CN113939519A - 促进毛发生长的新化合物及包含它们的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可用作刺激毛发生长的组合物的主要成分的新化合物，还涉及其在刺激毛发生长中的用途，其中所述新化合物是9‑脱氧‑31‑O‑去甲基‑脯氨基‑FK506、9‑脱氧‑36,37‑二氢‑FK506、31‑O‑去甲基‑36,37‑二氢‑FK506、9‑脱氧‑31‑O‑去甲基‑36,37‑二氢‑FK506、9‑脱氧‑FK520、31‑O‑去甲基‑FK520、9‑脱氧‑31‑O‑去甲基‑FK520、9‑脱氧‑FK523和9‑脱氧‑31‑O‑去甲基‑FK523。
Description
技术领域
本发明涉及可作为促进毛发生长的组合物的主要成分的新化合物的制备和用途，其中所述新化合物是9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506、9-脱氧-36,37-二氢-FK506、31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、9-脱氧-FK520、31-O-去甲基-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、9-脱氧-FK523和9-脱氧-31-O-去甲基-FK523。更具体地说，本发明涉及制备用于促进毛发生长的新化合物和组合物的方法，所述组合物包括每种新化合物作为活性成分。
背景技术
脱发(脱发症)在现代人中已经变得越来越普遍，不仅是由于衰老或遗传原因，也是由于后天因素的影响，例如环境污染、吸烟、工作压力和饮食模式改变引起的激素失衡。虽然脱发的人群的增长主要以40多岁至50多岁的中老年男性为主，但近年来，年轻人和女性脱发的人数也在增加。
根据韩国毛发修复治疗学会的统计分析，包括潜在的脱发患者在内，国内脱发人口约占1000万。2016年的医疗支出约为355亿韩元，海外和韩国脱发人数都在增加。根据宜必思世界(IBIS World)行业市场研究公司的测算，2016年美国脱发管理的市场规模为36亿美元，预计到2021年，将以每年0.7％的速度增长。
与此同时，根据韩国慢性病管理协会的一项调查，十分之七的韩国成年人认为脱发是一种疾病，并认为脱发会在社会生活中造成直接或间接的损失。并且，大约23％的成年人经历脱发。
脱发分为暂时性脱发的非瘢痕性脱发，和毛囊或发根永久性破坏所致的瘢痕性脱发。非瘢痕性脱发是一种常见的脱发形式，分为感染性脱发、创伤性脱发、炎性脱发、先天性脱发、内分泌性脱发、肿瘤性脱发、营养不良性脱发、药物性脱发。头发结构异常引起的脱发、雄性和雌性型脱发、以及斑秃也属于非瘢痕性脱发。
随着经济的发展和社会的老龄化，脱发已经被认为是一种疾病，而不是一种不可控制的现象，迫切需要开发有效的药物来治疗脱发，其会导致工作和社会生活中的心理焦虑和压力。
然而，虽然脱发的人越来越多，但脱发的确切原因还没有明确，也没有有效的预防脱发的方法。由于目前的情况，有效的防止脱发和促进头发生长的技术越来越受到人们的关注，市场上出现了各种阿各样的预防剂。
目前，外用的米诺地尔(Minoxidil)和口服的保法止(Propecia)是FDA批准的药物。但这些药物并不提供永久性的治疗效果，只提供延缓脱发进展或维持当前状态的效果。此外，外用生发促进剂如米诺地尔可能会很麻烦，因为它们需要每天使用才能保持促进头发生长的效果，而且效果不如口服剂。此外，保法止给女性服用可能会增加婴儿先天畸形的可能性，并可能导致性功能障碍等副作用。因此，需要开发能够提供超越暂时效应水平的基本治疗作用的药物。此外，不仅用于治疗，而且还用于预防的药物可能更有价值。
尽管韩国专利公开第10-2005-0071491号(发明名称：他克莫司(FK506)衍生物与β2-激动剂联合用于治疗哮喘)公开了FK506衍生物和β2-激动剂用于制备同时、分开或依次使用以治疗或预防急性或慢性哮喘的药物的新用途，但尚未有关于应用FK506衍生物、FK520衍生物或FK523衍生物促进毛发生长的研究。
公开
技术问题
本发明的一个目的是提供九种新化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的组合物，其包括选自九种新化合物中的至少一种作为活性成分。在这方面，所述促进毛发生长的组合物是指用于减轻、预防或治疗脱发的组合物。
本发明的另一目的是提供一种促进毛发生长的药物组合物，其包括选自九种新化合物的异构体或其药学上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。在这方面，所述促进毛发生长的药物组合物是指用于减轻、预防或治疗脱发的组合物。
本发明的另一目的是提供所述九种新化合物中每一种的生物制造方法。
本发明的另一目的是提供在所述九种新化合物的生物制造方法中可用的生产菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM(登录号：KCTC13581BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsB(登录号：KCTC13583BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的非处方药(OTC)组合物，其包括选自九种新化合物、其异构体或其药学上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的功能性食品组合物，其包括选自九种新化合物、其异构体或其在营养学上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的化妆品组合物，其包括选自九种新化合物、其异构体或其化妆品上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。
技术方案
经过大量的努力，本发明人发现了毛发生长促进作用的新化合物，9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506、9-脱氧-36,37-二氢-FK506、31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、9-脱氧-FK520、31-O-去甲基-FK520、9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、9-脱氧-FK523和9-脱氧-31-O-去甲基-FK523(以下统称为九种新化合物)，可作为促进毛发生长组合物的主要成分，开发了其制造方法和使用所述化合物作为活性成分的促进毛发生长组合物，并证实了所述组合物可有效地用作促进毛发生长组合物，从而完成了本发明。
有利效果
所述促进毛发生长的组合物，其包括选自根据的本发明的九种新化合物中的至少一种作为活性成分，可以在减轻、预防和治疗脱发中提供促进毛发生长的作用，从而提供基本的预防和治疗作用。
附图的简要说明
图1显示了9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨基-FK506的高效液相色谱分析结果。
图2显示了9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图3显示了9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图4显示了9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图5显示了9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图6显示了9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰基-FK506的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图7显示了9-脱氧-36,37-二氢-FK506的高效液相色谱分析结果。
图8显示了9-脱氧-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图9显示了9-脱氧-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图10显示了9-脱氧-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图11显示了9-脱氧-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图12显示了9-脱氧-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图13显示了31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的高效液相色谱分析结果。
图14显示了31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图15显示了31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图16显示了31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图17显示了31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图18显示了31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图19显示了9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的高效液相色谱分析结果。
图20显示了9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图21显示了9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图22显示了9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图23显示了9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图24显示了9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图25显示了9-脱氧-FK520的高效液相色谱分析结果。
图26显示了9-脱氧-FK520的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图27显示了9-脱氧-FK520的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图28显示了9-脱氧-FK520的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图29显示了9-脱氧-FK520的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图30显示了9-脱氧-FK520的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图31显示了31-O-去甲基-FK520的高效液相色谱分析结果。
图32显示了31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图33显示了31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图34显示了31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图35显示了31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图36显示了31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图37显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的高效液相色谱分析结果。
图38显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图39显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图40显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图41显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图42显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图43显示了9-脱氧-FK523的高效液相色谱分析结果。
图44显示了9-脱氧-FK523的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图45显示了9-脱氧-FK523的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图46显示了9-脱氧-FK523的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图47显示了9-脱氧-FK523的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图48显示了9-脱氧-FK523的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图49显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的高效液相色谱分析结果。
图50显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的核磁共振分析结果(1H-NMR)。
图51显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的核磁共振分析结果(13C-NMR)。
图52显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的核磁共振分析结果(COSY-NMR)。
图53显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的核磁共振分析结果(HSQC-NMR)。
图54显示了9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的核磁共振分析结果(HMBC-NMR)。
图55显示了本发明的9个新化合物的免疫抑制活性的降低程度。
图56显示了本发明的新化合物的毛发生长促进活性。
图57显示了通过识别触须长度的增加确定的本发明的新化合物的毛发生长促进活性。
图58显示了基于用本发明的新化合物处理的触须的组织学结果的毛发生长促进活性的研究结果。
[最佳模式]
在下文中，将详细描述本发明。
同时，本文公开的每个描述和实施方式可应用于描述不同的描述和实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受到下文提供的详细描述的限制。
此外，本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本发明的特定实施方式的许多等价物。这样的等价物旨在包含在以下权利要求的范围内。
为了解决这些问题，本发明提供了制备九种新化合物的方法，通过应用这些制备方法包括每种新化合物的促进毛发生长的组合物，以及减轻、预防和治疗脱发的方法。
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种化合物，其选自下组的九种新化合物，即下式1所示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨基-FK506、下式2所示的9-脱氧-36，37-二氢-FK506、下式3所示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式4所示的9-脱氧-31-O-去甲基-36，37-二氢-FK506、下式5所示的9-脱氧-FK520、下式6所示的31-O-去甲基-FK520、下式7所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、下式8所示的9-脱氧-FK523、下式9所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523、其异构体、或其药学上可接受的盐。
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
在特定的实施方式中，本发明的化合物可以包括其异构体或其药学上可接受的盐。
异构体是指化学式相同但原子排列不同的化合物，可以包括，例如，结构异构体、几何异构体、光学异构体(对映异构体)、立体异构体和非对映异构体。
药学上可接受的盐可以是指原化合物的任何有机或无机加成盐，其在对患者有效的浓度下不会引起副作用和损害化合物的有益作用，但对患者相对无毒无害。例如，药学上可接受的盐可以是由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐。酸加成盐可以通过本领域中常用的任何方法制备，例如，通过将化合物溶解在过量的水溶液中，并使用水混溶的有机溶剂(例如，甲醇、乙醇、丙酮或乙腈)沉淀盐。可以加热在水中的相同摩尔量的化合物和酸或醇(例如乙二醇单甲醚)，然后通过蒸发干燥混合物，或者可以通过抽吸过滤沉淀的盐。在这方面，游离酸可以是有机酸或无机酸。所述盐可以是使用碱制备的药学上可接受的金属盐。
在另一个具体实施方式中，本发明的化合物可以是溶剂化物或前药的形式，这在本发明的范围内。所述溶剂化物可优选地包括水合物和乙醇酸盐。
本发明的组合物可以作为单一制剂或与已知对脱发具有预防或治疗作用的各种药物组合使用，并且该组合物可以使用药学上可接受的载体或赋形剂配制成单剂量剂型或多剂量容器中的单位剂型。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指使用的载体或稀释剂不会对活生物体造成刺激，也不会损害所给药化合物的生物活性或性质。本发明中可获得的载体的类型没有特别限制，可以使用本领域中常用的任何类型的药学上可接受的载体。所述载体的非限制性实例可包括共表面活性剂，如卡必醇(Transcutol)、聚乙二醇、三醋酸甘油酯(Triacetin)及其任何混合物；表面活性剂，如聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)、吐温(Tween)、密尔吉(Myrj)、泊洛沙姆(Poloxamer)、普兰尼克(Pluronic)、Lutrol(泊洛沙姆)、硬脂酸甘油酯(Imwitor)、司盘(Span)和油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil)，单独或混合；油，如辛酸癸酸甘油三酯(Miglyol)、Captex和油酸乙酯，单独或混合；和有机酸，如赤藓二酸和柠檬酸，单独或混合。这些载体可以单独使用或以至少两种的混合物使用。
此外，如果需要，所述组合物还可以包括任何已知的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和/或抑菌剂。所述组合物可以与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等组合配制成可注射剂型，如水溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
为了实现上述目的，本发明的另一方面提供了防止或治疗脱发的方法，所述方法包括给个体施用所述组合物。
如本文所用，术语“个体”是指所有脱(毛)发或有脱(毛)发风险的动物。
本发明的组合物可以包括药学有效量的选自九种新化合物、其异构体或其盐中的至少一种。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理收益/风险比治疗疾病的量，所述组合物的日剂量通常为0.001mg/kg-1000mg/kg，优选0.05mg/kg-200mg/kg，更优选0.1mg/kg-100mg/kg，每天一次到几次。然而，为了本发明的目的，优选根据各种因素对特定患者不同地施用特定治疗有效量，这些因素包括要实现的应答的类型和程度，特定组合物，包括是否根据病例使用其他制剂，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，给药时间、给药途径、组合物的排泄率、治疗持续时间，以及与特定组合物联合或同时使用的药物，以及医学领域中众所周知的类似因素。
尽管不特别限于此，本发明的组合物可以分剂量每天给药一次或几次。
本发明的组合物可以单独给药或与其它治疗剂联合给药，也可以与现有的治疗剂顺序或同时给药。所述组合物可以单剂型或多剂型给药。考虑到所有上述因素，以最小的量给药组合物是很重要的，该最小的量可以表现出最大的效果而不引起副作用。所述的量可以由本领域的技术人员容易地确定。
如本文所用，术语“给药”是指通过任何适当的方法将本发明的组合物引入患者体内。本发明的组合物可以通过任何口服或胃肠外途径给药，只要该组合物到达目标组织。
本发明组合物的给药模式没有特别限制，可以使用本领域中通常可用的任何给药模式。给药模式的非限制性例子包括口服或胃肠外给药模式。根据所需的给药方式，本发明的组合物可以制备成各种剂型。
本发明的促进毛发生长的组合物可用于减轻、预防或治疗脱发。
本发明中，脱发既包括非瘢痕性脱发，即暂时性脱发，也包括毛囊或发根永久性破坏引起的瘢痕性脱发，非瘢痕性脱发包括感染性脱发、创伤性脱发、炎性脱发、先天性脱发、内分泌性脱发、肿瘤性脱发、营养不良脱发、药物性脱发、毛发结构异常引起的脱发、雄性型脱发、雌性型脱发、斑秃。
如本文所用，术语“缓解”是指通过给个体施用本发明的组合物来延缓脱发进展或减轻脱发症状的所有行为。
如本文所用，术语“预防”是指通过给个体施用本发明的组合物来抑制或延缓脱发的所有行为。
如本文所用，术语“治疗”指的是通过给怀疑有脱发的个体施用本发明的组合物来减轻或有益地改变脱发症状的所有行为。在本发明的一个具体实施方式中，九种新化合物的免疫抑制作用通过体外T细胞活性测定得到证实。结果证实，与FK506相比，其免疫抑制作用减弱。
此外，在本发明的另一个具体实施方式中，证实了九种新化合物对促进触须生长的作用。
在本发明的另一个具体实施方式中，证实了九种新化合物在促进触须生长方面的作用，并基于组织学结果证实了细胞生长标志物，从而证实了触须持续保持生长。
这些结果表明，这九种新化合物具有促进毛发生长的作用，且无免疫抑制活性引起的副作用，因此可以有效地用于缓解、预防或治疗脱发。
为了实现上述目的，本发明的另一方面提供了九种新化合物，9-脱氧-31-O-去甲基-丙烯基-FK506、9-脱氧-36，37-二氢-FK506、31-O去甲基-36,37-二氢-FK506、9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、9-脱氧-FK520、31-O去甲基-FK520、9-脱氧-31-O去甲基-FK520、9-脱氧-FK523和9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的生物制造方法。
在生物制造过程中，使用在培养属于链霉菌属的微生物的一般过程中采用的培养温度。适合于本发明实施方式的培养温度可优选在23℃至30℃的范围内，更优选在25℃至28℃的范围内。
此外，在制造过程中，培养过程的pH保持在6.5～9的范围内，优选在7～8的范围内。
同时，在制造过程中保持较高的溶解氧水平也很重要。当假设培养初期的溶解氧水平为100％时，应将溶解氧水平保持在30％或更高，直至结束培养。为此，搅拌可以以800rpm至1500rpm的速率进行。
在制造过程中由培养的微生物细胞产生的九种新化合物可以通过第一提取过程、第二提取过程和第三提取过程提取。在本发明中，通过有机溶剂萃取法进行第一提取过程，其中使用的溶剂可以是乙酸乙酯、甲醇或丙酮，优选乙酸乙酯或甲醇。第二提取过程可以使用硅胶色谱进行，甲醇或二氯甲烷可以用作溶剂。另外，第三提取过程可以使用色谱进行，其中使用的溶剂可以是乙腈、乙酸铵缓冲液、乙酸或甲酸，优选乙腈。这些方法的应用促进了九种新化合物的回收，并提高了产率。
为了实现上述目的，本发明的另一方面提供了可用于制造九种新化合物的生产菌株，即卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM(登录号：KCTC13581BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsB(登录号：KCTC13583BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的非处方药(OTC)组合物，其包括选自九种新化合物、其异构体或其药学上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。
当为了促进毛发生长的目的将包括从九种新化合物中选择的至少一种的组合物添加到OTC组合物中时，所述化合物可以原样添加，或者可以与其他OTC组分一起使用，并且可以根据本领域常用的任何方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据使用目的适当地确定。
如本文所用，术语“OTC组合物”是指用于医疗、缓解、治疗或预防人类或动物疾病的纤维、橡胶制品或类似制品；对人体没有重大影响或者不直接作用的非器具、非机械或者类似产品；以及用于灭菌、杀虫和类似目的以预防传染病的制剂。OTC产品不包括用于诊断、医疗、缓解、治疗或预防人类或动物疾病的产品，不包括器具、机械和设备；或用于对人或动物的结构或功能施加药理作用的产品，但器具、机械或设备除外。OTC产品可以包括外用配方和个人卫生产品。
尽管不特别限于此，皮肤外部剂可以具体制备为软膏、乳液、喷雾剂、贴剂、乳膏、粉末、悬浮液、凝胶剂或凝胶形式。个人卫生产品可以是，但不特别限于，具体地，肥皂、化妆品、湿纸巾、纸巾、洗发水、护肤霜、面霜、牙膏、口红、香水、底妆、粉底、腮红、睫毛膏、眼影、防晒乳液、护发产品、空气清新剂凝胶或洗涤凝胶。
此外，本发明的OTC组合物可以是消毒剂清洁剂、淋浴泡沫、软膏、湿纸巾、涂层剂等，但不限于此，OTC组合物的配制方法、剂量、使用方法、组分等可以适当地选自本领域已知的常规技术。
除了上述组分之外，本发明的OTC组合物还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂不受限制，只要它不对本发明的效果产生不利影响，并且可以包括填料、扩展剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
在本发明的一个实施方式中，证实了九种新化合物具有促进毛发生长的作用，并可用作防止脱发和促进毛发生长的OTC组合物。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的功能性食品组合物，其包括九种新化合物、其异构体或其在地理上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。
因为证实了毛发生长促进作用和显著降低的免疫抑制活性，包括选自九种新化合物的至少一种化合物的组合物可以制备成食品的形式，用于预防或缓解脱发相关疾病。
如本文所用，术语“功能食品”与保健专用食品、保健功能食品、保健食品相同，是指经加工处理后，既能有效地发挥身体调节功能，又能提供营养的具有较高药效和医疗功效的食品。所述食品可以制成各种形式，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、液体和丸剂，以获得预防或缓解与脱发相关的疾病的有益效果。
本发明的功能性食品可以通过本领域中常用的方法和通过添加在制备过程中本领域中通常添加的原料和成分来制备。此外，所述功能性食品的剂型可以不受限制地制备，只要该剂型作为食品是可接受的。本发明的功能性食品可以以各种类型的剂型制备。与一般药物不同，所述食品组合物包括作为原料的食品，因此，其优点是没有长期服用时可能发生的副作用。所述食品组合物的便携性也很好，因此，本发明的食品可以作为增强毛发生长促进作用的补充剂。
具体地说，所述功能性食品是通过将选自九种新化合物或其异构体的至少一种化合物添加到如饮料、茶、香料、树脂、糖果等食品材料或制成胶囊、粉末或悬浮液的食品中而制备的食品，其可用作各种食品如饮料、树脂、茶、维生素复合物和功能性食品。
根据任何已知的制造方法，所述食品可以制成片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、液体溶液和丸剂等剂型，并且本发明的组合物的量可以根据所述剂型调整。除了选自本发明九种新化合物中的至少一种化合物之外的其他成分作为活性成分没有特别限制，并且所述组合物还可以包括各种调味剂或天然碳水化合物作为附加成分。
天然碳水化合物的例子包括典型的糖，例如：葡萄糖、果糖等单糖；麦芽糖、蔗糖等双糖；多糖如糊精和环糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇。除上述之外，调味剂包括天然调味剂，如索马甜和甜叶菊提取物(例如莱鲍迪苷A和甘草酸苷)和合成调味剂(例如糖精和阿斯巴甜)可以有利地使用。
此外，本发明的组合物或功能性食品可以包括多种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成和天然调味剂、着色剂和填料(奶酪、巧克力等)、果胶酸或其盐、海藻酸或其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳酸饮料中使用的碳酸剂。
此外，本发明的功能性食品可以包括用于天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果浆。这些成分可以单独使用，也可以组合使用。
当制剂为粉末时，载体可以是乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末或其任何混合物。
当本发明的制剂是溶液或乳液时，载体可以是溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油，特别是棉籽油、花生油、玉米籽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油、脂肪族酯、聚乙二醇或山梨醇的脂肪酸酯。
当制剂是悬浮液时，载体可以是液体稀释剂，如水、乙醇或丙二醇，悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪。
本发明的另一目的是提供一种用于促进毛发生长的化妆品组合物，其包括选自九种新化合物、其异构体或其化妆品上可接受的盐中的至少一种作为活性成分。
如本文所用，“化妆品组合物”可以以任何商业制造的剂型制备，例如溶液、乳液、悬浮液、泥膏、乳霜、乳液、凝胶、粉末、喷雾剂、含表面活性剂的清洁剂、油、肥皂、液体清洁剂、浴弹、粉底、底妆、香精、滋养乳液、泡沫、包装、软化水、防晒霜、太阳油等。
当本发明的制剂是溶液或乳液时，载体可以是溶剂、增溶剂或乳化剂，如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油、脂肪族酯、聚乙二醇或山梨醇的脂肪酸酯。
当制剂是悬浮液时，载体可以是液体稀释剂，如水、乙醇或丙二醇，悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪。
当本发明的制剂是泥膏、乳霜或凝胶时，载体可以是动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌。
当本发明的制剂是粉末或喷雾时，载体可以是乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别地，在喷雾的情况下，制剂可进一步包括推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当本发明的制剂是含有表面活性剂的清洁剂时，载体可以是脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、异硫氰酸酯、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯。
在本发明的一个实施方式中，确认了九种新化合物促进毛发生长的作用，并确认了包括该化合物的组合物作为化妆品组合物用于防止脱发和促进毛发生长的用途。
[最佳模式]
在本发明的一个实施方式中，确认了九种新化合物促进毛发生长的效果，并确认了包括该化合物的组合物作为化妆品组合物用于防止脱发和促进毛发生长的用途。
实施例1：9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM(登录号：KCTC13581BP)为产9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD-fkbM基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双交叉同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD和fkbM基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD-fkbM基因，设计了一对左侧片段的引物FkbD-MLF/FkbD-MLR，和一对右侧片段的引物FkbD-MRF/FkbD-MRR。分离所有PCR片段，用HindI II-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。关于本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在下面的表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种同时去除C9羟化酶和31-O-甲基转移酶的质粒pΔfkbD-fkbM被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD-fkbM，作为安普霉素敏感性表型被选择，通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD-fkbM基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD-fkbM，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13581BP)。
表1
所用菌株和质粒的信息
表2
所用引物的信息
| 引物 | 序列5'至3'(下划线为限制性位点) | 限制性内切酶 |
| FkbDLF | TATA<u>AAGCTT</u>CGGAGCCCCGGTGGACCT | HindIII |
| FkbDLR | TTAA<u>TCTAGA</u>CGTCGCCTCGTCGTCGCT | XbaI |
| FkbDRF | GTAA<u>TCTAGA</u>GTCGGCTACTGCCTCTAC | XbaI |
| FkbDRR | GAAT<u>GAATTC</u>CGACGAACAGCGGTTCCT | EcoRI |
| FkbMLF | TACG<u>AAGCTT</u>TCTGTTCGGCATCCAGCA | HindIII |
| FkbMLR | TAGC<u>TCTAGA</u>GTCACCCGGGAGCAGTTC | XbaI |
| FkbMRF | TATA<u>TCTAGA</u>GACACCGAAGGCGCGCTC | XbaI |
| FkbMRR | TTAA<u>GAATTC</u>GAACACCGAGGCCGTCCA | EcoRI |
| FkbD-MLF | TATA<u>AAGCTT</u>CGGAGCCCCGGTGGACCT | HindIII |
| FkbD-MLR | TTAA<u>TCTAGA</u>CGTCGCCTCGTCGTCGCT | XbaI |
| FkbD-MRF | TATA<u>TCTAGA</u>GACACCGAAGGCGCGCTC | XbaI |
| FkbD-MRR | TTAA<u>GAATTC</u>GAACACCGAGGCCGTCCA | EcoRI |
| TcsBLF | GAC<u>AAGCTT</u>ATGCTGGCGGTGAAGGCG | HindIII |
| TcsBLR | CCG<u>TCTAGA</u>CCAGAAGGAATCGAGCCGGAA | XbaI |
| TcsBRF | CAG<u>TCTAGA</u>GTGATCCGTGCCCTGCACTCC | XbaI |
| TcsBRR | GCCGAATTCGATGACGATGTCCGGGTCG | EcoRI |
| TcsDLF | GCT<u>AAGCTT</u>CTCAGGCGTCTGCGGATGC | HidIII |
| TcsDLR | ATC<u>GGATCC</u>TTCGCTCACCGGGGCTGCC | BamHI |
| TcsDRF | AGC<u>AGATCT</u>GGCATGTTCTGGTCAGTCC | BglI |
| TcsDRR | GTC<u>GAATTC</u>CATGCCACGAACGGGTCGA | EcoRI |
9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM(登录号：KCTC13581BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/L L-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩后的提取物在水中复溶后，加入2倍于水体积的乙酸乙酯，摇动提取。将混合物放置直至水层和有机层分离。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3，9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式1表示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506。
制备的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506的分析结果如表3和图1至6所示，并基于该结果确认，9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM产生。
9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506(分子式：C41H57NO11和分子量：749.4714)的分析结果如下表3所示。
表3
基于1H-NMR和13C-NMR结果，一个酮碳(δC 214.00)、两个羰基碳(δC 171.99和170.09)、一个外亚甲基主链(δC 116.84和135.80)和2个烯烃主链(δC141.22和122.04；以及δC 132.64和129.79)被确认为特征官能团，并且观察到一个双氧化季碳(δC 98.73)、7个氧化次甲基碳(δC 78.28、77.39、75.28、75.81、74.73、71.14和69.23)，2个甲氧基碳(δC 57.98和56.48)，和5个甲基碳(δC 19.10、17.20、15.90、14.41和10.13)。得到的化合物被鉴定为由42个碳原子组成的FK506衍生物。为了准确鉴定化合物的结构，进行了2D-NMR确证。作为使用gCOSY鉴定质子偶联的结果，基于H-2与H-4的偶联，确认该化合物不是具有哌啶骨架的FK506而是包括没有CH2官能团的脯氨酰骨架的化合物。根据gHMBC数据，基于H-9(δH 2.56,2.63)与C-8(δC 171.99)和C-10(δC 98.73)的相关性，证实该化合物的C-9不是酮而是还原为CH2的骨架。此外，由于两个甲氧基官能团与C-13和C-15相连，证实C-31上不存在甲氧基。总之，该化合物被确认为9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506。
实施例2：9-脱氧-36,37-二氢-FK506的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)为产9-脱氧-36,37-二氢-FK506菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD和tcsD基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD和tcsD基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD基因，设计了一对左侧片段的引物FkbDLF/FkbDLR，和一对右侧片段的引物FkbDRF/FkbDRR。为了删除tcsD基因，设计了一对左侧片段的引物TcsDLF/TcsDLR，和一对右侧片段的引物TcsDRF/TcsDRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种去除C9羟化酶的质粒pΔfkbD被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD，被选为安普霉素敏感性表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsD导入构建的fkbD基因缺失链霉菌ΔfkbD，使用与fkbD基因的缺失相同的方法来删除tcsD基因。ΔfkbD,tcsD被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD和tcsD基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD,tcsD，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13580BP)。
9-脱氧-36,37-二氢-FK506是通过培养突变菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/L L-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-36,37-二氢-FK506。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩上清。浓缩提取物溶于水后，加入两倍体积的乙酸乙酯并混合。将混合物放置到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，9-脱氧-36,37-二氢-FK506得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式2表示的9-脱氧-36,37-二氢-FK506。
制备的9-脱氧-36,37-二氢-FK506鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-36,37-二氢-FK506的分析结果如表4和图7至12所示，并基于该结果确认，9-脱氧-36,37-二氢-FK506由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD产生。
9-脱氧-36,37-二氢-FK506(分子式：C44H73NO11和分子量：792.06)的分析结果如下表4所示。
表4
根据1H-NMR、13C-NMR和gHSQC结果，所得化合物由44个碳原子组成，另外还观察到一个甲氧基(δH 3.39和δC 56.56)和一个CH2基(δH 2.24、δH 1.70和δC 20.70)，未观察到外亚甲基官能团，甲基(δH0.88和δC13.91)与CH2基(δH 1.21和δC 20.41)的三重态偶联被观察到。为了准确鉴定结构，进行了2D-NMR。通过gCOSY鉴定质子偶联的结果，证实该化合物是包含哌啶主链的FK506，并且基于H-2到H-5的偶联，在哌啶主链上存在一个CH2官能团(δH2.24、δH 1.70和δC 20.70)。基于gHMBC，确认三个甲氧基氢(δH 3.39、3.36和3.35)分别与C-31(δC 77.11)、C-15(δC 77.11)和C-13(δC 74.33)相关，并且在三重偶联状态下观察到的甲基(δH 0.88和δC 13.91)和CH2基团(δH 1.21和δC 20.41)与C-21/33相关。因此，作为由tcsD基因缺失菌株产生的化合物，确定9-脱氧-36,37-二氢-FK506具有C-36/37之间存在的双键被还原的结构形式。
实施例3：31-O-去甲基-36，37-二氢-FK506的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)为产31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbM和tcsD基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbM和tcsD基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbM基因，设计了一对左侧片段的引物FkbMLF/FkbMLR，和一对右侧片段的引物FkbMRF/FkbMRR。为了删除tcsD基因，设计了一对左侧片段的引物TcsDLF/TcsDLR，和一对右侧片段的引物TcsDRF/TcsDRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种去除31-O-甲基转移酶的质粒pΔfkbM被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbM，被选为安普霉素敏感性表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsD导入构建的fkbM基因缺失链霉菌ΔfkbM，使用与fkbM基因的缺失相同的方法来删除tcsD基因。ΔfkbM,tcsD被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbM和tcsD基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbM,tcsD，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13584BP)。
31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/LMgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/LTES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/L L-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式3表示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506。
制备的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的分析结果如表5和图13至18所示，并基于该结果确认，31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD产生。
31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506(分子式：C43H69NO12和分子量：792.02)的分析结果如下表5所示。
表5
根据1H-NMR、13C-NMR和gHSQC结果，所得化合物由43个碳原子组成，由于还另外观察到一个酮碳(δC 196.54)，并观察到两个甲氧基，可以推断该化合物是由ΔfkbM基因产生的31-O-脱甲基衍生而来。基于gHMBC，确认两个甲氧基氢(δH 3.40和3.30)分别与C-15(δC75.21)和C-13(δC 74.03)相关。作为由tcsD基因缺失菌株产生的化合物，确定31-O-去甲基-35,37-二氢-FK506具有其中存在于C-36/37之间的双键被还原的结构。
实施例4：9-脱氧-31-O-去甲基-36，37-二氢-FK506的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)为产9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD-fkbM和tcsD基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD-fkbM和tcsD基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD-fkbM基因，设计了一对左侧片段的引物FkbD-MLF/FkbD-MLR，和一对右侧片段的引物FkbD-MRF/FkbD-MRR。为了删除tcsD基因，设计了一对左侧片段的引物TcsDLF/TcsDLR，和一对右侧片段的引物TcsDRF/TcsDRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种同时去除C9羟化酶和31-O-甲基转移酶的质粒pΔfkbD-fkbM被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD-fkbM，作为安普霉素敏感性表型被选择，通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsD导入构建的fkbD-fkbM基因缺失链霉菌ΔfkbD-fkbM，使用与fkbD-fkbM基因的缺失相同的方法来删除tcsD基因。ΔfkbD-fkbM,tcsD被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD-fkbM和tcsD基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsD，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13585BP)。
9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/L L-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式4表示的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506。
制备的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506的分析结果如表6和图19至24所示，并基于该结果确认，9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD产生。
9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506(分子式：C43H71NO11和分子量：778.04)的分析结果如下表6所示。
表6
根据1H-NMR、13C-NMR和gHSQC结果，尽管所获得的化合物由43个碳原子组成，但在物质1和物质2中，由于ΔfkbD的影响，观察到CH2官能团(δH2.67、2.49和δC 37.54)代替了酮。基于2D-NMR数据的分析结果，4号化合物的结构确定为由ΔfkbD-fkbM基因产生的9-脱氧-31-O-去甲基-35,37-二氢-FK506。
实施例5：9-脱氧-FK520的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)为产9-脱氧-FK520菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD和tcsB基因或fkbD和tcsD基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD和tcsB基因或fkbD和tcsD基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD基因，设计了一对左侧片段的引物FkbDLF/FkbDLR，和一对右侧片段的引物FkbDRF/FkbDRR。为了删除tcsB基因，设计了一对左侧片段的引物TcsBLF/TcsBLR，和一对右侧片段的引物TcsBRF/TcsBRR。为了删除tcsD基因，设计了一对左侧片段的引物TcsDLF/TcsDLR，和一对右侧片段的引物TcsDRF/TcsDRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种去除C9羟化酶的质粒pΔfkbD被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD，被选为安普霉素敏感性表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsB或pΔtcsD导入构建的fkbD基因缺失链霉菌ΔfkbD，使用与fkbD基因的缺失相同的方法来删除tcsB或tcsD基因。ΔfkbD,tcsB或ΔfkbD,tcsD被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD和tcsB基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD,tcsB，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13579BP)，以及构建的fkbD和tcsD基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD,tcsD，也于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13580BP)。
9-脱氧-FK520是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/LMgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/LL-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-FK520。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，9-脱氧-FK520得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式5表示的9-脱氧-FK520。
制备的9-脱氧-FK520鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-FK520的分析结果如表7和图25至30所示，并基于该结果确认，9-脱氧-FK520由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB或卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD产生。
9-脱氧-FK520(分子式：C43H71NO11和分子量：778.04)的分析结果如下表7所示。
表7
基于1H-NMR、13C-NMR和gHSQC数据，尽管由43个碳原子组成的化合物类似于9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506，但由于另外观察到甲氧基(δH 3.41和δC 56.81)，并且观察到较少的CH2官能团，因此该化合物被确认为结构异构体。通过gCOSY鉴定质子偶联的结果，证实该化合物具有基于H-2至H-5偶联的哌啶主链。基于从gHMBC中观察到三重偶联的甲基，以及由C-21(δH 1.72和1.52，和δC 20.41)之间的相关性形成的CH2基团(δH 1.72和1.52，和δC20.41),证实在C-21处存在的是构成FK520的乙基，而不是FK506的丙基。在此基础上，确定化合物5的结构为9-脱氧-FK520。
实施例6：31-O-去甲基-FK520的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbM,tcsB(登录号：KCTC13583BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)为产31-O-去甲基-FK520菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbM和tcsB基因或fkbM和tcsD基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbM和tcsB基因或fkbM和tcsD基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbM基因，设计了一对左侧片段的引物FkbMLF/FkbMLR，和一对右侧片段的引物FkbMRF/FkbMRR。为了删除tcsB基因，设计了一对左侧片段的引物TcsBLF/TcsBLR，和一对右侧片段的引物TcsBRF/TcsBRR。为了删除tcsD基因，设计了一对左侧片段的引物TcsDLF/TcsDLR，和一对右侧片段的引物TcsDRF/TcsDRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种去除31-O-甲基转移酶的质粒pΔfkbM被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbM，被选为安普霉素敏感性表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsB或pΔtcsD导入构建的fkbM基因缺失链霉菌ΔfkbM，使用与fkbM基因的缺失相同的方法来删除tcsB或tcsD基因。ΔfkbM,tcsB或ΔfkbM,tcsD被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbM和tcsB基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbM,tcsB，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13583BP)，以及构建的fkbM和tcsD基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbM,tcsD，也于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13584BP)。
31-O-去甲基-FK520是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsB(登录号：KCTC13583BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/LMgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/LL-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取31-O-去甲基-FK520。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，31-O-去甲基-FK520得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式6表示的31-O-去甲基-FK520。
制备的31-O-去甲基-FK520鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。31-O-去甲基-FK520的分析结果如表8和图31至36所示，并基于该结果确认，31-O-去甲基-FK520由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsB或卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD产生。
31-O-去甲基-FK520(分子式：C42H67NO12和分子量：777.99)的分析结果如下表8所示。
表8
虽然6号化合物的分子量为800.4563，与800.4924和800.4927的分子量非常相似，但基于1H-NMR、13C-NMR和gHSQC数据证实，由总共42个碳原子组成的化合物由于少一个甲氧基而具有一个碳原子差异，并观察到一个酮碳(δC196.50)。根据2D-NMR数据，确定了该化合物的结构为31-O-去甲基-FK520。
实施例7：9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)、卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)为产9-脱氧-31-O-去甲基-FK520菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD-fkbM和tcsB基因或fkbD-fkbM和tcsD基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD-fkbM和tcsB基因或fkbD-fkbM和tcsD基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD-fkbM基因，设计了一对左侧片段的引物FkbD-MLF/FkbD-MLR，和一对右侧片段的引物FkbD-MRF/FkbD-MRR。为了删除tcsB基因，设计了一对左侧片段的引物TcsBLF/TcsBLR，和一对右侧片段的引物TcsBRF/TcsBRR。为了删除tcsD基因，设计了一对左侧片段的引物TcsDLF/TcsDLR，和一对右侧片段的引物TcsDRF/TcsDRR。分离所有PCR片段，用HindII I-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种同时去除C9羟化酶和31-O-甲基转移酶的质粒pΔfkbD-fkbM被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD-fkbM，作为安普霉素敏感性表型被选择，通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsB或pΔtcsD导入构建的fkbD-fkbM基因缺失链霉菌ΔfkbD-fkbM，使用与fkbD-fkbM基因的缺失相同的方法来删除tcsB或tcsD基因。ΔfkbD-fkbM,tcsB或ΔfkbD-fkbM,tcsD被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD-fkbM和tcsB基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsB，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13582BP)，以及构建的fkbD-fkbM和tcsD基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsD，也于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13585BP)。
9-脱氧-31-O-去甲基-FK520是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/LMgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/LTES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/L L-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-31-O-去甲基-FK520。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，9-脱氧-31-O-去甲基-FK520得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式7表示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520。
制备的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-31-O-去甲基-FK520的分析结果如表9和图31至42所示，并基于该结果确认，9-脱氧-31-O-去甲基-FK520由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB或卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD产生。
9-脱氧-31-O-去甲基-FK520(分子式：C42H69NO11和分子量：764.01)的分析结果如下表9所示。
表9
基于1H-NMR、13C-NMR和gHSQC数据，尽管所获得的化合物由42个碳原子组成，显示出与31-O-去甲基-FK520类似的结果，但观察到从ΔfkbD-fkbM基因产生的CH2官能团(δH2.67和2.49以及δC 37.54)。根据2D-NMR数据，确定化合物7的结构为9-脱氧-31-O-去甲基-FK520。
实施例8：9-脱氧-FK523的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)为产9-脱氧-FK523菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD和tcsB基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD和tcsB基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD基因，设计了一对左侧片段的引物FkbDLF/FkbDLR，和一对右侧片段的引物FkbDRF/FkbDRR。为了删除tcsB基因，设计了一对左侧片段的引物TcsBLF/TcsBLR，和一对右侧片段的引物TcsBRF/TcsBRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种去除C9羟化酶的质粒pΔfkbD被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD，被选为安普霉素敏感性表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsB导入构建的fkbD基因缺失链霉菌ΔfkbD，使用与fkbD基因的缺失相同的方法来删除tcsB基因。ΔfkbD,tcsB被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD和tcsB基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD,tcsB，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13579BP)。
9-脱氧-FK523是通过培养突变菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/L CaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/LL-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-FK523。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，9-脱氧-FK523得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式8表示的9-脱氧-FK523。
制备的9-脱氧-FK523鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-FK523的分析结果如表10和图43至48所示，并基于该结果确认，9-脱氧-FK523由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB产生。
9-脱氧-FK523(分子式：C42H69NO11和分子量：764.01)的分析结果如下表10所示。
表10
所得化合物的分子量与9-脱氧-31-O-去甲基-FK520相同。尽管基于1H-NMR、13C-NMR和gHSQC数据，由总共42个碳原子组成的化合物具有与之非常相似的结构，但是由于另外观察到甲氧基(δH 3.41和δC 56.81)，并且观察到较少的CH2官能团，因此该化合物被确认为结构异构体，与9-脱氧-31-O-去甲基-FK520不同。通过gCOSY鉴定质子偶联的结果，证实该化合物具有基于H-2至H-5偶联的哌啶主链。基于gHMBC，在双偶联状态下观察到的甲基(δH1.18和δC17.13)与C-21(δH 3.21和δC 53.45)相关，从而证实了在C-21处存在构成FK523的甲基。在此基础上，确定了该化合物的结构为9-脱氧-FK523。
实施例9：9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的制备
卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)为产9-脱氧-31-O-去甲基-FK523菌株，其通过失活卡那霉素链霉菌(FK506产生菌株)的fkbD-fkbM和tcsB基因构建，根据Ban,Y.H.等人，(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)介绍的方法，通过双杂交同源重组引起框架内缺失。
具体而言，为了构建缺失fkbD-fkbM和tcsB基因的产FK506卡那霉素链霉菌菌株的突变体，将每个基因克隆至pKC1139载体并转移至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后通过接合用载体转化产FK506卡那霉素链霉菌菌株。
构建该菌株的方法可以更具体地解释为构建框架内基因缺失质粒和构建基因缺失菌株。
在框架内基因缺失质粒的构建中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139用于框架内基因缺失。质粒的构建通过对来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的Fosmid DNA缺失的靶基因的左侧和右侧片段进行PCR来进行。为了删除fkbD-fkbM基因，设计了一对左侧片段的引物FkbD-MLF/FkbD-MLR，和一对右侧片段的引物FkbD-MRF/FkbD-MRR。为了删除tcsB基因，设计了一对左侧片段的引物TcsBLF/TcsBLR，和一对右侧片段的引物TcsBRF/TcsBRR。分离所有PCR片段，用HindIII-XbaI或XbaI-EcoRI消化，克隆到pKC1139载体上。本实施例中使用的菌株、质粒和引物的信息显示在表1和表2中。
用于构建基因缺失菌株的质粒如表1所示。一种同时去除C9羟化酶和31-O-甲基转移酶的质粒pΔfkbD-fkbM被转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，并通过接合引入卡那霉素链霉菌以通过同源重组删除目的基因。缺失质粒和卡那霉素链霉菌染色体发生单次杂交的菌株通过在37℃(以pSG5为基础的复制子复制的非允许的温度)在安普霉素存在下培养抗安普霉素的转接物来选择。然后，获得的菌落在28℃下增殖三次，不进行选择，以允许第二次杂交。获得的双杂交突变体，即ΔfkbD-fkbM，作为安普霉素敏感性表型被选择，通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
通过将pΔtcsB导入构建的fkbD-fkbM基因缺失链霉菌ΔfkbD-fkbM，使用与fkbD-fkbM基因的缺失相同的方法来删除tcsB基因。ΔfkbD-fkbM,tcsB被选为安普霉素敏感性的表型，并通过PCR，任选地通过Southern印迹进行鉴定。
构建的fkbD-fkbM和tcsB基因缺失菌株，卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)ΔfkbD-fkbM,tcsB，于2018年7月17日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC13582BP)。
9-脱氧-31-O-去甲基-FK523是通过培养构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM(登录号：KCTC13582BP)制备的。这将更详细地描述。50mL R2YE培养基(包括103g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.25g/L K2SO4、10.12g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L酵母提取物(10％))、100mL/L TES缓冲液(5.73％，pH 7.2)、10mL/L磷酸钾(0.5％)、80mL/LCaCl2·2H2O(3.68％)、15mL/LL-脯氨酸(20％)、2mL/L微量元素溶液和5mL/L NaOH(1N))加入250mL三角振荡烧瓶中，并接种生产菌株。然后，将菌株在28℃、180rpm的旋转摇床培养箱中预培养两天。随后，将10毫升预培养的培养物接种到1升装在3升锥形烧瓶中的R2YE培养基中。接种后，将菌株在28℃和180rpm条件下培养6天。培养6天后，使用第一提取过程提取9-脱氧-31-O-去甲基-FK523。
第一提取过程如下进行。首先在培养液中加入等体积甲醇混合30分钟，离心除去微生物细胞，然后用旋转蒸发器浓缩除去微生物细胞的提取物。将浓缩的提取物溶于水后，加入提取物两倍体积的乙酸乙酯并混合，放置混合物直到分层为止。层分离后，上层(即有机溶剂层)使用旋转蒸发器回收和浓缩，并测量浓缩后的重量。将通过第一提取过程得到的提取物通过硅胶填充的柱子。在这种情况下，硅胶的量是通过第一提取过程获得的提取物重量的15倍，甲醇和二氯甲烷以五种比例混合(试样1.0:100，试样2.1:100，试样3.1:10，试样4.1:1，和试样5.100:0)用作流动相。在试样3中，9-脱氧-31-O-去甲基-FK523得到确证。用旋转蒸发器浓缩上述得到的试样3，并最终用HPLC纯化。
将浓缩物冻干以获得粉末形式的由式9表示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523。
制备的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523鉴定如下。具体进行了高效液相色谱分析、质谱分析和核磁共振分析。9-脱氧-31-O-去甲基-FK523的分析结果如表11和图49至54所示，并基于该结果确认，9-脱氧-31-O-去甲基-FK523由构建的生产菌株卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB产生。
9-脱氧-31-O-去甲基-FK523(分子式：C41H67NO11和分子量：752.01)的分析结果如下表11所示。
表11
基于1H-NMR、13C-NMR和gHSQC数据，所得化合物由41个碳原子组成，与9-脱氧-FK523不同，其少一个甲氧基。同时观察到由ΔfkbD-fkbM基因产生的CH2官能团(δH 2.70和2.51以及δC 36.25)。根据2D-NMR数据，确定了该化合物的结构为9-脱氧-31-O-去甲基-FK523。
实施例10：九个新化合物的免疫抑制活性鉴定
这九种新化合物的免疫抑制活性的降低程度由已知的体外T细胞活性测定鉴定(J.Immunol.143:718–726,1989)。
CD4+T细胞分裂是免疫应答的一个指标。当被Cell TraceTMViolet(CTV)染色的CD4+T细胞因免疫反应而增殖时，每个细胞的CTV量会减少，从而以此为指标来确定免疫抑制活性的程度。
从6～8周龄的B6J实验小鼠脾脏中分离单个细胞，用
小鼠CD4T细胞富集试剂盒(eBioscience)分离CD4+T细胞。CD4+T细胞用Cell TraceTMViolet(CTV)细胞增殖试剂盒(分子探针)染色，并向其中分别加入浓度为0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的FK506或9种新化合物，然后孵育72小时。为了激活T细胞，使用
小鼠T激活剂CD3/CD28(Gibco)。使用灭活的T细胞作为对照。孵育后用流式细胞术分析CTV强度。
下表12和图55显示了基于使用流式细胞仪测量的CTV强度的T细胞增殖程度，表明了FK506和九种新化合物的免疫抑制活性程度。如下表12和图55所示，与FK506相比，本发明提供的所有新化合物显示出免疫抑制活性降低。
表12
根据上述结果，确认本发明的九种新化合物与FK506相比免疫抑制活性显著降低，因此确定包括选自九种新化合物中的至少一种化合物作为活性成分的促进毛发生长的组合物可以在不考虑免疫抑制活性引起的副作用的情况下使用。
实施例11：九种新化合物毛发生长促进活性的鉴定
使用小鼠触须组织评估了本发明的九种新型化合物相对于母体药物(FK506)的毛发生长促进活性。从每只6至8周龄的实验黑鼠(C57BL/6小鼠)上剥下长有浓密毛发的嘴巴周围的嘴和嘴组织(胡须垫)，并用70％的乙醇短时间处理数秒。处理后的嘴巴组织在以下状态下制备，在冰上浸泡在添加1％青霉素/链霉素(P/S)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用镊子和刀片去除周围的皮下脂肪组织和结缔组织，同时使用解剖显微镜观察制备的嘴组织以暴露触须组织。然后，用镊子和刀片从嘴组织中分离出与毛囊有关的触须，并将触须添加到含有1％P/S的PBS中。然后，在孔板中装入触须培养基(含1％P/S和12.5μg/ml庆大霉素的无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM))，将分离出的每一根触须加入每个孔中。此外，在37℃、5％CO2的恒温箱中孵育它们，同时每2天用新鲜培养基更换一次培养基。为了评价这9种新化合物对触须生长的影响，将这9种新化合物与培养基混合，然后通过测量触须相对于参考值的长度、面积、体积等进行评价。
结果证实，这9种新化合物都可以提供与母体药物FK506相同水平的毛发生长促进活性。一些新化合物的结果作为代表性实例示于图56中。这些例子是为了说明目的而不是强调特定的化合物。此外，经新化合物处理测量的触须长度的增长结果显示在图57中。如图57所示，确认了新化合物和FK506均能增加触须的长度。
此外，在用一些新化合物处理的状态下培养的触须的组织学结果显示在图58中。证实与未处理组相比，由于新化合物9-脱氧-31-O-去甲基-FK520，细胞的生长标记物(Ki67)过度表达，因此证实用新化合物处理的触须的生长持续保持。基于该结果，证实了包括本发明九种新化合物中的至少一种作为活性成分的促进毛发生长组合物具有所需的促发效果，从而确定该组合物可以有效地用于预防和治疗脱发。
本发明的上述描述是出于说明的目的而提供的，本领域技术人员将理解，可以在不改变本发明的技术概念和必要特征的情况下进行各种改变和修改。因此，显然上述实施方式在所有方面是说明性的，并且不限制本发明。本文所公开的各种实施方式并不旨在限制，其真正的范围和精神由以下权利要求指示。本发明仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等效物的全部范围的限制。
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1.一种促进毛发生长的药物组合物，其包括选自下组的化合物：下式1所示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506)、下式2所示的9-脱氧-36,37-二氢-FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-FK506)、下式3所示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506(31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506)、下式4所示的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506(31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506)、下式5所示的9-脱氧-FK520(9-deoxo-FK520)、下式6所示的31-O-去甲基-FK520(31-O-demethyl-FK520)、下式7所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-FK520)、下式8所示的9-脱氧-FK523(9-deoxo-FK523)、下式9所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523(9-deoxo-31-O-demethyl-FK523)、其异构体、或其药学上可接受的盐作为活性成分：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM(登录号：KCTC13581BP)作为生产菌株产生的。
3.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-36,37-二氢-FK506是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)作为生产菌株产生的。
4.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)作为生产菌株产生的。
5.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)作为生产菌株产生的。
6.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-FK520是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsD(登录号：KCTC13580BP)作为生产菌株产生的。
7.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述31-O-去甲基-FK520是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsB(登录号：KCTC13583BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbM,tcsD(登录号：KCTC13584BP)作为生产菌株产生的。
8.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-31-O-去甲基-FK520是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)或卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsD(登录号：KCTC13585BP)作为生产菌株产生的。
9.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-FK523是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD,tcsB(登录号：KCTC13579BP)作为生产菌株产生的。
10.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述9-脱氧-31-O-去甲基-FK523是通过培养卡那霉素链霉菌ΔfkbD-fkbM,tcsB(登录号：KCTC13582BP)作为生产菌株产生的。
11.一种缓解、预防或治疗脱毛发的方法，所述方法包括：
给除人以外的个体施用用于促进毛发生长的组合物，所述组合物包括选自下组的化合物：下式1所示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506、下式2所示的9-脱氧-36,37-二氢-FK506、下式3所示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式4所示的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式5所示的9-脱氧-FK520、下式6所示的31-O-去甲基-FK520、下式7所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、下式8所示的9-脱氧-FK523、下式9所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523、其异构体、或其药学上可接受的盐，作为活性成分：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
12.权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脱发包括瘢痕性脱发；或至少一种选自下组的非瘢痕性脱发：感染性脱发、创伤性脱发、炎性脱发、先天性脱发、内分泌性脱发、肿瘤性脱发、营养不良脱发、药物性脱发、毛发结构异常引起的脱发、雄性型脱发、雌性型脱发、和斑秃。
13.一种促进毛发生长的非处方组合物，其包括选自下组的化合物：下式1所示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506、下式2所示的9-脱氧-36,37-二氢-FK506、下式3所示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式4所示的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式5所示的9-脱氧-FK520、下式6所示的31-O-去甲基-FK520、下式7所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、下式8所示的9-脱氧-FK523、下式9所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523、其异构体、或其药学上可接受的盐作为活性成分：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
14.一种促进毛发生长的功能性食品组合物，其包括选自下组的化合物：下式1所示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506、下式2所示的9-脱氧-36,37-二氢-FK506、下式3所示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式4所示的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式5所示的9-脱氧-FK520、下式6所示的31-O-去甲基-FK520、下式7所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、下式8所示的9-脱氧-FK523、下式9所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523、其异构体、或其药学上可接受的盐作为活性成分：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
15.一种促进毛发生长的化妆品组合物，其包括选自下组的化合物：下式1所示的9-脱氧-31-O-去甲基-脯氨酰-FK506、下式2所示的9-脱氧-36,37-二氢-FK506、下式3所示的31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式4所示的9-脱氧-31-O-去甲基-36,37-二氢-FK506、下式5所示的9-脱氧-FK520、下式6所示的31-O-去甲基-FK520、下式7所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK520、下式8所示的9-脱氧-FK523、下式9所示的9-脱氧-31-O-去甲基-FK523、其异构体、或其药学上可接受的盐作为活性成分：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
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