酵生成物を生産するために用いられている培地中で行うことができる。このような培地には、微生物が同化できる炭素源、窒素源および無機塩を含有する。
【００９４】
一般に、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いることができる。一般には、培地量の１〜１０重量％で変量するが、この範囲に限定されない。
【００９５】
窒素源としては、一般に蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩を用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、綿実粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で用られることが好ましい。
【００９６】
栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩化物、炭酸等のイオンを得ることのできる通常の塩類を使用し得る。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属の塩も使用し得る。
【００９７】
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。
【００９８】
ＳＡＮＫ ６０１０１株を培養し、Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を生産する培地のｐＨは、５．０〜８．０に変化できる。
【００９９】
本菌株は１４℃乃至４５℃の範囲で生育し、特に１９．５℃乃至３９．５℃の範囲で良好に生育する。更にＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質の生産には２２℃乃至３０℃が好適である。
【０１００】
Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質は、好気的な培養により生産され、その培養方法としては、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等が用いられる。
【０１０１】
小規模には、振とう培養機を使用し、三角フラスコ中の液体培地で培養する。フラスコは通常のものまたは水流調節壁がついたものを用い、１００〜２５０ ｒｐｍでフラスコを振とうすることが好適である。培養は一段階または複数段階の種培養の発育工程を経ておこなうことができる。種培養フラスコは１乃至１０日間、または菌体の成長が目視で確認できるまで培養する。成長した種培養液は、その一部または全部を次段階の種培地または生産培地への接種に使用することができる。接種した生産培地を含むフラスコを１乃至１０日間培養し、培養終了後、フラスコの含有物を回収する。
【０１０２】
大量の培養の場合には、攪拌機、通気装置をつけた適当なタンクで通気攪拌培養をすることが好ましい。この場合、栄養培地をタンクの中で作製することができる。栄養培地を１２１℃乃至１３０℃まで加熱して滅菌し、冷却後、小規模または大規模培養の方法であらかじめ成長させてあった種培養液を接種する。攪拌速度、通気量、溶存酸素濃度を制御し、１乃至１０日間培養をおこない、内容物を回収する。この培養方法は多量の化合物を得るのに適している。
【０１０３】
培養の経過にしたがって生産される目的化合物の量の経時変化を知るには、例えば培養液の一部を等量のアセトンで抽出、アセトン留去後、酸性条件下酢酸エチル抽出し、濃縮、乾固した油状物中の目的化合物の量を高速液体クロマトグラフィーに付して測定する。通常は９６時間から１６８時間の培養で目的化合物の生産量は最高値に達する。
【０１０４】
３．抽出精製
培養終了後、培養液中の液体部分および菌体に存在する目的化合物は、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、菌体およびそのろ液または上清中に存在する目的化合物をその物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。
【０１０５】
例えば、目的化合物を含む溶液を、水と混和しない有機溶剤、たとえば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の単独またはそれらの組合せにより、目的化合物を抽出することにより精製が可能である。
【０１０６】
また、活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上、ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上、三菱化学（株）社製）等が使用される。目的化合物を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または目的化合物を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることにより得られる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス ５０Ｗ×４、ダウエックス１×２、ダウエックス ＳＢＲ−Ｐ（ダウ・ケミカル社製）等が使用される。目的化合物を含む上記のごときイオン交換樹脂の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または目的化合物を吸着させた後、塩酸やアンモニア水を用いて溶出させることにより得られる。
【０１０７】
このようにして得られた目的化合物は、さらにシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（アマシャムバイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【０１０８】
目的化合物の精製における所在は化合物が有する物理化学的性質または生物学的性質を利用したさまざまな検出手段によって測定することができる。例えば次に挙げる各々の方法によって測定することができる。
【０１０９】
高速液体クロマトグラフィー
＜Ａ物質＞
分離カラム： ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分、
＜Ｂ物質＞
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分
＜Ｃ物質＞
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： ６０％アセトニトリル−トリエチルアミンリン酸バッファー（０．３％、ｐＨ５）
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ８．９分。
＜Ｄ物質＞
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。
４．Ａ物質、Ｃ物質、Ｅ物質の合成
（Ａ物質またはＣ物質の製造）
また、本発明のＡ物質およびＣ物質は、Ｂ物質を溶媒中、塩素化剤と反応させることによっても得ることができる。
【０１１０】
「塩素化剤」としては、トリブチルホスフィン等のトリアルキルホスフィンまたは置換されていてもよいトリフェニルホスフィンと四塩化炭素の組み合わせを挙げることができる。好適には、トリフェニルホスフィンと四塩化炭素の組み合わせである。
【０１１１】
使用される溶媒としては、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適にはエーテル類である。好適には、脂肪族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類であり、より好適には、ハロゲン化炭化水素類であり、もっとも好適には、ジクロロメタンである。
【０１１２】
反応温度は、原料化合物、反応試薬によって異なるが、−２０℃乃至１００℃で行なわれ、好適には、室温乃至７０℃である。
【０１１３】
反応時間は、反応温度、原料化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異なるが、通常１０分間乃至３日間で、好適には、１５時間乃至４０時間である。
【０１１４】
反応終了後、本反応の目的化合物は、例えば、反応混合物を濃縮し、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することで得られる。
【０１１５】
得られた化合物は、必要ならば、常法、例えば、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって更に精製できる。
（Ｅ物質の製造）
本発明のＥ物質は、Ｄ物質を溶媒中、塩基性条件下にメタンスルホン化剤を反応させることにより得ることもできる。
【０１１６】
「メタンスルホン化剤」としては、メタンスルホニルクロリドを使用することができる。
【０１１７】
使用される塩基としては、例えば、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適には、有機塩基類であり、特に好適にはジメチルアミノピリジンまたはトリエチルアミンである。
【０１１８】
使用される溶媒としては、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適にはエーテル類である。好適には、脂肪族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類であり、より好適には、ハロゲン化炭化水素類であり、もっとも好適には、クロロホルムである。
【０１１９】
反応温度は、原料化合物、反応試薬によって異なるが、−２０℃乃至１００℃で行なわれ、好適には、室温乃至７０℃である。
【０１２０】
反応時間は、反応温度、原料化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異なるが、通常１０分間乃至３日間で、好適には、１５時間乃至４０時間である。
【０１２１】
反応終了後、本反応の目的化合物は、例えば、反応混合物を濃縮し、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することで得られる。
【０１２２】
得られた化合物は、必要ならば、常法、例えば、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって更に精製できる。
（Ｃ物質の製造）
本発明のＡ物質は、Ｃ物質を塩基で処理した後、塩素イオンを反応させることにより得ることもできる。
▲１▼塩基処理
使用される塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウムのようなアルカリ金属炭酸塩類；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウムのようなアルカリ金属炭酸水素塩類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、リチウムメトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド類を挙げることができ、好適には、アルカリ金属アルコキシド類であり、特に好適にはカリウムｔ−ブトキシドである。
【０１２３】
塩基処理に使用される溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ‐ブチルアルコール、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノール、シクロヘキサノールのようなアルコール類を挙げることができ、好適には、ｔ−ブチルアルコールである。
▲２▼塩素イオンとの反応
塩素イオンを与える物質としては、塩酸、塩化ピリジニウム、または、塩化ベンジルトリエチルアンモニウムのようなテトラアルキルアンモニウム塩を挙げることができ、好適には、塩化ピリジニウムである。
【０１２４】
使用される溶媒としては、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適にはエーテル類である。好適には、脂肪族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類であり、より好適には、ハロゲン化炭化水素類であり、もっとも好適には、ジクロロメタンである。
【０１２５】
反応温度は、原料化合物、反応試薬によって異なるが、−２０℃乃至１００℃で行なわれ、好適には、室温乃至７０℃である。
【０１２６】
反応時間は、反応温度、原料化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異なるが、通常１０分間乃至３日間で、好適には、１５時間乃至４０時間である。
【０１２７】
反応終了後、本反応の目的化合物は、例えば、反応混合物を濃縮し、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することで得られる。
【０１２８】
得られた化合物は、必要ならば、常法、例えば、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって更に精製できる。
５．投与形態
本発明のＡ物質、Ｅ物質またはＣ物質を医薬として使用する場合には、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、注射剤、局所投与剤、経膣剤、経皮吸収剤等により非経口的に又は吸入剤により経口若しくは経鼻的に投与することができる。
【０１２９】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビットのような糖類；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプンのようなデンプン誘導体；結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩類；リン酸カルシウムのようなリン酸塩類；炭酸カルシウムのような炭酸塩類；硫酸カルシウムのような硫酸塩類等）、結合剤（例えば、前記のデンプン誘導体又はセルロース誘導体；ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等）、崩壊剤（例えば、前記のデンプン誘導体又はセルロース誘導体；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾された、デンプン又はセルロース誘導体等）、滑沢剤（例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；ビーズワックス、ゲイロウのようなワックス類；グリコール；フマル酸のようなカルボン酸類；硫酸カルシウムのような硫酸類塩；ロイシン；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；前記の賦形剤におけるデンプン誘導体等）、安定剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；無水酢酸；ソルビン酸；ホウ酸；アジピン酸；安息香酸ナトリウムのようなカルボン酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；レチノ−ル、トコフェロール、アスコルビン酸ナトリウムのような抗酸化剤、合成ヒドロスルファイト等）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等）、懸濁化剤（例えば、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）、希釈剤、製剤用溶剤（例えば、水、エタノール、グリセリン、生理食塩水、グルコース溶液、シクロデキストリン分子当たり２乃至１１個のヒドロキシプロピル基を有するα、β、又はγ−シクロデキストリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００等）等の添加物を用いて周知の方法で製造される。
【０１３０】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１日当たり下限１ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１０００ｍｇ）を、静脈内投与の場合には、１日当たり下限０．１ｍｇ（好適には０．５ｍｇ）、上限６００ｍｇ（好適には、５００ｍｇ）を成人に対して、１日当り１乃至６回症状に応じて投与することが望ましい。
【０１３１】
【実施例】
次に、実施例、試験例、製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
（実施例１） Ａ物質の製造
（Ａ）培養
ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１株を培地組成−１で示される培地４５０ｍｌを含む２リットル容三角フラスコに、スラントより接種し、回転振盪培養機を用いて、２１０ｒｐｍ、２８℃で１４４時間培養したものを種培養液とした。次に、培地組成−１で示される培地１５リットルを３０リットル容ジャー・ファーメンターに入れ、１２１℃で３０分間加熱滅菌した。これを２８℃に冷却した後、種培養液４５０ｍｌを接種し、毎分１５リットルの空気を通気し、溶存酸素量５．０ｐｐｍを保持させるように回転数を１００から２８０ｒｐｍの範囲内で調整しながら２８℃で、２４時間通気攪拌培養したものを前培養液とした。次に、培地組成−２で示される培地３００リットルを６００リットル容タンクに入れ、１２１から１２７℃で３５分間加熱滅菌した。これを２６℃に冷却した後、前培養液９リットルを接種し、毎分３００リットルの空気を通気し、溶存酸素量５．０ｐｐｍを保持させるように回転数を８３から１１０ｒｐｍの範囲内で調整しながら、２６℃で、１６８時間攪拌培養した。
［培地組成−１］
グルコース ３．０％
生イースト １．０％
大豆粉 ３．０％
炭酸カルシウム ０．４％
硫酸マグネシウム７水和物 ０．２％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．０１％
滅菌前ｐＨ７．２
［培地組成−２］
シュークロース ５．０％
生イースト １．０％
大豆粉 ３．０％
炭酸カルシウム ０．４％
硫酸マグネシウム７水和物 ０．２％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．０１％
滅菌前ｐＨ７．２
（Ｂ）単離
得られた培養液３１０リットルを塩酸でｐＨ５．０に調整した後、アセトンを３１０リットル加えて抽出した。これにろ過助剤としてセライト５４５（ジョンズ マンビル プロダクト コーポレーション製）１０ｋｇを加えてろ過し、アセトン抽出液５７０リットルを得た。そして塩酸でｐＨを２．９に調整して３００リットルの酢酸エチルで抽出し、抽出液を４３０リットル得た。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質およびＤ物質を含む抽出物２８２．４ｇを得た。
【０１３２】
次いでこの抽出物をコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ １４リットル）を用いて精製した。あらかじめコスモシルカラムをアセトニトリル：水＝３：７で平衡化し、抽出物２８２．４ｇを５００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液を全量吸着後、アセトニトリル：水＝２：３、アセトニトリル：水＝１：１、アセトニトリル：水＝３：２各４０リットルで段階溶出し、１０リットルずつ１２分画した。
【０１３３】
Ａ物質およびＣ物質を含むフラクションＮｏ．９からＮｏ．１１を集め、活性画分３０リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質およびＣ物質を含む粗精製物１６．８ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣＰａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物１６．８ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２を溶媒として流速２５０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間６２．４から６６．６分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分２リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル１．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質の無色粉末９６０ｍｇを得た。
【０１３４】
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分
（実施例２） Ｂ物質の製造
実施例１に記載のＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質およびＤ物質を含む抽出物２８２．４ｇをコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ １４リットル）にかけた溶出液より、Ｂ物質およびＤ物質を含むフラクションＮｏ．５および６を集め減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＢ物質およびＤ物質を含む粗精製物２０．１ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物２０．１ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１を溶媒として流速２４０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間６６．８から７４．８分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作をして活性画分、４リットルを得た。それを減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＢ物質を含む粗精製物１．５５ｇを得た。
【０１３５】
次いでこの粗精製物をコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ １００ｍｌ）を用いて精製した。あらかじめコスモシルカラムをアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝２：３で平衡化し、粗精製物１．５５ｇをメタノール：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）＝３：７ ２０ｍｌに溶解して全量を吸着してアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝１：１で溶出し、１８ｍｌずつ分画した。Ｂ物質を含むフラクションＮｏ．８からＮｏ．１３までを集め１２０ｍｌ得た．減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＢ物質を含む粗精製物７３．０ｍｇを得た。さらにＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）で精製した。あらかじめアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝１：１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物をメタノール１．８ｍｌに溶解した試料溶液１５０μｌを注入後、アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝１：１を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間１２．０から１３．８分までを分取した。残りの試料溶液についても同様に分取し、１３０ｍｌの分取液を得た。減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、濃縮乾固してＢ物質の粗精製物３５．７ｍｇを得た。
【０１３６】
次にこの粗精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）でさらに精製した。あらかじめアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ７．０＝１：１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物３５．７ｍｇをアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ７．０＝１：１ １ｍｌに溶解した試料溶液１３０μｌを注入後、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ７．０＝１：１を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間３．０から４．８分までを分取した。残りの試料溶液についても同様に分取して８７ｍｌを得た。それを減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨを３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、濃縮乾固してＢ物質の無色粉末２６．０ｍｇを得た。
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝６：４
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分
（実施例３） ビラントマイシン（Ｃ物質）の製造
実施例１に記載のＡ物質およびＣ物質を含む粗精製物１６．８ｇをＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物１６．８ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２を溶媒として流速２５０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間５２．８から６０．８分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分４リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル２．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＣ物質を含む粗精製物５．３４ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）でさらに精製した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物５．３４ｇを６０ｍｌメタノールに溶解した試料溶液３０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２を溶媒として流速２５０ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間５３．２から６１．６分までを分取した。残りの試料溶液３０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分４．２リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル２．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＣ物質の無色粉末４．８８ｇを得た。
本化合物は下記の物理化学的性状を有していた：
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝−１３．５°（ｃ ０．５１ ＣＨＣｌ３）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３５１．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３５７３０）、２２７（１１２３０）、３０７（２７４８０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４１１、２９８３、２９２４、１６７３、１６０９、１５１７、１２８９、１２５４、１１３１、１１１０、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６３ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （１Ｈ， ｍ）， １．８１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０９ （１Ｈ， ｍ）， ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １７．０ Ｈｚ， ６．０ Ｈｚ）， ３．３７ （１Ｈ， ｍ）， ３．３９ （３Ｈ， ｓ）， ３．５５ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．３６ （１Ｈ， ｍ）， ４．６４ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ６．５３ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．７６ （１Ｈ， ｓ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄ， １．５ Ｈｚ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．５， １９．９， ２０．６， ２７．８， ３３．５， ３３．６， ５６．２， ５８．１， ５９．４， ７４．０， １１３．６， １１６．１， １１７．５， １２４．８， １２６．５， １３０．４， １３２．５， １４７．２， １７１．１
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： ６０％アセトニトリル−トリエチルアミンリン酸バッファー（０．３％、ｐＨ５）
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ８．９分。
（実施例４） Ｄ物質の製造法
実施例２に記載のＢ物質およびＤ物質を含む粗精製物２０．１ｇをＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物２０．１ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１を溶媒として流速２４０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間４９．６から６２．８分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作をして活性画分、６リットルを得た。それを減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル３．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＤ物質を含む粗精製物７．７３ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）でさらに精製した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物７．７３ｇを６０ｍｌメタノールに溶解した試料溶液３０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１を溶媒として流速２４０ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間５２．６から６４．４分までを分取した。残りの試料溶液３０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分５．５リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル２．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＤ物質の無色粉末４．８６ｇを得た。
【０１３７】
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。
（実施例５） Ｅ物質の製造法
Ｄ物質の粉末５０ｍｇを４ｍｌのクロロホルムに溶解し、そこに５６０μｌのトリエチルアミンと６０μｌのメタンスルホニルクロライドを加え、室温で２時間攪拌した。この反応溶液に水を加え、ｐＨ４．５で酢酸エチル抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固した。この抽出物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）で精製した。あらかじめアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、抽出物を１．２ｍｌのアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：１に溶解した試料溶液３００μｌを注入後、アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：１を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間３．６から４．５分までを分取した。残りの試料溶液９００μｌについても同様の操作を行い、活性画分２２ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＥ物質の無色粉末８．２ｍｇを得た。
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．４０分
（実施例６） Ａ物質およびＣ物質の製造方法
（６−１）（１Ｒ，９ａＳ）−１−（３，４−ジメチルペンタ−３−エンイル）−１−（メトキシメチル）−３，３−ジメチル−９，９ａ−ジヒドロ−１Ｈ−［１，３］オキサゾロ ［３，４−ａ］インドール−７−カルボン酸（化合物２）
【０１３８】
【化３６】
【０１３９】
実施例２で得られたＢ物質（化合物１）（５ｍｇ； ０．０１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン０．５ｍｌに溶かし、室温にて攪拌した。これに２，２−ジメトキシプロパン（０．０２ｍｌ；０．１５ｍｍｏｌ）とピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸塩（０．４ｍｇ； ０．００１５ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物１の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物２を得た（５ｍｇ；収率８９％）。
ｍｐ： １５５−１５７℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．０９ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ３．９）， １．４９−１．６９ （１３Ｈ， ｍ）， １．７３ （３Ｈ， ｓ）， １．９６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ４．９）， ２．０７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ３．９）， ３．０９ （２Ｈ， ｍ）， ３．３２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．５４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ４．４５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．８， ５．９）， ６．６０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．７４ （１Ｈ， ｓ）， ７．８２（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．３， １９．９， ２０．５， ２７．９， ２８．５， ３０．７， ５９．６， ７０．２， ７６．０， ８２．１， ９４．０， １０９．４， １１８．９， １２４．１， １２６．７， １２７．２， １３１．０， １３２．１， １５３．２， １７２．３
ＩＲ （ＫＢｒ） ｃｍ−１： ３３４２， ２９８４， ２９２４， ２８６１， １６７５， １６０７， １４５０， １３７１， １２６８， １１２１， １０６
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３７４ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３１ＮＯ４ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３７４．２３３１，ｆｏｕｎｄ： ３７４．２３２７
［α］Ｄ ２５ ： ＋１９６．９°（ｃ ０．５９ ＣＨＣｌ３）
（６−２）（１Ｒ，９ａＳ）−１−（３，４−ジメチルペンタ−３−エンイル）−１−（メトキシメチル）−３，３−ジメチル−９，９ａ−ジヒドロ−１Ｈ−［１，３］オキサゾロ［３，４−ａ］インドール−７−カルボン酸 メチルエステル（化合物３）
【０１４０】
【化３７】
【０１４１】
（６−１）で得られた化合物２（１４８ｍｇ； ０．３９６ｍｍｏｌ）をメタノール３ｍｌとジクロロメタン０．１ｍｌの混合溶媒に溶かし、水浴中にて攪拌した。これにトリメチルシリルジアゾメタンの２Ｍヘキサン溶液（１．６ｍｌ； ３．１６８ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。室温にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物２の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物３を得た（１２６ｍｇ； 収率 ８２％）。
ｍｐ： １１４−１１５℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．０８ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ４．９）， １．４８ （３Ｈ， ｓ）， １．５４−１．６２ （ｍ， １０Ｈ）， １．７３ （３Ｈ， ｓ）， １．９６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ２．０７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ４．９）， ３．０８ （２Ｈ， ｍ）， ３．３２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．５４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．８６ （３Ｈ， ｓ）， ４．４４ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．８， ４．９）， ６．６０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．６９ （１Ｈ， ｓ）， ７．７６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．２， １９．８， ２０．５， ２５．９， ２７．９， ２８．６， ２８．８， ３０．８， ５１．６， ７０．２， ７６．０， ８２．１， ９４．１， １０９．６， １２０．０， １２４．１， １２６．１， １２７．２，１３０．０， １３２．０， １５２．６， １６７．４
ＩＲ （ＫＢｒ） ｃｍ−１： ２９８９， ２９２８， ２９０５， ２８６０， １６９８， １６０６， １４９３， １４４９， １３８２， １３６７， １２９６， １２７２， ８４２， ７７０
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３８８ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ４ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３８８．２４８８，ｆｏｕｎｄ： ３８８．２４８８
［α］Ｄ ２５ ： ＋１８７．６°（ｃ ０．４０ ＣＨＣｌ３）
Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ４−０．５Ｈ２Ｏ： Ｃ， ６９．６７； Ｈ， ８．６４； Ｎ， ３．５３． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ，６９．６２； Ｈ， ８．９４； Ｎ， ３．５３
（６−３）（２Ｓ）−２−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−（メトキシメチル）−４，５−ジメチルヘキサ−４−エンイル］インドリン−５−カルボン酸 メチルエステル（化合物４）
【０１４２】
【化３８】
【０１４３】
上記（６−２）で得られた化合物３（１２６ｍｇ； ０．３２５ｍｍｏｌ）をメタノール１ｍｌとジクロロメタン５ｍｌの混合溶媒に溶かし、室温にて攪拌した。これにＰＰＴＳ（４８ｍｇ；０．１９１ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物３の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物４を得た（９５ｍｇ； 収率 ８４％）。
ｍｐ： １６１−１６２℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．４８ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， １．５７ （１Ｈ， ｔｄ，Ｊ＝１２．７． ４．９）， １．６４ （６Ｈ， ｓ）， １．６５ （３Ｈ， ｓ）， ２．０１ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ２．１５ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ３．９）， ２．７３ （２， １Ｈ）， ２．９６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１５．６， ８．８）， ３．０６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１５．６， １０．７）， ３．４２ （４Ｈ， ｍ）， ３．５２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ３．８４ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝９．８）， ４．７３ （１Ｈ， ｂｒ ｓ）， ６．５５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．７２ （１Ｈ， ｓ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．３， １９．９， ２０．５， ２８．１， ２９．９， ３２．６， ５１．５， ５９．５， ６６．１， ７３．０， ７８．３， １０７．５， １１９．８， １２４．４， １２６．０， １２７．１， １２８．１， １３０．６，， １５５．２， １６７．３
ＩＲ （ＣＨＣｌ３） ｃｍ−１： ３６９０， ３４１８， ２９５２， ２９２５， ２８６２， １７０４， １６１４， １４５０， １４３６， １２８２， １１１３
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３４８ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ４ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３４８．２１７５，ｆｏｕｎｄ： ３４８．２１５９
［α］Ｄ ２５ ： ＋０．６°（ｃ ０．９９ ＣＨＣｌ３）
Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ４−０．２５Ｈ２Ｏ： Ｃ， ６８．２５； Ｈ， ８．４５； Ｎ， ３．９８． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ， ６８．４１； Ｈ， ８．４０； Ｎ， ４．０１
（６−４）（２Ｒ，３Ｒ）−３−クロロ−２−（３，４−ジメチルペンタ−３−エンイル）−２−（メトキシメチル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−カルボン酸 メチルエステル（化合物５）
【０１４４】
【化３９】
【０１４５】
上記（６−３）で得られた化合物４（１０ｍｇ； ００２８８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１ｍｌに溶かし、室温にて攪拌した。これに四塩化炭素（０．０８４ｍｌ； ０．８６４ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（４６ｍｇ； ０．１７３ｍｍｏｌ）を加えた。４０℃にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物４の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物５を得た（２．８ｍｇ； 収率 ２７％）。
ｍｐ： １２０−１２１℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．６２−１．６３ （１０Ｈ， ｍ）， １．８１ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１３．２，４．９）， ２．０２ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．２， ４．９）， ２．１０ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ３．１１ （１Ｈ，ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ５．９）， ３．３４−３．４０ （４Ｈ， ｍ）， ３．５５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．８５ （３Ｈ， ｓ）， ４．３６ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝４．９）， ４．５４ （１Ｈ， ｂｒ ｓ）， ６．５３ （１Ｈ， ｄ，Ｊ＝８．８）， ７．７１−７．７３ （２Ｈ， ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．４， １９．９， ２０．６， ２７．８， ３３．４， ３３．７， ５１．５， ５６．３， ７４．０， １１３．６， １１６．０， １１８．８， １２４．８， １２６．６， １２９．６， １３１．７， １４６．４， １６７．２
ＩＲ （ｆｉｌｍ） ｃｍ−１： ３３５６， ２９２３， １６９５， １６１１， １５１５， １４３６， １３３０， １２８８， １２５２， １１９４， １１２８， １１０５， ７７０
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３６６ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２８ＣｌＮＯ３ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３８８．１６５６， ｆｏｕｎｄ： ３８８．１６５９
［α］Ｄ ２５ ： −１９．５°（ｃ ０．３６ ＣＨＣｌ３）
Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２９ＣｌＮＯ３： Ｃ，６５．６５； Ｈ，７．７１； Ｎ，３．８３； Ｃｌ， ９．６９． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ，６５．５２； Ｈ，７．７１； Ｎ，３．８７； Ｃｌ，９．６０
（６−５）Ａ物質およびＣ物質（Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ）
【０１４６】
【化４０】
【０１４７】
上記（６−４）で得られた化合物５（４．８ｍｇ； ００１３１ｍｍｏｌ）をｔ−ブチルアルコールに溶かし、室温にて攪拌した。これにカリウムｔ−ブトキシドの１Ｍｔ−ブチルアルコール溶液（０．０３ｍｌ； ０．０２９ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。８０℃にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物５の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（１ｍｌ）に溶かし、氷浴中にて攪拌した。そこに塩化ピリジニウム（２３ｍｇ； ０．１９７ｍｍｏｌ）を加えた。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え室温にした。酢酸エチルにて抽出、飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を減圧溜去した。残渣を分取ＨＰＬＣ（展開溶媒；６０％ＭｅＣＮ−５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ （ｐＨ ４））にて精製し、淡黄色油状物質としてＡ物質（０．４ｍｇ； 収率 ９％）およびＣ物質（２．７ｍｇ； 収率 ５９％）を得た。
〈Ａ物質〉
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １．６４ （６Ｈ， ｍ）， １．６６ （３Ｈ， ｓ）， １．７５ （１Ｈ， ｔｄ，Ｊ＝１３．２， ４．９）， １．８６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１３．２， ４．９）， ２．１６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ２．２７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．２， ４．９）， ３．１２ （２Ｈ， ｍ）， ３．３９ （３Ｈ， ｓ）， ３．６２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ３．６６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１０．７）， ４．３３ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝８．８）， ６．５１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．８）， ７．６３（１Ｈ， ｓ）， ７．６８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １８．６， ２０．１， ２０．６， ２９．９， ３２．０， ３４．８， ５９．４， ６６．０， ７６．２， ７８．５， １０７．６， １１９．７， １２５．６， １２６．９， １２８．０， １２９．０， １３２．２， １５７．５， １７０．８
ＩＲ （ＣＨＣｌ３） ｃｍ−１： ２９２６， １６７４， １６１１， １４５５， １４２４， １２７０， １１２２
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３５２（（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３５２．１６７９， ｆｏｕｎｄ： ３５２．１６９４
［α］Ｄ ２５ ： ＋６０．８°（ｃ １．０９ ＣＨ３ＯＨ）
〈Ｃ物質（Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ）〉
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １．５４−１．６７ （１１Ｈ， ｍ）， ２．０６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７，４．９）， ２．１７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７． ４．９）， ３．０６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１７．６， ４．９）， ３．３３−３．３８（４Ｈ， ｍ）， ３．５０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ３．５９ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ４．４３ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝４．９），６．６１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．６３ （２Ｈ， ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １８．６， ２０．１， ２０．６， ２８．９， ３４．６， ５８．４， ５８．９， ５９．６， ７４．８， １１４．２， １１６．９， １１８．７， １２５．２， １２８．２， １３０．７， １３３．０， １４８．９， １７０．７
ＩＲ （ＣＨＣｌ３） ｃｍ−１： ２４２８， ２９２６， １６７５， １６０９， １４２９， １３３０， １２９０， １２５４， １１３２， １１１１
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３５２（（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３５２．１６７９， ｆｏｕｎｄ： ３５２．１６９３
［α］Ｄ ２５ ： ＋１８．１°（ｃ １．０９ ＣＨ３ＯＨ）
（実施例７） Ａ物質の製造方法
【０１４８】
【化４１】
【０１４９】
実施例３または実施例６で得られたＣ物質（５０ｍｇ； ００１３１ｍｍｏｌ）をｔ−ブチルアルコール（０．５ｍｌ）に溶かし、室温にて攪拌した。これにカリウムｔ−ブトキシドの１Ｍｔ−ブチルアルコール溶液（０．３ｍｌ； ０．３１ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。８０℃にて攪拌し、溶媒を減圧留去した。
【０１５０】
得られた残渣をメタノール（３ｍｌ）に溶かし、氷浴中にて攪拌した。そこに塩化ピリジニウム（２４６ｍｇ； ２．１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え室温にした。酢酸エチルにて抽出、飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を減圧溜去した。残渣を分取ＨＰＬＣ（展開溶媒；６０％ＭｅＣＮ−５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ （ｐＨ ４））にて精製し、淡黄色油状物質として化合物Ａ（５ｍｇ； 収率 ９％）および化合物Ｃ（２５ｍｇ； 収率 ５０％）を得た。
（試験例１） ＨＩＦ−１安定化試験
ＨＲＥに結合して生物活性をしめすＨＩＦ−１のαサブユニット（ＨＩＦ−１α）の蛋白質量増加を測定することで低酸素応答の誘導を確認した。
【０１５１】
ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞８×１０５個を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有したダルベッコ改変ミニマムエッセンシャル培地（ＤＭＥＭ）４ｍｌに懸濁し、培養用６０ｍｍディッシュに接種して、３７度、二酸化炭素濃度５％、湿度１００％の炭酸ガスインキュベーター中で培養した。培養１８時間後に、培養培地４ｍｌに対して被検試料のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液またはＤＭＳＯのみをＤＭＳＯの終濃度が０．５％となるように添加し、さらに６時間、炭酸ガスインキュベーター中で培養した。また、対照低酸素処理試料として、ＤＭＳＯのみを加えた細胞を６時間、酸素濃度０．８％に維持した３７度、二酸化炭素濃度５％、湿度１００％の低酸素炭酸ガスインキュベーターで培養した。
【０１５２】
処理した培養細胞から、定法に従い、抽出用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１ｍＭ エチレンジアミンテトラアセテート、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％トリトンＸ−１００、０．１％デオキシコール酸、１ｍＭオルソバナジン酸、コンプリートプロテアーゼインヒビター（ロシュ社製））を用いて１００μｌの細胞抽出液を作製した。この試料を以下に示す操作でウエスタンブロット解析によるＨＩＦ−１α蛋白質の量評価に供した。細胞抽出液２０μｇを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＭＯＰＳバッファーの系でゲルの操作法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、蛋白質を分離した。蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ミリポア社製）に転写し、メンブレンの操作法に従い、ブロッキング溶液（５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝食塩水）にてブロック、ブロッキング溶液に２５０倍希釈した抗ＨＩＦ−１α抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）との反応、ブロッキング溶液に５，０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）との反応をおこなった。これをＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社製）およびＸ線フィルム（コダック社製）を用い、操作法に従いフィルムを感光させたのち、現像した。
【０１５３】
この方法においてＡ物質およびＣ物質は図１に示したように、Ｅ物質は図２に示したように、２０および２００ｎｇ／ｍｌにてＨＩＦ−１α量を無処理の場合と比較して顕著に増加させた。
（試験例２）ＶＥＧＦ誘導試験
ＶＥＧＦの、培養上清中の量をＥＬＩＳＡ測定することで低酸素応答誘導の程度を求めた。
【０１５４】
ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞２×１０４個を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１００μｌに懸濁し、９６穴培養プレートに接種して、３７度、二酸化炭素濃度５％、湿度１００％の炭酸ガスインキュベーター中で培養した。培養培地１００μｌに対してＤＭＳＯに溶解した被検試料溶液０．５μｌを加えて２４時間炭酸ガスインキュベーター中で培養後、培養上清８０μｌを回収し測定試料液とした。また、対照低酸素処理試料として、ＤＭＳＯのみを加えた細胞を２４時間、酸素濃度０．８％に維持した炭酸ガスインキュベーター中で培養した上清を用いた。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ測定キット（Ｇｅｎｚｙｍｅ ＴＥＣＨＮＥ製）の添付プロトコールに従って行った。試料液はキット添付のＳｔａｎｄａｒｄ Ｂｕｆｆｅｒ ＧＴ５Ｋで５倍に希釈してアッセイに使用し、添付標準試料との比較によりＶＥＧＦ濃度を算出した。
【０１５６】
この方法においてＡ物質および天然および合成Ｃ物質は表４に示したように、Ｅ物質は表５に示したように、１２．５または２５および５０ｎｇ／ｍｌにてＶＥＧＦ量を無処理の場合と比較して顕著に増加させた。
【０１５７】
【表４】
【０１５８】
【表５】
【０１５９】
【発明の効果】
以上のように本発明のＡ物質、Ｃ物質およびＥ物質は、低酸素応答を誘導する顕著な活性を有するので、血管新生誘導剤、嫌気的糖代謝活性化剤、エネルギー代謝改善・賦活剤、虚血性心疾患治療薬、潰瘍、火傷、創傷治癒薬、糖尿病性神経障害治療薬、赤血球生産増強薬・貧血治療薬、抗肥満薬・脂肪組織形成抑制剤、抗糖尿病剤、抗脳虚血薬、抗腫瘍薬・抗転移薬、悪液質治療薬、遺伝子治療制御剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ物質およびＣ物質のＨＩＦ−１α安定化活性
検体で処理したＨｅｐＧ２細胞の抽出液を試料として、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いてウェスタンブロッティングをおこなった。１と４．対照（ＤＭＳＯ）、２と３．低酸素処理、５．Ａ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、６．Ａ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、７．Ａ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）、８．実施例３のＣ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、９．実施例３のＣ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、１０．実施例３のＣ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）。
【図２】Ｃ物質およびＥ物質のＨＩＦ−１α安定化活性
検体で処理したＨｅｐＧ２細胞の抽出液を試料として、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いてウェスタンブロッティングをおこなった。１．低酸素処理、２．対照（ＤＭＳＯ）、３．実施例６のＣ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、４．実施例６のＣ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、５．実施例６のＣ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）、６．Ｅ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、７．Ｅ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、８．Ｅ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）。
【発明の属する技術分野】
本発明は、低酸素応答誘導活性を有する化合物、該化合物を有効成分とする医薬、特に血管新生誘導、嫌気的糖代謝活性化、エネルギー代謝改善・賦活等の活性によって治療または予防できる疾患の治療薬または予防薬、虚血性心疾患、潰瘍、火傷、創傷、糖尿病性神経障害、赤血球生産低下・貧血、肥満・脂肪組織形成、糖尿病、脳虚血、腫瘍・転移、悪液質の治療薬または予防薬、遺伝子治療制御剤、並びに、該化合物の製造法及びその原料化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体・細胞は、低酸素、低栄養または低糖濃度等の刺激に暴露されると、低酸素応答エレメント（ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、以下「ＨＲＥ」という。）を介して低酸素応答をすることが知られている。ＨＲＥは、例えば５’−ＲＣＧＴＧ−３’（Ｒはプリン塩基）等の、転写因子ハイポキシアインデューシブルファクター（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）（以下、「ＨＩＦ」という。）が結合する塩基配列である。ＨＲＥは、上記刺激により転写が活性化する遺伝子群（以下、「低酸素応答遺伝子」という。）の発現調節部位に存在し、本配列に転写因子ＨＩＦが結合することにより低酸素応答遺伝子の転写が誘導される。
【０００３】
ＨＩＦは、ハイポキシアインデューシブルファクター−１（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ−１）（以下、「ＨＩＦ−１」という。）およびハイポキシアインデューシブルファクター−２（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−２）（以下、「ＨＩＦ−２」という。）の総称であり、上記の刺激に応答して蛋白量および生物活性が増加すると考えられている。ＨＩＦ−１またはＨＩＦ−２は、それぞれ、ハイポキシアインデューシブルファクター−１α（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）（以下、「ＨＩＦ−１α」という。）またはハイポキシアインデューシブルファクター−２α（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−２α）（以下、「ＨＩＦ−２α」という。）（ＥＰＡＳ）と、Ａｒｎｔ（ハイポキシアインデューシブルファクターβ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒβ）（以下、「ＨＩＦβ」という。））との複合体からなる。
【０００４】
低酸素応答遺伝子としては、血管内皮増殖因子（以下、「ＶＥＧＦ」という。）、エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」という。）、血管内皮増殖因子レセプターＦＬＴ−１ （以下、「ＶＥＧＦＲ−１」という。）、α１Ｂアドレナジックレセプター（α１Ｂ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アドレノメジュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、エンドセリン１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）、ヘムオキシゲナーゼ（ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ １、以下、「ＨＯ−１」という。）、ニトリックオキシドシンターゼ２（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １、以下、「ＰＡＩ１」という。）、グルコーストランスポーター１（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、グルコーストランスポーター３（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）１、ヘキソキナーゼ２、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）などが報告されている（非特許文献１参照）。またＨＩＦはＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３を誘導することでペルオキソームプロリファレーターアクティベイティッドレセプター（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ（以下、「ＰＰＡＲγ」という。）の発現を抑制することが報告されている（非特許文献２参照）。また、ＨＩＦは６−ホスホフルクト２−キナーゼ／フルクトース２，６−ビスホスファターゼ３（６−ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏ−２−ｋｉｎａｓｅ／ｆｒｕｃｔｏｓｅ−２，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ３、以下、「ＰＦＫＢＦ３」という。）を誘導する。ＰＦＫＢＦ３はフルクトース２，６−ビスホスフェート（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−２，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産することでホスホフルクトキナーゼ１（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ １）を活性化、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を阻害する（非特許文献３参照）。さらにＨＩＦはｐ５３、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、以下、「ｉＮＯＳ」という。）を誘導する（非特許文献４参照）。
【０００５】
上記低酸素応答遺伝子のうち、ＶＥＧＦおよびＦＬＴ−１は血管新生において主要な役割を果たすことが報告されている（非特許文献５、非特許文献６参照）。このほかにもα１Ｂアドレナジックレセプター、アドレノメジュリン、エンドセリン１、ＨＯ−１、誘導性一酸化窒素合成酵素２、ＰＡＩ１は血管新生に働くと考えられている（非特許文献１参照）。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、血管新生誘導剤として有用である。
【０００６】
また、解糖系は細胞におけるエネルギー生産に重要な役割を果たしており、特に低酸素時には必須のエネルギー供給経路となる。グルコーストランスポーター１およびグルコーストランスポーター３の誘導はグルコースの細胞への取り込みを促進すると考えられており、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、乳酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＰＦＫＢＦ３などの発現はグルコースを原料とする解糖系を活性化すると考えられている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、嫌気的糖代謝活性化剤、エネルギー代謝改善・賦活剤として有用である。
【０００７】
さらに、虚血状態にある心筋に血管新生を誘導または嫌気的糖代謝を促進すると、梗塞部位を含む心筋の血流を改善し、酸素および栄養源補給を増大し、または虚血状態の細胞のエネルギー代謝を改善することにより、心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患の予防、進行・発症の抑制、回復促進活性を示すことが期待されている。また、虚血性心疾患の動物モデルである、ラット心臓冠状動脈虚血再環流試験においてＨＯ−１を発現させる遺伝子治療が組織破壊保護作用を示すことが報告されている（非特許文献７参照）。従って、低酸素応答誘導能を有し、血管新生を誘導または嫌気的糖代謝を促進する化合物は、虚血性心疾患治療薬として有用である。
【０００８】
潰瘍、火傷、創傷部位においては血管新生誘導活性および嫌気的糖代謝促進活性を通じ、損傷を受けた組織の細胞死抑制および組織再生促進効果が期待されている。また、低酸素応答遺伝子の一つであるＶＥＧＦは、消化管潰瘍モデル動物実験系において治療効果を有することが報告されている（非特許文献８参照）。また、火傷および創傷を負った患者において、ＶＥＧＦ誘導と治癒との相関が報告され、ＶＥＧＦの治癒促進活性が示唆されている（非特許文献９参照）。従って、低素応答誘導能を有する化合物は、潰瘍、火傷、創傷治癒薬として有用である。
【０００９】
糖尿病性神経障害においては、末梢組織が虚血状態に起因する損傷を受けることが主要な病態である。組織に血管新生を誘導または嫌気的糖代謝を促進することで、組織損傷の抑制・予防・治療効果が期待される。また、低酸素応答遺伝子の一つであるＶＥＧＦは、動物実験系において糖尿病性神経障害治療効果を発揮することが報告されている（非特許文献１０参照）。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、糖尿病性神経障害治療薬として有用である。
【００１０】
上記低酸素応答遺伝子のうち、ＥＰＯは赤血球生産において不可欠な役割を果たし、様々なタイプの貧血の治療に用いられている（非特許文献１１参照）。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、赤血球生産増強薬・貧血治療薬として有用である。
【００１１】
また、上記低酸素応答遺伝子のうち、ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化促進活性を有する。嫌気的糖代謝を活性化すること、およびＰＰＡＲγの発現を低下させて脂肪細胞の分化を抑制することで、抗肥満活性が期待される。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、抗肥満薬・脂肪組織形成抑制剤として有用である。
【００１２】
さらに、上記低酸素応答遺伝子のうちグルコーストランスポーターは、高発現により、細胞内へのグルコース取り込みが促進する。また解糖系の活性化により、グルコース消費が促進される。さらにＰＦＫＢＦ３高発現によって生じたフルクトース２，６−二リン酸は解糖系を活性化すると共にフルクトース１，６−ビスホスファターゼを阻害し、糖新生を抑制する。低酸素応答誘導能を有する化合物は、これらの現象により達成される、血中からのグルコース取り込み、消費の活性化、および血中へのグルコース供給の抑制を通じ、血糖低下作用および糖尿病予防・治療効果を発揮することが期待されている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、抗糖尿病剤として有用である。
【００１３】
脳梗塞をはじめとする脳虚血時には、低酸素に暴露された神経細胞の細胞死が観察される。ＨＩＦは、血管新生または嫌気的糖代謝活性化または赤血球増強活性を通じて脳虚血時の組織傷害を抑制することが期待される。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は、抗脳虚血薬として有用である。
【００１４】
腫瘍細胞の原発巣および転移巣においては、ＨＩＦの活性化によりＶＥＧＦが発現することで腫瘍組織に血管新生を誘導する。全身性にＨＩＦ誘導を通じてＶＥＧＦ濃度を上昇させることで腫瘍組織周辺のＶＥＧＦ濃度勾配を破壊し、腫瘍組織における血管新生を阻害することが期待される。低酸素刺激で誘導されたＨｉｆ−１は、ｐ５３の産生量および生物活性を増大させることが知られている（非特許文献１２参照）また、ｐ５３は細胞周期停止、細胞死誘導活性があることが知られている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は抗腫瘍薬・抗転移薬として有用である。
【００１５】
癌に伴って発症する悪液質は糖代謝をはじめとする代謝異常によりエネルギー枯渇を生じる病態である（非特許文献１３参照）。低酸素応答誘導能を有する化合物は、細胞内へのグルコース取り込み、解糖系によるエネルギー産生によってこの症状を緩和することが期待されている。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は悪液質治療薬として有用である。
【００１６】
遺伝子治療において導入遺伝子の発現を制御することは治療の有効性と安全性の見地から非常に重要である（非特許文献１４参照）。ＨＲＥで発現制御されるトランスジーンを体内に導入した場合、ＨＲＥは常酸素状態では遺伝子発現を誘導しないが、活性化された場合にのみどの組織においても迅速に遺伝子を発現誘導することが期待される。従って、低酸素応答誘導能を有する化合物は遺伝子治療制御剤として有用である。
【００１７】
低酸素応答誘導剤は、上述の通り種々の薬理活性が期待されているが、このような化合物としては、現在のところデフェロキサミン（Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）などの鉄キレーター、コバルトイオンなどの金属イオンが知られているのみである。これら、キレーター類や金属イオンは生体内では選択的な薬効を発現しない可能性が高いのみでなく、他の生体機能に影響を与えて副作用が発現する危険性があり、未だ満足すべき低酸素応答誘導剤は存在しない。
【００１８】
また、下記式
【００１９】
【化１０】
【００２０】
【非特許文献１】
Ｇｒｅｇｇ Ｌ． Ｓｅｍｅｎｚａ、「Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」 １４， ｐ．１９８３−１９９１ （２０００）
【非特許文献２】
Ｚ． Ｙｕｎら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ」 ２， ｐ．３３１−３４１ （２００２）
【非特許文献３】
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｍｉｎｃｈｅｎｋｏら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ２７７， ｐ．６１８３−６１８７ （２００２）
【非特許文献４】
Ｖ． Ｃｈｉａｒｕｇｉら、「Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．」 １２５， ｐ．５２５−５２８ （１９９９）
【非特許文献５】
Ｍａｓａｂｕｍｉ Ｓｈｉｂｕｙａ、「Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」 ２６， ｐ．２５−３５ （２００１）
【非特許文献６】
Ｎａｐｏｌｅｏｎｅ Ｆｅｒｒａｒａ、「Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｉｓｉｏｌ．」 ２８０， Ｃ１３５８−Ｃ１３６６（２００１）
【非特許文献７】
Ｌ． Ｇ． Ｍｅｌｏら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」 １０５， ｐ．６０２−６０７ （２００２）
【非特許文献８】
Ｓ． Ｓｚａｂｏら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｉｓ」 ９５， ｐ．３２５−３３５ （２００１）
【非特許文献９】
Ｓ． Ｇｒａｄら、「Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ．」 ３６， ｐ．３７９−８３， （１９９８）
【非特許文献１０】
Ｐｅｔｅ Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒら， 「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」 １０７， ｐ．１０８３−１０９２ （２００１）
【非特許文献１１】
Ｋａｉ−Ｕｗｅ Ｅｃｋａｒｄｔ、「Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」 １６， ｐ．１７４５−１７４９ （２００１）
【非特許文献１２】
Ｗ． Ｇ． Ａｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」 ３９２， ｐ．４０５−４０８ （１９９８）
【非特許文献１３】
Ｊ． Ｍ． Ａｒｇｉｌｅｓら、「Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．」 ２１， ｐ．８３−１０１ （２００１）
【非特許文献１４】
Ｐｈｉｌｉｐ Ｗ． Ｚｏｌｔｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｍ． Ｗｉｌｓｏｎ、「Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」 ９５３， ｐ．５３−６３ （２００１）
【非特許文献１５】
Ａ． Ｎａｋａｇａｗａら、「Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」 ３４， ｐ．４０８−４１５ （１９８１）
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らはこのような観点から新たな低酸素応答誘導活性を有する物質を探索した結果、土壌より分離した、ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＲＲＭ ＢＰ−８０１６）株の培養液中に生産される化合物が低酸素応答の誘導活性を有すること、および同一培養液中に含まれる化合物が低酸素応答の誘導活性を有する化合物の合成中間体になり得る事を見出して本発明を完成した。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１） 下記一般式（Ｉ）又は下記一般式（ＩＩ）
【００２３】
【化１１】
［式中、Ｒ１は、塩素原子又は水酸基を示し、Ｒ２は、水酸基又はメタンスルホニルオキシ基を示す。］
で表される化合物又はその塩、
（２） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋７０．６°（ｃ ０．５，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３５１．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３２８５０）、２２７（１１９５０）、３０８（２４０７０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０２、２９８３、２９２４、１６７２、１６１０、１５０３、１４５５、１４３１、１２７１、１１２０、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６２ （３Ｈ， ｓ） １．６９ （１Ｈ， ｍ）， １．７９ （１Ｈ， ｍ）， ２．１２， （２Ｈ， ｍ）， ３．０１ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ） ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， １０．５ Ｈｚ）， ３．３４ （３Ｈ， ｓ）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ３．６２ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ４．２８ （１Ｈ，ｍ）， ６．４６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ６．７３ （１Ｈ， ｄ， ２．０ Ｈｚ）， ７．５１ （１Ｈ， ｓ）， ７．５６ （１Ｈ，ｄｄ， ８．５ Ｈｚ， １．５ Ｈｚ）， １１．９５ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．２， １９．６， ２０．３， ２８．４， ３０．４， ３３．３， ５８．６， ６３．４， ７３．９， ７８．５， １０６．０， １１８．１， １２４．０， １２５．２， １２６．５， １２７．２， １３０．３， １５５．６， １６７．４
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）（ワイエムシィ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝６：４
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分
（３） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋３０．２°（ｃ０．５，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２７ＮＯ４（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３３３．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０４（３０３４０）、２２６（１１４６０）、３０７（１９１８０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４１１、３３５３、２９８３、２９２４、１６７１、１６１０、１５０３、１４５５、１４３３、１２７０、１１１３、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．３７ （２Ｈ， ｍ）， １．５７ （３Ｈ， ｓ）， １．５７ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．９７ （１Ｈ， ｍ）， ２．０６ （１Ｈ， ｍ）， ２．８９ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， １０．０ Ｈｚ）， ２．９７ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， ９．０ Ｈｚ）， ３．２９ （３Ｈ， ｓ）， ３．３０ （２Ｈ， ｍ）， ３．９７ （１Ｈ， ｍ）， ４．２６ （１Ｈ， ｓ）， ６．３４ （１Ｈ， ｓ）， ６．４３ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４８ （１Ｈ， ｓ）， ７．５３ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， １．０ Ｈｚ）， １１．８７ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．２， １９．６， ２０．３， ２７．６， ２８．８， ３１．８， ５８．６， ６４．２， ７３．２， ７５．０， １０５．９， １１７．５， １２２．８， １２５．２， １２７．７， １２８．０， １３０．２， １５６．３， １６７．５
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分
（４） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：白色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝−１３．９°（ｃ ０．５１、ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２７ＮＯ４（ＴＯＦ−ＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３３３．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３１３００）、２２９（１０３６０）、３０９（２４３１０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４０４、２９８１、２９２６、１６７２、１６０７、１５１７、１２８８、１２５４、１１０８、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．５３ （１Ｈ， ｍ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６３ （３Ｈ， ｓ）， １．８２ （１Ｈ， ｍ）， ２．０７ （２Ｈ， ｍ）， ２．８６ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， ６．０ Ｈｚ）， ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １７．０ Ｈｚ， ４．０ Ｈｚ）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．４９ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ３．６７ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．９９ （１Ｈ， ｍ）， ４．５０ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ６．５０ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， ２．０ Ｈｚ）， ７．７８ （１Ｈ， ｄ， １．５ Ｈｚ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．４， ２０．０， ２０．６， ２７．７， ３２．７， ３３．３， ５７．６， ５９．５， ６７．４， ７５．０， １１３．４， １１７．０， １１７．８， １２４．６， １２６．８， １３０．２， １３３．２， １４７．４， １７１．７
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。
（５） 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）性質：白色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋１０．０°（ｃ ０．２８、ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ６Ｓ；
５）分子量：４１１ （ＡＰＣＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（２５９１０）、２２５（ｓｈ）、２９７（１３８４０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３３９１、２９２５、１６７３、１６０９、１５１８、１３３３、１１７４、１１１１９１６、９００；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．５６ （１Ｈ， ｍ）， １．５８ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．７１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０４ （２Ｈ， ｍ）， ３．０１ （３Ｈ， ｓ）， ３．１５ （１Ｈ， ｄｄ， １７．５ Ｈｚ， ３．０ Ｈｚ）， ３．２２ （１Ｈ， ｄｄ， １７．５ Ｈｚ， ３．０ Ｈｚ）， ３．４３ （３Ｈ， ｓ）， ３．４６ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．５９ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．６６ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ５．０７ （１Ｈ， ｔ， ３．５ Ｈｚ）， ６．５２ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ７．７７ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ７．７８ （１Ｈ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．４， １９．９， ２０．６， ２７．７， ３０．０， ３３．３， ３９．１， ５７．２， ５９．３， ７２．７， ７４．５， １１３．５，１１４．７， １１７．７， １２５．０， １２６．２， １３０．５， １３２．６， １４６．８， １７１．３
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．４０分
（６） ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する、（１）から（４）のいずれか１項に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）から（４）のいずれか１項に記載の化合物を回収することを特徴とする、（１）から（４）に記載の化合物の製造方法（ただし、式（ＩＩ）で表される化合物において、Ｒ２がメタンスルホニルオキシ基である化合物を製造する場合を除く。）、
（７） ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物の生産菌がストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６）株であることを特徴とする、請求項６に記載の製造法、
（８） ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６）、
（９） 下記式
【００２５】
【化１２】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物あるいはその塩を有効成分として含有する医薬、
（１０） 下記式
【００２７】
【化１３】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物あるいはその塩を有効成分として含有する血管新生誘導剤、
（１１） 下記式
【００２９】
【化１４】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する嫌気的糖代謝活性化剤またはエネルギー代謝改善・賦活剤、
（１２） 下記式
【００３１】
【化１５】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する虚血性心疾患の予防薬または治療薬、
（１３） 下記式
【００３３】
【化１６】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する潰瘍、火傷または創傷治癒剤、
（１４） 下記式
【００３５】
【化１７】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する糖尿病性神経障害の予防薬または治療薬、
（１５） 下記式
【００３７】
【化１８】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する赤血球生産増強剤または貧血の予防薬若しくは治療薬、
（１６） 下記式
【００３９】
【化１９】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する抗肥満薬または脂肪組織形成抑制剤、
（１７） 下記式
【００４１】
【化２０】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する糖尿病の予防薬または治療薬、
（１８） 下記式
【００４３】
【化２１】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する抗脳虚血剤、
（１９） 下記式
【００４５】
【化２２】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する腫瘍の治療薬若しくは予防薬または抗転移薬、
（２０） 下記式
【００４７】
【化２３】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する悪液質の予防薬または治療薬、
（２１） 下記式
【００４９】
【化２４】
で表される化合物または（２）若しくは（５）に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する遺伝子治療制御剤、
（２２） 下記式
【００５１】
【化２５】
で表される化合物に塩素化剤を反応させることを特徴とする、下記式
【００５３】
【化２６】
で表される化合物の製造方法、
（２３） 下記式
【００５５】
【化２７】
で表される化合物にメタンスルホン化剤を反応させることを特徴とする、下記式
【００５７】
【化２８】
で表される化合物の製造方法。
（２４） 下記式
【００５９】
【化２９】
で表される化合物を塩基で処理した後、塩素イオンを反応させることを特徴とする、下記式
【００６１】
【化３０】
で表される化合物の製造方法に関する。
【００６３】
本明細書において「化合物Ａ」とは、下記式
【００６４】
【化３１】
で表される化合物または上記（２）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００６６】
本明細書において、「化合物Ｂ」とは、下記式
【００６７】
【化３２】
で表される化合物または上記（３）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００６９】
本明細書において「化合物Ｄ」とは、下記式
【００７０】
【化３３】
で表される化合物または上記（４）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００７２】
本明細書において「化合物Ｅ」とは、下記式
【００７３】
【化３４】
で表される化合物または上記（５）に記載の物理化学的性状を有する化合物である。
【００７５】
本発明の化合物のうち、Ａ物質、Ｅ物質及びＣ物質は低酸素応答誘導活性を有するため、血管新生誘導剤、嫌気的糖代謝活性化剤、エネルギー代謝改善・賦活剤、虚血性心疾患治療薬、潰瘍、火傷、創傷治癒薬、糖尿病性神経障害治療薬、赤血球生産増強薬・貧血治療薬、抗肥満薬・脂肪組織形成抑制剤、抗糖尿病剤、抗脳虚血薬、抗腫瘍薬・抗転移薬、悪液質治療薬または遺伝子治療制御剤あるいはこれらの疾患の予防剤として有用である。
【００７６】
上記Ｂ物質はＡ物質またはＣ物質の合成中間体として、Ｃ物質はＡ物質の合成中間体として、Ｄ物質はＥ物質の合成中間体として、それぞれ使用することができる。
【００７７】
本発明の化合物は、種々の異性体を有する。すなわち、本発明の化合物は不斉炭素原子を有するため光学異性体が存在し、各々がＳ配位、Ｒ配位である立体異性体が存在する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明はこれら各々の異性体およびこれらの異性体の混合物も全て含む。これらの異性体は、立体特異的合成法を使用し、または光学活性化合物を原料化合物として使用して、直接製造するか、または、異性体の混合物から常法により抽出することにより得ることができる。
【００７８】
本発明の化合物として好適には、以下の式で表される光学異性体である。
【００７９】
【化３５】
本発明の化合物は、塩基性の基及び酸性の基を有するので、酸または塩基と反応して塩になることができる。本発明はそのような化合物の塩も包含する。本発明の化合物が医薬として使用される場合、本発明の化合物の塩は、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。
【００８１】
酸との塩としては、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸の塩；酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩などのカルボン酸の塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸の塩；グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸の塩等が挙げられ、好適には無機酸の塩又はカルボン酸の塩であり、更に好適には塩酸塩、硝酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩又はシュウ酸塩である。
【００８２】
また、塩基との塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属の塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、コバルト等の金属塩；アンモニウム等の無機塩；ｔ−オクチルアミン、ジベンジルアミン、モルフォリン、グルコサミン、フェニルグリシンアルキルエステル、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、グアニジン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン、ピペラジン、テトラメチルアンモニウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩の塩等を挙げることができる。
【００８３】
本発明の塩として好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００８４】
また、本発明の化合物は、大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があり、そのような塩も本発明に包含される。
【００８５】
さらに、本発明の化合物は、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があるが、そのような塩も本発明に包含される。
【００８６】
周知のとおり、放線菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ ６０１０１株もこの点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ ６０１０１株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ちＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を生産する、ＳＡＮＫ ６０１０１株およびその変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ ６０１０１株に包含されるものである。
【００８７】
【発明の実施の形態】
１．生産菌について
本発明のＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質の製造法において用いられるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株としては、例えばストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１株を挙げることができる。ＳＡＮＫ ６０１０１株は茨城県岩井市で採集した土壌から土壌希釈法による希釈液から分離できる。ＳＡＮＫ ６０１０１株の菌学的特徴は、次のとおりである。
（１）形態学的特徴
ＳＡＮＫ ６０１０１株は、ＩＳＰ．〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕規定の寒天培地上２８℃、１４日間培養後、顕微鏡下観察では、ＳＡＮＫ ６０１０１株の基生菌糸は良好に伸長、分岐し、薄黄、薄黄味茶乃至黄味灰を示すが、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様の菌糸断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐し、薄青乃至は青味灰を示す。気菌糸の先端に３乃至１０個またはそれ以上の胞子連鎖を形成し、胞子連鎖の形態はフック乃至ループ状を示す。走査型電子顕微鏡による観察では、胞子の表面構造は平滑乃至しわ状を示す。胞子は楕円形で、その大きさは０．４〜０．６×１．５〜２．０μｍである。また、気菌糸の車軸分岐、菌核や胞子のうなどの特殊器官は観察されない。
（２）各種培養基上の諸性質
各種培養基上で２８℃、１４日培養後の性状は表１に示したとおりである。色調の表示はマンセル方式による日本色彩研究所版「標準色票」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。
【００８８】
【表１】
２８℃で培養後、２乃至２１日間に観察したＳＡＮＫ ６０１０１株の生理学的性質は表２に示したとおりである。
【００８９】
【表２】
【００９０】
【表３】
ＳＡＮＫ ６０１０１株の化学分類学的性状は放線菌の分類と同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 〔日本放線菌学会編、日本学会事務センター、４９−８２頁（２００１）〕に従い検討した。その結果、細胞壁からＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出され、全細胞中の糖成分として特徴的なパターンは認められなかった。主要メナキノン分子種としてＭＫ−９（Ｈ２）， ＭＫ−９（Ｈ４）が検出された。
【００９１】
ＩＳＰ．〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕基準、ワックスマン著、ジ・アクチノミセテス（Ｓ．Ａ． Ｗａｋｓｍａｎ、Ｔｈｅ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻、ブキャナンとギボンズ編、バージーズ・マニュアル（Ｒ． Ｅ． Ｂｕｃｈａｎａｎ ａｎｄ Ｎ． Ｅ． Ｇｉｂｂｏｎｓ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９７４年）、バージーズ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第 ４ 巻（１９８９年）、放線菌の分類と同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 〔日本放線菌学会編、日本学会事務センター（２００１）〕およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に関する最近の文献によって同定を行い、本菌株が放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属すると判断した。そこで、本菌株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１株と同定した。なお、本菌株は２００２年４月１２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６を付与された。
【００９２】
また、Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を生産するＳＡＮＫ ６０１０１株の変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、生物化学の分野で通常使用される遺伝学的方法、例えば組み換え、形質導入、形質転換等により得ることができる。
【００９３】
２．培養について
Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を得るための、微生物の培養は、通常発酵生成物を生産するために用いられている培地中で行うことができる。このような培地には、微生物が同化できる炭素源、窒素源および無機塩を含有する。
【００９４】
一般に、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いることができる。一般には、培地量の１〜１０重量％で変量するが、この範囲に限定されない。
【００９５】
窒素源としては、一般に蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩を用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、綿実粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で用られることが好ましい。
【００９６】
栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩化物、炭酸等のイオンを得ることのできる通常の塩類を使用し得る。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属の塩も使用し得る。
【００９７】
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。
【００９８】
ＳＡＮＫ ６０１０１株を培養し、Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質を生産する培地のｐＨは、５．０〜８．０に変化できる。
【００９９】
本菌株は１４℃乃至４５℃の範囲で生育し、特に１９．５℃乃至３９．５℃の範囲で良好に生育する。更にＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質の生産には２２℃乃至３０℃が好適である。
【０１００】
Ａ物質、Ｂ物質、Ｃ物質またはＤ物質は、好気的な培養により生産され、その培養方法としては、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等が用いられる。
【０１０１】
小規模には、振とう培養機を使用し、三角フラスコ中の液体培地で培養する。フラスコは通常のものまたは水流調節壁がついたものを用い、１００〜２５０ ｒｐｍでフラスコを振とうすることが好適である。培養は一段階または複数段階の種培養の発育工程を経ておこなうことができる。種培養フラスコは１乃至１０日間、または菌体の成長が目視で確認できるまで培養する。成長した種培養液は、その一部または全部を次段階の種培地または生産培地への接種に使用することができる。接種した生産培地を含むフラスコを１乃至１０日間培養し、培養終了後、フラスコの含有物を回収する。
【０１０２】
大量の培養の場合には、攪拌機、通気装置をつけた適当なタンクで通気攪拌培養をすることが好ましい。この場合、栄養培地をタンクの中で作製することができる。栄養培地を１２１℃乃至１３０℃まで加熱して滅菌し、冷却後、小規模または大規模培養の方法であらかじめ成長させてあった種培養液を接種する。攪拌速度、通気量、溶存酸素濃度を制御し、１乃至１０日間培養をおこない、内容物を回収する。この培養方法は多量の化合物を得るのに適している。
【０１０３】
培養の経過にしたがって生産される目的化合物の量の経時変化を知るには、例えば培養液の一部を等量のアセトンで抽出、アセトン留去後、酸性条件下酢酸エチル抽出し、濃縮、乾固した油状物中の目的化合物の量を高速液体クロマトグラフィーに付して測定する。通常は９６時間から１６８時間の培養で目的化合物の生産量は最高値に達する。
【０１０４】
３．抽出精製
培養終了後、培養液中の液体部分および菌体に存在する目的化合物は、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、菌体およびそのろ液または上清中に存在する目的化合物をその物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。
【０１０５】
例えば、目的化合物を含む溶液を、水と混和しない有機溶剤、たとえば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の単独またはそれらの組合せにより、目的化合物を抽出することにより精製が可能である。
【０１０６】
また、活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上、ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上、三菱化学（株）社製）等が使用される。目的化合物を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または目的化合物を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることにより得られる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス ５０Ｗ×４、ダウエックス１×２、ダウエックス ＳＢＲ−Ｐ（ダウ・ケミカル社製）等が使用される。目的化合物を含む上記のごときイオン交換樹脂の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または目的化合物を吸着させた後、塩酸やアンモニア水を用いて溶出させることにより得られる。
【０１０７】
このようにして得られた目的化合物は、さらにシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（アマシャムバイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【０１０８】
目的化合物の精製における所在は化合物が有する物理化学的性質または生物学的性質を利用したさまざまな検出手段によって測定することができる。例えば次に挙げる各々の方法によって測定することができる。
【０１０９】
高速液体クロマトグラフィー
＜Ａ物質＞
分離カラム： ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分、
＜Ｂ物質＞
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分
＜Ｃ物質＞
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： ６０％アセトニトリル−トリエチルアミンリン酸バッファー（０．３％、ｐＨ５）
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ８．９分。
＜Ｄ物質＞
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。
４．Ａ物質、Ｃ物質、Ｅ物質の合成
（Ａ物質またはＣ物質の製造）
また、本発明のＡ物質およびＣ物質は、Ｂ物質を溶媒中、塩素化剤と反応させることによっても得ることができる。
【０１１０】
「塩素化剤」としては、トリブチルホスフィン等のトリアルキルホスフィンまたは置換されていてもよいトリフェニルホスフィンと四塩化炭素の組み合わせを挙げることができる。好適には、トリフェニルホスフィンと四塩化炭素の組み合わせである。
【０１１１】
使用される溶媒としては、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適にはエーテル類である。好適には、脂肪族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類であり、より好適には、ハロゲン化炭化水素類であり、もっとも好適には、ジクロロメタンである。
【０１１２】
反応温度は、原料化合物、反応試薬によって異なるが、−２０℃乃至１００℃で行なわれ、好適には、室温乃至７０℃である。
【０１１３】
反応時間は、反応温度、原料化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異なるが、通常１０分間乃至３日間で、好適には、１５時間乃至４０時間である。
【０１１４】
反応終了後、本反応の目的化合物は、例えば、反応混合物を濃縮し、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することで得られる。
【０１１５】
得られた化合物は、必要ならば、常法、例えば、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって更に精製できる。
（Ｅ物質の製造）
本発明のＥ物質は、Ｄ物質を溶媒中、塩基性条件下にメタンスルホン化剤を反応させることにより得ることもできる。
【０１１６】
「メタンスルホン化剤」としては、メタンスルホニルクロリドを使用することができる。
【０１１７】
使用される塩基としては、例えば、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適には、有機塩基類であり、特に好適にはジメチルアミノピリジンまたはトリエチルアミンである。
【０１１８】
使用される溶媒としては、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適にはエーテル類である。好適には、脂肪族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類であり、より好適には、ハロゲン化炭化水素類であり、もっとも好適には、クロロホルムである。
【０１１９】
反応温度は、原料化合物、反応試薬によって異なるが、−２０℃乃至１００℃で行なわれ、好適には、室温乃至７０℃である。
【０１２０】
反応時間は、反応温度、原料化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異なるが、通常１０分間乃至３日間で、好適には、１５時間乃至４０時間である。
【０１２１】
反応終了後、本反応の目的化合物は、例えば、反応混合物を濃縮し、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することで得られる。
【０１２２】
得られた化合物は、必要ならば、常法、例えば、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって更に精製できる。
（Ｃ物質の製造）
本発明のＡ物質は、Ｃ物質を塩基で処理した後、塩素イオンを反応させることにより得ることもできる。
▲１▼塩基処理
使用される塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウムのようなアルカリ金属炭酸塩類；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウムのようなアルカリ金属炭酸水素塩類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、リチウムメトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド類を挙げることができ、好適には、アルカリ金属アルコキシド類であり、特に好適にはカリウムｔ−ブトキシドである。
【０１２３】
塩基処理に使用される溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ‐ブチルアルコール、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノール、シクロヘキサノールのようなアルコール類を挙げることができ、好適には、ｔ−ブチルアルコールである。
▲２▼塩素イオンとの反応
塩素イオンを与える物質としては、塩酸、塩化ピリジニウム、または、塩化ベンジルトリエチルアンモニウムのようなテトラアルキルアンモニウム塩を挙げることができ、好適には、塩化ピリジニウムである。
【０１２４】
使用される溶媒としては、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；Ｎ−メチルピペリジン、ピリジン、４−ピロリジノピリジン、ピコリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンのような有機塩基類を挙げることができ、好適にはエーテル類である。好適には、脂肪族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類であり、より好適には、ハロゲン化炭化水素類であり、もっとも好適には、ジクロロメタンである。
【０１２５】
反応温度は、原料化合物、反応試薬によって異なるが、−２０℃乃至１００℃で行なわれ、好適には、室温乃至７０℃である。
【０１２６】
反応時間は、反応温度、原料化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異なるが、通常１０分間乃至３日間で、好適には、１５時間乃至４０時間である。
【０１２７】
反応終了後、本反応の目的化合物は、例えば、反応混合物を濃縮し、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することで得られる。
【０１２８】
得られた化合物は、必要ならば、常法、例えば、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって更に精製できる。
５．投与形態
本発明のＡ物質、Ｅ物質またはＣ物質を医薬として使用する場合には、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、注射剤、局所投与剤、経膣剤、経皮吸収剤等により非経口的に又は吸入剤により経口若しくは経鼻的に投与することができる。
【０１２９】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビットのような糖類；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプンのようなデンプン誘導体；結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩類；リン酸カルシウムのようなリン酸塩類；炭酸カルシウムのような炭酸塩類；硫酸カルシウムのような硫酸塩類等）、結合剤（例えば、前記のデンプン誘導体又はセルロース誘導体；ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等）、崩壊剤（例えば、前記のデンプン誘導体又はセルロース誘導体；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾された、デンプン又はセルロース誘導体等）、滑沢剤（例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；ビーズワックス、ゲイロウのようなワックス類；グリコール；フマル酸のようなカルボン酸類；硫酸カルシウムのような硫酸類塩；ロイシン；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；前記の賦形剤におけるデンプン誘導体等）、安定剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；無水酢酸；ソルビン酸；ホウ酸；アジピン酸；安息香酸ナトリウムのようなカルボン酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；レチノ−ル、トコフェロール、アスコルビン酸ナトリウムのような抗酸化剤、合成ヒドロスルファイト等）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等）、懸濁化剤（例えば、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）、希釈剤、製剤用溶剤（例えば、水、エタノール、グリセリン、生理食塩水、グルコース溶液、シクロデキストリン分子当たり２乃至１１個のヒドロキシプロピル基を有するα、β、又はγ−シクロデキストリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００等）等の添加物を用いて周知の方法で製造される。
【０１３０】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１日当たり下限１ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１０００ｍｇ）を、静脈内投与の場合には、１日当たり下限０．１ｍｇ（好適には０．５ｍｇ）、上限６００ｍｇ（好適には、５００ｍｇ）を成人に対して、１日当り１乃至６回症状に応じて投与することが望ましい。
【０１３１】
【実施例】
次に、実施例、試験例、製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
（実施例１） Ａ物質の製造
（Ａ）培養
ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１株を培地組成−１で示される培地４５０ｍｌを含む２リットル容三角フラスコに、スラントより接種し、回転振盪培養機を用いて、２１０ｒｐｍ、２８℃で１４４時間培養したものを種培養液とした。次に、培地組成−１で示される培地１５リットルを３０リットル容ジャー・ファーメンターに入れ、１２１℃で３０分間加熱滅菌した。これを２８℃に冷却した後、種培養液４５０ｍｌを接種し、毎分１５リットルの空気を通気し、溶存酸素量５．０ｐｐｍを保持させるように回転数を１００から２８０ｒｐｍの範囲内で調整しながら２８℃で、２４時間通気攪拌培養したものを前培養液とした。次に、培地組成−２で示される培地３００リットルを６００リットル容タンクに入れ、１２１から１２７℃で３５分間加熱滅菌した。これを２６℃に冷却した後、前培養液９リットルを接種し、毎分３００リットルの空気を通気し、溶存酸素量５．０ｐｐｍを保持させるように回転数を８３から１１０ｒｐｍの範囲内で調整しながら、２６℃で、１６８時間攪拌培養した。
［培地組成−１］
グルコース ３．０％
生イースト １．０％
大豆粉 ３．０％
炭酸カルシウム ０．４％
硫酸マグネシウム７水和物 ０．２％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．０１％
滅菌前ｐＨ７．２
［培地組成−２］
シュークロース ５．０％
生イースト １．０％
大豆粉 ３．０％
炭酸カルシウム ０．４％
硫酸マグネシウム７水和物 ０．２％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．０１％
滅菌前ｐＨ７．２
（Ｂ）単離
得られた培養液３１０リットルを塩酸でｐＨ５．０に調整した後、アセトンを３１０リットル加えて抽出した。これにろ過助剤としてセライト５４５（ジョンズ マンビル プロダクト コーポレーション製）１０ｋｇを加えてろ過し、アセトン抽出液５７０リットルを得た。そして塩酸でｐＨを２．９に調整して３００リットルの酢酸エチルで抽出し、抽出液を４３０リットル得た。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質およびＤ物質を含む抽出物２８２．４ｇを得た。
【０１３２】
次いでこの抽出物をコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ １４リットル）を用いて精製した。あらかじめコスモシルカラムをアセトニトリル：水＝３：７で平衡化し、抽出物２８２．４ｇを５００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液を全量吸着後、アセトニトリル：水＝２：３、アセトニトリル：水＝１：１、アセトニトリル：水＝３：２各４０リットルで段階溶出し、１０リットルずつ１２分画した。
【０１３３】
Ａ物質およびＣ物質を含むフラクションＮｏ．９からＮｏ．１１を集め、活性画分３０リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質およびＣ物質を含む粗精製物１６．８ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣＰａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物１６．８ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２を溶媒として流速２５０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間６２．４から６６．６分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分２リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル１．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質の無色粉末９６０ｍｇを得た。
【０１３４】
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分
（実施例２） Ｂ物質の製造
実施例１に記載のＡ物質、Ｂ物質、Ｃ物質およびＤ物質を含む抽出物２８２．４ｇをコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ １４リットル）にかけた溶出液より、Ｂ物質およびＤ物質を含むフラクションＮｏ．５および６を集め減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＢ物質およびＤ物質を含む粗精製物２０．１ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物２０．１ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１を溶媒として流速２４０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間６６．８から７４．８分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作をして活性画分、４リットルを得た。それを減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＢ物質を含む粗精製物１．５５ｇを得た。
【０１３５】
次いでこの粗精製物をコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ １００ｍｌ）を用いて精製した。あらかじめコスモシルカラムをアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝２：３で平衡化し、粗精製物１．５５ｇをメタノール：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）＝３：７ ２０ｍｌに溶解して全量を吸着してアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝１：１で溶出し、１８ｍｌずつ分画した。Ｂ物質を含むフラクションＮｏ．８からＮｏ．１３までを集め１２０ｍｌ得た．減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＢ物質を含む粗精製物７３．０ｍｇを得た。さらにＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）で精製した。あらかじめアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝１：１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物をメタノール１．８ｍｌに溶解した試料溶液１５０μｌを注入後、アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝１：１を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間１２．０から１３．８分までを分取した。残りの試料溶液についても同様に分取し、１３０ｍｌの分取液を得た。減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、濃縮乾固してＢ物質の粗精製物３５．７ｍｇを得た。
【０１３６】
次にこの粗精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）でさらに精製した。あらかじめアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ７．０＝１：１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物３５．７ｍｇをアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ７．０＝１：１ １ｍｌに溶解した試料溶液１３０μｌを注入後、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ７．０＝１：１を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間３．０から４．８分までを分取した。残りの試料溶液についても同様に分取して８７ｍｌを得た。それを減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨを３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、濃縮乾固してＢ物質の無色粉末２６．０ｍｇを得た。
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝６：４
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分
（実施例３） ビラントマイシン（Ｃ物質）の製造
実施例１に記載のＡ物質およびＣ物質を含む粗精製物１６．８ｇをＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物１６．８ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２を溶媒として流速２５０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間５２．８から６０．８分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分４リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル２．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＣ物質を含む粗精製物５．３４ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）でさらに精製した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物５．３４ｇを６０ｍｌメタノールに溶解した試料溶液３０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２を溶媒として流速２５０ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間５３．２から６１．６分までを分取した。残りの試料溶液３０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分４．２リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル２．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＣ物質の無色粉末４．８８ｇを得た。
本化合物は下記の物理化学的性状を有していた：
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝−１３．５°（ｃ ０．５１ ＣＨＣｌ３）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３５１．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３５７３０）、２２７（１１２３０）、３０７（２７４８０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４１１、２９８３、２９２４、１６７３、１６０９、１５１７、１２８９、１２５４、１１３１、１１１０、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６３ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （１Ｈ， ｍ）， １．８１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０９ （１Ｈ， ｍ）， ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １７．０ Ｈｚ， ６．０ Ｈｚ）， ３．３７ （１Ｈ， ｍ）， ３．３９ （３Ｈ， ｓ）， ３．５５ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．３６ （１Ｈ， ｍ）， ４．６４ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ６．５３ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．７６ （１Ｈ， ｓ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄ， １．５ Ｈｚ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．５， １９．９， ２０．６， ２７．８， ３３．５， ３３．６， ５６．２， ５８．１， ５９．４， ７４．０， １１３．６， １１６．１， １１７．５， １２４．８， １２６．５， １３０．４， １３２．５， １４７．２， １７１．１
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： ６０％アセトニトリル−トリエチルアミンリン酸バッファー（０．３％、ｐＨ５）
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ８．９分。
（実施例４） Ｄ物質の製造法
実施例２に記載のＢ物質およびＤ物質を含む粗精製物２０．１ｇをＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）で分離した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物２０．１ｇを１００ｍｌメタノールに溶解した試料溶液５０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１を溶媒として流速２４０ｍｌ／分で溶出した。検出波長３００ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間４９．６から６２．８分までを分取した。残りの試料溶液５０ｍｌについても同様の操作をして活性画分、６リットルを得た。それを減圧下濃縮し、アセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル３．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＤ物質を含む粗精製物７．７３ｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｒ−３１０５−２０ＡＭ φ１００×５００ｍｍ）でさらに精製した。あらかじめアセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物７．７３ｇを６０ｍｌメタノールに溶解した試料溶液３０ｍｌを注入後、アセトニトリル：０．５％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝９：１１を溶媒として流速２４０ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間５２．６から６４．４分までを分取した。残りの試料溶液３０ｍｌについても同様の操作を行い、活性画分５．５リットルを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、リン酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチル２．０リットルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＤ物質の無色粉末４．８６ｇを得た。
【０１３７】
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。
（実施例５） Ｅ物質の製造法
Ｄ物質の粉末５０ｍｇを４ｍｌのクロロホルムに溶解し、そこに５６０μｌのトリエチルアミンと６０μｌのメタンスルホニルクロライドを加え、室温で２時間攪拌した。この反応溶液に水を加え、ｐＨ４．５で酢酸エチル抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固した。この抽出物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）で精製した。あらかじめアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：１で平衡化したＨＰＬＣカラムに、抽出物を１．２ｍｌのアセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：１に溶解した試料溶液３００μｌを注入後、アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：１を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間３．６から４．５分までを分取した。残りの試料溶液９００μｌについても同様の操作を行い、活性画分２２ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＥ物質の無色粉末８．２ｍｇを得た。
この無色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た。：
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．４０分
（実施例６） Ａ物質およびＣ物質の製造方法
（６−１）（１Ｒ，９ａＳ）−１−（３，４−ジメチルペンタ−３−エンイル）−１−（メトキシメチル）−３，３−ジメチル−９，９ａ−ジヒドロ−１Ｈ−［１，３］オキサゾロ ［３，４−ａ］インドール−７−カルボン酸（化合物２）
【０１３８】
【化３６】
実施例２で得られたＢ物質（化合物１）（５ｍｇ； ０．０１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン０．５ｍｌに溶かし、室温にて攪拌した。これに２，２−ジメトキシプロパン（０．０２ｍｌ；０．１５ｍｍｏｌ）とピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸塩（０．４ｍｇ； ０．００１５ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物１の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物２を得た（５ｍｇ；収率８９％）。
ｍｐ： １５５−１５７℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．０９ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ３．９）， １．４９−１．６９ （１３Ｈ， ｍ）， １．７３ （３Ｈ， ｓ）， １．９６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ４．９）， ２．０７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ３．９）， ３．０９ （２Ｈ， ｍ）， ３．３２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．５４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ４．４５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．８， ５．９）， ６．６０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．７４ （１Ｈ， ｓ）， ７．８２（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．３， １９．９， ２０．５， ２７．９， ２８．５， ３０．７， ５９．６， ７０．２， ７６．０， ８２．１， ９４．０， １０９．４， １１８．９， １２４．１， １２６．７， １２７．２， １３１．０， １３２．１， １５３．２， １７２．３
ＩＲ （ＫＢｒ） ｃｍ−１： ３３４２， ２９８４， ２９２４， ２８６１， １６７５， １６０７， １４５０， １３７１， １２６８， １１２１， １０６
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３７４ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３１ＮＯ４ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３７４．２３３１，ｆｏｕｎｄ： ３７４．２３２７
［α］Ｄ ２５ ： ＋１９６．９°（ｃ ０．５９ ＣＨＣｌ３）
（６−２）（１Ｒ，９ａＳ）−１−（３，４−ジメチルペンタ−３−エンイル）−１−（メトキシメチル）−３，３−ジメチル−９，９ａ−ジヒドロ−１Ｈ−［１，３］オキサゾロ［３，４−ａ］インドール−７−カルボン酸 メチルエステル（化合物３）
【０１４０】
【化３７】
（６−１）で得られた化合物２（１４８ｍｇ； ０．３９６ｍｍｏｌ）をメタノール３ｍｌとジクロロメタン０．１ｍｌの混合溶媒に溶かし、水浴中にて攪拌した。これにトリメチルシリルジアゾメタンの２Ｍヘキサン溶液（１．６ｍｌ； ３．１６８ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。室温にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物２の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物３を得た（１２６ｍｇ； 収率 ８２％）。
ｍｐ： １１４−１１５℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．０８ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ４．９）， １．４８ （３Ｈ， ｓ）， １．５４−１．６２ （ｍ， １０Ｈ）， １．７３ （３Ｈ， ｓ）， １．９６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ２．０７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝ １２．７， ４．９）， ３．０８ （２Ｈ， ｍ）， ３．３２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．５４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．８６ （３Ｈ， ｓ）， ４．４４ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．８， ４．９）， ６．６０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．６９ （１Ｈ， ｓ）， ７．７６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．２， １９．８， ２０．５， ２５．９， ２７．９， ２８．６， ２８．８， ３０．８， ５１．６， ７０．２， ７６．０， ８２．１， ９４．１， １０９．６， １２０．０， １２４．１， １２６．１， １２７．２，１３０．０， １３２．０， １５２．６， １６７．４
ＩＲ （ＫＢｒ） ｃｍ−１： ２９８９， ２９２８， ２９０５， ２８６０， １６９８， １６０６， １４９３， １４４９， １３８２， １３６７， １２９６， １２７２， ８４２， ７７０
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３８８ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ４ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３８８．２４８８，ｆｏｕｎｄ： ３８８．２４８８
［α］Ｄ ２５ ： ＋１８７．６°（ｃ ０．４０ ＣＨＣｌ３）
Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ４−０．５Ｈ２Ｏ： Ｃ， ６９．６７； Ｈ， ８．６４； Ｎ， ３．５３． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ，６９．６２； Ｈ， ８．９４； Ｎ， ３．５３
（６−３）（２Ｓ）−２−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−（メトキシメチル）−４，５−ジメチルヘキサ−４−エンイル］インドリン−５−カルボン酸 メチルエステル（化合物４）
【０１４２】
【化３８】
上記（６−２）で得られた化合物３（１２６ｍｇ； ０．３２５ｍｍｏｌ）をメタノール１ｍｌとジクロロメタン５ｍｌの混合溶媒に溶かし、室温にて攪拌した。これにＰＰＴＳ（４８ｍｇ；０．１９１ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物３の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物４を得た（９５ｍｇ； 収率 ８４％）。
ｍｐ： １６１−１６２℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．４８ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， １．５７ （１Ｈ， ｔｄ，Ｊ＝１２．７． ４．９）， １．６４ （６Ｈ， ｓ）， １．６５ （３Ｈ， ｓ）， ２．０１ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ２．１５ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ３．９）， ２．７３ （２， １Ｈ）， ２．９６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１５．６， ８．８）， ３．０６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１５．６， １０．７）， ３．４２ （４Ｈ， ｍ）， ３．５２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ３．８４ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝９．８）， ４．７３ （１Ｈ， ｂｒ ｓ）， ６．５５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．７２ （１Ｈ， ｓ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．３， １９．９， ２０．５， ２８．１， ２９．９， ３２．６， ５１．５， ５９．５， ６６．１， ７３．０， ７８．３， １０７．５， １１９．８， １２４．４， １２６．０， １２７．１， １２８．１， １３０．６，， １５５．２， １６７．３
ＩＲ （ＣＨＣｌ３） ｃｍ−１： ３６９０， ３４１８， ２９５２， ２９２５， ２８６２， １７０４， １６１４， １４５０， １４３６， １２８２， １１１３
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３４８ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ４ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３４８．２１７５，ｆｏｕｎｄ： ３４８．２１５９
［α］Ｄ ２５ ： ＋０．６°（ｃ ０．９９ ＣＨＣｌ３）
Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ４−０．２５Ｈ２Ｏ： Ｃ， ６８．２５； Ｈ， ８．４５； Ｎ， ３．９８． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ， ６８．４１； Ｈ， ８．４０； Ｎ， ４．０１
（６−４）（２Ｒ，３Ｒ）−３−クロロ−２−（３，４−ジメチルペンタ−３−エンイル）−２−（メトキシメチル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−カルボン酸 メチルエステル（化合物５）
【０１４４】
【化３９】
上記（６−３）で得られた化合物４（１０ｍｇ； ００２８８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１ｍｌに溶かし、室温にて攪拌した。これに四塩化炭素（０．０８４ｍｌ； ０．８６４ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（４６ｍｇ； ０．１７３ｍｍｏｌ）を加えた。４０℃にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物４の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、無色固体として表題の化合物５を得た（２．８ｍｇ； 収率 ２７％）。
ｍｐ： １２０−１２１℃
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １．６２−１．６３ （１０Ｈ， ｍ）， １．８１ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１３．２，４．９）， ２．０２ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．２， ４．９）， ２．１０ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ３．１１ （１Ｈ，ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ５．９）， ３．３４−３．４０ （４Ｈ， ｍ）， ３．５５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ３．８５ （３Ｈ， ｓ）， ４．３６ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝４．９）， ４．５４ （１Ｈ， ｂｒ ｓ）， ６．５３ （１Ｈ， ｄ，Ｊ＝８．８）， ７．７１−７．７３ （２Ｈ， ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ： １８．４， １９．９， ２０．６， ２７．８， ３３．４， ３３．７， ５１．５， ５６．３， ７４．０， １１３．６， １１６．０， １１８．８， １２４．８， １２６．６， １２９．６， １３１．７， １４６．４， １６７．２
ＩＲ （ｆｉｌｍ） ｃｍ−１： ３３５６， ２９２３， １６９５， １６１１， １５１５， １４３６， １３３０， １２８８， １２５２， １１９４， １１２８， １１０５， ７７０
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３６６ （（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２８ＣｌＮＯ３ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３８８．１６５６， ｆｏｕｎｄ： ３８８．１６５９
［α］Ｄ ２５ ： −１９．５°（ｃ ０．３６ ＣＨＣｌ３）
Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２９ＣｌＮＯ３： Ｃ，６５．６５； Ｈ，７．７１； Ｎ，３．８３； Ｃｌ， ９．６９． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ，６５．５２； Ｈ，７．７１； Ｎ，３．８７； Ｃｌ，９．６０
（６−５）Ａ物質およびＣ物質（Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ）
【０１４６】
【化４０】
上記（６−４）で得られた化合物５（４．８ｍｇ； ００１３１ｍｍｏｌ）をｔ−ブチルアルコールに溶かし、室温にて攪拌した。これにカリウムｔ−ブトキシドの１Ｍｔ−ブチルアルコール溶液（０．０３ｍｌ； ０．０２９ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。８０℃にて攪拌し、薄層クロマトグラフィーにて化合物５の消失を確認後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（１ｍｌ）に溶かし、氷浴中にて攪拌した。そこに塩化ピリジニウム（２３ｍｇ； ０．１９７ｍｍｏｌ）を加えた。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え室温にした。酢酸エチルにて抽出、飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を減圧溜去した。残渣を分取ＨＰＬＣ（展開溶媒；６０％ＭｅＣＮ−５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ （ｐＨ ４））にて精製し、淡黄色油状物質としてＡ物質（０．４ｍｇ； 収率 ９％）およびＣ物質（２．７ｍｇ； 収率 ５９％）を得た。
〈Ａ物質〉
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １．６４ （６Ｈ， ｍ）， １．６６ （３Ｈ， ｓ）， １．７５ （１Ｈ， ｔｄ，Ｊ＝１３．２， ４．９）， １．８６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１３．２， ４．９）， ２．１６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７， ４．９）， ２．２７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．２， ４．９）， ３．１２ （２Ｈ， ｍ）， ３．３９ （３Ｈ， ｓ）， ３．６２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ３．６６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１０．７）， ４．３３ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝８．８）， ６．５１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．８）， ７．６３（１Ｈ， ｓ）， ７．６８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．８）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １８．６， ２０．１， ２０．６， ２９．９， ３２．０， ３４．８， ５９．４， ６６．０， ７６．２， ７８．５， １０７．６， １１９．７， １２５．６， １２６．９， １２８．０， １２９．０， １３２．２， １５７．５， １７０．８
ＩＲ （ＣＨＣｌ３） ｃｍ−１： ２９２６， １６７４， １６１１， １４５５， １４２４， １２７０， １１２２
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３５２（（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３５２．１６７９， ｆｏｕｎｄ： ３５２．１６９４
［α］Ｄ ２５ ： ＋６０．８°（ｃ １．０９ ＣＨ３ＯＨ）
〈Ｃ物質（Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ）〉
１Ｈ−ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １．５４−１．６７ （１１Ｈ， ｍ）， ２．０６ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７，４．９）， ２．１７ （１Ｈ， ｔｄ， Ｊ＝１２．７． ４．９）， ３．０６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１７．６， ４．９）， ３．３３−３．３８（４Ｈ， ｍ）， ３．５０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９．８）， ３．５９ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ４．４３ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝４．９），６．６１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．８）， ７．６３ （２Ｈ， ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ： １８．６， ２０．１， ２０．６， ２８．９， ３４．６， ５８．４， ５８．９， ５９．６， ７４．８， １１４．２， １１６．９， １１８．７， １２５．２， １２８．２， １３０．７， １３３．０， １４８．９， １７０．７
ＩＲ （ＣＨＣｌ３） ｃｍ−１： ２４２８， ２９２６， １６７５， １６０９， １４２９， １３３０， １２９０， １２５４， １１３２， １１１１
ｍｓ （ＦＡＢ） ｍ／ｚ： ３５２（（Ｍ＋Ｈ）＋） ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３ （（Ｍ＋Ｈ）＋）： ３５２．１６７９， ｆｏｕｎｄ： ３５２．１６９３
［α］Ｄ ２５ ： ＋１８．１°（ｃ １．０９ ＣＨ３ＯＨ）
（実施例７） Ａ物質の製造方法
【０１４８】
【化４１】
実施例３または実施例６で得られたＣ物質（５０ｍｇ； ００１３１ｍｍｏｌ）をｔ−ブチルアルコール（０．５ｍｌ）に溶かし、室温にて攪拌した。これにカリウムｔ−ブトキシドの１Ｍｔ−ブチルアルコール溶液（０．３ｍｌ； ０．３１ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。８０℃にて攪拌し、溶媒を減圧留去した。
【０１５０】
得られた残渣をメタノール（３ｍｌ）に溶かし、氷浴中にて攪拌した。そこに塩化ピリジニウム（２４６ｍｇ； ２．１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え室温にした。酢酸エチルにて抽出、飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を減圧溜去した。残渣を分取ＨＰＬＣ（展開溶媒；６０％ＭｅＣＮ−５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ （ｐＨ ４））にて精製し、淡黄色油状物質として化合物Ａ（５ｍｇ； 収率 ９％）および化合物Ｃ（２５ｍｇ； 収率 ５０％）を得た。
（試験例１） ＨＩＦ−１安定化試験
ＨＲＥに結合して生物活性をしめすＨＩＦ−１のαサブユニット（ＨＩＦ−１α）の蛋白質量増加を測定することで低酸素応答の誘導を確認した。
【０１５１】
ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞８×１０５個を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有したダルベッコ改変ミニマムエッセンシャル培地（ＤＭＥＭ）４ｍｌに懸濁し、培養用６０ｍｍディッシュに接種して、３７度、二酸化炭素濃度５％、湿度１００％の炭酸ガスインキュベーター中で培養した。培養１８時間後に、培養培地４ｍｌに対して被検試料のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液またはＤＭＳＯのみをＤＭＳＯの終濃度が０．５％となるように添加し、さらに６時間、炭酸ガスインキュベーター中で培養した。また、対照低酸素処理試料として、ＤＭＳＯのみを加えた細胞を６時間、酸素濃度０．８％に維持した３７度、二酸化炭素濃度５％、湿度１００％の低酸素炭酸ガスインキュベーターで培養した。
【０１５２】
処理した培養細胞から、定法に従い、抽出用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１ｍＭ エチレンジアミンテトラアセテート、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％トリトンＸ−１００、０．１％デオキシコール酸、１ｍＭオルソバナジン酸、コンプリートプロテアーゼインヒビター（ロシュ社製））を用いて１００μｌの細胞抽出液を作製した。この試料を以下に示す操作でウエスタンブロット解析によるＨＩＦ−１α蛋白質の量評価に供した。細胞抽出液２０μｇを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＭＯＰＳバッファーの系でゲルの操作法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、蛋白質を分離した。蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ミリポア社製）に転写し、メンブレンの操作法に従い、ブロッキング溶液（５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝食塩水）にてブロック、ブロッキング溶液に２５０倍希釈した抗ＨＩＦ−１α抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）との反応、ブロッキング溶液に５，０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）との反応をおこなった。これをＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社製）およびＸ線フィルム（コダック社製）を用い、操作法に従いフィルムを感光させたのち、現像した。
【０１５３】
この方法においてＡ物質およびＣ物質は図１に示したように、Ｅ物質は図２に示したように、２０および２００ｎｇ／ｍｌにてＨＩＦ−１α量を無処理の場合と比較して顕著に増加させた。
（試験例２）ＶＥＧＦ誘導試験
ＶＥＧＦの、培養上清中の量をＥＬＩＳＡ測定することで低酸素応答誘導の程度を求めた。
【０１５４】
ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞２×１０４個を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１００μｌに懸濁し、９６穴培養プレートに接種して、３７度、二酸化炭素濃度５％、湿度１００％の炭酸ガスインキュベーター中で培養した。培養培地１００μｌに対してＤＭＳＯに溶解した被検試料溶液０．５μｌを加えて２４時間炭酸ガスインキュベーター中で培養後、培養上清８０μｌを回収し測定試料液とした。また、対照低酸素処理試料として、ＤＭＳＯのみを加えた細胞を２４時間、酸素濃度０．８％に維持した炭酸ガスインキュベーター中で培養した上清を用いた。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ測定キット（Ｇｅｎｚｙｍｅ ＴＥＣＨＮＥ製）の添付プロトコールに従って行った。試料液はキット添付のＳｔａｎｄａｒｄ Ｂｕｆｆｅｒ ＧＴ５Ｋで５倍に希釈してアッセイに使用し、添付標準試料との比較によりＶＥＧＦ濃度を算出した。
【０１５６】
この方法においてＡ物質および天然および合成Ｃ物質は表４に示したように、Ｅ物質は表５に示したように、１２．５または２５および５０ｎｇ／ｍｌにてＶＥＧＦ量を無処理の場合と比較して顕著に増加させた。
【０１５７】
【表４】
【表５】
【発明の効果】
以上のように本発明のＡ物質、Ｃ物質およびＥ物質は、低酸素応答を誘導する顕著な活性を有するので、血管新生誘導剤、嫌気的糖代謝活性化剤、エネルギー代謝改善・賦活剤、虚血性心疾患治療薬、潰瘍、火傷、創傷治癒薬、糖尿病性神経障害治療薬、赤血球生産増強薬・貧血治療薬、抗肥満薬・脂肪組織形成抑制剤、抗糖尿病剤、抗脳虚血薬、抗腫瘍薬・抗転移薬、悪液質治療薬、遺伝子治療制御剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ物質およびＣ物質のＨＩＦ−１α安定化活性
検体で処理したＨｅｐＧ２細胞の抽出液を試料として、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いてウェスタンブロッティングをおこなった。１と４．対照（ＤＭＳＯ）、２と３．低酸素処理、５．Ａ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、６．Ａ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、７．Ａ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）、８．実施例３のＣ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、９．実施例３のＣ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、１０．実施例３のＣ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）。
【図２】Ｃ物質およびＥ物質のＨＩＦ−１α安定化活性
検体で処理したＨｅｐＧ２細胞の抽出液を試料として、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いてウェスタンブロッティングをおこなった。１．低酸素処理、２．対照（ＤＭＳＯ）、３．実施例６のＣ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、４．実施例６のＣ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、５．実施例６のＣ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）、６．Ｅ物質（２ｎｇ／ｍｌ）、７．Ｅ物質（２０ｎｇ／ｍｌ）、８．Ｅ物質（２００ｎｇ／ｍｌ）。
Claims (24)
- 下記一般式（Ｉ）又は下記一般式（ＩＩ）
で表される化合物又はその塩。 - 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩。
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋７０．６°（ｃ ０．５，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２６ＣｌＮＯ３（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３５１．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３２８５０）、２２７（１１９５０）、３０８（２４０７０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０２、２９８３、２９２４、１６７２、１６１０、１５０３、１４５５、１４３１、１２７１、１１２０、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６２ （３Ｈ， ｓ） １．６９ （１Ｈ， ｍ）， １．７９ （１Ｈ， ｍ）， ２．１２， （２Ｈ， ｍ）， ３．０１ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ） ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， １０．５ Ｈｚ）， ３．３４ （３Ｈ， ｓ）， ３．５８ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ３．６２ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ４．２８ （１Ｈ，ｍ）， ６．４６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ６．７３ （１Ｈ， ｄ， ２．０ Ｈｚ）， ７．５１ （１Ｈ， ｓ）， ７．５６ （１Ｈ，ｄｄ， ８．５ Ｈｚ， １．５ Ｈｚ）， １１．９５ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．２， １９．６， ２０．３， ２８．４， ３０．４， ３３．３， ５８．６， ６３．４， ７３．９， ７８．５， １０６．０， １１８．１， １２４．０， １２５．２， １２６．５， １２７．２， １３０．３， １５５．６， １６７．４
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）（ワイエムシィ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝６：４
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ９．９分 - 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩。
１）性質：無色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋３０．２°（ｃ０．５，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２７ＮＯ４（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３３３．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０４（３０３４０）、２２６（１１４６０）、３０７（１９１８０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４１１、３３５３、２９８３、２９２４、１６７１、１６１０、１５０３、１４５５、１４３３、１２７０、１１１３、７７４；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．３７ （２Ｈ， ｍ）， １．５７ （３Ｈ， ｓ）， １．５７ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．９７ （１Ｈ， ｍ）， ２．０６ （１Ｈ， ｍ）， ２．８９ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， １０．０ Ｈｚ）， ２．９７ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， ９．０ Ｈｚ）， ３．２９ （３Ｈ， ｓ）， ３．３０ （２Ｈ， ｍ）， ３．９７ （１Ｈ， ｍ）， ４．２６ （１Ｈ， ｓ）， ６．３４ （１Ｈ， ｓ）， ６．４３ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４８ （１Ｈ， ｓ）， ７．５３ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， １．０ Ｈｚ）， １１．８７ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．２， １９．６， ２０．３， ２７．６， ２８．８， ３１．８， ５８．６， ６４．２， ７３．２， ７５．０， １０５．９， １１７．５， １２２．８， １２５．２， １２７．７， １２８．０， １３０．２， １５６．３， １６７．５
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．２分 - 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩。
１）性質：白色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝−１３．９°（ｃ ０．５１、ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ１９Ｈ２７ＮＯ４（ＴＯＦ−ＭＳスペクトルにより測定）；
５）分子量： ３３３．２（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（３１３００）、２２９（１０３６０）、３０９（２４３１０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３４０４、２９８１、２９２６、１６７２、１６０７、１５１７、１２８８、１２５４、１１０８、７７４
；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．５３ （１Ｈ， ｍ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６３ （３Ｈ， ｓ）， １．８２ （１Ｈ， ｍ）， ２．０７ （２Ｈ， ｍ）， ２．８６ （１Ｈ， ｄｄ， １６．５ Ｈｚ， ６．０ Ｈｚ）， ３．１１ （１Ｈ， ｄｄ， １７．０ Ｈｚ， ４．０ Ｈｚ）， ３．４０ （３Ｈ， ｓ）， ３．４９ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ３．６７ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．９９ （１Ｈ， ｍ）， ４．５０ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ６．５０ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．７５ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， ２．０ Ｈｚ）， ７．７８ （１Ｈ， ｄ， １．５ Ｈｚ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．４， ２０．０， ２０．６， ２７．７， ３２．７， ３３．３， ５７．６， ５９．５， ６７．４， ７５．０， １１３．４， １１７．０， １１７．８， １２４．６， １２６．８， １３０．２， １３３．２， １４７．４， １７１．７
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３１２−３（φ６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ５．０＝３：２
流速： １．５ｍｌ／分
検出波長： ２１０、３００ｎｍ
保持時間： ３．７５分。 - 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩。
１）性質：白色粉末；
２）［α］２５ Ｄ ＝＋１０．０°（ｃ ０．２８、ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶。水に不溶；
４）分子式：Ｃ２０Ｈ２９ＮＯ６Ｓ；
５）分子量：４１１ （ＡＰＣＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
６）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０５（２５９１０）、２２５（ｓｈ）、２９７（１３８４０）ｎｍに吸収極大を示す；
７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：３３９１、２９２５、１６７３、１６０９、１５１８、１３３３、１１７４、１１１１９１６、９００；
８） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
１．５６ （１Ｈ， ｍ）， １．５８ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．７１ （１Ｈ， ｍ）， ２．０４ （２Ｈ， ｍ）， ３．０１ （３Ｈ， ｓ）， ３．１５ （１Ｈ， ｄｄ， １７．５ Ｈｚ， ３．０ Ｈｚ）， ３．２２ （１Ｈ， ｄｄ， １７．５ Ｈｚ， ３．０ Ｈｚ）， ３．４３ （３Ｈ， ｓ）， ３．４６ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ３．５９ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．６６ （１Ｈ， ｂｒ， ｓ）， ５．０７ （１Ｈ， ｔ， ３．５ Ｈｚ）， ６．５２ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ７．７７ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ７．７８ （１Ｈ， ｓ）
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
１８．４， １９．９， ２０．６， ２７．７， ３０．０， ３３．３， ３９．１， ５７．２， ５９．３， ７２．７， ７４．５， １１３．５，１１４．７， １１７．７， １２５．０， １２６．２， １３０．５， １３２．６， １４６．８， １７１．３
１０）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ水（ｐＨ４．５）＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ｎｍ
保持時間： ４．４０分 - ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する、請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を回収することを特徴とする、請求項１から４に記載の化合物の製造方法。（ただし、式（ＩＩ）で表される化合物において、Ｒ２がメタンスルホニルオキシ基である化合物を製造する場合を除く。）
- ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物の生産菌がストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６）株であることを特徴とする、請求項６に記載の製造法。
- ストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１６）。
- 下記式
- 下記式
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する嫌気的糖代謝活性化剤またはエネルギー代謝改善・賦活剤。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する虚血性心疾患の予防薬または治療薬。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する潰瘍、火傷または創傷治癒剤。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する糖尿病性神経障害の予防薬または治療薬。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する赤血球生産増強剤または貧血の予防薬若しくは治療薬。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する抗肥満薬または脂肪組織形成抑制剤。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する糖尿病の予防薬または治療薬。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する抗脳虚血剤。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する腫瘍の治療薬若しくは予防薬または抗転移薬。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する悪液質の予防薬または治療薬。
- 請求項１０に記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する遺伝子治療制御剤。
- 下記式
- 下記式
- 下記式
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|---|---|---|---|---|
| EP1578431A4 (en) * | 2002-12-06 | 2008-04-23 | Fibrogen Inc | GREASE CONTROL |
| EP1578430A4 (en) * | 2002-12-06 | 2008-04-23 | Fibrogen Inc | TREATMENT OF DIABETES |
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| CN102964352A (zh) * | 2012-11-23 | 2013-03-13 | 华中师范大学 | 具有生物活性的手性2，3-二氢吡咯［1，2-a］吲哚衍生物及其不对称合成方法 |
| WO2014175119A1 (ja) * | 2013-04-26 | 2014-10-30 | 松谷化学工業株式会社 | エネルギー消費の促進および／またはエネルギー消費機能低下の治療および／または予防剤、または方法 |
| CN109486745A (zh) * | 2017-09-12 | 2019-03-19 | 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 | Fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用 |
-
2003
- 2003-06-24 JP JP2003178823A patent/JP2004083570A/ja active Pending
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