WO2022224820A1

WO2022224820A1 - きのこ由来の概日リズム調節物質

Info

Publication number: WO2022224820A1
Application number: PCT/JP2022/017131
Authority: WO
Inventors: 亨石原; 剛一柳; 直史西田
Original assignee: 国立大学法人鳥取大学; 株式会社ジーピーシー研究所; 鳥取県
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2022-10-27
Also published as: JPWO2022224820A1

Abstract

本発明は、式Ｉ、式Ｉ'、式ＩＩまたは式ＩＩ'で示される化合物、ならびに該化合物またはツチナメコの培養物を含む概日リズム調節用組成物などを提供する。

Description

きのこ由来の概日リズム調節物質

　本発明は、きのこ由来生理活性物質およびその用途に関する。詳細には、本発明は、きのこ由来の概日リズム調節物質およびそれを含む食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物等に関する。なお、本願は、日本国特許出願第２０２１−０７２７１９号に対して優先権を主張するものである。該日本国特許出願の全内容を参照により本願に組み込む。

　概日リズムとは、生物が本来保持している約２４時間周期のリズムである。その乱れは概日リズム睡眠障害（航空機による長距離移動やシフト勤務などによって生じる社会的概日リズム睡眠障害を含む）の原因となるばかりでなく、生活習慣病やがんなどにも関連していることが明らかになってきている。概日リズムが腸内環境、免疫、認知、学習機能、薬剤代謝など、多岐にわたる生理機能に影響していることを示す研究も多く発表されてきている。これらの要因から、概日リズム改善に対する社会的ニーズが増大している。このようなニーズに答えるべく、概日リズム調節物質の探索が行われている（例えば、特許文献１~４）。しかしながら、これらの物質は、効果や安全性の点で必ずしも満足できるものではない。

特開平０６−７２８７４号公報特開平１１−５１５０１４号公報特開２００３−８１８２９号公報特開２０１０−２１５５６１号公報

　概日リズム調節作用を有する新たな物質を見出す必要性があった。そのような物質を含む概日リズム調節用組成物、そのような物質を用いる概日リズム調節方法などを提供する必要性もあった。

　上記課題を解決するために、本発明者らは、２０００種近いきのこの抽出物ライブラリーを作成し、概日リズム調節物質に関してスクリーニングを行ったところ、食用とされるきのこであるツチナメコ（Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ　ｅｒｅｂｉａ）の抽出物が非常に強力な概日リズム調節作用を有することを見出した。そして、本発明者らは、この抽出物から概日リズム調節物質を単離し、構造決定し、これらの物質が文献未記載のジテルペノイド、（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオール、および（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオールであると同定した。さらに本発明者らは、動物実験においてこれらの物質の概日リズム調節活性を確認した。かくして、本発明者らは本発明を完成させた。

　したがって、本発明は以下のものを提供する：
　（１）式Ｉ：

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、またはＣＯＲ^ａであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＲ^ｂＲ^ｃ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、またはハロゲンであり、ＡはＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｒ^ａは水素またはＣ_１−３アルキルであり、Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは互いに独立して水素またはＣ_１−３アルキルである］で示される化合物。
　（２）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が互いに独立してメチルまたはエチルであり、ＡがＣＨ_２である、（１）記載の化合物。
　（３）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が水素であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７がメチルであり、ＡがＣＨ_２である、（２）記載の化合物。
　（４）立体配置（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）を有する（１）~（３）のいずれか記載の化合物。
　（５）式Ｉ’：

で示される（４）記載の化合物。
　（６）式ＩＩ：

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、またはＣＯＲ^ａであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＲ^ｂＲ^ｃ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、またはハロゲンであり、Ｒ^ａは水素またはＣ_１−３アルキルであり、Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは互いに独立して水素またはＣ_１−３アルキルであり、ｎは１−３の整数である］で示される化合物。
　（７）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が互いに独立してメチルまたはエチルであり、ｎが１または２である、（６）記載の化合物。
　（８）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が水素であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７がメチルであり、ｎが１である、（７）記載の化合物。
　（９）立体配置（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）を有する（６）~（８）のいずれか記載の化合物。
　（１０）式ＩＩ’：

で示される（９）記載の化合物。
　（１１）（１）~（１０）のいずれか記載の化合物を含む、概日リズム調節用の組成物。
　（１２）（５）記載の化合物および／または（１０）記載の化合物を含む、（１１）記載の組成物。
　（１３）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を含む、概日リズム調節用の組成物。
　（１４）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、（１３）記載の組成物。
　（１５）ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、（１４）記載の組成物。
　（１６）食品組成物、医薬組成物または化粧料組成物である、（１１）~（１５）のいずれか記載の組成物。
　（１７）概日リズムの乱れに起因する健康障害を改善、治療または予防するための、（１１）~（１６）のいずれか記載の組成物。
　（１８）健康障害が概日リズム睡眠障害である、（１７）記載の組成物。
　（１９）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこを培養し、培養物から（１）~（１０）のいずれか記載の化合物を精製することを含む、（１）~（１０）のいずれか記載の化合物の製造方法。
　（２０）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、（１９）記載の方法。
　（２１）ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、（２０）記載の方法。
　（２２）化合物が、（５）記載の化合物および／または（１０）記載の化合物である、（１９）~（２１）のいずれか記載の方法。
　（２３）受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているツチナメコ。

　さらに本発明は以下のものを提供する：
　（２４）（１）~（１０）のいずれか記載の化合物を、概日リズム調節を要する対象に投与することを含む、概日リズム調節方法。
　（２５）化合物が、（５）記載の化合物および／または（１０）記載の化合物である、（２４）記載の方法。
　（２６）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を、概日リズム調節を要する対象に投与することを含む、概日リズム調節方法。
　（２７）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、（２６）記載の方法。
　（２８）ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、（２７）記載の方法。
　（２９）概日リズムの乱れに起因する健康障害を改善、治療または予防するための、（２４）~（２８）のいずれか記載の方法。
　（３０）健康障害が概日リズム睡眠障害である、（２９）記載の方法。

　さらに本発明は以下のものを提供する：
　（３１）概日リズム調節における使用のための、（１）~（１０）のいずれか記載の化合物。
　（３２）（５）記載の化合物および／または（１０）記載の化合物である、（３２）記載の化合物。
　（３３）概日リズム調節における使用のための、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物。
　（３４）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、（３３）記載の培養物。
　（３５）ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、（３４）記載の培養物。
　（３６）概日リズムの乱れに起因する健康障害の改善、治療または予防における使用のための、（３１）または（３２）記載の化合物、または（３３）~（３５）のいずれか記載の培養物。
　（３７）健康障害が概日リズム睡眠障害である、（３６）記載の化合物または培養物。

　さらに本発明は以下のものを提供する：
　（３８）概日リズム調節用の組成物を製造するための、（１）~（１０）のいずれか記載の化合物の使用。
　（３９）化合物が、（５）記載の化合物および／または（１０）記載の化合物である、（４０）記載の使用。
　（４０）概日リズム調節用の組成物を製造するための、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物の使用。
　（４１）Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、（４０）記載の使用。
　（４２）ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、（４３）記載の使用。
　（４３）組成物が、概日リズムの乱れに起因する健康障害を改善、治療または予防するために用いられる、（３８）~（４２）のいずれか記載の使用。
　（４４）健康障害が概日リズム睡眠障害である、（４３）記載の使用。

　本発明によれば、新規概日リズム調節物質、ならびにそれらを含む概日リズム調節用組成物などが提供される。本発明の概日リズム調節物質は概日リズム調節作用が大きい。しかも該物質は、可食きのこであるツチナメコ由来であるため、安全性が高い。したがって、該物質を含む概日リズム調節用組成物は、概日リズム調節作用が大きく、安全性が高い。さらに本発明によれば、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を含む概日リズム調節用組成物が提供される。ツチナメコを含むＣｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこは食用に供されるものが多いので、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を含む概日リズム調節用組成物もまた、概日リズム調節作用が大きく、安全性が高い。式Ｉおよび式ＩＩで示される本発明の化合物およびその類縁体、ならびにＣｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を含む組成物は、食品、医薬品、化粧品、ならびに時間栄養学等の分野に大きなインパクトを与えると考えられる。

図１は、ツチナメコ（ＴＵＦＣ　３２１５７株）の培養濾液の酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、得られたヘキサン／アセトン＝６０／４０（ｖ／ｖ）画分の概日リズム調節活性を示すフラフである。グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線は活性画分を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図２は、上記ヘキサン／アセトン＝６０／４０（ｖ／ｖ）画分をＯＤＳカラムクロマトグラフィーにかけ、得られたメタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）画分の概日リズム調節活性を示すフラフである。グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線は活性画分を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図３の上パネルは、上記メタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）画分のＨＰＬＣチャートである。図３の下パネルは、ＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣによって精製されたＦｒ．２中の活性物質の概日リズム調節活性を示すフラフである。図３の下パネルのグラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線は活性画分を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図４は、図３上パネルの保持時間４．５~５．０分のフラクションを８０％アセトニトリル／０．１％酢酸を用いたＯＤＳカラムによるＨＰＬＣのチャートを示す。Ｆｒ．１およびＦｒ．２をそれぞれ分取した。図５は、単離されたＦｒ．２中の活性物質の^１Ｈ　ＮＭＲスペクトル（上パネル）および^１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル（下パネル）を示す。図６は、Ｆｒ．１中の活性物質の概日リズム調節活性を示すグラフである。グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線はＦｒ．１中の活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図７の左上パネルは、Ｆｒ．１を５０％アセトニトリル／０．１％酢酸を用いたＯＤＳカラムに供して得られたＨＰＬＣのチャートである。図７の左下パネルは、Ｆｒ．１−２を７０％メタノール／水を用いたＯＤＳカラムに供して得られたＨＰＬＣのチャートである。図７の右上パネルは、図７の左上のＨＰＬＣチャートの保持時間約１１分のピークを分取して得られたフラクション（Ｆｒ．１−２）中の活性物質の概日リズム調節活性を示すグラフである。図７の右下のパネルは、図７の左下のＨＰＬＣチャートの保持時間約２０分のピークを分取して得られたフラクション（Ｆｒ．１−２−６）中の活性物質の概日リズム調節活性を示すグラフである。右上パネルおよび左上パネルにおいて、グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線は活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図８は、Ｆｒ．２中の活性物質とＦｒ．１−２−６中の活性物質の^１Ｈおよび^１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルの比較を示す。図９は、Ｆｒ．２中の活性物質の濃度依存的な振幅増大活性を示すグラフである。グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。細かい破線はＦｒ．２中の活性物質３μｇ／ｍｌ添加系、粗い破線はＦｒ．２中の活性物質１０μｇ／ｍｌ添加系、実線はＦｒ．２中の活性物質３０μｇ／ｍｌ添加系、点線は溶媒のみ添加系の結果を示す。図１０は、概日リズムのピーク前にＦｒ．２中の活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムの変化を示すグラフである。グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線はＦｒ．２中の活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図１１は、概日リズムのピーク後にＦｒ．２中の活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムの変化を示すグラフである。グラフの横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線はＦｒ．２中の活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。図１２は、明期から暗期に変わる１時間前（ＺＴ１１）に、Ｆｒ．２中の活性物質をＢｍａｌ１レポーターマウス（株式会社ジーピーシー研究所）に投与した場合の（３日間にわたりＺＴ１１における投与を行った）、各時間におけるマウス肝臓の発光の変化を示す写真である。図中、青は発光値が低いことを、赤は発光値が高いことを示す。左３匹がＦｒ．２中の活性物質投与群、右２匹がコントロール群である。図１３は、ＺＴ１１に、Ｆｒ．２中の活性物質をＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の（３日間にわたりＺＴ１１における投与を行った）、各時間におけるマウス肝臓の発光値の変化を示すグラフである。横軸は測定時点を、縦軸は相対発光強度を示す。実線はＦｒ．２中の活性物質をＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の発光強度を、破線は溶媒のみをＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の発光強度を示す。図１４は、明期から暗期に変わって１時間後（ＺＴ１３）に、Ｆｒ．２中の活性物質をＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の（３日間にわたりＺＴ１３における投与を行った）、各時間におけるマウス肝臓の発光の変化を示す写真である。図中、青は発光値が低いことを、赤は発光値が高いことを示す。左３匹がＦｒ．２中の活性物質投与群、右２匹がコントロール群である。図１５は、ＺＴ１３に、Ｆｒ．２中の活性物質をＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の（３日間にわたりＺＴ１３における投与を行った）、各時間におけるマウス肝臓の発光値の変化を示すグラフである。横軸は測定時点を、縦軸は相対発光強度を示す。実線はＦｒ．２中の活性物質をＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の発光強度を、破線は溶媒のみをＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した場合の発光強度を示す。図１６は、Ｆｒ．１−２−６中の活性物質の概日リズム調節活性を示すフラフである。横軸は測定時間（ｈ）、縦軸はＤｅｔｒｅｎｄｅｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を示す。実線はＦｒ．１−２−６中の活性物質を細胞に添加した場合の概日リズムを、破線は溶媒のみを細胞に添加した場合の概日リズムを示す。

　本発明は、１の態様において、式Ｉで示される化合物を提供する。

　式Ｉの化合物は、１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオールおよびその類縁体を包含する。式Ｉの化合物は、その誘導体を包含する。式Ｉの化合物は、その構造異性体および立体異性体を包含する。さらに式Ｉの化合物が塩および溶媒和物を形成しうる場合は、その塩および溶媒物も式Ｉの化合物に包含される。

　式Ｉの化合物において、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、またはＣＯＲ^ａである。Ｒ^ａは水素またはＣ_１−３アルキルである。好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルである。さらに好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は水素である。

　Ｃ_１−３アルキルは炭素数１~３個のアルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピル基を包含する。

　式Ｉの化合物において、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＲ^ｂＲ^ｃ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、またはハロゲンである。Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは互いに独立して水素またはＣ_１−３アルキルである。Ｃ_１−３アルキルにつていては上で説明したとおりである。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を包含する。好ましくは、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立してメチルまたはエチルである。さらに好ましくは、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７はメチルである。

　ＡはＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである。好ましくは、ＡはＣＨ_２である。

　好ましい式Ｉの化合物は、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が互いに独立してメチルまたはエチルであり、ＡがＣＨ_２である化合物である。さらに好ましい式Ｉの化合物は、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が水素であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７がメチルであり、ＡがＣＨ_２である化合物、すなわち、１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオールである。この化合物の好ましい立体配置は（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）である。したがって、本発明の特に好ましい式Ｉの化合物の１つは（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオール（式Ｉ’の化合物）である。

　本発明は、もう１つの態様において、式ＩＩで示される化合物を提供する。

　式ＩＩの化合物は、１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオールおよびその類縁体を包含する。式Ｉの化合物は、その誘導体を包含する。式ＩＩの化合物は、その構造異性体および立体異性体を包含する。さらに式ＩＩの化合物が塩および溶媒和物を形成しうる場合は、その塩および溶媒和物も式ＩＩの化合物に包含される。

　式ＩＩの化合物において、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、またはＣＯＲ^ａである。Ｒ^ａは水素またはＣ_１−３アルキルである。好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルである。さらに好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は水素である。

　式ＩＩの化合物において、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＲ^ｂＲ^ｃ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、またはハロゲンである。Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは互いに独立して水素またはＣ_１−３アルキルである。Ｃ_１−３アルキルについては上で説明したとおりである。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を包含する。好ましくは、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立してメチルまたはエチルである。さらに好ましくは、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７はメチルである。

　式ＩＩの化合物において、ｎは０、１、２または３である。好ましくは、ｎは１または２である。さらに好ましくは、ｎは１である。

　好ましい式ＩＩの化合物は、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が互いに独立してメチルまたはエチルであり、ｎが１または２である化合物である。さらに好ましい式ＩＩの化合物は、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が水素であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７がメチルであり、ｎが１である化合物、すなわち１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオールである。この化合物の好ましい立体配置は（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）である。したがって、本発明の特に好ましい式ＩＩの化合物の１つは（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオール（式ＩＩ’の化合物）である。

　式Ｉの化合物および式ＩＩの化合物は概日リズム調節活性を有する。概日リズムは、生物が本来保持している約２４時間周期のリズムである。本明細書において、概日リズムの調節は、概日リズムの周期を短くする、または長くすること、位相を前進させること、または後退させること、あるいは振幅を大きくすることを包含する。

　概日リズムの乱れは、航空機による長距離移動による時差ボケ、シフト勤務などによって生じる社会的時差ボケ、および概日リズム睡眠障害の原因となるばかりでなく、生活習慣病やがんなどにも関連していることが明らかになってきている。概日リズムが腸内細菌、免疫、認知および学習機能、肌機能やエネルギー代謝、薬剤や栄養素の吸収、代謝、排泄など、多岐にわたる生理機能に影響していることを示す研究も多く発表されてきている。これらの要因から、消費者の概日リズム改善物質への関心は非常に高く、社会的ニーズも急増している。

　式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を用いて概日リズムを調節することにより、概日リズムの乱れに起因する様々な疾病や障害を改善、治療または予防することができる。概日リズムの乱れに起因する障害としては、概日リズム睡眠障害（例えば睡眠相後退症候群、睡眠相前進症候群、非２４時間睡眠覚醒症候群、不規則型睡眠覚醒パターン、交代勤務による睡眠障害、時差症候群（いわゆる時差ボケ）など）、腸内細菌叢の乱れ、免疫機能の低下、認知および学習機能の低下、薬剤の代謝異常、ならびに生活習慣病やがんなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を用いて概日リズム睡眠障害を改善、治療または予防してもよい。概日リズムの調節のために、式Ｉの化合物を用いてもよく、式ＩＩの化合物を用いてもよく、式Ｉの化合物と式ＩＩの化合物を併用してもよく、あるいは式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を他の概日リズム調節剤あるいは睡眠改善剤と併用してもよい。

　例えば式Ｉ’の化合物は、動物において概日リズムの位相を後退させることができる（実施例の（７）（ｉｉｉ）、図１２、図１３、図１４、図１５参照）。したがって、例えば式Ｉ’の化合物を、概日リズムの位相を後退させるために用いてもよい。例えば式Ｉ’の化合物を、例えば体内時計が早まりすぎるのを抑制するために使用してもよい。体内時計が早まりすぎるのを抑制することによって、例えば極端な早寝早起きになりすぎる生活パターンを改善することができる。このような使用は、特に高齢者において有用でありうる。

　本発明においては、株式会社ジーピーシー研究所が開発した、概日リズムレポーターマウス由来の細胞（ＧＰ−Ｍ０２−Ｐ２）を用いて概日リズム調節物質をスクリーニングした。このマウスには、概日リズムを形成する時計遺伝子のひとつｂｍａｌ１遺伝子（ｂｍａｌ１）のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されている。このマウス由来の細胞にサンプルを添加して発光の変化を調べることにより、概日リズムに直接働きかける物質の取得が可能になる。本発明の式Ｉの化合物および式ＩＩの化合物の概日リズムの調節活性は、上記マウス由来の細胞を用いて確認されたので、本発明の式Ｉの化合物および式ＩＩの化合物は、概日リズムに直接働きかける物質である。これに対して、既存の機能性表示食品やサプリメント等の睡眠改善製品は、アミノ酸や神経伝達物質、アロマオイル等を含むものであり、中枢神経の鎮静作用や深部体温の変化、ストレスの緩和等が作用メカニズムと考えられている。したがって、本発明で得られた式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を睡眠改善製品に応用した場合、既存の睡眠改善製品とは異なる昼夜の生体リズムのメリハリや概日リズムの改善による自然な睡眠を誘発する新しい作用メカニズムを持つ製品が得られる。

　したがって、本発明は、もう１つの態様において、式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を含む、概日リズム調節用組成物を提供する。この態様の組成物を、概日リズムの乱れに起因する健康障害を改善、治療または予防に使用してもよい。例えば、この態様の組成物を概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防に使用してもよい。

　上記組成物は、食品組成物、医薬組成物、または化粧料組成物であってもよい。

　本発明の組成物が食品組成物である場合、その形態は特に限定されず、固形、半固形、液体等いずれの形態であってもよい。食品には飲料も含まれる。また、食品組成物はいわゆるトクホや機能性表示食品等の健康食品やサプリメントを含む。食品組成物の製造方法は当業者に公知である。健康食品やサプリメントの形態は医薬組成物の形態に準じるものであってもよく、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ドリンク、ドロップなどの形態であってもよい。健康食品やサプリメントは、医薬組成物の製造方法に準じた方法により製造されてもよい。

　本発明の組成物が医薬組成物である場合、剤形は特に限定されず、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、ドリンク、シロップ、ドロップなどの経口剤、クリーム、ジェル、軟膏、パスタなどの塗布剤のほか、注射剤、輸液剤などが例示される。医薬組成物は、適当な担体または賦形剤とともに処方される。医薬組成物の製造方法は当業者に公知である。

　本発明の組成物が化粧料組成物である場合、その形態は特に限定されず、例えばローション、クリーム、ジェル、乳液、ファンデーション、シャンプー、リンス、石けん、ボディーソープ、入浴剤などであってもよい。化粧料組成物の製造方法は当業者に公知である。

　本発明の組成物の摂取量、投与量または使用量は、概日リズム調節効果を見ながら、適宜決定、変更されうる。

　本発明の式Ｉの化合物および式ＩＩの化合物は、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこであるツチナメコ（Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ　ｅｒｅｂｉａ）の培養物から得られた。したがって、本発明は、もう１つの態様において、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を含む、概日リズム調節用組成物を提供する。Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのことしては、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ　ｅｒｅｂｉａ、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ　ａｅｇｅｒｉｔａ、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この態様の組成物は、ツチナメコ（Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ　ｅｒｅｂｉａ）の培養物を含む。より好ましくは、この態様の組成物は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されたツチナメコの培養物を含む。この態様の組成物を概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防に使用してもよい。この態様の組成物は、医薬組成物、食品組成物または化粧料組成物であってもよい。

　本発明において、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物は、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこを培地で培養して得られる培養物全体（菌糸および培地）、菌糸、培養濾液のいずれであってもよい。きのこの培養物は、ホモジナイザー等の公知の手段により菌糸を破砕して得られた抽出物であってもよい。きのこの培養物は、公知の手段・方法にて濃縮物（エキス）、乾燥品（例えば凍結乾燥品）、粉末、ペレット、顆粒などに成形されてもよい。好ましくは、きのこの培養物は培養濾液である。培養濾液は、フィルターや遠心分離機を用いてきのこの培養物から菌糸を除いたものである。溶媒抽出やクロマトグラフィーなどの公知の手段、方法を用いて培養濾液を精製してもよく、凍結乾燥などの公知の手段、方法を用いて濃縮してもよい。本発明において、好ましくは、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物は式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を含むものである。

　本発明は、さらなる態様において、式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を対象に投与することを含む、該対象における概日リズムの調節方法を提供する。上記概日リズムの調節は、概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防であってもよい。

　本発明は、さらなる態様において、対象における概日リズムの調節における使用のための式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を提供する。上記概日リズムの調節は、概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防であってもよい。

　本発明は、さらなる態様において、対象における概日リズムの調節のための組成物の製造における、式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物の使用を提供する。上記概日リズムの調節は、概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防であってもよい。

　本発明は、さらなる態様において、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を対象に投与することを含む、該対象における概日リズムの調節方法を提供する。上記概日リズムの調節は、概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防であってもよい。

　本発明は、さらなる態様において、対象における概日リズムの調節における使用のためのＣｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を提供する。上記概日リズムの調節は、概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防であってもよい。

　本発明は、さらなる態様において、対象における概日リズムの調節のための組成物の製造における、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物の使用を提供する。上記概日リズムの調節は、概日リズム睡眠障害の改善、治療または予防であってもよい。

　本発明は、さらにもう１つの態様において、Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこを培養し、培養物から式Ｉの化合物および／または式ＩＩで示される化合物を精製することを含む、式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物の製造方法を提供する。

　Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養方法は公知である。培養条件は、使用するきのこの種類、必要とされる式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物の量などを考慮して、適宜選択することができる。例えば、モルト液体培地中、２０~３０℃でツチナメコを２週間~２ヶ月培養してもよい。培養物に関しては上で説明したとおりである。式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物の製造にはツチナメコを用いることが好ましく、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されたツチナメコを用いることがさらに好ましい。上記寄託菌株を用いた場合、概日リズム調節活性を有する主な生成物として、（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオールおよび（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオールが得られる。

　培養物からの式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物の精製は、溶媒抽出、クロマトグラフィー等の公知の手段、方法を用いて行うことができる。例えば、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて培養物を抽出し、活性画分を得てもよい。クロマトグラフィー例としては、ＯＤＳカラム等を用いる逆相カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラム等を用いる順相カラムクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。精製を行うことによって、培養物から式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を単離してもよく、式Ｉの化合物および／または式ＩＩの化合物を多く含む画分を得てもよい。

　本発明は、さらにもう１つの態様において、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されたツチナメコを提供する。本菌を培養して培養物を得て、培養物から式Ｉの化合物および式ＩＩの化合物を得ることができる。

　特に断らないかぎり、本明細書で用いる用語は、生物学、生化学、化学、薬学、医学、時間栄養学等の分野において通常に理解されている意味に解される。

　以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

　（１）概日リズム調節物質のスクリーニング方法
　鳥取大学附属菌類きのこ遺伝資源研究センターが保有するきのこの菌株を液体培養し、菌体と培養濾液から抽出物を作成した。人工培養が困難な菌株については、野外で採取した子実体から抽出物を作成した。

　株式会社ジーピーシー研究所が開発した、概日リズムレポーターマウス由来の細胞（ＧＰ−Ｍ０２−Ｐ２）を実験に使用した。この細胞は、概日リズムを形成する時計遺伝子のひとつｂｍａｌ１遺伝子（ｂｍａｌ１）のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたマウスに由来する。この細胞にきのこ抽出物サンプルを添加し、発光の変化を調べることにより、概日リズムへの影響について調べた。

　（２）概日リズム調節物質のスクリーニング結果
　１７６０個のサンプルのスクリーニングを行い、２４個のサンプルが概日リズムに影響を与えることを見出した。

　（３）概日リズム調節物質の単離および同定
　食用きのこであるツチナメコ（ＴＵＦＣ　３２１５７株）を大量培養し、活性物質の単離および同定を行った。ツチナメコをモルト培地に移植し、１ヶ月間２５℃で培養した。培養液を吸引濾過により濾液と菌糸体に分離した。培養濾液を酢酸エチルで抽出したところ４５０ｍｇの抽出物が得られた。酢酸エチル抽出物に概日リズム調節活性が見られたので、これをさらにヘキサンとアセトンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー、次いで水とメタノールを用いたＯＤＳカラムクロマトグラフィーによって分画した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーではヘキサン／アセトン＝６０／４０（ｖ／ｖ）画分（収量１４５．７ｍｇ）に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーではメタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）画分（収量５７．６ｍｇ）に活性が見られた。上記各画分の概日リズム調節活性を、図１および図２に示す。ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにて得られたメタノール／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）画分中に含まれる、保持時間４．５~５．０分のフラクション（図３上パネル参照）を、８０％アセトニトリル／０．１％酢酸を用いたＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣによって精製した（ＨＰＬＣチャートを図４に示す）。保持時間７分のフラクション（Ｆｒ．１）から活性物質２．２ｍｇを得た。保持時間１０分のフラクション（Ｆｒ．２）から活性物質１６．９ｍｇを得た。Ｆｒ．２中の活性物質の概日リズム調節活性を図３下パネルに示す。

　（４）Ｆｒ．２中の活性物質の同定
　続いて、Ｆｒ．２中の活性物質をエレクトロスプレイイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）および高分解能質量分析（ＨＲ　ＥＳＩ　ＭＳ）によって分析したところ、分子量が３１８、分子式がＣ_２０Ｈ_３０Ｏ_３であることがわかった。
　ＥＳＩ−ＭＳ
　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：ｍ／ｚ　３４１［Ｍ＋Ｎａ］＋，３８２［Ｍ＋Ｎａ＋ＡＣＮ］＋
　Ｎｅｇａｔｉｖｅ：ｍ／ｚ　３１８［Ｍ＋Ｃｌ］−，３６３［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−
　ＨＲ　ＥＳＩ　ＭＳ
　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：ｍ／ｚ　３４１．２０７８　Ｃ２０Ｈ３０Ｏ３Ｎａ（Δ＝−０．８７６）
　Ｎｅｇａｔｉｖｅ：ｍ／ｚ　３５３．１８９０　Ｃ２０Ｈ３０Ｏ３Ｃｌ（Δ＝１．１８１）

　さらに、一次元および二次元ＮＭＲの解析から、この化合物は下式：

で示される構造を有する文献未記載のジテルペノイド、１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオールであることが明らかとなった。この化合物の^１Ｈ　ＮＭＲスペクトルおよび^１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルを、それぞれ図５の上パネルおよび下パネルに示す。

　（５）Ｆｒ．２中の活性物質の立体構造決定
　上と同様の方法にて、ツチナメコ（ＴＵＦＣ　３２１５７株）を培養し、培養液からＦｒ．２を得た。Ｆｒ．２中の活性物質を少量のトルエンに加熱溶解させた後、放冷して室温とし、さらに４℃に冷却して、単結晶を得た。単結晶をＸ線結晶構造解析に供したところ、２分子の化合物は、結晶中で分子間水素結合により中空構造を持つドーナツ状の１２量体を形成しており、その内部にトルエン分子が包接されていることがわかった。さらに、２θ_ｍａｘ＝１５２．３３４°でデータ処理・構造解析を行ったところ、非対称単位中に１２分子の化合物と、７分子のトルエンが存在していることがわかった。得られた１２分子の構造はすべて予想構造と一致し、同一の立体配置（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）を持っていた。これらの結果から、Ｆｒ．２中の活性物質を、（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−７−メチレン−１ａ，２，４ａ，５，６，７，７ａ，７ｂ−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロプロパ［ｅ］アズレン−５，６−ジオールと同定した。本化合物の立体構造を含めた構造式を以下に示す。

　（６）Ｆｒ．１中の活性物質の同定
　上と同様の方法にて、ツチナメコ（ＴＵＦＣ　３２１５７株）を培養し、培養液からＦｒ．１を得た。Ｆｒ．１中の活性物質の概日リズム調節活性を調べたところ、位相後退作用が認められた（図６）。Ｆｒ．１を５０％アセトニトリル／０．１％酢酸を用いたＯＤＳカラムに供したところ、ＨＰＬＣチャート上に５つのピークが認められた（図７左上パネル）。保持時間約１１分のフラクション（Ｆｒ．１−２）を分取した。Ｆｒ．１−２中に含まれる活性物質の概日リズム調節活性を図７右上パネルに示す。Ｆｒ．１−２を、７０％メタノール／水を用いたＯＤＳカラムに供したところ、ＨＰＬＣチャート上に６つのピークが認められた（図７左下パネル）。保持時間約２０分のフラクション（Ｆｒ．１−２−６）を分取した。Ｆｒ．１−２−６中に含まれる活性物質の概日リズム調節活性を図７右下パネルに示す。Ｆｒ．１−２−６中に含まれる活性物質は、振幅増大作用および位相後退作用を有していることがわかった。Ｆｒ．１−２−６中に含まれる活性物質について構造解析を行った。

　Ｆｒ．２中の活性物質とＦｒ．１−２−６中の活性物質の^１Ｈ　ＮＭＲおよび^１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルを比較し（図８）、^１Ｈ　^１Ｈ　ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ等を考慮して、Ｆｒ．１−２−６中の活性物質の構造と立体配置を決定した。この化合物は下式：

で示される構造を有する文献未記載のジテルペノイド、１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオールであることが明らかとなった。この化合物は（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）の立体配置を持っていた。これらの結果から、Ｆｒ．１−２−６の活性物質を、（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）−１−（１−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）−１，４−ジメチル−１，１ａ，２，４ａ，５，６，７ａ，７ｂ−オクタヒドロスピロ［シクロプロパ［ｅ］アズレン−７，２’オキシラン］−５，６−ジオールと同定した。本化合物の立体構造を含めた構造式を以下に示す。

　（７）Ｆｒ．２中の活性物質（式Ｉ’）の概日リズム調節活性
　以下の（ｉ）、（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）の実験において、株式会社ジーピーシー研究所が開発した、概日リズムレポーターマウス由来の細胞（ＧＰ−Ｍ０２−Ｐ２）を使用した。以下に基本的な実験手順を示す。
　１日目：細胞（ＧＰ−Ｍ０２−Ｐ２）を測定用ディッシュに播種した。
　２日目：細胞播種から２４時間後にデキサメタゾンにより同調処理を２時間実施した。２時間後、基質含有培地に置換してリズム測定を開始した。
　３~７日目：５日間の発光測定により細胞のリズムデータを取得した。

　（ｉ）概日リズム調節活性の濃度依存性
　２日目に、Ｆｒ．２中の活性物質を添加した培地を用いてリズム測定を開始した。培地中のＦｒ．２中の活性物質の濃度は３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌであった。結果を図９に示す。Ｆｒ．２中の活性物質は、濃度依存的に振幅を変化させることが確認された。

　（ｉｉ）細胞への添加タイミングによる作用の違い
　事前に実験を行って、２日目から測定し続けた概日リズムの最初のピーク到達時間を予測した（３日目の午前中に最初のピークを迎えることがわかった）。
　（ｉｉ−１）ピーク前添加
　３日目のピーク到達予測時間の２時間前に測定中の細胞の培地中にＦｒ．２中の活性物質を添加し、測定を再開した。結果を図１０に示す。この実験では、Ｆｒ．２中の活性物質は位相後退作用を示した。
　（ｉｉ−２）ピーク後添加
　３日目のピーク到達予測時間の４時間後に測定中の細胞の培地中にＦｒ．２中の活性物質を添加し、測定を再開した。結果を図１１に示す。この実験では、Ｆｒ．２中の活性物質は振幅増大、および位相前進作用を示した。
　これらの実験から、Ｆｒ．２中の活性物質は、添加のタイミングによって位相を前進させたり、後退させたり、あるいは位相に変化を生じさせなかったりすることがわかった。

　（ｉｉｉ）マウス概日リズムに対する影響
　概日リズムを形成する時計遺伝子のひとつｂｍａｌ１遺伝子（ｂｍａｌ１）のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されているマウス（Ｂｍａｌ１レポーターマウス）（株式会社ジーピーシー研究所）を用いて実験を行った。明期から暗期に変わる１時間前（ＺＴ１１）または明期から暗期に変わって１時間後（ＺＴ１３）に、Ｆｒ．２中の活性物質（５ｍｇ／ｋｇ）をＢｍａｌ１レポーターマウスに投与した。３日間にわたって各タイミングにおいてＦｒ．２中の活性物質を投与した。いずれの実験系においてもＺＴ１５（明期から暗期に変わって３時間後）から２４時間、４時間おきにマウスの発光値を測定した。発光基質（Ｄ−ルシフェリン）をマウス皮下に投与し、投与１０分後に発光値を測定した。コントロール系では溶媒（ＤＭＳＯ）のみを投与した。
　ＺＴ１１におけるＦｒ．２中の活性物質の投与の結果を図１２および図１３に示す。ＺＴ１３におけるＦｒ．２中の活性物質の投与の結果を図１４および図１５に示す。いずれの実験系においても、位相の後退が確認された。
　以上より、Ｆｒ．２中の活性物質は動物において概日リズムを変化させることがわかった。

　（８）Ｆｒ．１−２−６中の活性物質（式ＩＩ’）の概日リズム調節活性
　上記（７）（ｉ）と同様の試験を行った。結果を図１６に示す。Ｆｒ．１−２−６中の活性物質が振幅増大、および位相後退作用を示すことがわかった。

　本発明は、食品、医薬品および化粧品の分野、ならびに時間栄養学の研究等の分野において非常に有用である。

　本願明細書に記載されたツチナメコ（鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源センターＴＵＦＣ　３２１５７株）は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８　１２２号室にある独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センターに寄託され、２０２１年３月３１日付けで受領番号ＮＩＴＥ　ＡＰ−０３４５３を付与された。本菌は、２０２１年４月２６日付けで受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ−０３４５３を付与された（受託日：２０２１年３月３１日）（国内寄託）。次いで、本菌は、２０２２年３月１５日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３を付与された（受託日：２０２１年３月３１日）（国際寄託）。

Claims

　式Ｉ：

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、またはＣＯＲ^ａであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＲ^ｂＲ^ｃ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、またはハロゲンであり、ＡはＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｒ^ａは水素またはＣ_１−３アルキルであり、Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは互いに独立して水素またはＣ_１−３アルキルである］で示される化合物。
　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が互いに独立してメチルまたはエチルであり、ＡがＣＨ_２である、請求項１記載の化合物。
　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が水素であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７がメチルであり、ＡがＣＨ_２である、請求項２記載の化合物。
　立体配置（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）を有する請求項１~３のいずれか１項記載の化合物。
　式Ｉ’：

で示される請求項４記載の化合物。
　式ＩＩ：

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、またはＣＯＲ^ａであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は互いに独立して水素、Ｃ_１−３アルキル、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＲ^ｂＲ^ｃ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、またはハロゲンであり、Ｒ^ａは水素またはＣ_１−３アルキルであり、Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは互いに独立して水素またはＣ_１−３アルキルであり、ｎは０−３の整数である］で示される化合物。
　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が互いに独立して水素、メチル、エチルまたはアセチルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が互いに独立してメチルまたはエチルであり、ｎが１または２である、請求項６記載の化合物。
　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が水素であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７がメチルであり、ｎが１である、請求項７記載の化合物。
　立体配置（１Ｒ，１ａＳ，４ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｓ，７ａＲ，７ｂＳ）を有する請求項６~８のいずれか１項記載の化合物。
　式ＩＩ’：

で示される請求項９記載の化合物。
　請求項１~１０のいずれか１項記載の化合物を含む、概日リズム調節用の組成物。
　請求項５記載の化合物および／または請求項１０記載の化合物を含む、請求項１１記載の組成物。
　Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこの培養物を含む、概日リズム調節用の組成物。
　Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、請求項１３記載の組成物。
　ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、請求項１４記載の組成物。
　食品組成物、医薬組成物または化粧料組成物である、請求項１１~１５のいずれか１項記載の組成物。
　概日リズムの乱れに起因する健康障害を改善、治療または予防するための、請求項１１~１６のいずれか１項記載の組成物。
　健康障害が概日リズム睡眠障害である、請求項１７記載の組成物。
　Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこを培養し、培養物から請求項１~１０のいずれか１項記載の化合物を精製することを含む、請求項１~１０のいずれか１項記載の化合物の製造方法。
　Ｃｙｃｌｏｃｙｂｅ属のきのこがツチナメコである、請求項１９記載の方法。
　ツチナメコが受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているものである、請求項２０記載の方法。
　化合物が、請求項５記載の化合物および／または請求項１０記載の化合物である、請求項１９~２１のいずれか１項記載の方法。
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ−０３４５３として独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託されているツチナメコ。