CN113825507A - 具有抗氧化性和神经保护活性的大环化合物 - Google Patents

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CN113825507A CN202080035236.2A CN202080035236A CN113825507A CN 113825507 A CN113825507 A CN 113825507A CN 202080035236 A CN202080035236 A CN 202080035236A CN 113825507 A CN113825507 A CN 113825507A
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A·费尔南德斯·梅达德
M·D·L·A·维努埃萨·纳瓦罗
J·M·桑切斯·洛佩兹
J·P·博拉诺斯·赫尔南德兹
M·D·L·A·阿尔梅达·帕拉
E·费尔南德斯·桑切斯
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Abstract

用于治疗与氧化应激有关的疾病的以下通式的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体
Figure DDA0003349019600000011
其中波浪键～是双键或环氧化物，

Description

具有抗氧化性和神经保护活性的大环化合物
技术领域
本发明涉及大环化合物、含有它们的药物组合物以及它们作为抗氧化和神经保护产品的用途。
背景技术
活组织检查或尸检的组织病理学检查已经揭示，相当多的人类慢性和急性疾病与氧化应激的生化征象有关。氧化应激定义了一种异常状况，其中细胞不能有效地消除活性氧和活性氮(统称为RONS)的内源性形成(
Figure BDA0003349019580000011
JP,等人.Adv.Drug Deliv.Rev.61:1299-1315,2009)。RONS(包括以下物质中的一种或多种：过氧化氢或H2O2、超氧化物阴离子或O2 ·-、一氧化氮或·NO、过氧亚硝酸根阴离子或ONOO-、羟基自由基或·OH、等)是起重要细胞信号传递作用的生理学上合成的分子；但是，RONS在本质上是不稳定的，并且会通过与自身、氧或细胞成分(例如脂质、核酸或蛋白)的化学反应而迅速分解。此外，RONS的分解实际上主要是通过特定酶(通常称作抗氧化物酶)的作用而发生。这些包括几个蛋白家族，包括谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧还蛋白、硫氧还蛋白等，它们广泛地分布在组织和细胞中。这些抗氧化物酶中的一些需要辅因子才能发挥全部功能，其中最重要的是谷胱甘肽和NADPH。在这些中，谷胱甘肽也被认为是一种抗氧化剂，因为它也可以直接与RONS反应，因此有助于它们的除去，尽管谷胱甘肽的这种清除作用的总体贡献很小。此外，负责这些辅因子的生物合成或再生的酶也被认为是抗氧化物酶，且包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶(催化谷胱甘肽生物合成中的限速步骤的酶)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(磷酸戊糖途径的第一个限速酶，其从氧化形式NADP再生NADPH)。
RONS的形成无所不在地发生，尽管主要来源是线粒体呼吸链的复合物I和III(其形成O2 ·-)、质膜结合的NADPH氧化酶(其形成O2 ·-)、一氧化氮合酶(其形成·NO)、超氧化物歧化酶(其从O2 ·-形成H2O2)、以及形成·OH的O2 ·-与阳离子(铜或铁)的化学反应。通过鱼藤酮的作用可以强烈刺激线粒体复合物I的RONS形成。细胞通常以平衡的方式持续产生和降解RONS，该方式会防止RONS的积累并从而避免其潜在的细胞破坏作用。但是，在某些导致RONS形成过多或抗氧化剂介导的RONS消除受损的病理生理情况下，会发生氧化应激。由于对细胞的核酸、脂质和蛋白的全面和无差别损害，氧化应激会造成细胞毒性、组织和器官功能障碍并最终造成死亡。存在许多与这种氧化应激有关的人类疾病，如神经变性疾病诸如帕金森病、阿尔茨海默氏病、老年痴呆、亨廷顿病、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化、中风和具有神经肌肉病变的线粒体病。
尽管在细胞RONS代谢(即，RONS形成和除去)及其与人类疾病的高度相关性方面具有丰富的知识，但迄今为止，还没有在临床试验中被证明有效(即保护性或修复性)的抗氧化药理学策略(Kamat CD,等人J.Alzheimers Dis 15:473-493,2008)。在该背景下，迄今为止使用的所提出的药理学策略是基于药物清除(即通过直接反应除去和灭活)RONS的能力，因此在理论上有助于预防和/或阻断氧化应激。令人困惑的是，在某些与氧化应激相关的人类疾病动物模型中(在啮齿类动物中)进行的研究已经产生了非常有前途的结果，其中一些抗氧化药理学策略随后在临床试验中失败。这种不一致的原因尚不清楚。
因此，具有抗氧化性和神经保护性能的小分子的设计和开发是用于开发新治疗剂的有吸引力的方案。
已经公开了Pyrrocidines A、B和C(Wicklow DT,等人,Phytopathology,99:109-15,2009；Haiyin HH,等人,Tetrahedron Lett.,43:1633-6,2002；Wicklow DT,等人,Mycol.Res.109:610-8,2005；Yoshihito S等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18:6050-6053,2008；Ear A.等人,Organic&biomolecular chemistry 13.12:3662-3666,2015；US7129266B2；Casella,Thiago M.,等人.Phytochemistry 96:370-377,2013)作为抗微生物的、细胞毒性的和细胞凋亡的诱导剂化合物。
Figure BDA0003349019580000021
已经公开了Hirsutellone A-E(Masahiko I,等人,Tetrahedron 61:5577-83,2005；US20060122252)作为针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗细菌化合物。
Figure BDA0003349019580000031
已经公开了化合物GKK1032A1和A2(JP2001247574)作为抗微生物和抗肿瘤化合物。已经公开了GKK1032(Pastre R等人.Quimica Nova,30:1867-71,2007)作为抗微生物化合物。已经公开了GKK1032C(Qi Xin等人,The Journal of Antibiotics,72:237-240,2019)作为抗微生物化合物。
Figure BDA0003349019580000032
发明内容
本发明涉及以下通式的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体用于治疗与氧化应激有关的疾病的用途：
Figure BDA0003349019580000041
其中
波浪键～是双键或环氧化物，
Figure BDA0003349019580000042
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢和被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R5选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基或卤素；
X表示由式(III)至(XII)代表的基团，
Figure BDA0003349019580000043
Figure BDA0003349019580000051
其中
虚线键代表任选的双键，当存在时，其为式(II)的化合物中X和(B)之间的双键；
R6选自氢、被取代的或未被取代的酰基、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的芳烷基、-CONH2、碱金属和糖；且
R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3。
在另一个方面，本发明也涉及用作药物的通式(I)或(II)的化合物，其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体或混合物，所述药物用于治疗与氧化应激有关的疾病。
在另一个方面，本发明也涉及通式(Ia)或(IIa)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体:
Figure BDA0003349019580000052
其中
波浪键～是双键或环氧化物，
Figure BDA0003349019580000053
X表示由下式代表的基团，
Figure BDA0003349019580000054
Figure BDA0003349019580000061
其中，
虚线键代表任选的双键，当存在时，其为式(II)的化合物中X和(B)之间的双键；
其中R6选自氢、被取代的或未被取代的酰基、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的芳烷基、-CONH2、碱金属和糖；
其中R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3；
或其药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物或立体异构体，
前提条件是，不包括下式的化合物:
Figure BDA0003349019580000062
在另一个方面，本发明也涉及用作药物的通式(Ia)或(IIa)的化合物，其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体或混合物。
在另一个方面，本发明也涉及通式(Ia)或(IIa)的化合物，其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体或混合物在药物的制备中的用途。
可以用本发明的化合物治疗的一些疾病以非限制性方式为：神经变性疾病诸如帕金森病、阿尔茨海默氏病、老年痴呆、亨廷顿病、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化；中风；和具有神经肌肉病变的线粒体病。
本发明的其它方面是治疗方法，和用于用在这些方法中的化合物。
因此，本发明进一步提供了一种治疗与氧化应激有关的疾病的方法，所述方法包括给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的如上定义的通式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。优选地，需要这种治疗的患者可以是任何哺乳动物，特别是人。
本发明也涉及通过能够产生通式(Ia)或(IIa)的化合物的微生物菌株获得通式(Ia)或(IIa)的化合物。
优选的方法包括以下步骤：在具有可同化的碳源和氮源及盐的水性营养培养基中，在受控的淹没需氧条件下培养能够产生通式(Ia)或(IIa)的化合物的微生物菌株，然后从培养液(cultured broth)中回收并纯化本发明的天然化合物，或通过使用本领域技术人员已知的标准有机合成反应处理培养液以获得相应的衍生物，然后从反应的粗产物回收并纯化这些衍生物。
本发明也涉及通过从能够产生它们的微生物菌株分离的天然化合物合成而获得通式(Ia)或(IIa)的化合物。
通式(Ia)或(IIa)的化合物可通过使用购买的起始原料以常规方法合成制得。例如，使用本领域技术人员已知的标准有机合成反应。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，包含通式(Ia)或(IIa)的化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体以及药学上可接受的载体。
在权利要求中限定了本发明的这些和其它方面。
附图说明
图1表示四种不同的神经元组中H2O2的形成情况，A)代表未处理组，B)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮处理的神经元，C)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和1μg/ml的化合物I处理的神经元，D)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和5μg/ml的化合物I处理的神经元。
图2表示五种不同的神经元组中H2O2的形成情况，它们都被温育6小时。A)代表未处理组，B)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮处理的神经元，C)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和1μg/ml的化合物I处理的神经元，D)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和1μg/ml的GKK1032处理的神经元，E)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和1μg/ml的Pyrrocidine A处理的神经元。
图3表示两种不同的神经元组中H2O2的形成情况，A)代表对照组，A1未用化合物I处理且A2用5μg/ml的化合物I预处理，B)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮处理的神经元，B1未用化合物I处理且B2用5μg/ml的化合物I预处理。
图4表示五种不同的神经元组中的蛋白质含量，A)代表未处理组，A1温育3h且A2温育6h，B)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮处理的神经元，B1温育3h且B2温育6h，C)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和0.1μg/ml的化合物I处理的神经元，C1温育3h且C2温育6h，D)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和1μg/ml的化合物I处理的神经元，D1温育3h且D2温育6h，E)代表用L-丁硫氨酸亚砜亚胺和鱼藤酮和5μg/ml的化合物I处理的神经元，E1温育3h且E2温育6h。
图5显示了在兴奋毒性NMDA刺激以后或未刺激(对照)的神经元(C57BL6/J)细胞中H2O2的产生情况。对于NMDA受体激活，将体外8天的神经元与100μM NMDA一起温育10分钟。然后将神经元洗涤，并在仅含有DMSO(DMSO空心条)、DMSO和NMDA(DMSO实心条)以及递增量的GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine A、Pyrrocidine B、CL0661、CL0667和CL0670的培养基中进一步温育4小时。0.1μM、1μM、5μM的浓度。*:p-值<0.05相对于DMSO+NMDA(学生t检验(student’s test))。
图6显示了在兴奋毒性NMDA刺激以后或未刺激(对照)的神经元(C57BL6/J)细胞中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性。对于NMDA受体激活，将体外8天的神经元与100μM NMDA一起温育10分钟。然后将神经元洗涤，并在仅含有DMSO(DMSO空心条)、DMSO和NMDA(DMSO实心条)以及递增量的GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine B、CL0661、CL0665、CL0667和CL0670的培养基中进一步温育24小时。0.1μM、1μM、5μM的浓度。*:p值<0.05相对于DMSO+NMDA(学生t检验)。
图7显示了在兴奋毒性NMDA刺激以后或未刺激(对照)的神经元(C57BL6/J)细胞中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性。对于NMDA受体激活，将体外8天的神经元与10μMβ-淀粉样蛋白一起温育10分钟。然后将神经元洗涤，并在仅含有DMSO(DMSO空心条)、DMSO和β-淀粉样蛋白(DMSO实心条)以及递增量的GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine A、CL0661、CL0663、CL0664、CL0665、CL0666、CL0667、CL0669和CL0670的培养基中进一步温育24小时。0.1μM、1μM和5μM的浓度。*:p值<0.05相对于DMSO+β-淀粉样蛋白(学生t检验)。
图8显示了用化合物CLO670(5μM)处理24小时的表达突变亨廷顿蛋白的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的代表性图像。突变亨廷顿蛋白聚集以白色箭头指示，GFP亨廷顿蛋白(绿色)和β-微管蛋白(红色)。使用40倍水浸物镜，通过Operetta CLS自动化的共焦显微镜获得图像。
图9显示了用化合物GKK1032C(5μM)和CL0670(5μM)处理24小时的表达突变α-共核蛋白蛋白的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的代表性图像。突变α-共核蛋白蛋白聚集以白色箭头指示，GFPα-共核蛋白蛋白(绿色)和β-微管蛋白(红色)。使用40倍水浸物镜，通过Operetta CLS自动化的共焦显微镜获得图像。
图10表示在t＝0min、5min、15min、30min、1小时、4小时、10小时、24小时和48小时收集的雌性C57BL/6小鼠的血浆和脑中的化合物I的浓度。
图11表示分成两组的8周龄C57BL6/J雄性小鼠的转棒试验的结果：对照(注射媒介物的小鼠)和化合物I(注射每日一次150mg/kg的化合物I剂量的小鼠)。
图12表示仅注射媒介物的8周龄C57BL6/J雄性小鼠和注射化合物I(150mg/kg的每日一次剂量)的小鼠的旷场试验结果。*:p-值<0.05相对于对照(学生t检验)。
图13显示了与图12中相同的旷场试验结果，但以动物的活动方式表示。顶部四个图像显示了小鼠的活动，而底部四个图像表示热图。
图14显示了仅注射媒介物的8周龄C57BL6/J雄性小鼠和注射化合物I(150mg/kg的每日一次剂量)的小鼠的异常物体识别测试。顶部图像显示偏好指数，而底部图像表示活动图。
图15显示了组I(□)、II(■)、III(●)和IV(○)的转棒试验结果。*或#：p-值<0.05相对于3-硝基丙酸(*学生t检验；#ANOVA,DMS事后)。在第1天和第2天进行化合物I和CL0670注射。在第1、1.5、2、2.5、3和3.5天进行3-硝基丙酸注射。显示的数据点是在注射后2小时获得，p-值<0.05相对于对照(学生t检验)。
图16显示了组I(□)、II(■)、III(●)和IV(○)的旷场试验结果。*或#：p-值<0.05相对于3-硝基丙酸(*学生t检验；#ANOVA，DMS事后)。在第1天、第2天和第3天进行GKK1032C和CL0670注射。在第1、1.5、2、2.5、3和3.5天进行3-硝基丙酸注射。显示的数据点是在注射后4小时获得，p-值<0.05相对于对照(学生t检验)。
图17显示了化合物I和CL0670在小鼠中的神经保护作用评估中的转棒试验结果，所述小鼠发生或未发生中脑动脉阻塞：在没有阻塞的情况下进行手术并施用GKK1032C和CL0670的小鼠；发生中脑动脉阻塞(缺血)的小鼠，发生中脑动脉阻塞并施用GKK1032C和CL0670的小鼠。*：p值<0.05相对于缺血(学生t检验)。
图18显示了进行在实施例11中解释的试验的小鼠的中风大小。在没有阻塞的情况下进行手术并施用GKK1032C和CL0670的小鼠；发生中脑动脉阻塞(缺血)的小鼠，发生中脑动脉阻塞并施用GKK1032C和CL0670的小鼠。
图19是发生中脑动脉阻塞效应的小鼠(空心条)和发生中脑动脉阻塞并施用化合物I和CL0670(实心条)的小鼠的脑中风体积的图解表示。*：p-值<0.05相对于缺血(学生t检验)。
图20显示了化合物CL0661的1H-NMR谱(CDCl3)。
图21显示了化合物CL0661的13C-NMR谱(CDCl3)。
图22显示了化合物CL0665的1H-NMR谱(CDCl3)。
图23显示了化合物CL0665的13C-NMR谱(CDCl3)。
图24显示了化合物CL0666的1H-NMR谱(CDCl3)。
图25显示了化合物CL0666的13C-NMR谱(CDCl3)。
图26显示了化合物CL0670的1H-NMR谱(CDCl3)。
图27显示了化合物CL0670的13C-NMR谱(CDCl3)。
图28显示了化合物CL0663的1H-NMR谱(CDCl3)。
图29显示了化合物CL0663的13C-NMR谱(CDCl3)。
图30显示了化合物CL0664的1H-NMR谱(CDCl3)。
图31显示了化合物CL0664的13C-NMR谱(CDCl3)。
图32显示了化合物CL0667的1H-NMR谱(CDCl3)。
图33显示了化合物CL0667的13C-NMR谱(CDCl3)。
图34显示了化合物CL0669的1H-NMR谱(CDCl3)。
图35显示了化合物CL0669的13C-NMR谱(CDCl3)。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗与氧化应激有关的疾病的以下通式的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体
Figure BDA0003349019580000111
其中
波浪键～是双键或环氧化物，
Figure BDA0003349019580000112
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢和被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R5选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基或卤素；
X表示由式(III)至(XII)代表的基团，
Figure BDA0003349019580000113
其中
虚线键代表任选的双键，当存在时，其为式(II)的化合物中X和(B)之间的双键；
R6选自氢、被取代的或未被取代的酰基、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的芳烷基、-CONH2、碱金属和糖；且
R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3。
本发明也涉及如上定义的通式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体在药物制备中的用途，所述药物用于治疗与氧化应激有关的疾病。
本发明也涉及一种用于治疗与氧化应激有关的疾病的方法，其中所述方法包括给有此需要的人施用治疗有效量的如上定义的通式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
在式(III)-(XII)中的术语(A)和(B)表示基团X与分子的其余部分键合的位置。
在另一个方面，本发明涉及通式(Ia)或(IIa)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体:
Figure BDA0003349019580000121
其中
波浪键～是双键或环氧化物，
Figure BDA0003349019580000122
X表示由下式代表的基团，
Figure BDA0003349019580000131
其中
虚线键代表任选的双键，当存在时，其为式(II)的化合物中X和(B)之间的双键；
其中R6选自氢、被取代的或未被取代的酰基、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的芳烷基、-CONH2、碱金属和糖；
其中R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3；
或其药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物或立体异构体，
前提条件是，不包括以下式的化合物：
Figure BDA0003349019580000132
在本说明书中，以下术语具有指明的含义：
环氧化物，
Figure BDA0003349019580000141
应理解为通过环氧化物的两个碳原子中的每一个与式(I)的化合物的6元环连接的三原子环醚环。
烷基优选为具有1至约20个碳原子，更优选为具有1至约12个碳原子，甚至更优选为具有1至约6个碳原子。具有1、2、3、4或5个碳原子的烷基是特别优选的。甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基)是本发明化合物中特别优选的烷基。除非另有说明，否则本文中使用的术语烷基表示环状和非环状基团，尽管环状基团会包含至少三个碳环成员。非环状烷基表示直链或支链烷基。
在本发明化合物中优选的烯基和炔基含有一个或多个不饱和键和2至约20个碳原子，更优选2至约12个碳原子，甚至更优选2至约6个碳原子。本文中使用的术语烯基和炔基表示环状和非环状基团，尽管环状基团会分别包含至少三个或五个碳环成员。非环状烯基或炔基表示直链或支链烯基或炔基。本发明的优选的非环状炔基是-CH-CC。
芳基表示单个和多个芳族环基团，包括含有单独的和/或稠合的芳基的多环基团。典型的芳基含有1至3个单独环或稠合环和6至约18个碳环原子，诸如苯基、萘基、茚基、菲基或蒽基。本发明化合物中的芳基可以在一个或多个可用位置被一个或多个合适的基团取代。
酰基具有形式R8CO-，其中R8是有机基团，诸如之前定义的烷基或芳基，例如乙酰基、丙酰基、苯甲酰基等。合适的酰基具有2至约12个碳原子，优选2至约8个碳原子，更优选2至约6个碳原子，最优选2个碳原子。
重要的碱金属包括钠或钾。
芳烷基表示与如上定义的烷基连接的芳基。优选的芳烷基是苄基。
卤素表示F、Cl、Br、I。优选的卤素是Br。
糖表示单糖、二糖或三糖或糖衍生物，优选单糖或二糖。戊糖或己糖化合物是优选的。衍生物包括糖苷(sugar glycosides)、N-葡基胺(N-glycosylamines)、O-酰基衍生物、O-甲基衍生物、糖醇、糖酸和脱氧糖。
腈是具有-C≡N官能团的有机化合物，优选在本发明的上下文中，腈是-CH2-C≡N基团。
上述基团可以在一个或多个可用位置被一个或多个合适的下述基团取代：诸如OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、OSO2R’、OSO3R’、NO2、NHR’、N(R’)2、＝N-R’、N(R’)COR’、N(COR’)2、N(R’)SO2R’、N(R’)C(＝NR’)N(R’)R’、N3、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCOOR’、OCONHR’、OCON(R’)2、CONHR’、CON(R’)2、CON(R’)OR’、CON(R’)SO2R’、PO(OR’)2、PO(OR’)R’、PO(OR’)(N(R’)R’)、被取代的或未被取代的C1-C12烷基、被取代的或未被取代的C2-C12烯基、被取代的或未被取代的C2-C12炔基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的芳烷基，其中每个R'基团独立地选自氢、OH、O-糖、NO2、NH2、SH、CN、卤素、＝O、COH、CO烷基、COOH、CO2碱金属、被取代的或未被取代的C1-C12烷基、被取代的或未被取代的C2-C12烯基、被取代的或未被取代的C2-C12炔基和被取代的或未被取代的芳基。当这些基团本身被取代时，取代基可选自上述列表。
术语“药学上可接受的盐”表示在施用给患者后能够提供(直接地或间接地)如本文所述的化合物的任何盐。应当理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为那些可用于制备药学上可接受的盐。盐和衍生物的制备可以通过本领域已知的方法进行。
例如，本文提供的化合物的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐例如如下制备：使这些化合物以游离酸或碱的形式与化学计量量的合适碱或酸在水中或有机溶剂中或它们的混合物中反应。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。酸式盐的例子包括：无机酸式盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐，和有机酸式盐例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱式盐的例子包括无机盐，例如钠盐、钾盐、钙盐和铵盐，以及有机碱式盐，例如乙二胺、乙醇胺、N,N-二亚烷基乙醇胺、三乙醇胺和碱性氨基酸盐。
本发明的化合物可以是作为游离化合物或溶剂化物(例如水合物、醇化物，特别是甲醇化物)的结晶形式，并且两种形式意图都在本发明的范围内。溶剂化方法通常是在本领域中已知的。本发明的化合物可以呈现不同的多晶型形式，并且本发明意图涵盖所有这样的形式。
除非另有说明，否则作为通式(I)或(II)的化合物的衍生物的任何化合物均在本发明的范围和精神内。术语“衍生物”以其最宽含义使用，并且涵盖在体内转化为本发明化合物的那些化合物。衍生物的例子包括但不限于通式(I)或(II)的化合物的衍生物和代谢物，其包括可生物水解的部分例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。优选地，具有羧基官能团的化合物的衍生物是羧酸的低级烷基酯。羧酸酯通过使分子上存在的任何羧酸基团酯化而方便地形成。衍生物通常可以使用众所周知的方法制备，诸如Burger“药物化学与药物发现(Medicinal Chemistry and Drug Discovery)第6版(Donald J.Abraham编,2001,Wiley)和“前药的设计与应用(Design and Applications of Prodrugs)”(H.Bundgaard编,1985,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers))中描述的那些方法。
本文提及的任何化合物意图代表此类特定化合物以及某些变体或形式。本文中使用的术语“立体异构体”包括此类化合物的任何对映异构体、非对映异构体或几何异构体(E/Z)。具体地，本文提及的化合物可能具有不对称中心，且因此以不同的对映异构体或非对映异构体形式存在。因此，本文提及的任何给定化合物意图代表以下中的任何一种：外消旋体、一种或多种对映异构体形式、一种或多种非对映异构体形式及其混合物。同样，双键引起的立体异构现象或几何异构现象也是可能的，因此在某些情况下，分子可以作为(E)-异构体或(Z)-异构体(反式和顺式异构体)存在。如果分子含有几个双键，则每个双键都有它自己的立体异构现象，这可能与分子的其它双键的立体异构现象相同或不同。所有立体异构体，包括本文提及的化合物的对映异构体、非对映异构体和几何异构体，及其混合物，都被认为在本发明的范围内。
此外，本文提及的任何化合物都可以作为互变异构体存在。具体而言，术语互变异构体表示化合物的两种或更多种结构异构体中的一种，所述结构异构体平衡存在并且易于从一种异构形式转化为另一种异构形式。常见的互变异构体对是胺-亚胺、酰胺-亚氨酸、酮-烯醇、内酰胺-内酰亚胺等。
此外，当在介质中存在水合物、溶剂化物和多晶型物、及其混合物时，本文提及的任何化合物意图代表这样的形式。本文提及的化合物的所有几何异构体、互变异构体、阻转异构体、水合物、溶剂化物、多晶型物和同位素标记形式，及其混合物，都被认为在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本发明的化合物还意图包括差别仅在于一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，除了氢被氘或氚置换、或者碳被13C-或14C-富集的碳或15N-富集的氮置换之外，具有本结构的化合物均处于本发明的范围内。
上述式(I)或(II)的化合物的一个重要特征是它们的生物活性，且特别是它们的抗氧化性和神经保护性能。
因此，本发明提供了可用于治疗与氧化应激相关的疾病或病症的化合物和药物组合物。这样的疾病或病症包括神经变性疾病诸如帕金森病、阿尔茨海默氏病、老年痴呆、亨廷顿病、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化、中风和具有神经肌肉病变的线粒体病。
可用于本发明的方法的药物组合物包含用于施用给患者的式(I)、(II)的化合物或其混合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体以及药学上可接受的载体。
术语“载体”表示与活性成分一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适的药物载体由E.W.Martin在1995年描述在“雷明顿药学大全(Remington’s PharmaceuticalSciences)”中。
药物组合物的例子包括用于口服、局部或胃肠外施用的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等)或液体(溶液、悬浮液或乳液)组合物。
在一个优选的实施方案中，药物组合物为固体或液体口服形式。适合口服施用的剂型可以是片剂、胶囊剂、糖浆剂或溶液剂，并且可以含有本领域已知的常规赋形剂，诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；制片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉羟乙酸钠或微晶纤维素；或药学上可接受的润湿剂诸如月桂基硫酸钠。
通过混合、填充或压片的常规方法，可以制备固体口服组合物。重复混合操作可用于将活性剂分布在采用大量填充剂的那些组合物中。这样的操作在本领域中是常规的。可以例如通过湿法或干法制粒制备片剂，并任选地根据常规药学实践中众所周知的方法进行包衣，特别是用肠溶衣。
药物组合物也可适用于胃肠外施用，诸如呈适当单位剂型的无菌溶液、悬浮液或低压冻干产品。可以使用适当的赋形剂，诸如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。
将使用标准方法制备提及的制剂，诸如在西班牙和美国药典和类似参考文本中描述或提及的那些方法。
式(I)、(II)的化合物或其组合物的施用可以是通过任何合适的方法，诸如静脉内输注、口服制剂以及腹膜内和静脉内施用。由于对患者的方便和待治疗疾病的慢性特性，口服施用是优选的。
通常，式(I)或(II)的化合物的有效施用量将取决于所选化合物的相对效力、所治疗障碍的严重程度和患者的体重。但是，活性化合物通常每天施用一次或多次，例如每天1、2、3或4次，典型的每日总剂量是在0.1-1000mg/kg/天的范围内。
通式(I)或(II)的化合物及其组合物可以与其它药物一起使用以提供联合疗法。其它药物可以形成相同组合物的一部分，或作为单独的组合物提供用于在相同时间或在不同时间施用。
在本发明的一个特定实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自氢和被取代的或未被取代的C1-C3烷基。优选地，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自氢和甲基。
在一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个、优选至少两个、更优选至少三个独立地选自被取代的或未被取代的C1-C6烷基。在一个特定实施方案中，所述被取代的或未被取代的C1-C6烷基是被取代的或未被取代的C1-C3烷基。优选地它是甲基。
在另一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5独立地选自被取代的或未被取代的C1-C6烷基，优选地选自被取代的或未被取代的C1-C3烷基，更优选地它们是甲基。
在本发明的一个特定实施方案中，R6选自氢、被取代的或未被取代的C2-C12酰基、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6烯基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、被取代的或未被取代的C6-C10芳基、被取代的或未被取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、-CONH2、碱金属和糖。
在另一个实施方案中，R6选自氢、被取代的或未被取代的-C(O)(C1-C6)烷基、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、被取代的或未被取代的C2-C4烯基、被取代的或未被取代的C2-C4炔基、被取代的或未被取代的C6-C10芳基和被取代的或未被取代的(C6-C10)芳基(C1-C3)烷基。
在另一个实施方案中，R6选自氢、被取代的或未被取代的乙酰基、被取代的或未被取代的甲基、乙基、苯基和被取代的或未被取代的苄基。
根据一个实施方案，R6选自氢、乙酰基、甲基、乙基、苯基和苄基。在一个优选的实施方案中，R5是氢。
在本发明的一个特定实施方案中，X代表由下式表示的基团
Figure BDA0003349019580000191
其中R6和虚线键如前面所定义。
在本发明的另一个特定实施方案中，X代表由下式表示的基团
Figure BDA0003349019580000192
其中
其中R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3，优选地选自氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、被取代的或未被取代的C2-C4炔基和-CH2-腈。
根据本发明的第一方面的一个实施方案，使用的式(I)或(II)的化合物选自：
Figure BDA0003349019580000193
Figure BDA0003349019580000201
Figure BDA0003349019580000211
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
优选地，使用的式(I)或(II)的化合物选自：
Figure BDA0003349019580000221
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。在一个实施方案中，本发明的化合物优选地是其中通式是(Ia)或(IIa)的那些，
Figure BDA0003349019580000231
其中X表示由下式代表的基团，
Figure BDA0003349019580000232
且其中R6、R7、波浪键和虚线键如前面所定义，
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
在一个特定实施方案中，R6选自氢、被取代的或未被取代的C2-C12酰基、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6烯基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、被取代的或未被取代的C6-C10芳基、被取代的或未被取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、-CONH2、碱金属和糖。
在另一个特定实施方案中，R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、被取代的或未被取代的C2-C4炔基和-CH2-腈。
在一个优选的实施方案中，式(Ia)或(IIa)的化合物选自：
Figure BDA0003349019580000241
Figure BDA0003349019580000251
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
落入通式(Ia)或(IIa)下的特别优选的本发明的化合物是化合物：
Figure BDA0003349019580000252
Figure BDA0003349019580000261
Figure BDA0003349019580000271
可以使用微生物生产式(Ia)或(IIa)的化合物。优选地，用于生产式(Ia)或(IIa)的化合物的生物体是真菌菌株HT-09B-VENT-WQ002，其培养物已经于2011年1月18日由拜奥马研究所有限公司(Instituto Biomar S.A.,Parque Tecnológico de León,Parcela M-10.4,24009-Armunia,León,西班牙)在登录号CECT 20769下保藏在西班牙的瓦伦西亚大学(Universidad de Valencia)的西班牙典型培养物保藏中心(Colección
Figure BDA0003349019580000272
deCultivos Tipo)。该保藏已经根据《布达佩斯条约》的规定进行，并且在授予本申请的专利后，对公众可获得性的所有限制将不可撤销地保留。
该生物体分离自在西班牙马德里El Ventorrillo收集的土壤样品。
虽然保藏的菌株显然是优选的，但本发明不限制于或不限于任何特定菌株或生物体。本发明的目的是在本发明的范围内包括式(Ia)或(IIa)的化合物的其它生产生物体、菌株或突变体。
在合适的培养基中在受控条件下培养的HT-09B-VENT-WQ002产生化合物(I)。该菌株优选地在需氧和嗜温(mesophilic)条件下在水性营养培养基中生长。在固体培养基上培养它的最佳温度是24-28℃。用于培养的pH范围为5到7。用葡萄糖和淀粉的生长是最好的。也可以使用其它碳源，诸如面粉、甘油和葡萄糖。在摇动培养中，菌丝体高度密集地生长。
在本发明中，化合物(I)、化合物I和GKK1032C都是相同的化合物。
培养特征：
在维持42％湿度的培养室中，在24℃在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextroseagar)上，使菌落在10天内达到4cm直径。
菌落特征：
菌落适度生长，白色，多毛到棉样。它在浸没的菌丝处产生黄色色素。
显微术：
分生孢子梗直立，透明(hialine)，具有梗基的分叉轮生，无分枝。分生孢子球具有光滑壁，2-3μm直径。
在ITS1-5.8S-ITS2核糖体DNA区域的测序分析后，实现了分类学分类。使用Blastn算法将序列与基因库(Gene Bank)储存物进行对比。当与桔青霉(Penicillium citrinum)相比时，菌株HT-09B-VENT-WQ002具有100％匹配。
发酵：
桔青霉HT-09B-VENT-WQ002当在合适的培养基中在受控条件下培养时产生通式(Ia)或(IIa)的化合物。该菌株优选地在水性营养培养基中在需氧和嗜温(优选在24℃-28℃)条件下、以及在5.0和7.0之间的pH生长。多种液体培养基可用于培养生物体。有用的培养基是这样的培养基：其包括可同化的碳源，诸如淀粉、糊精、葡萄糖等，可同化的氮源诸如蛋白、蛋白水解物、脱脂燕麦粉、玉米浸液等，以及有用的无机阴离子和阳离子诸如钠、镁、钾、铵、硫酸根、氯离子、磷酸根、碳酸根等。也可以添加痕量元素。优选通过向发酵培养基供应空气来实现通气。搅拌由机械叶轮提供。
优选地，将储用培养物于-70℃在20％甘油中冷冻保存。
由优选生物体生产式(Ia)或(IIa)的化合物所需的必需步骤是：从冷冻或低压冻干的菌丝体开始。在嗜温温度和在需氧条件下，用含有上面描述的一些成分的培养基在摇瓶中获得培养初始细胞的菌丝体。该接种物用于在具有更大体积的烧瓶中开始培养。有时生产培养基可能与用作接种物的培养基不同。
在一个优选的实施方案中，通过色谱法、沉淀或结晶，优选通过色谱法，分离和纯化所述化合物。
可以使用本领域已知的技术制备本发明的其它化合物。例如，所述化合物可以通过改变发酵条件或通过使用式(I)或(II)的化合物作为起始材料的常规化学方法制备，或通过合成使用本领域技术人员已知的标准有机合成反应通过商购可得的产品和试剂制备，所述标准有机合成反应诸如在以下文献中描述的那些：“综合有机转化：官能团制备指南(Comprehensive Organic Transformations:A Guide to Functional GroupPreparations)”,第2版,Richard C.Larock，或“March's高等有机化学：反应、机理和结构(Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure)”,第6版,Michael B.Smith,和Jerry March，或“高等有机化学，B部分：反应与合成(AdvancedOrganic Chemistry,Part B:Reactions and Synthesis)”,第5版,Francis A.Carey,和Richard J.Sundberg。
作为可通过常规化学方法获得的式(Ia)或(IIa)的天然产物衍生物的例子，化合物A和B可以通过分别用MeOH/HCl和EtOH/HCl处理化合物I来获得。
Figure BDA0003349019580000291
化合物C可以通过用Ac2O和吡啶处理化合物I来获得。
Figure BDA0003349019580000301
将通过实施例进一步举例说明本发明。这些应仅被解释为本发明的示例。将在下面通过发明人进行的试验来举例说明本发明，所述试验清楚地表明了式(I)或(II)的化合物在权利要求限定的申请中的有用性。
实施例
实施例1:HT-09B-VENT-WQ002的发酵
储用培养物：
将HT-09B-VENT-WQ002的纯培养物于-70℃在20％甘油中冷冻保存。
接种物：
用生长良好的琼脂培养物接种在250mL摇瓶中的40mL含有2％燕麦粉、2％麦芽浸出物、0.01％KH2PO4、0.005％MgSO4和自来水的种子培养基，并在24℃在旋转振荡器(200rpm)上培养。将烧瓶温育48小时，并用作第一阶段接种物。
发酵：
将250mL相同培养基在2L锥形瓶中接种10％的第一阶段接种物。于24℃下，在旋转振荡器(200rpm)上发酵7天。可以通过HPLC或具有足够灵敏度的任何其它方法来监测化合物I的生成。
实施例2：化合物I和GKK1032的生成
将真菌HT-09B-VENT-WQ002的发酵液(4L)通过硅藻土过滤，并将菌丝饼用2L的EtOAc/MeOH(3:1)混合物提取两次。将所得悬浮液过滤并在EtOAc和水之间分层。将有机层干燥并将粗提取物(3.1g)通过硅胶上的VFC(真空快速色谱法)分馏，用己烷/EtOAc/MeOH的分级式梯度洗脱。将馏分7-8(用EtOAc和EtOAc/MeOH 9:1洗脱，0.4g)应用到硅胶柱上，并通过用己烷/EtOAc梯度洗脱进行快速色谱分离。将馏分11(用己烷/EtOAc 6:4洗脱，32mg)最后通过半制备型反相HPLC(Agilent Prep 1100 HPLC,5-μg C18柱；30x100 mm；用40-100水性MeOH梯度洗脱25分钟，流速为21.6mL/min，在200nm紫外检测)纯化，得到19mg化合物I(Rt:17.64min)。按照相同的方案纯化馏分6(用己烷/EtOAc 8:2洗脱，32mg)，得到9.5mg已知化合物GKK1032(Rt:18.57min)。保留时间与在Agilent 1200 HPLC(Zorbax XDB C18,1.8μm柱；4.6x 50mm；用含有0.1％三氟乙酸的15-100水性MeOH梯度洗脱20分钟，流速为0.5mL/min，在20℃，在200nm紫外检测)中的分析有关。
化合物I具有分子式C32H39NO5，其通过APCI和API-ES质谱([M+H]+，m/z＝518)、13CNMR和DEPT数据确定。通过2D NMR实验(COSY、HSQC和HMBC)最终确定化合物I的1H和13C NMR谱的完整分配，且其光谱数据如表1所示。
Figure BDA0003349019580000311
表1.化合物I的1H和13C NMR谱数据[δ(ppm),JHH(Hz)；CDCl3]和HMBC
Figure BDA0003349019580000312
Figure BDA0003349019580000321
实施例3：式(I)或(II)的化合物的生成
使用吸附树脂XAD-1180作为固定相和EtOAc/MeOH 3:1作为流动相，将真菌HT-09B-VENT-WQ002的发酵液(8L)进行固相萃取。LCMS允许分离化合物I(106mg，96％纯度)、GKK1032(3.5mg，70％纯度)、pyrrocidine A(15.8mg，77％纯度)、pyrrocidine B(5.63mg，94％纯度)和GKK-1032A2(7.67mg，53％纯度)。
进行另外五个发酵(总体积49.5L)，并分离出3g GKK1032。将该化合物进行不同的反应，主要与低分子量有机金属、酸、碱、烷化剂和还原剂反应，生成14种在结构上与化合物I相关的化合物：
Figure BDA0003349019580000322
Figure BDA0003349019580000331
如下制备化合物CL0652：
将13mg化合物GKK1032溶解在10mL CH2Cl2和1mL CH3CN中。然后加入2茶匙的K2CO3。30分钟以后，加入2当量的CH3I。24小时以后，TLC表明一些起始原料仍有剩余，所以又加入2当量的CH3I。4小时以后，再次加入2当量的CH3I。最后，在24小时以后停止反应，共使用6当量的CH3I。蒸发溶剂，并将残余物溶解在EtOAc中，用饱和盐水溶液(aqueous brinesolution)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸干，得到11mg CL0652。
如下制备化合物CL0653：
将23mg化合物GKK1032溶解在25mL CH2Cl2中并加入1.2当量的N-溴琥珀酰亚胺(NBS)。通过TLC监测反应。24小时以后，再加入1当量的NBS。最后，在48小时以后，将反应混合物用饱和盐水溶液洗涤，得到27mg反应混合物，将其通过制备薄层色谱法(preparativeTLC)纯化，用己烷/EtOAc(6:4)洗脱，分离出8mg纯的CL0653。
如下制备化合物CL0661：
将60mg化合物GKK1032溶解在无水THF中并加入过量的NaH(在氮气氛下)。72h以后，将反应油倒在冰和EtOAc上并蒸发THF。将得到的残余物用饱和盐水溶液洗涤，得到51mg反应混合物，将其通过制备薄层色谱法纯化，用己烷/EtOAc(6:4)洗脱，分离出9mg纯的CL0661和20mg起始原料。
如下制备化合物CL0663和CL0664：
将237mg化合物GKK1032溶解在20mL CH2Cl2和20mL CH3CN中。然后加入2茶匙的K2CO3。30分钟以后，加入3当量的CH3I。通过TLC监测反应，最后，在经过6天和共加入5当量的CH3I以后，蒸去溶剂，并将残余物溶解在EtOAc中，用饱和盐水溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将反应混合物(218mg)在CH3OH中结晶，得到120mg纯的CL0652和96mg母液。将母液通过制备薄层色谱法纯化，用己烷/EtOAc(8:2)洗脱，得到16mg CL0652、12mg CL0663和10mg CL0664。
如下制备化合物CL0665：
将83mg化合物GKK1032溶解在40mL CH3OH中并用冰冷却至0℃。分别加入5当量的NaBH4和LiCl。8天以后，将反应物用饱和盐水溶液洗涤。将反应混合物在CH3OH中结晶，得到60mg沉淀物，将其通过制备薄层色谱法纯化，用己烷/EtOAc(7:3)洗脱。此后，分离12mgCL0665并用甲醇重结晶，得到3mg纯的CL0665。
如下制备化合物CL0666：
将85mg化合物GKK1032溶解在20mL THF中并用冰冷却至0℃。然后加入5当量的LiAlH4。6天以后，将反应物倒在EtOAc和冰上。蒸发THF并将残余物用饱和盐水溶液洗涤。将反应产物通过制备薄层色谱法进一步纯化，用己烷/EtOAc(2:8)洗脱，得到18mg纯的CL0666。
如下制备化合物CL0667：
将48mg化合物GKK1032溶解在2mL DMF中。然后加入2茶匙的K2CO3。30分钟以后，加入2当量的氯乙腈。24小时以后，另外加入2当量的氯乙腈并再搅拌24小时。然后蒸发DMF，将粗残余物溶解在EtOAc中，并用饱和NaCl溶液洗涤，得到55mg粗残余物，将其通过制备薄层色谱法进一步纯化，用CH2Cl2/CH3OH(98:2)洗脱，分离出15mg CL0667，将其最后进行硅胶柱层析分离，用己烷/EtOAc(6:4)洗脱，得到12mg纯的CL0667。
如下制备化合物CL0669：
将43mg化合物GKK1032溶解在3mL DMF中并加入过量的K2CO3。30分钟以后，加入1.5当量的氯乙腈。在经过5天和共加入3当量的氯乙腈以后，蒸发DMF并将反应混合物溶解在EtOAc中，并用饱和盐水溶液洗涤。然后将反应混合物干燥并通过硅胶柱色谱法纯化，用CH2Cl2/CH3OH(92:8)洗脱，分离出34mg CL0669，将其通过制备薄层色谱法进一步纯化，用CH2Cl2/CH3OH(96:4)洗脱，得到9mg纯的CL0669。
如下制备化合物CL0670：
将32mg化合物GKK1032溶解在20mL CH2Cl2中并加入1.2当量的间氯过苯甲酸。4天以后，将反应混合物用5％NaHCO3溶液洗涤，用饱和盐水溶液中和并干燥。将粗残余物在CH3OH中结晶，得到10.5mg纯的CL0670。
如下制备化合物CL0671和CL0672：
将79mg化合物GKK1032溶解在DMF中，并加入5当量的氯丙酮和过量的K2CO3。4天以后，蒸去DMF，并将反应混合物溶解在EtOAc中，并用饱和盐水溶液洗涤，得到100mg复杂混合物，将其通过制备薄层色谱法进一步纯化，用己烷/EtOAc(6:4)洗脱，得到14.8mg CL0671和12.2mg CL0672。最后将两种化合物在甲醇中结晶，得到7mg纯的CL0671和5mg纯的CL0672。
如下制备化合物CL0673：
将28mg化合物CL0652溶解在20mL CH2Cl2中并加入1.2当量的间氯过苯甲酸。24小时以后，将反应混合物用5％NaHCO3溶液洗涤，用饱和盐水溶液中和并干燥。将粗残余物在CH3OH中结晶，得到12.7mg纯的CL0673。
如下制备化合物CL0674：
将67mg化合物GKK1032溶解在15mL CH2Cl2中并加入1.2当量的乙酸汞(II)。经过6天和几次加入乙酸汞(II)以后，将反应混合物用饱和NaCl水溶液洗涤并蒸干。将粗残余物通过制备薄层色谱法进一步纯化，用己烷/EtOAc(1:1)洗脱，分离出58mg CL0674，将其最后在甲醇中结晶，得到4.2mg纯的CL0674。
通过1H-NMR、13C-NMR和MS技术对化合物进行鉴定和表征。化合物CL0661、CL0665、CL0666和CL0670的NMR谱(CDCl3)显示在图17至24中。
实施例4：化合物I、GKK1032和Pyrrocidine A的干扰活性氧物质形成的能力.
已经在如先前所述(Herrero-Mendez A.等人,Nat.Cell.Biol.11:747-752,2009)得到的大鼠皮质原代神经元中进行了实验。在培养7或8天后，在没有或有L-丁硫氨酸亚砜亚胺(L-BSO；100μM)(谷氨酸-半胱氨酸连接酶的抑制剂，因此造成细胞的谷胱甘肽剥夺)和线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮(0.2μM)存在下培养神经元。
将数据表示为来自n＝6的平均值±平均值的标准差(SEM)(即，独立测量的6个独立孔)。L-BSO和鱼藤酮处理显著刺激神经元中活性氧和活性氮(RONS)的内源性产生，如使用荧光方法
Figure BDA0003349019580000371
Red过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒(Invitrogen,目录号A22188)使用多孔荧光读数器(Varioskan,Thermo Scientific)通过H2O2的释放所检测的。
将H2O2与化合物I、GKK1032和Pyrrocidine A混合以评估它是否干扰H2O2测定方法，从而导致这样的干扰不存在。
进行了四个不同的实验来研究化合物的干扰内源性活性氧形成的能力。
a)在6小时内用L-BSO和鱼藤酮处理神经元，然后用磷酸盐-缓冲盐水(PBS)洗涤两次，之后将化合物I以1和5μg/ml的浓度加给神经元，并立即记录接下来的2小时中H2O2的释放情况。如在图1中所示，化合物I剂量依赖性地降低神经元形成H2O2的速率。
b)将神经元与化合物I或GKK1032或Pyrrocidine A(1μg/ml)以及与L-BSO和鱼藤酮一起温育6小时，然后将细胞用PBS洗涤两次并在接下来的2小时中记录H2O2的形成速率。如图2所示，用化合物I或GKK1032或Pyrrocidine A对神经元的预处理明显降低了H2O2的速率。
c)将神经元与化合物I(5μg/ml)一起温育72小时(即，从培养的第4天到第7天)，然后将细胞用PBS洗涤两次并进一步与L-BSO和鱼藤酮一起温育6小时。在该阶段之后，再次洗涤细胞并确定在接下来的2小时内H2O2的生成速率。如图3所示，用化合物I对神经元的预处理非常明显地阻止了L-BSO+鱼藤酮诱导的H2O2形成。化合物I还阻止了未经处理的神经元中的H2O2形成。
d)在有不同浓度的化合物I(0.1、1或5μg/ml)存在下与L-BSO和鱼藤酮一起温育3或6小时后，测定神经元中的蛋白浓度。如图4所示，用L-BSO+鱼藤酮温育神经元稍微降低了孔中剩余的蛋白浓度，表明神经元死亡水平较低但可测量。相比之下，化合物I的存在剂量依赖性地阻止了蛋白浓度从0.1μg/ml开始的这种降低(6小时)。因此，化合物I被揭示为抗神经毒性的和促存活的化合物。
实施例5：式(I)的化合物用于阻止H2O2的形成
在如先前所述(Herrero-Mendez A.等人,Nat.Cell.Biol.11:747-752,2009)得到的大鼠皮质原代神经元中进行了实验。在B27-MAO培养7或8天后，将神经元(来自C57BL6/J小鼠)在有N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA，H2O2产生促进剂；100μM)存在下温育10分钟，然后是PBS洗涤步骤，并在不存在(DMSO)或存在递增量的GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine B、Pyrrocidine A、CL0661、CL0665、CL0667和CL0670(0.1μM、1μM和5μM)的情况下进行24小时的B27温育步骤。B27-MAO代表Neurobasal培养基，在没有抗氧化剂(减去抗氧化剂，MAO)存在的情况下补充了B27补充物。
使用荧光方法
Figure BDA0003349019580000381
Red过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒(Invitrogen,目录号A22188)通过多孔荧光读数器(Varioskan,Thermo Scientific)测量H2O2的释放。
通过测量天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性来确定神经元细胞凋亡(Veas-Perez de Tudela等人.Sci Rep 5:18180；doi:10.1038/srep18180(2015)。
将数据表示为来自n＝3的平均值±平均值的标准差。
如在图5中所示，GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine B、Pyrrocidine A、CL0661、CL0667和CL0670成功地阻止了神经元细胞中H2O2的产生。
另外，GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine B、CL0661、CL0665CL0667和CL0670有效保护神经元细胞免于细胞凋亡，如在图6中所示。
实施例6:式(I)的化合物用于阻止神经元细胞凋亡.
在如先前所述(Herrero-Mendez A.等人,Nat.Cell.Biol.11:747-752,2009)得到的小鼠皮质原代神经元中进行了实验。在B27-MAO培养7或8天后，将神经元(来自C57BL6/J小鼠)在没有(DMSO)或有递增浓度的式(I)化合物存在下与β-淀粉样蛋白(10μM,24h)一起温育，所用的式(I)化合物为：GKK1032C、GKK1032、Pyrrocidine A、CL0661、CL0663、CL0664、CL0665、CL0666、CL0667、CL0669和CL0670(0.1μM、1μM和5μM的浓度)。选择用β-淀粉样蛋白对神经元细胞的处理来体外模拟在阿尔茨海默病患者的脑中发现的淀粉样蛋白斑块的形成。B27-MAO代表Neurobasal培养基，在没有抗氧化剂(减去抗氧化剂，MAO)存在的情况下补充了B27补充物。
通过测量活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3来测量与β-淀粉样蛋白一起温育24小时后的神经元细胞凋亡，且结果如图7所示。
试验化合物在试验浓度都显示出明显的神经保护作用。
实施例7.式(I)的化合物用于阻止亨廷顿和α-共核蛋白聚集
在37℃和5％CO2下将SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞保持在补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素-0.1mg/mL链霉素的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中。
为了研究化合物对在细胞中积累的突变亨廷顿和共核蛋白的影响，用组成活性的突变亨廷顿表达载体pEGFP-Q74(其编码与亨廷顿片段融合的EGFP蛋白，对应于具有74个CAG重复的外显子1；c.54GCA[74]；Addgene；#40262)和EGFP-α共核蛋白-A53T(Addgene；#40823)转染SH-SY5Y。
对于转染测定，将细胞接种(30×103细胞/cm2)在96-多孔板(涂有poliornitine-纤连蛋白)上。根据生产商的说明书(Thermo Fisher)使用含Plus试剂的LTX用0.3μgpEGFP-Q74质粒转染细胞。24小时后，用新培养基更换培养基，并在37℃用递增量的GKK1032C和CL0670(0.1μM、1μM和5μM)或DMSO(对照细胞)处理细胞24小时。最后，将细胞在室温(RT)用4％低聚甲醛(PFA)固定15分钟，并进行免疫荧光测定(β-微管蛋白：红色和GFP:绿色)。用Operetta CLS共焦显微镜(Perkin Elmer)获得图像。
图8表明，突变的共核蛋白和聚集体数量在5μM GKK1032C和CL0670处理的细胞中显著减少。
图9表明，突变的亨廷顿蛋白和聚集体数量在5μM CL0670处理的细胞中显著减少。
实施例8:化合物I的最大耐受剂量和药代动力学.
在腹膜内施用给9周龄雌性C57BL/6(～25g)小鼠后，测定化合物I的最大耐受剂量(MTD)和药代动力学(PK)。注射剂包括在Creomophor-EtOH-H2O(10:5:85)中的150mg/Kg剂量的化合物I。使用先前经过验证的分析方法在每个重复的不同时间(施用前、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、4小时、10小时、24小时和48小时)测定在血浆和脑中的GKK1032C浓度。结果如图10所示，并表明在注射后4小时血浆中的最高浓度为30000ng/mL。GKK1032C成功地穿过血脑屏障，从而经过约18小时在脑中达到高水平。在注射后4小时脑内的最高浓度为850ng/mL，并逐渐下降，直至在施用后24小时达到对照水平。
实施例9:化合物I及其在正常条件下对小鼠运动协调、恐惧/焦虑和短期记忆的影响.
进行实验以评价向小鼠腹膜内施用化合物I是否会对动物的运动协调、恐惧/焦虑和短期记忆行为产生任何影响。该实验的动机是确定，在正常条件下，化合物I的注射是否会在体内影响8周龄C57BL6/J雄性小鼠的行为。将小鼠分为I组(仅媒介物注射)和II组(化合物I注射)。给小鼠每天注射一次150mg/kg的剂量持续3天。试验由转棒性能试验(在第1、2、3和4天)、旷场试验(在第2天和第3天)和异常物体识别测试(仅在第4天)组成。
图11表明，化合物I对试验动物的运动协调没有影响。
图12和13显示了旷场试验结果，它们提供了动物关于恐惧和/或焦虑的行为变化的迹象。令人惊讶的是，化合物I增加了动物在场地中央广场度过的时间以及立起(啮齿动物在中央广场用其后腿站立的频率)的增加。化合物I进一步增加了线穿过(即啮齿动物穿过网格线的频率)的数量。该实验的结果证明，动物具有增加的探索行为，并且化合物I通过减少恐惧和/或通过减少焦虑水平具有去抑制作用。
图15显示了异常物体识别测试。结果表明，化合物I的施用没有改变啮齿动物的短期记忆。
实施例10:化合物I和CL0670及其在小鼠模型中保护神经元免于亨廷顿病的作用.
进行亨廷顿病的化学模型以评价化合物I和CL0670的保护神经元的能力。这通过腹膜内注射3-硝基丙酸实现，3-硝基丙酸通过抑制琥珀酸脱氢酶诱导神经元氧化应激。
将8周龄C57BL6/J雄性小鼠分为4组。
给组I的小鼠(4只小鼠)注射GKK1032C和CL0670(每日一次150mg/kg的剂量持续3天)。
给组II的小鼠(5只小鼠)注射GKK1032C和CL0670(每日一次150mg/kg的剂量持续3天)和3-硝基丙酸(每日两次50mg/kg的剂量持续3天)。对于组II，在注射GKK1032C和CL0670的2小时后和12小时后，注射3-硝基丙酸。
给组III的小鼠(5只小鼠)注射3-硝基丙酸(每日两次50mg/kg的剂量持续3天)。
给组IV的小鼠(6只小鼠)仅注射媒介物。
在注射后2小时，每天一次对小鼠进行转棒试验。在第4天，在与第1-3天相同的时间对小鼠进行转棒试验，并在试验后收集样品。
图15显示了组I(□)、II(■)、III(●)和IV(○)的转棒试验结果。自实验的第一天起，属于组III(仅用氧化应激诱导物3-硝基丙酸处理)的那些小鼠的运动协调受到显著影响。该结果与亨廷顿病情景一致。治疗2天后，组II中的小鼠的运动能力显著改善，这表明GKK1032C和CL0670在两次施用后部分地防止运动失调。
图16显示了组I、II、III和IV的旷场试验结果。令人惊讶的是，GKK1032C和CL0670增加了动物在场地中心广场度过的时间和线穿过(即啮齿动物穿过网格线的频率)的数量。该实验的结果证明动物具有改善和恢复行为。
实施例11：化合物I和CL0670在小鼠模型中保护神经元免于中风的能力.
中脑动脉阻塞涉及暂时地或永久地限制MCA血流到皮质和纹状体。中风的脑缺血模型通常用于评估脑中的缺血性损伤。中脑动脉(MCA)的阻塞会导致纹状体和皮质中的脑血流量减少。它是一个高度可重复的模型，其导致类似于在人类中风中发生的那些脑损伤。
以10mg/kg的剂量静脉内地施用化合物GKK1032C和CL0670。将11-周龄C57BL6/J雄性小鼠分为3组，每组7只：发生中脑动脉阻塞(缺血)的小鼠，发生中脑动脉阻塞并施用GKK1032C和CL0670的小鼠。
将所有小鼠首先在转棒中训练连续3天。该阶段以后，将小鼠用七氟烷麻醉并进行手术。通过维持手术丝阻塞中脑动脉30分钟来进行阻塞。一旦取出，就在颈静脉处注射GKK1032C和CL0670。复苏后24小时，将动物进行转棒试验。
结果显示在图18中，其中观察到进行阻塞手术(中风)的那些小鼠遭受到显著的(约75％)运动协调损害。向中风小鼠立即注射GKK1032C和CL0670极大地改善了动物的恢复情况(约17％)，如图17所示。
为了对比GKK1032C和CL0670对小鼠的运动协调和外科手术引起的脑损伤的神经保护作用，将动物处死，并在用氯化四唑处理后通过目检测量中风大小。图18表明，平均中风体积百分比(percentage averaged stroke volume)是约48％，而用GKK1032C和CL0670治疗的小鼠的平均中风体积百分比是39.5％。数据证实，GKK1032C和CL0670是抗中风的极好神经保护剂。
图19表明，GKK1032C和CL0670能够保护大约18％的由中脑动脉阻塞引起的中风体积。
Figure BDA0003349019580000421

Claims (15)

1.用于治疗与氧化应激有关的疾病的下式的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体：
Figure FDA0003349019570000011
其中
波浪键～是双键或环氧化物，
Figure FDA0003349019570000012
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢和被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R5选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基或卤素；
X表示由式(III)至(XII)代表的基团，
Figure FDA0003349019570000013
其中
虚线键代表任选的双键，当存在时，其为式(II)的化合物中X和(B)之间的双键；
R6选自氢、被取代的或未被取代的酰基、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的芳烷基、-CONH2、碱金属和糖；且
R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3；
所述疾病选自神经变性疾病、中风和具有神经肌肉病变的线粒体病。
2.用于根据权利要求1所述的用途的化合物，其中所述疾病选自神经变性疾病和具有神经肌肉病变的线粒体病。
3.用于根据权利要求2所述的用途的化合物，其中所述神经变性疾病选自帕金森病、阿尔茨海默氏病、老年痴呆、亨廷顿病、多发性硬化和肌萎缩性侧索硬化。
4.用于根据权利要求1-3中的任一项所述的用途的化合物，其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自氢和甲基。
5.用于根据权利要求1-4中的任一项所述的用途的化合物，其中R6选自氢、被取代的或未被取代的C2-C12酰基、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6烯基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、被取代的或未被取代的C6-C10芳基、被取代的或未被取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、-CONH2、碱金属和糖。
6.用于根据权利要求5所述的用途的化合物，其中R6选自氢、被取代的或未被取代的乙酰基、被取代的或未被取代的甲基、乙基、苯基和被取代的或未被取代的苄基。
7.用于根据权利要求1-6中的任一项所述的用途的化合物，其中所述式(I)或(II)的化合物选自：
Figure FDA0003349019570000021
Figure FDA0003349019570000031
Figure FDA0003349019570000041
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
8.下式的化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物或立体异构体：
Figure FDA0003349019570000042
其中
波浪键～是双键或环氧化物，
Figure FDA0003349019570000051
X表示由下式代表的基团，
Figure FDA0003349019570000052
其中
虚线键代表任选的双键，当存在时，其为式(II)的化合物中X和(B)之间的双键；
其中R6选自氢、被取代的或未被取代的酰基、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯基、被取代的或未被取代的炔基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的芳烷基、-CONH2、碱金属和糖；
其中R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、腈、-CH2-腈和-CH2-CO-CH3；
前提条件是，不包括下式的化合物：
Figure FDA0003349019570000061
9.根据权利要求8所述的化合物，其中R6选自氢、被取代的或未被取代的C2-C12酰基、被取代的或未被取代的C1-C6烷基、被取代的或未被取代的C2-C6烯基、被取代的或未被取代的C2-C6炔基、被取代的或未被取代的C6-C10芳基、被取代的或未被取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、-CONH2、碱金属和糖。
10.根据权利要求8所述的化合物，其中R7选自氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、被取代的或未被取代的C2-C4炔基和-CH2-腈。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的化合物，所述化合物选自：
Figure FDA0003349019570000062
Figure FDA0003349019570000071
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
12.一种用于制备在权利要求1-11中的任一项中定义的化合物的方法，所述方法包括在水性营养培养基中培养菌株HT-09B-VENT-WQ002，其可在登录号CECT 20769下从西班牙瓦伦西亚大学的西班牙典型培养物保藏中心得到，从培养液中分离并纯化所产生的化合物，以及任选地，将所述化合物转化为权利要求1-11中任一项定义的化合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水性营养培养基包含pH值为5-7的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
14.一种药物组合物，其包含在权利要求8-11中的任一项中定义的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体以及药学上可接受的载体。
15.用作药物的在权利要求8-11中的任一项中定义的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。
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