KR102087710B1

KR102087710B1 - 회전형 세포배양 장치를 이용한 nk 세포 활성과 증식 향상의 배양 방법 및 이에 생산된 nk 배양액의 용도

Info

Publication number: KR102087710B1
Application number: KR1020190059769A
Authority: KR
Inventors: 정재준; 성수현; 서보승
Original assignee: 주식회사 아리바이오
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2020-03-11

Abstract

본 발명은 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 NK 세포 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 회전형 세포배양장치의 미세중력 배양에 따른 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법에서 혈청 (FBS)를 대체한 스피룰리나추출물을 사용하여 배양된 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

Description

회전형 세포배양 장치를 이용한 NK 세포 활성과 증식 향상의 배양 방법 및 이에 생산된 NK 배양액의 용도{Method for enhancing expansion and activation of NK cell using rotary cell culture system and their NK conditioned media}

본 발명은 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 NK 세포 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 회전형 세포배양장치의 미세중력 배양에 따른 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 상기 방법으로 배양된 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

종양을 제거하는 면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호작용을 통해 일어난다.

상기 NK 세포는 선천 면역을 담당하는 중요한 세포이다. 체내에는 총 약 1억 개의 NK 세포가 있으며 간이나 골수에서 성숙한다. NK 세포는 림프구의 일종으로 인체 내 골수, 비장, 말초혈액 및 제대혈에 분포하며, 말초 혈액의 경우 림프구의 약 10% 정도이다. NK 세포는 CD56및 CD16에 양성이며 CD3에는 음성으로 나타내는 것이 특징이다. NK 세포는 인터류킨-2(Interleukin-2;IL-2), 인터류킨-12 (Interleukin-12; IL-12) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotociXity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative)등이 향상된다.

특히, NK 세포는 인터페론 감마(IFN-γ), 인터페론 알파(IFN-α) 및 인터류킨-10(IL-10)을 분비하고, 세포 표면에 여러 수용체를 발현하는데 이들 수용체는 세포 흡착, 세포 살해능력의 활성화 또는 세포 살해능력의 억제 관여한다.

그러나 정상 상태에서 체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 비활성화 세포 (Inactivated NK cell)이지만, 실제로 치료용으로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에 정상혈액으로부터 NK 세포를 활성화 시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.

또한, NK 세포를 항암 면역 세포치료로 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 절실하다. 그러나 NK 세포는 혈액 내 림프구의 10 내지 15% 정도로 존재하며, 특히, 암환자에서는 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 1% 미만으로 존재해 사실상 충분한 세포 수의 확보가 힘든 실정이다.

또한, NK 세포를 배양하더라도 FBS를 첨가해야 NK세포가 증식,활성되기 때문에 NK 세포를 암 치료제로 이용하기 위해서는 충분한 효능을 유지할 수 있을 정도의 대량으로 이를 생산하는 기술이 필수적이나, NK 세포를 시험관 내에서 대량 증식 및 배양이 상당히 어려운 실정이다.

이에, 실제 유요한 수준으로 NK 세포를 증식, 활성 및 배양하는 기술의 개발에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나, 아직 임상에 적용 가능한 수준에 미치지 못하고 있다.

등록특허공보 제10-1683614호

본 발명의 목적은 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 NK 세포 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NK 세포 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NK 세포 배양액의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

본 발명은 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 NK 세포 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물세포 배양에 필수적인 FBS를 대체한 배양액을 회전형 세포배양장치의 미세중력 배양으로 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 상기 방법으로 배양된 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

회전형 세포배양장치(Rotary Cell Culture System; RCCS) 또는 미세중력 세포배양 시스템(Microgravity Cell Culture System; MCCS)은 미국의 NASA에서 처음 개발된 기술로서 세포를 배양하는 배양액이 담기 원통(vessel)이 회전하면서 중력을 미세하게 만들어 세포가 입체적으로 배양되어 유효성분이 많도록 하는 장치를 말한다.

지구상에서 대부분의 조직 배양은 평판 형태의 배양기에서 1차원적으로 이루어지고 있으며, 이는 생명체 내에서 3차원적으로 배양되는 것과 외형과 기능적인 측면에서 차이점이 존재한다.

중력에 의한 유기체의 유동과 침전효과는 전단력을 일으켜 합체되려는 세포들의 수를 억제하고, 각각의 세포를 분리하려는 특성을 가지고 있어, 전단력을 줄이고 3차원적으로 세포 및 조직들을 배양하기 위하여, 회전에 의해 중력효과를 감소시키는 회전형 세포배양장치를 사용하고 있다.

이런 회전형 세포배양장치는 세포와 조직에 작용하는 응력을 제어함으로써 효과적인 배양이 이루어지도록 하며, 인체조직에 대해 표본화할 수 있는 전형적인 세포 배양이 가능해졌으며, 미세중력장에서는 전단력이 최소화되어 더욱 크고 양질의 세포 조직 배양이 이루어진다.

그러므로 일반적인 세포뿐만 아니라 면역세포와 같은 부유 세포들의 일반적인 배양 환경에서 배양한 세포의 상태보다 미세중력 상태에서 월등하게 잘 성장하고 손상이 없을 뿐 아니라, 3차원 입체 배양을 갖기 때문에 기존 배양기와 달리 손상 없는 세포성장과 증식이 가능하다.

본 발명의 일 양태는 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법에 관한 것이다.

상기 단핵 세포(mononuclear cell)는 제대혈에서 확보된 CBMC(Cord blood mononuclear cell) 또는 말초혈액에서 확보된 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단핵 세포에는 백혈구, NK 등 다양한 면역세포들이 존재한다.

상기 배양 방법은 항체 제1용액에서 단핵 세포를 배양하는 제1 단계; 항체 제2용액을 첨가하는 제2 단계; 사이토카인 제1용액을 첨가하는 제3 단계; 항체 제2용액을 첨가하는 제4 단계; 사이토카인 제2용액을 첨가하는 제5 단계; 항체 제2용액을 첨가하는 제6 단계; 기본용액을 첨가하는 제7 단계; 및 회전형 세포배양장치에 단핵세포를 포함하는 기본용액을 넣어 배양하여 NK 세포 배양액을 수득하는 제8 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 기본용액은 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있다.

상기 항체 제1용액은 IL-2, L-글루타민, 항-CD16, 항-CD56 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민, 0.1 내지 15ug/mL의 항-CD16, 0.1 내지 15ug/mL의 항-CD56 및 세포배양용 배지 포함하는 것일 수 있다.

상기 항체 제2용액은 항체 제1용액 및 기본용액을 1:6 내지 1:10의 부피비 혼합한 것일 수 있다.

상기 사이토카인 제1용액은 IL-2, L-글루타민, IL-12, IL-18 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민, 0.5 내지 5 ng/mL의 IL-12, 2 내지 50 ng/mL IL-18 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있다.

상기 사이토카인 제2용액은 IL-15, IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10 내지 35ng/mL의 IL-15, 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 것일 수 있다.

상기 NK 세포 배양액의 NK 세포의 비율은 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37℃% 이상, 38% 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 25 내지 40%, 26 내지 40%, 27 내지 40%, 28 내지 40%, 29 내지 40%, 30 내지 40%, 31 내지 40%, 32 내지 40%, 33 내지 40%, 34 내지 40%, 35 내지 40%, 36 내지 40%, 37℃ 내지 40% 또는 38 내지 40%인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 NK 세포 배양액의 IFN-γ 농도는 8 ng/ml 이상, 9 ng/ml 이상, 예를 들어, 10 ng/ml 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 NK 세포 배양액에 포함된 전체 세포 수는 1.0 X 106개/ml 이상, 1.1 X 106개/ml 이상, 1.2 X 106개/ml 이상 또는 1.3 X 106개/ml, 예를 들어, 1.4 X 106개/ml인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제8 단계는 2.7 X 107/ml의 농도의 단핵 세포를 포함하는 기본용액을 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제8 단계는 RPM 15 내지 20 속도로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제8 단계는 7일간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 양태는 NK 세포 배양액을 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 피부 질환은 건선, 아토피성 피부염, 비(非)알러지성 피부염 또는 피부 건조증인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 NK 세포 배양액은 상기 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법에 의해 배양된 것일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 NK 세포 배양액의 약제학적 유효량을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 내지 1000 ug(마이크로그램), 0.001 내지 1000 ug, 0.01 내지 1000 ug, 0.1 내지 1000 ug, 또는 1.0 내지 1000 ug일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 NK 세포 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 화장품 조성물에 관한 것이다.

상기 피부상태 개선은 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제, 상처 재생, 여드름 개선, 피부 재생 또는 피부 미백인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물은 NK 세포 배양액의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부상태 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 NK 세포 배양액과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 NK 세포 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 식품은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등일 수 있다.

상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 NK 세포 배양액의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

상기 식품이 음료인 경우에는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 NK 세포 배양액을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등, 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 NK 세포 배양액의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.

본 발명은 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 NK 세포 배양액을 포함하는 화장품 조성물, 보다 상세하게는 회전형 세포배양장치의 미세중력 배양에 따른 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시킨 배양 방법 및 상기 방법으로 배양된 배양액을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 일반 Bag 배양에 비해 NK 세포의 활성 및 증식을 향상시켰으며, NK 세포의 대표적인 사이토카인 인터페론 감마 생산도 유의성 있게 향상되어, 화장품 조성물로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 1] 단핵세포층 분리 수득

제대혈에서 확보한 단핵 세포를 CBMC(Cord blood mononuclear cell)라하고, 말초혈액에서 확보한 단핵 세포를 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)라하며, 이 두 세포를 총칭하여 단핵 세포(mononuclear cell)이라 한다.

단핵 세포가 1.077보다 낮은 비중을 가지는 성질을 이용하여 1.077 비중의 Ficoll-Paque용액을 이용하여 원심 분리하여, 비중의 차이에 따라 1.077보다 비중이 큰 적혈구 등은 아래 침전되고, 1.077보다 비중이 낮은 단핵 세포들은 상층으로 분리되는 원리를 이용하여, 단핵세포층을 분리하였다.

구체적으로, 인천 제일여성병원으로부터 제공받은 100ml의 제대혈을 50ml 시린지(syringe)를 이용하여 거품이 나지 않도록 조심스럽게 혈액을 뽑은 후, PBS를 25ml씩 넣어둔 50ml conical 튜브(4개)에 25ml씩 넣어서 희석하였다. 그 다음, 5ml 파이펫(pipet)을 이용하여 50ml 코니칼 튜브 또는 SepMate 튜브(STEMCELL Technologies Inc.)(단핵구 세포들 분리전용 튜브) 홀에 밀착시켜 피콜(ficoll)을 15ml씩 넣어주었다. 그 다음, 제대혈을 50ml 코니칼 튜브 또는 SepMate 튜브에 조심스럽게 넣어주고 8개의 튜브의 볼륨을 맞춰준 후, 1200 X g에서 15분간 원심분리하였다. 그 다음, 새로운 50ml 튜브에 상층액을 하층액(붉은색의 적혈구)이 들어가지 않도록 주의하면서 회수하였다. 상층액 회수가 끝나면 PBS를 넣어 전체 양(total volume)이 50ml이 되도록 채워주었다. 300 X g에서 10분간 원심분리한 후 펠릿이 들어가지 않도록 주의하면서 상층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 8개의 튜브의 펠릿을 하나의 튜브에 회수한 후 세포 수를 측정(cell counting)하고, 300 X g에서 10분간 원심분리하였다. 2X10^7cells/ml이 되도록 동결보존액(freezing solution)을 넣고 파이펫팅한 후 동결튜브에 각각 1ml씩 분주하였다. 초저온 냉동고(Deep freezer)에서 하룻밤(overnight) 후 LN2 탱크(-197℃)에 옮겨 보관하였다.

[ 제조예 2] 배지 제조

세포배양용 배지는 KBM 배지(Kohjin-bio), ALyS 배지(Cell Science & Technology Institute, Inc.), X-Vivo 배지(론자), IMDM, MEM, DMEM, RPMI-1640 등 일반적으로 사용되는 세포 배양용 배지를 사용하였다.

기본용액은 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민 및 세포배양용 배지 포함하도록 제조하였다.

항체 제1용액은 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민, 0.1 내지 15ug/mL의 항-CD16, 0.1 내지 15ug/mL의 항-CD56 및 세포배양용 배지 포함하도록 제조하였다.

항체 제2용액은 항체 제1용액 및 기본용액을 1:6 내지 1:10의 부피비 혼합하여 제조하였다.

사이토카인 제1용액은 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민, 0.5 내지 5 ng/mL의 IL-12, 2 내지 50 ng/mL IL-18 및 세포배양용 배지 포함하도록 제조하였다.

사이토카인 제2용액은 10 내지 35ng/mL의 IL-15, 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민 및 세포배양용 배지 포함하도록 제조하였다.

항체-사이토카인혼합용액은 1 내지 12 ug/mL의 항-CD3, 3600 IU/mL의 IL-2, 5uM/mL의 L-글루타민, 0.5 내지 5 ng/mL의 IL-12, 2 내지 50 ng/mL IL-18 및 세포배양용 배지 포함하도록 제조하였다.

[ 제조예 3] 스피룰리나 추출액 제조

스피룰리나 추출액은 스피룰리나분말 100g에 정제수 1,000ml를 넣고 초음파추출기를 이용하여 120kHz 조건으로 40~60℃에서 30분 단위로 12시간 추출하였다. 초음파 추출물을 얻은 후, 여과한 다음 감압여과하고 농축하여 스피룰리나 추출액을 확보하였다.

[ 비교예 1] FBS 미첨가후 , 회전형 세포배양장치(미세중력 세포 배양시스템) 배양

0일 차에서는 제조예에서 수득한 단핵 세포(Cord blood mononuclear cell)를 항체 제1용액 3.5ml을 이용하여 풀어 세포현탁액과 불활성 혈청(inactivation serum) 0.5ml을 T25 배양 접시(culture flask)에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

1일 차에는 배양중인 T25 배양 접시(culture flask)에 항체 제2용액 1ml을 추가하고 가볍게 흔들어 준 후 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

2일 차에서는 배양중인 T25 배양 접시(culture flask)를 세포들이 잘 자라도록 부드럽게 흔들어 준 후 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

3일 차에는 사이토카인 제1용액 4.5ml과 혈청(serum) 0.25ml을 T25 배양 접시(culture flask)에 추가하고 37℃, 5% CO2 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

4일 차에서는 배양중인 T25 배양 접시(culture flask)의 세포를 T75 배양 접시(culture flask)로 옮긴 후, 항체 제2용액 9ml를 추가하고 0일 차에 사용하고 남은 불활성 혈청(inactivation serum) 전량과 혈청(serum) 0.5ml을 추가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

5일 차에서는 배양 중인 T75 배양 접시(culture flask)에 사이토카인 제2용액을 9ml 첨가하고 혈청(serum) 0.5ml을 추가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

6일 차에서는 배양 중인 T75 배양 접시(culture flask)세포를 T175 배양접시 (culture flask)로 옮긴 후 항체 제2용액을 27ml 추가하고 혈청(serum) 1.5ml을 추가하여 37℃, 5% CO2 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

7일 차에서는 배양 중인 세포를 모아서 원심분리하여 배양액을 제거하고 생리식염수(PBS)로 세포를 3번 반복 세척한 후, T175 배양 접시(culture flask)에 옮긴 후 기본용액 36ml에 혈청(serum) 2ml 추가(혈청 세포배양)하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

8일 차에서는 500ml 회전형 세포배양장치(미세중력 배양시스템)에 기본용액 460ml에 혈청(serum) 25ml, 세포 2.7 X 10⁷/ml을 넣어 RPM 15 내지 20 속도로 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 7일간 배양하였다.

15일 차에서는 배양 중인 회전형 세포배양장치(미세중력 세포배양시스템)의 배양액을 수거한 후, 원심분리기로 400Xg에서 5분간 원심분리 통해 NK 세포와 배양액을 분리하였다.

[ 비교예 2] FBS 첨가후 , 회전형 세포배양장치(미세중력 세포 배양시스템)배양

8일 차에서는 500ml 회전형 세포배양장치(미세중력 배양시스템)에 기본용액 460ml에 혈청(serum) 25ml 세포 2.7 X 10⁷/ml을 넣어 RPM 15 내지 20 속도로 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 7일간 배양하였다.

30% 스피룰리나 추출액: 70% FBS 첨가후 , 회전형 세포배양장치(미세중력 세포 배양시스템) 배양

3일 차에는 사이토카인 제1용액 4.5ml과 스피룰리나추출물 0.075ml 혈청(serum) 0.175ml을 T25 배양 접시(culture flask)에 추가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

4일 차에서는 배양중인 T25 배양 접시(culture flask)의 세포를 T75 배양 접시(culture flask)로 옮긴 후, 항체 제2용액 9ml를 추가하고 0일 차에 사용하고 남은 불활성 혈청(inactivation serum) 전량과 스피룰리나추출물 0.15ml 혈청(serum) 0.35ml를 추가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

5일 차에서는 배양 중인 T75 배양 접시(culture flask)에 사이토카인 제2용액을 9ml 첨가하고 스피룰리나추출물 0.15ml 혈청(serum) 0.35ml를 추가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

6일 차에서는 배양 중인 T75 배양 접시(culture flask)세포를 T175 배양접시 (culture flask)로 옮긴 후 항체 제2용액을 27ml 추가하고 스피룰리나추출물 0.45ml 혈청(serum) 1.05ml를 추가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

7일 차에서는 배양 중인 세포를 모아서 원심분리하여 배양액을 제거하고 생리식염수(PBS)로 세포를 3번 반복 세척한 후, T175 배양 접시(culture flask)에 옮긴 후 기본용액 36ml에 스피룰리나추출물 0.6ml 혈청(serum) 1.4ml를 추가(혈청 세포배양)하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

8일 차에서는 500ml 회전형 세포배양장치(미세중력 배양시스템)에 기본용액 460ml에 스피룰리나추출물 7.5ml 혈청(serum) 17.5ml와 세포 2.7 X 10⁷/ml을 넣어 RPM 15 내지 20 속도로 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 7일간 배양하였다.

70% 스피룰리나 추출액: 30% FBS 첨가후 , 회전형 세포배양장치(미세중력 세포 배양시스템) 배양

3일 차에는 사이토카인 제1용액 4.5ml과 스피룰리나추출물 0.175ml 혈청(serum) 0.075ml을 T25 배양 접시(culture flask)에 추가하고 37℃, 5% CO2 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

4일 차에서는 배양중인 T25 배양 접시(culture flask)의 세포를 T75 배양 접시(culture flask)로 옮긴 후, 항체 제2용액 9ml를 추가하고 0일 차에 사용하고 남은 불활성 혈청(inactivation serum) 전량과 스피룰리나추출물 0.35ml 혈청(serum) 0.15ml를 추가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

5일 차에서는 배양 중인 T75 배양 접시(culture flask)에 사이토카인 제2용액을 9ml 첨가하고 스피룰리나추출물 0.35ml 혈청(serum) 0.15ml를 추가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

6일 차에서는 배양 중인 T75 배양 접시(culture flask)세포를 T175 배양접시 (culture flask)로 옮긴 후 항체 제2용액을 27ml 추가하고 스피룰리나추출물 1.05ml 혈청(serum) 0.45ml를 추가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

7일 차에서는 배양 중인 세포를 모아서 원심분리하여 배양액을 제거하고 생리식염수(PBS)로 세포를 3번 반복 세척한 후, T175 배양 접시(culture flask)에 옮긴 후 기본용액 36ml에 스피룰리나추출물 1.4ml 혈청(serum) 0.6ml를 추가(혈청 세포배양)하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 배양하였다.

8일 차에서는 500ml 회전형 세포배양장치(미세중력 배양시스템)에 기본용액 460ml에 스피룰리나추출물 17.5ml 혈청(serum) 7.5ml와 세포 2.7 X 10⁷/ml을 넣어 RPM 15 내지 20 속도로 37℃, 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 7일간 배양하였다.

[ 실험예 1] 세포 전체 수 비교

배양한 세포를 튜브에 회수한 후 10ul를 이피 튜브(EP 튜브)에 옮겼다. 트립판 블루(Trypan Blue)를 10ul 염색한 후, 해마토사이토메터(hemocytometer)에 10ul 주입하였다. 현미경(OLYMPUS-CKX41, Hemocytometer: MARIENFELD-0640030)에 올린 뒤 배율을 맞추어 밝기를 조절한 후, 4칸의 세포 수를 측정하였다. 세포 수 측정이 끝나면 하기 계산식에 대입하여 세포 전체 수 (total cell number)를 확인하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[계산식]

전체 세포 수 = 측정 세포 수 X 희석배수 X 10^4 X 세포 원액 볼륨

	세포수
비교예1	3.60 X 10^5 ± 0.25
비교예2	1.40 X 10^6 ± 0.22
실시예1	1.38 X 10^6 ± 0.32
실시예2	0.71 X 10^6 ± 0.25

표 1에서 확인할 수 있듯이, 비교예1의 FBS를 첨가하지 않은 배지에서 배양한 세포 수는 3.60 X 10⁵/ml인 반면, 비교예2의 세포 수는 1.40 X 10⁶개/ml로 나타났다. FBS를 대체한 실험결과인 실시예 1과 실시예 2에서는 실시예 1과 같이 30%의 FBS를 스피룰리나추출물로 대체한 배지에서 비교예 2와 유사한 세포수의 증가를 보였고, 70% 스피룰리나추출물을 첨가한 실시예 2에서는 비교예 2에 비하여 50%정도 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 유의성 있는 세포 수의 증가는 회전형 세포배양장치에 의한 미세중력 상태에서 NK 세포배양시 30%의 FBS를 스피룰리나로 대체했을시 100% FBS와 유사한 세포의 증식 및 활성이 나타나고 스피룰리나추출물 농도가 증가하면 세포의 증가가 둔화되는 것을 확인하였다.

[ 실험예 2] NK 세포의 마커(marker)인 CD3 -/ CD56 +의 발현 측정

제대혈에서 분리 획득한 CBMC 및 배양한 전체 세포 수에서는 NK 세포뿐만 아니라 T 세포, B 세포, 대식세포 등 다양한 세포들이 포함되어 있어, NK 세포 증식을 확인하기에 부족하기 때문에, 좀더 정확한 NK 세포의 증식 및 활성을 확인하기 위해 NK 세포의 마커인 CD3-/CD56+ 발현을 FACS로 확인하였다.

구체적으로, 3개 군(CBMC, 혈청이 첨가된 NK 배양액을 이용한 Bag 배양, 혈청이 첨가된 NK 배양액을 이용한 미세중력(무중력)배양)에서 각 시료(2 X 10^7cells/ml)을 1000Xg에서 5분간 원심분리하였다. 그 다음, PBS 1ml로 펠릿을 잘 풀어준 뒤, 시료 당 EP 튜브 4개(control, CD3+, CD56+ 및 CD3+CD56+)에 250ul씩 나누어 담았다. 대조군(control)을 제외한 나머지 3개의 튜브(CD3+, CD56+ 및 CD3+CD56+)에 각각 항체(Ab)를 (5ul/1 X 10^6 cell)농도로 25ul씩 넣어주었다. 항체를 넣고 반응시키는 과정부터는 빛을 차단하였다.

그 다음, 상온에서 40분간 반응시키면서 잘 흔들어주었다. 1000Xg에서 5분간 원심분리 한 후, 파이펫으로 상층액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세척하였다. 다시 반복하여 1000Xg에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 PBS를 500ul씩 넣어 잘 섞어주었다. 5 X 10^6/500ul 농도의 세포가 들어있는 각 튜브를 얼음이 담긴 스티로폼 박스에 넣어 보관한 후, FACS 기기를 이용하여 FACS 분석하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

	CD3-CD56+ (%)	CD3-CD56- (%)	CD3+CD56+ (%)	CD3+CD56- (%)
CBMC (Cord blood mononuclear cell)	1.97±0.81	11.27±2.48	24.73±1.79	62.03±3.46
비교예1	13.3±1.17	11.1±3.1	22.6±3.41	31.6±2.03
비교예2	48.3±3.18	10.1±1.1	25±2.51	34.6±2.59
실시예1	48.7±2.68	13.1±4.1	25.7±3.51	34.8±2.39
실시예2	21.13±0.55	16.97±2.25	25.53±4.37	39.37±4.23

표 2에서 확인할 수 있듯이, 제대혈액에서 확보한 단핵 세포들(Cord blood mononuclear cells; CBMC)에서는 NK 세포의 비율이 1.97±0.81%이고, FBS 미처리한 비교예 1에서는 13.3±1.17%였으나, 100% FBS가 들어간 비교예 2에서는 48.3±3.18%로 매우 유의성 있게 증가하였고, 30% 스피룰리나추출물과 70% FBS를 처리한 실시예 1에서는 48.7±2.68%로 비교예 2와 동등 이상의 NK cell의 증가를 나타내었고, 70% 스피룰리나와 30% FBS를 첨가한 실시예 2에서는 21.13±0.55%로 비교예 1 보다는 높지만, 30% 스피룰리나 추출물보다는 낮게 나타내었다.

[ 실험예 3] 인터페론 감마( IFN -γ) 측정

인터페론 감마 항체(IFN-γ Antibody)와 코팅 버퍼(coating buffer)를 1:250으로 희석하여 96웰 배양 접시(96well plate)에 100ul씩 넣어주었다. 인터페론 감마 항체가 잘 코팅되도록 배양 접시를 막아주고 4°C에서 오버나이트(overnight)하였다. 세척버퍼(Wash buffer)와 증류수(DW)를 희석한다. 코팅 버퍼(Coating buffer)를 털어낸 후, 각 웰에 세척 버퍼(Wash buffer)를 300ul씩 넣어 3회 세척 후, 킴 타올 위에 잘 털어주었다. 그 다음, 각 웰에 Assay diluent를 200ul씩 넣은 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 스탠다드(Standard)와 NK세포 배양액(NKCM)을 assay diluent와 1:250으로 희석하였다. 반응이 끝나면 킴 타올 위에 잘 털어준 뒤 각 웰에 세척 버퍼를 300ul씩 넣어 3회 세척하였다. 그 다음, 킴 타올 위에 잘 털어준 뒤, 각 웰에 스탠다드와 시료를 100ul씩 넣어주고 실온에서 2시간 반응시켰다. 킴 타올 위에 잘 털어준 뒤 세척 버퍼를 300ul씩 넣어 5회 세척하였다. 각 웰에 Working Detector (Detection+SAv-HRP reagent, 1:250)를 100ul씩 넣어주고 실온에서 1시간 반응시켰다. 잘 털어내고 세척 버퍼를 300ul씩 넣어 세척하고, 이를 7회 반복하였다. Substrate solution을 100ul씩 넣어주고 빛 차단 후 실온에서 30분간 반응시켰다. Stop solution을 50ul씩 넣어주었다. 450nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과는 표 3에 나타냈다.

	IFN-γ (ng/ml)
비교예1	3.77±0.77
비교예2	10.67±0.4
실시예1	10.36±0.2
실시예2	6.77±0.23

표 3에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1에서는 IFN-γ는 3.0 내지 4.54 ng/ml로 평균 3.77±0.77 ng/ml이 생산되었고, 비교예 2예에서는 10.27 내지 11.07 ng/ml로 평균 10.67±0.4 ng/ml가 생산량과 비교하여 실시예 1예에서는 10.16 내지 10.56 ng/ml로 평균 10.36±0.2 ng/ml의 생산량으로 비교예 2와 비교하여 매우 유의성 있게 높은 증가를 확인하였다.

그러므로 NK 세포의 대표적인 사이토카인으로 알려진 IFN-γ 생산은 100% FBS를 처리한 군인 비교예 2와 30% 스피룰리나추출물과 70% FBS를 첨가한 군에서 유사한 결과가 나옴에 따라 FBS를 30%정도 스피룰리나로 대체할 수 있음을 나타낸다.

[ 실험예 4] 항산화 효능평가

슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SuperoXide dismutase; SOD)는 항산화 효소 중에서 활성산소를 제거하는 능력이 가장 큰 효소라고 알려져 있는데, 1초에 10만개에 달하는 활성산소를 제거한다. 이런 항산화 효소인 SOD는 인체 질병의 90% 이상의 원인 활성산소를 제거 억제하며 피부 노화 억제 효과 우수하다. 이러한 SOD의 효능은 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유사 활성(SOD-like activity) 측정을 통하여 확인할 수 있다.

구체적으로, SOD-like 활성 측정 방법은 다음과 같다. 96웰 배양 접시의 웰(well)에 50mM Tris-HCl 버퍼 150ul를 넣은 후, 비교예 NKCM과 실시예 NKCM을 각각 20mg/ml 농도로 10ul씩 넣었다. 그, 다음, 50mM 피로갈롤(Pyrogallol) 10ul를 넣은 후, 25℃에서 10분간 반응시켰다. 그 다음, 1N HCl 50ul을 넣은 후, 420nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 표 5에 나타내었다. 양성대조군(positive control)로 엘 아크로빅산(L-Ascorbic acid)을 6.25mg/ml농도로 10ul 처리하였다.

Control (%)	L-Ascorbic acid (6.25mg/ml) (%)	비교예2 NKCM (20mg/ml) (%)	실시예1 NKCM (20mg/ml) (%)
0	77.1±3.26	67±3.46	63±6.08

표 5에서 확인할 수 있듯이, 비교예 2 (100% FBS 첨가)에 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유사 활성(SOD-like activity)을 측정 확인한 결과는 평균 67%±3.46이며, 실시예1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가)에 처리 결과는 평균 63%±6.03 으로 유사함을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 5] 미백 효능평가

5-1. L- Tyrosinase 활성 억제

타이로시나제(Tyrosinase)는 멜라닌 합성에 있어 중요하게 작용하는 효소로기질인 타이로신(tyrosine)이 산화되는 과정을 촉매하는데, 이 과정에서 멜라닌 흡광도를 측정함으로써 시료의 타이로시나제(tyrosinase)의 활성 억제능을 검토하는 방법으로 미백 효능을 평가하였다.

구체적으로, 96웰 배양 접시(96 well plate)의 각 웰에 버섯형 타이로시나제(Mushroom Tyrosinase, 420 U/ml) 100ul를 첨가하였다. 버섯형 타이로시나제가 첨가된 각 웰(well)에 비교예 NK 배양액(NKCM)과 실시예 NK 배양액(NKCM)을 각각 20mg/ml의 농도로 100ul 넣은 후 37℃℃에서 10분간 반응시켰다. 각 웰에 엘 티로신(L-Tyrosine) 용액을 100ul씩 넣고 37℃℃에서 10분간 반응시켰다. 475nm에서 흡광도 값을 측정하여, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

알부틴(Arbutin)을 양성대조군(Positive control)으로써 2.5mg/ml 농도로 100ul 처리하였다.

Control, (%)	Arbutine (2.5mg/ml), (%)	비교예2 NKCM (20mg/ml), (%)	실시예1 NKCM (20mg/ml), (%)
0	46.3±3.25	43.2±1.01	42.9±1.7

표 6에서 확인할 수 있듯이, 비교예 2 (100% FBS 첨가) NKCM의 평균은 43%±1.01 이며, 실시예 1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가) NKCM의 평균은 42.9%±1.7임을 확인하였다. 이 결과들은 대조군(Control)의 0%에 비교하면 유의성 있게 매우 높았으며, 특히, 실시예 1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가) NKCM은 비교예 2 (100% FBS 첨가) NKCM 과 유사한 효능을 나타내었다.

5-2. L- dihydroXy phenylalamin (L- DOPA ) 억제

타이로신(tyrosine)이 4-디하이드로시페닐라라닌 (4-dihydroxyphenylalanine; DOPA)으로 산화되는 과정을 타이로시나제(Tyrosinase)가 촉매하는데, 이 과정을 멜라닌 흡광도로 측정함으로써, 시료의 산화된 L-DOPA의 활성 억제능을 검토하는 방법으로 미백 효능을 평가한다.

구체적으로, 96웰 배양접시(96 well plate)의 각 웰에 버섯형 타이로시나제(Mushroom Tyrosinase, 420 U/ml) 100ul를 첨가하였다. 그 다음, 버섯형 타이로시나제가 첨가된 각 웰에 비교예와 같이 배양한 NK 배양액(NKCM)과 실시예와 같이 배양한 NK배양액 (NKCM)을 각각 20mg/ml의 농도로 100ul 넣은 후, 37℃℃에서 10분간 반응시켰다. 그 다음, 각 웰에 엘-도파(L-DOPA)용액을 100ul씩 넣고 37℃℃에서 10분간 반응시켰다. 475nm에서 흡광도 값을 측정하여, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

코직산(Kojic acid)을 양성대조군(Positive control)으로서 0.3mg/ml농도로 100ul 처리하였다.

Control (%)	Kojic acid (0.3mg/ml) (%)	비교예2 NKCM (20mg/ml) (%)	실시예1 NKCM (20mg/ml) (%)
0	31.5±3.46	25.4 ±0.99	24.9 ±1.45

표 7에서 확인할 수 있듯이, L-DOPA 억제(L-DOPA inhibition)은 비교예 2 (100% FBS 첨가) NKCM에서 평균 25.4%±0.99 이며, 실시예1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가) NKCM에서는 평균 24.9%±1.45 임을 확인하였다. 실시예 1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가) NKCM은 비교예 2 (100% FBS 첨가) NKCM 과 유사한 효능을 나타내었다.

[ 실험예 6] 주름개선 효능평가 (엘라스타아제 활성 억제)

주름생성은 진피조직 속의 콜라겐(Collagen)과 엘라스틴(Elastin)이 그물망 구조를 형성하면서 피부의 탄력성을 유지시켜 주는데 노화, 자외선 등의 내외적 요인들로 인하여 피부의 탄력이 감소하고 과다 발현된 엘라스타아제(Elastase)에 의해서 엘라스틴(Elastin)의 그물망 구조가 깨지게 되면서 생성된다. 따라서, 주름개선 효능은 엘라스타아제(Elastase)의 활성 억제를 측정함으로써 확인한다.

구체적으로, 0.12M Tris-HCl 버퍼, pH8.0 100ul를 각각 웰에 넣었다. 웰에 엘라스테이스(elastase, 2.5U/ml) 10ul를 첨가하였다. 시료 20ul를 각 웰에 첨가하고 25℃에서 10분간 반응시켰다. 1.0mM N-숙시닐-(Ala)3-p-니트로아닐라이드 100ul 을 각 웰에 넣고 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 파장 410nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

양성대조군(Positive control)로 MeOSu-AAPV-CMK (0.3mg/ml)농도로 처리하였다.

Control (%)	MeOSu-AAPV-CMK (0.3mg/ml) (%)	비교예2 NKCM (20mg/ml) (%)	실시예1 NKCM (20mg/ml) (%)
0	90.1±3.56	79.6 ±3.37	81.0±1.70

표 8에서 확인할 수 있듯이, 엘라스타아제 억제(Elastase inhibition)은 비교예 2 (100% FBS 첨가) NKCM는 평균 79.6 ±3.37 (%)이고, 실시예 1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가) NKCM은 평균 81.0±1.70 (%)임을 확인하였다. 실시예 1 (30% 스피룰리나추출물:70% FBS 첨가) NKCM은 비교예 2 (100% FBS 첨가) NKCM 과 유사한 효능을 나타내었다.

한편, 본 발명의 상세한 설명 및 첨부도면에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않고 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들을 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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NK 세포를 포함하며 엘라스타아제 활성을 억제하는 NK 세포 배양액을 함유하는 주름개선용 화장품 조성물에 있어서,
상기 NK 세포를 포함하는 NK 세포 배양액 제조방법은,
IL-2, 항-CD16 및 항-CD56을 포함한 항체 제1용액에서 단핵 세포(Cord blood mononuclear cell)를 배양하는 제1단계와;
상기 제1단계가 수행된 배지에 상기 항체 제1용액과 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액을 혼합한 항체 제2용액을 첨가하는 제2단계와;
상기 제2단계가 수행된 배지에 IL-2과, IL-12 및 IL-18을 포함한 사이토카인 제1용액과, 스피룰리나추출물과, FBS를 첨가하는 제3단계와;
상기 제3단계가 수행된 배지에 상기 항체 제2용액과, 스피룰리나추출물과, FBS를 첨가하는 제4단계와;
상기 제4단계가 수행된 배지에 IL-15, IL-2를 포함한 사이토카인 제2용액과, 스피룰리나추출물과, FBS를 첨가하는 제5단계와;
상기 제5단계가 수행된 배지에 항-CD3, IL-2, IL-12 및 IL-18을 포함한 항체 제2용액과, 스피룰리나추출물과, FBS를 첨가하는 제6단계와;
상기 제6단계가 수행된 배지에서 분리한 단핵 세포를 기본용액과, 스피룰리나추출물과, FBS를 포함한 배지에서 배양하는 제7단계와;
회전형 세포배양장치에 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액과, 상기 제7단계에서 배양한 단핵 세포와, 스피룰리나추출물과, FBS를 넣고 배양하여 NK 세포를 포함하는 NK 세포 배양액을 수득하는 제8단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장품 조성물.