CN101074234B - 一种抗肿瘤抗生素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种新的抗肿瘤抗生素，其特点是通过发酵培养保藏登记号为CGMCC No.1935的一株拟诺卡氏菌株(Nocardiopsis sp.)YIM 80133，再从其发酵液中分离、纯化提取物，得到分子式为C21H20O10，分子量为432.38的一种新的吡喃萘醌类抗肿瘤抗生素，经实验证明，本发明的抗肿瘤抗生素对人早幼粒白血病肿瘤细胞有较强的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的抗肿瘤抗生素及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和生活质量的世界性疾病，为仅次于心血管疾病的第二大死因。多年来已从微生物代谢产物中发现了为数众多的抗肿瘤活性物质，大量来源于微生物的抗癌剂在制药工业日益起着重要作用。放线菌是一类数量大、种类多、具有重要实用价值和开发潜力的微生物资源，是各种生理活性物质的重要产生菌。由放线菌产生的抗肿瘤抗生素，如阿霉素、丝裂霉素、博莱霉素、更生霉素等是目前肿瘤治疗中常用的药物，在肿瘤化学治疗中占有重要地位。
我国抗生素的研究主要以跟踪和仿制为主，自行开发、创制的能力和水平很低，具有自主知识产权的新化合物的报道很少。因此，具有自主知识产权的新化合物的研究，不仅直接为人类疾病的治疗提供新品种，而且为新药的研发提供活性先导化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种不同于已知吡喃萘醌类抗生素结构的新抗肿瘤抗生素，它对肿瘤细胞，特别是对人早幼粒白血病细胞有较强的抑制作用。
本发明的另一个目的是提供一种抗肿瘤抗生素的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种抗肿瘤抗生素，本抗生素的产生菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2007年1月29日；保藏登记入册编号为CGMCC No.1935；通过培养一株拟诺卡氏菌株(Nocardiopsis sp.)YIM 80133，再从其发酵液中分离纯化提取物，得到本抗肿瘤抗生素；本抗肿瘤抗生素是分子式为C21H20O10，分子量为432.38的化合物，该化合物具有如下结构：
本发明的抗肿瘤抗生素的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏2.0～6.0g；葡萄糖2.0～6.0g；麦芽膏3.0～7.0g；复合维生素0.5～2.0ml；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将菌株YIM 80133加到灭菌后的培养基中，28℃下于转速为190～250转/分钟的摇床上摇瓶发酵2天；
(2)菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取大豆粉10.0～30.0g；甘露醇10.0～30.0g；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133种子液加到灭菌后的培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10％，28℃下于转速为190～250转/分钟的摇床上摇瓶发酵5～7天；
(3)发酵液处理：①发酵液经2500～3500转/分钟离心，离心时间为15～25分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取4～6次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油状物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脱，收集三氯甲烷∶甲醇为50∶1的活性组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；④将粗品一种抗肿瘤抗生素进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集活性组分，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；⑤将较纯品一种抗肿瘤抗生素经过制备高效液相纯化，收集活性峰段，回收溶剂，冷冻干燥，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。
在种子培养基的制备中最好是酵母膏为4.0g；葡萄糖为4.0g；麦芽膏为5.0g；复合维生素为1.0ml。
在发酵培养基的制备中最好是大豆粉为20.0g；甘露醇为20.0g。
摇瓶发酵时摇床转数为220转/分钟为宜，发酵时间以6天为宜。
发酵液分离时，离心机转速以3000转/分钟为宜，所述的离心时间为20分钟为宜，所述的乙酸乙醋的萃取次数以5次为宜。
一种抗肿瘤抗生素纯品经分析型HPLC检测，色谱柱(250×4.6mm，5μm，Alltech，C18)；甲醇∶水7∶3等度洗脱，检测波长254nm，流速1.0ml/min，证实一种抗肿瘤抗生素纯品纯度高于98％。
本发明抗肿瘤抗生素经常规MTT法实验证明，它对人肿瘤细胞株有抑制作用，其抗肿瘤活性如表(1)所示。
表(1)本发明抗肿瘤抗生素的体外抗肿瘤活性
附图说明
图1为本发明抗生素的化学结构式；
图2为本发明抗生素的紫外吸收光谱；
图3为本发明抗生素的红外吸收光谱；
图4为本发明抗生素的氢谱(DMSO)；
图5为本发明抗生素的碳谱(13C-NMR、DEPT)；
图6为本发明抗生素的HSQC(异核多量子相关)；
图7为本发明抗生素的HMBC(异核多键相关)；
图8为本发明抗生素的H-H COSY谱；
图9为本发明抗生素的NOESY谱；
图10为本发明抗生素的质谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
化合物(I)的制备
(1)菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏4.0g；葡萄糖4.0g；麦芽膏5.0g；复合维生素1.0ml；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将菌株YIM 80133加到灭菌后的培养基中，28℃下于转速为220转/分钟的摇床上摇瓶发酵2天。
(2)菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取大豆粉20.0g；甘露醇20.0g；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133种子液加到灭菌后的培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10％，28℃下于转速为220转/分钟的摇床上摇瓶发酵6天。
(3)发酵液处理：①发酵液经3000转/分钟离心，离心时间为20分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取5次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油状物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脱，收集三氯甲烷∶甲醇为50∶1的活性组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；④将粗品一种抗肿瘤抗生素进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集活性组分，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；⑤将较纯品一种抗肿瘤抗生素经过制备高效液相纯化，收集活性峰段，回收溶剂，冷冻干燥，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。
如上所得的本发明化合物，具有下述理化性质：
1.性状：橙黄色结晶。
2.熔点：170±1℃。
3.分子量：分子量为432.38。
4.分子式：分子式为C21H20O10。
5.元素分析：C 58.32％、H4.66％、O 37.02％。
6.紫外吸收光谱：UVλmax：256.3(甲醇溶剂)证明分子结构中含有苯环。
7.红外吸收光谱中的特征官能团：(KBr)IR(3129，1786，1730，1653cm-1波数)证明分子结构中有酚羟基，羧羰基，醌羰基。
8.综合1H谱、13C谱、HSQC(异核多量子相关)、HMBC(异核多键相关)、NOESY谱、H-H COSY谱、质谱(ESI-MS)[M+Na]+＝455，[M-H]-＝431分析数据，确定了本发明抗肿瘤抗生素的分子量为432.38，分子式为C21H20O10，其结构如附图1所示。
实施例2
实施例1中制备的化合物(I)对肿瘤细胞的抑制活性测定采用常规MTT法。
实验证明，化合物(I)对人肿瘤细胞株有抑制作用。
对人早幼粒白血病细胞株HL-60的IC50(ug/ml)为0.23。
对人肺腺癌细胞株AGZY的IC50(ug/ml)为19.58。
以上肿瘤细胞株均由昆明医学院保存。
实施例3
化合物(I)的制备
(1)菌种液体种子培养：
①液体种子培养基的制备：取酵母膏2.0g；葡萄糖2.0g；麦芽膏3.0g；复合维生素0.5ml；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将菌株YIM 80133加到灭菌后的培养基中，28℃下于转速为190转/分钟的摇床上摇瓶发酵2天。
(2)菌种发酵培养：
①发酵培养基的制备：取大豆粉10.0g；甘露醇10.0g；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133种子液加到灭菌后的培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10％，28℃下于转速为190转/分钟的摇床上摇瓶发酵5天。
(3)发酵液处理：①发酵液经2500转/分钟离心，离心时间为15分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取4次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油状物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脱，收集三氯甲烷∶甲醇为50∶1的活性组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；④将粗品一种抗肿瘤抗生素进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集活性组分，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；⑤将较纯品一种抗肿瘤抗生素经过制备高效液相纯化，收集活性峰段，回收溶剂，冷冻干燥，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。
实施例4
化合物(I)的制备
(1)菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏6.0g；葡萄糖6.0g；麦芽膏7.0g；复合维生素2.0ml；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将菌株YIM 80133加到灭菌后的培养基中，28℃下于转速为250转/分钟的摇床上摇瓶发酵2天。
(2)菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取大豆粉30.0g；甘露醇30.0g；加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133种子液加到灭菌后的培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10％，28℃下于转速为250转/分钟的摇床上摇瓶发酵7天。
(3)发酵液处理：
①发酵液经3500转/分钟离心，离心时间为25分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取6次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油状物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脱，收集三氯甲烷∶甲醇为50∶1的活性组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；④将粗品一种抗肿瘤抗生素进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集活性组分，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；⑤将较纯品一种抗肿瘤抗生素经过制备高效液相纯化，收集活性峰段，回收溶剂，冷冻干燥，得到一种抗肿瘤抗生素纯品。
Claims (5)
1.一种抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤：
(1)菌种液体种子培养：
①液体种子培养基的制备：取酵母膏2.0～6.0g、葡萄糖2.0～6.0g、麦芽膏3.0～7.0g、复合维生素0.5～2.0ml、加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将菌株YIM 80133加到灭菌后的培养基中，28℃下于转速为190～250转/分钟的摇床上摇瓶发酵2天；
(2)菌种发酵培养：
①发酵培养基的制备：取大豆粉10.0～30.0g、甘露醇10.0～30.0g、加水至1000ml，pH 9.0，120℃灭菌30min；②发酵：将上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133种子液加到灭菌后的培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10％，28℃下于转速为190～250转/分钟的摇床上摇瓶发酵5～7天；
(3)发酵液处理：
①发酵液经2500～3500转/分钟离心，离心时间为15～25分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取4～6次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油状物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脱，收集三氯甲烷∶甲醇为50∶1的活性组分，回收溶剂，得到粗品一种抗肿瘤抗生素；④将粗品一种抗肿瘤抗生素进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集活性组分，回收溶剂，得到一种抗肿瘤抗生素较纯品；⑤将较纯品一种抗肿瘤抗生素经过制备高效液相纯化，收集活性峰段，回收溶剂，冷冻干燥，得到一种抗肿瘤抗生素纯品，所述抗肿瘤抗生素的结构为：
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的酵母膏为4.0g、葡萄糖为4.0g、麦芽膏为5.0g、复合维生素为1.0ml。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的大豆粉为20.0g、甘露醇为20.0g。
4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的摇瓶转速为220转/分钟，所述发酵时间为6天。
5.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤抗生素的制备方法，其特征是所述的发酵液离心转速为3000转/分钟，所述的离心时间为20分钟，所述的乙酸乙醋的萃取次数为5次。
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