CN116444540A - 咔唑生物碱化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了咔唑生物碱化合物及其制备方法与应用，所述咔唑生物碱类化合物是从链霉菌Streptomyces sp.HS‑NF‑1322中得到的；本发明提供的咔唑生物碱类化合物能够抑制HT22细胞和PC12细胞经erastin诱导的铁死亡，并降低活性氧水平，可用于制备神经保护类药物；
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及三个新颖的咔唑生物碱化合物及其提取方法，以及在制备抑制神经细胞铁死亡药物中的应用。
背景技术
神经系统疾病是指神经系统的任何功能障碍，包括阿尔茨海默氏症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏症(HD)、抑郁症、脑卒中、失语症、癫痫等。随着人口的老龄化趋势及人口快速增长，神经系统疾病引起的死亡和伤残临床病例也在急剧增加。尽管现代医学如今已取得了长足进步，但针对神经系统疾病的治疗发展仍然缓慢。
神经保护剂指的是一类能治疗和改善神经系统疾病的药物，能减少病理状况下的神经应激反应，降低炎症损伤，促进神经细胞再生和修复。根据作用机制，可对目前所有的神经保护剂进行分类，主要包括：谷氨酸阻断剂，自由基清除剂，兴奋性氨基酸调节剂，钙离子拮抗剂，免疫抑制剂等。然而，这些神经保护剂实际治疗效果并不理想，由于高选择性的血脑屏障(BBB)会阻止治疗药物进入大脑，且神经过程的复杂性及其功能衰退的不可逆性限制了潜在治疗药物作用活性靶点，这些药物都未能有效干预疾病的进展。因此，针对现行药物的缺陷，亟需开发一种新型作用机制的神经保护剂。
铁死亡(ferroptosis)是近些年发现的一种新颖的铁依赖性细胞程序性死亡形式，已被证实与脑卒中、阿尔茨海默氏症、创伤性脑损伤等多种神经疾病的发生发展密切相关。有研究表明，通过抑制神经细胞铁死亡能够有效降低神经损伤，是神经保护剂的潜力靶点，然而，针对该靶点的药物发掘正处于起步阶段，结构多样性的铁死亡抑制剂仍具有重要的价值。因此发掘具有铁死亡抑制作用的先导化合物具有重要的现实意义。
发明内容
本发明目的是提供链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1322中三个新颖咔唑生物碱化合物及其微生物发酵制备方法，所述的咔唑生物碱化合物通过抑制神经细胞铁死亡而产生神经保护作用，可用于制备神经保护剂。
本发明的技术方案如下：
三种咔唑生物碱化合物，antiostatin A7(1)、morindolestatin B(2)和morindolestatin C(3)，结构式如下所示：
本发明还提供了三种咔唑生物碱化合物的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)采用YMS培养基、发酵培养基依次对链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1322菌株进行培养，获得种子液；
其中，链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1322菌株是2017年6月从浙江天目山的土壤样品中分离得到的，根据100％16S rRNA基因测序(GenBank,accession No.MK027058)，表明其为链霉菌菌株，该样本已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCCNo.15461；
具体菌株培养的操作方法如下：将链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1322菌株在25mL YMS培养基中培养7天，摇床设定为速度250rpm，温度28℃，得到种子培养物；而后将20mL种子培养物接种于含有250mL发酵培养基的1000mL锥形烧瓶中，置于温度为28℃，转速为250rpm的摇床培养2天，得到种子液；
YMS培养基组成：麦芽提取物(10g/L)、酵母提取物(2g/L)、KNO3(1g/L)、琼脂(20g/L)；
发酵培养基组成：葡萄糖(4g/L)、麦芽提取物(10g/L)、酵母提取物(4g/L)、CaCO3(2g/L)；
(2)利用发酵罐对步骤(1)所得种子液进行放大发酵，期间基于强化前体供应，添加链霉菌合成咔唑生物碱所需的聚酮合酶(PKS)底物，发酵液离心去除菌丝体，备用；
具体放大发酵的操作方法如下：将种子液转移至50L发酵罐中，培养基28L，在此基础上，基于强化前体供应，添加链霉菌(合成咔唑生物碱所需的PKS底物进行生产发酵)以及L-色氨酸(2g/L)、丙酮酸钠(1g/L)，保持发酵环境温度为28℃，搅拌桨转速100rpm，发酵6天，随后将所得发酵液以4000rpm转速离心6分钟，除去菌丝体，备用；
培养基组成为：葡萄糖(10g/L)、可溶性淀粉(40g/L)、酵母提取物(4g/L)、麦芽提取物(4g/L)、CaCO3(2g/L)、MgSO4·7H2O(1g/L)、NaCl(1g/L)、KH2PO4(2g/L)；
(3)取步骤(2)除去菌丝体的发酵液，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后得到粗提取物；
优选乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1～1:2，特别优选1:1.2；
(4)将步骤(3)所得粗提取物进行100-200目硅胶柱层析，以体积比分别为10:1、9:1、8:2、7:3的氯仿与甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，利用氯仿：甲醇＝15:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同分流，得到5个组分，依次标记为组分A-组分E；
具体的，硅胶柱选用10cm，层析柱高度H：20cm，对应的柱体积约为1.5L；
粗提物质量与硅胶质量比为1:10～1:20，优选1:15；
(5)取步骤(4)中的组分B减压浓缩，使用葡聚糖凝胶柱层析，以体积比10:1的氯仿和甲醇的混合溶液进行洗脱，以氯仿：甲醇＝8:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同Rf值为0.3的流份并减压浓缩，之后通过半制备型高效液相色谱，以体积分数为98％的甲醇水溶液进行洗脱，分离得到化合物2(tR＝21.6min)和化合物3(tR＝22.5min)；
其中，葡聚糖凝胶柱的填料为Sephadex LH-20，4cm，层析柱高度H：80cm；
半制备型高效液相色谱柱选用Zorbax SB-C18，9.4mm，L：250mm，粒径：5μm；洗脱剂流速：1.5mL/min；
(6)取步骤(4)中的组分C减压浓缩，用200-300目硅胶柱层析分离，经体积比9:1、4:1、2:1、1:1正己烷与丙酮的混合溶液梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，以氯仿：甲醇＝6:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同Rf值为0.3的流份并减压浓缩，之后通过半制备型高效液相色谱，以体积分数为40％的乙腈水溶液进行洗脱，分离得到化合物1(tR＝26.3min)；
其中，硅胶柱选用3cm，层析柱高度H：50cm，对应的柱体积约为1000mL；
半制备型高效液相色谱柱选用Zorbax SB-C18，9.4mm，L：250mm，粒径：5μm；洗脱剂流速：1.5mL/min。
本发明所述的三种咔唑生物碱化合物可用于制备抑制铁死亡活性药物。
本发明所述的三种咔唑生物碱化合物的抑制铁死亡活性使用了半数有效浓度(EC50)、细胞保护作用和逆转活性氧水平三种评价方法。
优选的，所述抑制铁死亡活性药物为：能够抑制erastin诱导的HT22细胞及PC12细胞的细胞损伤和活性氧水平的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
当给予不同剂量的化合物1-3时，能有效逆转erastin对HT22细胞和PC12细胞损伤；浓度为10μM的化合物1和2能显著降低细胞内ROS水平，其抑制活性与阳性药DFO相当。上述三种新型咔唑生物碱能明显逆转erastin诱导的铁死亡，并能有效减少细胞内ROS的生成，有作为新型神经保护剂的良好应用前景。
附图说明
图1化合物1-3在HT22和PC12细胞中的抑制铁死亡活性。
图2化合物1和2在HT22和PC12细胞中的抑制活性氧能力。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：菌株发酵及化合物1-3的分离提取
(1)将Streptomyces sp.HS-NF-1322菌株在含有麦芽提取物(10g/L)、酵母提取物(2g/L)、KNO3(1g/L)和琼脂(20g/L)的25mL YMS培养基中培养7天，摇床设置为速度250rpm，温度28℃。而后将20mL种子培养物接种于含有250mL发酵培养基(4g/L葡萄糖、10g/L麦芽提取物、4g/L酵母提取物、2g/L CaCO3)的1000mL锥形烧瓶中，置于温度为28℃，转速为250rpm的摇床培养2天，得到种子液；链霉菌菌株HS-NF-1322是2017年6月从浙江天目山的土壤样品中分离得到的，根据100％16S rRNA基因测序结果(GenBank,accession No.MK027058)，表明其为链霉菌菌株，该样本已保存于中国总微生物培养中心(编号为CGMCC No.15461)。
(2)将步骤(1)得到的种子液转移至50L发酵罐中，其主要配方为10g/L葡萄糖、40g/L可溶性淀粉、4g/L酵母提取物、4g/L麦芽提取物、2g/L CaCO3、1g/L MgSO4·7H2O、1g/LNaCl、2g/L KH2PO4，此基础上，基于强化前体供应，额外添加链霉菌合成antiostatin及morindolestatin所需的PKS底物(2g/L L-色氨酸、1g/L丙酮酸钠)进行生产发酵，保持发酵环境温度为28℃，搅拌桨转速100rpm，发酵6天。随后，将所得的发酵液以4000rpm转速离心6分钟，除去菌丝体；
(3)取步骤(2)获得的发酵液，于室温下用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的用量以发酵液的体积比为1:1.2，减压浓缩后获得粗提取物(55.6g)；
(4)将步骤(3)中所得的粗提取物进一步分离，经100–200目的硅胶柱层析，粗提取物质量与硅胶质量比为1:15，以体积比分别为10:1、9:1、8:2、7:3的氯仿与甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，每个柱体积约为1.5L。以氯仿/甲醇15:1(体积比)展开剂对其进行薄层层析(TLC)检测，在254nm的紫外灯下检测斑点，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显色，根据显色情况合并分流并且减压浓缩，分得5个组分Fr.A–Fr.E；
(5)取步骤(4)中的Fr.B组分(590.1mg)，使用葡聚糖凝胶柱层析，凝胶柱填料Sephadex LH-20，以体积比10:1的氯仿和甲醇的混合溶液为洗脱液进行洗脱，经氯仿/甲醇8:1(体积比)展开剂对其进行薄层层析(TLC)检测，在254nm的紫外灯下检测斑点，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显色，根据显色情况合并Rf值为0.3的流份并且减压浓缩，进一步通过半制备型高效液相色谱，色谱柱选用Zorbax SB-C18，以流动相为98％的甲醇水溶液进行洗脱，分别收集tR＝21.6min和tR＝22.5min的峰，浓缩得到化合物2(13.8mg)和3(25.3mg)；
(6)取步骤(4)中的Fr.C组分(82.2mg)，用200–300目的硅胶柱层析进一步分离，经9:1、4:1、2:1、1:1正己烷与丙酮的混合溶液梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，以氯仿/甲醇6:1(体积比)展开剂对其进行薄层层析(TLC)检测，在254nm的紫外灯下检测斑点，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显色，根据显色情况合并相同Rf值为0.3的流份并且减压浓缩。随后，通过半制备型高效液相色谱，色谱柱选用Zorbax SB-C18，以体积分数为40％的乙腈水溶液进行洗脱，收集tR＝26.3min部分的洗脱液，得到化合物1(6.4mg)。
实施例2：化合物1-3的结构鉴定
化合物1的理化数据如下：淡黄色粉末；HR-ESI-MS m/z:[M-H]-367.2028，计算值C22H27N2O3 -367.2027，确定其分子式为C22H28N2O3；旋光IR vmax3393,3368,3335,2925,2855,1665,1618,1585,1511,1483,1458,1421,1371,1284,1147cm-1；UV(EtOH)λmax(logε):221(4.41),239(4.33),302(4.11)nm。氢谱及碳谱见表1。
化合物2的理化数据如下：红棕色粉末；HR-ESI-MS m/z:[M+H]+492.2648，计算值C32H34N3O2 +492.2646，确定其分子式为C32H33N3O2；旋光IR vmax 3392,2918,2849,1674,1547,1456,1339,1301,1251,1224,1144,1107,738cm-1。UV(EtOH)λmax(logε):219(4.64),236(4.49),255(4.28),306(3.80),407(3.85)nm。氢谱及碳谱见表1。
化合物3：红棕色粉末；HRESI-MS m/z:[M+H]+506.2806，计算值C33H36N3O2 +506.2803，确定其分子式为C33H35N3O2；旋光IR vmax 3392,2918,2849,1674,1547,1457,1339,1301,1251,1224,1144,1107,738cm-1；UV(EtOH)λmax(logε):219(4.61),238(4.46),255(4.28),306(3.69),407(3.85)nm；。氢谱及碳谱见表1。
表1化合物1-3的核磁数据
1H-NMR:400MHz；13C-NMR:100MHz；溶剂a:CD3OD；溶剂b:DMSO-d6
实施例3：化合物抑制神经细胞铁死亡的保护作用
分别在HT22和PC12两种细胞株中，利用erastin造神经细胞铁死亡模型，在此基础上，加入实施例1中制备的化合物1-3使每个化合物形成浓度梯度(终浓度0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)，评价其对神经细胞铁死亡的抑制作用。优选活性较强的化合物并评价其在10μM浓度时，对模型细胞内活性氧水平提高是否具有抑制作用。
实验方法：
1.细胞培养：
HT22和PC12细胞培养于含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素)的达尔伯克(氏)必须培养基(DMEM)，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养，待细胞长至对数生长期时，进行相关实验。
2.细胞活力检测：
取对数生长期HT22和PC12细胞接种于96孔板，细胞密度约为7×103/孔，空白组加入erastin(终浓度5μM)，实验组除相同浓度erastin外额外加入阳性药(终浓度10μM)和待测样品(终浓度0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)，倒置显微镜下观察细胞状态，每组大于3个复孔。培养24h后弃去培养液，将CCK-8(Cell Counting Kit-8)与DMEM完全培养液按1:10的比例稀释后，每孔加入100μL稀释液，避光在培养箱中继续孵育2h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)，分别计算各组的相对存活率。计算公式：细胞相对存活率％＝(A实验组-A背景组)/(A对照组-A背景组)×100％
3.ROS测定：
利用DCFH-DA探针检测细胞ROS量，按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10μM。培养箱内培养神经细胞12h后，去除细胞培养液，替换培养基为稀释后的DCFH-DA，放置30分钟后，PBS洗去培养基，在流式细胞仪中检测。
4.实验结果：
结果显示，以HT22细胞及PC12细胞建立erastin诱导的体外铁死亡模型，其中造模组与对照组之间具有显著性差异(P<0.001)，说明在此实验中铁死亡诱导剂erastin造模是有效的。而加药组(化合物1-3)细胞的相对存活率高于erastin造模组，证实三个化合物能抑制erastin诱导的HT22细胞及PC12细胞发生铁死亡。在HT22细胞的铁死亡模型中，化合物1发挥着有效的细胞保护作用，能够显著(P<0.001)抑制erastin诱导的神经细胞铁死亡，且存在浓度依赖性，当浓度为10μM时其相对存活率高达85.1％；化合物2和化合物3的抑制铁死亡活性相当，在0.01μM浓度下皆具有统计学意义(P<0.01)。此外，化合物在PC12细胞株建立的模型中有更为显著的保护作用(P<0.001,P<0.01)，当化合物1作用浓度为10μM时能完全逆转erastin诱导的铁死亡，相对存活率明显上升，效果优于阳性对照药DFO。具体实验结果见图1。
通过对上述抑制铁死亡数据进行进一步研究，计算化合物对不同细胞铁死亡的EC50值，结果显示，化合物1-3在PC12模型中的EC50值分别为0.06μM、0.89μM、1.42μM，表明化合物在该模型中无明显细胞毒性。
选择对数生长的HT22和PC12细胞，接种于12孔板，细胞密度约为1×104/孔，24小时后按以上相同方法分组处理细胞(化合物1和2浓度为10μM)，在培养箱中孵育24h。用PBS对每个孔洗涤两遍，并加入终浓度为10μM的DCFH-DA探针，继续在培养箱内避光孵育20min，用PBS洗涤两遍后置于荧光显微镜下采集图像拍照。通过ImageJ计算绿色荧光强度，比较不同组的荧光强度，实验结果见图2。
实验结果显示，在此评估方法中，经erastin处理的HT22和PC12细胞中的ROS水平显著增加(121.0％；114.0％)，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。其中，化合物1和2处理后的HT22细胞内ROS水平显著降低(P<0.001)，相对DCF荧光强度分别为50.2％和58.6％，比阳性对照药DFO(68.2％)相比更有降低HT22细胞内活性氧表达的优势。而PC12细胞的活性氧实验则表明，与erastin造模组相比化合物1和2具有降低活性氧表达的作用(91.1％；104.8％)，与阳性对照药DFO(97.6％)的抑制活性相当。
本发明采用小鼠海马神经元细胞系HT22及大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12作为活性筛选细胞株。以CCK-8法分别测定化合物1-3与erastin联合用药、erastin单独给药、以及阳性对照DFO与erastin联用时，两种细胞的OD值，分别计算其相对存活率，探究这三个化合物对erastin诱导的铁死亡的逆转作用。进一步进行的活性氧实验表明，给药浓度为10μM的化合物1-2均能有效减少erastin诱导的ROS，具有良好的显著性。
上述研究结果表明，化合物1-3可逆转erastin介导的细胞损伤及ROS激增，具有潜在的神经保护作用。
Claims (10)
1.三种咔唑生物碱化合物，结构式如下所示：
2.如权利要求1所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)采用YMS培养基、发酵培养基依次对链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1322菌株进行培养，获得种子液；
(2)利用发酵罐对步骤(1)所得种子液进行放大发酵，期间基于强化前体供应，添加链霉菌合成咔唑生物碱所需的聚酮合酶底物，发酵液离心去除菌丝体，备用；
(3)取步骤(2)除去菌丝体的发酵液，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后得到粗提取物；
(4)将步骤(3)所得粗提取物进行100-200目硅胶柱层析，以体积比分别为10:1、9:1、8:2、7:3的氯仿与甲醇混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，利用氯仿：甲醇＝15:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同分流，得到5个组分，依次标记为组分A-组分E；
(5)取步骤(4)中的组分B减压浓缩，使用葡聚糖凝胶柱层析，以体积比10:1的氯仿和甲醇的混合溶液进行洗脱，以氯仿：甲醇＝8:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同Rf值为0.3的流份并减压浓缩，之后通过半制备型高效液相色谱，以体积分数为98％的甲醇水溶液进行洗脱，分离得到化合物2(tR＝21.6min)和化合物3(tR＝22.5min)；
(6)取步骤(4)中的组分C减压浓缩，用200-300目硅胶柱层析分离，经体积比9:1、4:1、2:1、1:1正己烷与丙酮的混合溶液梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积，以氯仿：甲醇＝6:1(体积比)为展开条件，经薄层层析检测后合并相同Rf值为0.3的流份并减压浓缩，之后通过半制备型高效液相色谱，以体积分数为40％的乙腈水溶液进行洗脱，分离得到化合物1(tR＝26.3min)。
3.如权利要求2所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，菌株培养的操作方法如下：将链霉菌Streptomyces sp.HS-NF-1322菌株在25mL YMS培养基中培养7天，摇床设定为速度250rpm，温度28℃，得到种子培养物；而后将20mL种子培养物接种于含有250mL发酵培养基的1000mL锥形烧瓶中，置于温度为28℃，转速为250rpm的摇床培养2天，得到种子液；
YMS培养基组成：麦芽提取物(10g/L)、酵母提取物(2g/L)、KNO3(1g/L)、琼脂(20g/L)；
发酵培养基组成：葡萄糖(4g/L)、麦芽提取物(10g/L)、酵母提取物(4g/L)、CaCO3(2g/L)。
4.如权利要求2所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，放大发酵的操作方法如下：将种子液转移至50L发酵罐中，培养基28L，在此基础上，基于强化前体供应，添加链霉菌以及L-色氨酸、丙酮酸钠，保持发酵环境温度为28℃，搅拌桨转速100rpm，发酵6天，随后将所得发酵液以4000rpm转速离心6分钟，除去菌丝体，备用；
培养基组成为：葡萄糖(10g/L)、可溶性淀粉(40g/L)、酵母提取物(4g/L)、麦芽提取物(4g/L)、CaCO3(2g/L)、MgSO4·7H2O(1g/L)、NaCl(1g/L)、KH2PO4(2g/L)。
5.如权利要求2所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，硅胶柱选用10cm，层析柱高度H：20cm，对应的柱体积为1.5L。
6.如权利要求2所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，葡聚糖凝胶柱的填料为Sephadex LH-20，4cm，层析柱高度H：80cm。
7.如权利要求2所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，硅胶柱选用3cm，层析柱高度H：50cm，对应的柱体积为1000mL。
8.如权利要求2所述的三种咔唑生物碱化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)或步骤(6)中，半制备型高效液相色谱柱选用Zorbax SB-C18，9.4mm，L：250mm，粒径：5μm；洗脱剂流速：1.5mL/min。
9.如权利要求1所述的三种咔唑生物碱化合物在制备抑制铁死亡活性药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑制铁死亡活性药物为：能够抑制erastin诱导的HT22细胞及PC12细胞的细胞损伤和活性氧水平的药物。
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