CN102030753B - 异戊烯基化吲哚类生物碱及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及两种异戊烯基化吲哚类生物碱制备方法和应用。本发明用从采自辽宁营口环渤海湾海域潮间带的海泥样品分离得到的真菌烟曲霉Aspergillusfumigatus生产出两个异戊烯基化吲哚类生物碱，通过对真菌烟曲霉Aspergillusfumigatus进行大量发酵，发酵液经过滤后，用乙酸乙酯萃取获得含有式（I）化合物1的萃取物，然后从萃取物中分离纯化出式（I）化合物1；菌丝体用丙酮超声提取，然后从提取物中分离纯化出式（I）化合物2。本发明制备的化合物具有较好的抗肿瘤活性，有望成为抗肿瘤药物的先导化合物。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及异戊烯基化吲哚类生物碱及其制备方法和应用，涉及用海洋来源真菌烟曲霉Aspergillusfumigatus生产的两种异戊烯基化吲哚类生物碱和制备方法，及其在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
背景技术：
异戊烯基化吲哚类生物碱是真菌特有的次级代谢产物，尤其存在于青霉和曲霉属真菌中。该类化合物具有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制等作用。
本发明所涉及的化合物是由色氨酸残基、脯氨酸残基及异戊烯基形成的。崔承彬等人（Tetrahedron 1996, 52, 12651-12666）从海泥来源的真菌烟曲霉Aspergillus fumigatus代谢产物中得到异戊烯基化吲哚类生物碱tryprostatin A，是新的细胞周期抑制剂，并通过作用机制研究阐明其为新型M期微管重组抑制剂（Biochem. 1998, 333, 543-548）。因此，希望能从该类化合物中寻找新的抗肿瘤药物先导化合物。
发明内容：
本发明的目的在于提供两种异戊烯基化吲哚类生物碱及其制备方法和应用。本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明是从海洋来源微生物次级代谢产物中寻找具有抗肿瘤活性的物质，对由中国各海域采集到的海洋微生物（细菌、真菌和放线菌）菌株进行筛选，发现真菌烟曲霉Aspergillusfumigatus发酵提取物具有较好的肿瘤细胞生长抑制活性，进而对该菌株进行大量培养发酵和代谢产物的系统分离，首次从中得到了本发明的化合物，并通过各种波谱手段鉴定其结构为异戊烯基化吲哚类生物碱，如式（I）所示：
（I）
其结构特征是：式（I）化合物为化合物1，其中R1、R2均为氢，R3为a-羟基；或化合物2，其中R1为异戊烯基，R2为a-甲氧基，R3为b-羟基。
本发明的目的还在于提供式（I）化合物1和2的制备方法，及其在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
本发明将分离自2008年3月采于辽宁营口环渤海湾海域潮间带的海泥样品的真菌烟曲霉Aspergillusfumigatus进行大量发酵，发酵液经过滤后，用乙酸乙酯萃取，萃取物经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇100：2的洗脱物再经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮4：1洗脱物经开放ODS柱色谱进一步纯化，以甲醇-水55：45洗脱得式（I）化合物1；菌丝体用丙酮超声提取，提取物经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇100：2的洗脱物再经开放ODS柱色谱，甲醇-水70：30洗脱物经硅胶柱色谱进一步纯化，以石油醚-丙酮5：1洗脱得式（I）化合物2。
本发明采用MTT法测试了式（I）化合物1和2对人前列腺癌PC-3细胞株的生长抑制活性；采用台盼兰法测试了式（I）化合物1和2对人白血病U937细胞株的生长抑制活性。实验证实，式（I）化合物1和2均对人白血病U937细胞株有明显的生长抑制作用。因此，其可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
本发明的式（I）化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化得到；也可通过化学方法合成该类化合物。
本发明制备方法简单易行，重现性好，且制备的化合物具有较好的抗肿瘤活性。
具体实施方式：
在如下的实施例中所指的化合物1和2的结构如下式所示：
（I）
式（I）中化合物1的R1、R2均为氢，R3为a-羟基；或化合物2的R1为异戊烯基，R2为a-甲氧基，R3为b-羟基。
实施例1：化合物1和2的发酵生产及分离精制
1 发酵生产
生产菌的发酵培养：烟曲霉Aspergillusfumigatus经复苏后，从斜面转接到装有100 mL培养液[培养基组成：甘露醇（2.0 %），酵母膏（0.3 %），味精（1.0 %），葡萄糖（1.0 %），麦芽糖（2.0 %），玉米浆（0.1 %），MgSO4·7H2O（0.03 %），KH2PO4（0.05 %），CaCO3（2.0 %），陈海水配制，pH 6.5]的三角瓶（500 mL）中，在28 ℃、转速为165转/分钟的摇床上培养48-72小时，获得种子培养液。取种子培养液5 mL加入到装有150 mL上述培养液的300个500 mL的三角瓶中，按上述大发酵条件进行培养7天，获得发酵培养液约45 L。
2 浸膏的获得
用16层纱布将菌丝体和发酵液分离。发酵液45 L，减压浓缩至3.5 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到浸膏21.0 g。菌丝体用丙酮超声提取三次，每次1小时，所得提取液减压回收得浸膏250.0 g。
3 化合物的分离精制
乙酸乙酯萃取物（21.0 g）经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇100：2的洗脱物再经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮4：1洗脱物经开放ODS柱色谱进一步纯化，以甲醇-水55：45洗脱得化合物1（12 mg）；菌丝体丙酮超声提取物（250.0 g）经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇100：2的洗脱物再经开放ODS柱色谱，甲醇-水70：30洗脱物经硅胶柱色谱进一步纯化，以石油醚-丙酮5：1洗脱得化合物2（5 mg）。
化合物1：白色无定形粉末。[α]D 22 +99.0 (c 0.07, CHCl3)；UV (MeOH) λ max 227, 275, 297 nm；IR (KBr) ν max 3417, 2928, 1660, 1383, 1219, 773 cm-1；HRESIMS m/z 516.2462 [M+Na]+ (Calcd for C28H35N3O5Na, 516.2474)；1H 和13C NMR数据见表1。
化合物2：无色针晶。[α]D 22 -53.4 (c 0.21, CHCl3)；UV (MeOH) λ max 221, 272, 291 nm；CD (MeOH) λ (Δe) 230 (-5.0), 270 (+6.0), 295 (+3.1) nm；IR (KBr) ν max 3421, 2925, 1665, 1387, 1219, 772 cm-1；HRESIMS m/z 434.1508 [M+K]+ (Calcd for C22H25N3O4K, 434.1482)；1H 和13C NMR数据见表1。
表1 化合物1和2的1H和13C NMR数据（CDCl3, TMS）
a Recorded at 150 MHz. b Recorded at 75 MHz. c Recorded at 300 MHz.
实施例2：化合物1和2的肿瘤细胞生长抑制活性测试
1 实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物1和2。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。
细胞株及细胞的继代培养：PC-3和U937细胞均培养于含有10% (V/V)经加热灭活的胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/mL链霉素及0.2% NaHCO3的RPMI-1640培养液中，37 °C、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育。
1-1 MTT法活性测试方法
本发明采用MTT法测试了化合物1和2对人前列腺癌PC-3细胞株的生长抑制活性。96孔板每孔接种2′104个细胞，使其贴壁24小时后，加入不同浓度受试药物于37 °C继续培养4天。然后每孔加入50 mL 2 mg/mL MTT溶液于37 °C孵育4小时后，弃取上清液，每孔加入200 mL DMSO，室温振荡10分钟后，在酶标仪570 nm处测量每个孔的吸光度值。以未加入受试药物的吸光度值作对照来求得药物对细胞的生长抑制率，计算出半数抑制浓度GI50。
1-2 台盼兰法活性测试方法
本发明采用台盼兰法测试了化合物1和2对人白血病U937细胞株的生长抑制活性。取对数生长期的受试细胞，以 (4-5)′104 cells/mL的密度接种于24孔板内，每孔内2 mL。接种完毕后即加入相应浓度的待测药物。药物处理四天后，从每孔的细胞悬液中吸取50 mL细胞悬液，加入50 mL的0.4% 台盼蓝溶液中混匀，在3分钟内，于光学显微镜下观察，分别计数每孔的细胞总数。每孔中的总细胞数占对照孔总细胞数的百分比即为该浓度药物的生长抑制率，计算出半数抑制浓度GI50。
2 实验结果
表2 化合物1和2对U937和PC-3的细胞生长抑制活性
Claims (3)
1.异戊烯基化吲哚类生物碱，其特征在于：其结构通式如（I）所示：
其中化合物1：R1、R2均为氢，R3为α-羟基；
化合物2：R1为异戊烯基，R2为α-甲氧基，R3为β-羟基。
2.如权利要求1所述的异戊烯基化吲哚类生物碱的制备方法，其特征在于：对真菌烟曲霉Aspergillusfumigatus进行大量发酵，发酵液经过滤后，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇100：2的洗脱物再经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮4：1洗脱物经开放ODS柱色谱进一步纯化，以甲醇-水55：45洗脱得式（I）化合物1；菌丝体用丙酮超声提取，提取物经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇100：2的洗脱物再经开放ODS柱色谱，甲醇-水70：30洗脱物经硅胶柱色谱进一步纯化，以石油醚-丙酮5：1洗脱得式（I）化合物2。
3.权利要求1所述的式（I）化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
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