KR20160057196A - Pachymic acid를 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백복령으로부터 분리한 Pachymic acid를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항염 효과를 통해 멜라닌 합성 억제가 뛰어난 미백 물질을 함유하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

Pachymic acid를 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물{the composition of whitening cosmetic formula containing Pachymic acid}

본 발명은 피부 미백 효과가 우수한 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Pachymic acid를 함유하는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 대기 오염에 의한 공기 및 자외선 등 각종 유해성 물질에 노출되어 여러 가지 피부 문제를 일으킬 수 있다. 그 중 기미, 주근깨, 잡티등은 가장 큰 피부 문제 중의 하나로 이를 개선하기 위한 많은 노력이 기울어져 왔다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 관련 요인들이 중요하다. 특히, 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 색소이다. 피부의 색소침착은 자외선이나 염증 등의 자극에 의해 야기되며 또 유전적 요인이나 호르몬, 식품 등과 화학물질 등의 인자에 의해서도 발생된다고 알려져 있다. 특히 기미, 주근깨, 색소침착 등과 같은 피부색소 이상침착 증상에 프로스타글란딘 (prostaglandins), 히스타민(histamine), 알파-MSH(alpha-MSH), NO(Nitric oxide) 같은 염증 관련 인자가 관여되어 멜라노사이트(melanocyte)내에서 멜라닌 생성을 활성화 시킨다는 것은 잘 알려져 있다. (Biofactors 2009;35:193-199.) 또한 조직의 손상과 재생과정에서도 면역학적 매개체에 의해 과색소 침착이 수반된다는 보고도 있다. (J Invest Dermatol 1958;29:197-209)

멜라닌 색소 합성을 구체적으로 살펴보면 멜라닌 세포(melanocytes)가 여러 요인에 의해 자극을 받으면 티로시나제(tyrosinase)가 멜라노좀(melanosome)에서 멜라닌을 생성한다. 즉, 멜라닌 세포 내 티로신은 티로시나제의 작용으로 도파(dopa)로 변하고, 이어 도파옥시다제 (dopaoxidase)의 작용으로 도파퀴논(dopa-quinone)으로 변한 후, 티로시나제 관련단백질-1(tyrosinase-related protein-1, 이하 TRP-1이라고 명기)과 티로시나제 관련단백질-2(tyrosinase-related protein-2, 이하 TRP-2이라고 명기)의 작용에 의하여 멜라닌을 생성한다.

이러한 일련의 반응에서 티로시나제는 멜라닌 색소 형성 과정의 속도-제한 반응을 활성화 시키므로, 멜라닌 형성은 티로시나제의 활성 및 발현에 의하여 1차적으로 제어된다. 또한, DOPA크롬 상호변이효소로 알려진 TRP-2는 DOPA 크롬의 5,6-디하이드록시인돌-2-카르복실산(DHICA)로의 반응을 활성화시키고, TRP-1는 DHICA를 카르복실 인돌-퀴논으로 산화시킨다. 결과적으로 TRP-1 및 TRP-2는 불용성 색소인 멜라닌 형성에 최종단계인 중합반응에 관여한다.

이들 티로시나제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase-related protein-1), TRP-2(tyrosinase-related protein-2)는 염증 매개물질에 의해 활성이 증가되어 멜라닌의 합성이 증가된다는 보고가 있다 (한영숙, 항염증성 천연추출물의 멜라닌 생성에 미치는 영향, 아주대 박사학위논문, 2002).

즉, 염증이 발생하게 되면 피부에 존재하는 세포인 림프구(lymphocyte), 대식세포 (macrophage), 내피세포(endothelial cell), 섬유아세포(fibroblast)등 염증반응에 관여하는 세포들로부터 i-NOS의 발현이 증가하여 NO생성을 촉진, 염증반응을 촉진시킴과 동시에 색소침착을 유도한다.

현재까지의 미백제는 주로 멜라닌 생합성에서 없어서는 안될 기본적이면서도 1차 타겟 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하는 것을 통해 멜라닌 생성량을 줄이는 물질이 개발되어 왔다. 이렇게 개발된 미백제로는 코지산, 알부틴, 글루타치온, 비타민 C 등이 있지만 소비자들이 만족할 만한 미백효과를 갖지 못하고 있으며 피부 안전성 때문에 그 사용량에 제한적이다. 따라서 멜라닌 합성단계별로 다양한 시도가 이루어져 왔다.

그 외 효과가 있다고 민간에서 널리 알려진 천연 추출물은 활성성분이 미량 함유되어 있으며 산지나 수확시기에 따라 함량 변화가 심해 품질의 균질성을 갖기가 어려운 실정이다. 또한 각종의 화합물이 함께 추출됨으로 인해 피부 부작용 및 색상등에서의 단점을 지니고 있다. 이러한 점을 극복하기 위해 정제가 필요하나 소요되는 비용이 높아 실제 대량 생산으로 응용되지 못하는 문제점을 갖고 있다. 예를 들면 미백효능이 알려진 감초추출물과 상백피추출물 등은 산지에 따라 그 효능의 차이가 극히 심하여 제품의 균질성을 유지하기 어려운 실정이다.(참조: Fragrance. J., 6, 59(1990))

최근 항염 효과를 갖는 일부 천연물에 대한 연구가 이루어져 과도한 멜라닌 색소 침착을 경감시켜주기 위해 화장료나 의약품에 배합 사용되고 있으나, 이들은 불충분한 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한적이다.

따라서, 피부 부작용을 유발하지 않으면서 피부 미백효과를 갖는 원료에 대한 연구가 활발히 진행되었고, 본 발명자는 종래부터 생약 등으로 사용되어 오던 여러 가지 천연물을 대상으로 종래의 물질들이 갖는 문제점을 극복하고 효능이 월등한 미백제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 백복령으로부터 제조한 Pachymic acid가 매우 우수하게 멜라닌 합성량을 감소시키는 물질임을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

동시에 본 발명은 기존의 천연물을 단순 추출한 추출액을 사용한 것이 아니라, 미백효과를 증강시키기 위해 Pachymic acid를 고 함량화 시키는 제조법을 개발하였다.

Pachymic acid

본 발명자들은 멜라닌 세포에 Pachymic acid를 처리, 멜라닌세포 내 멜라닌색소 형성 과정에 미치는 영향을 살펴본 결과, 세포 내 멜라닌 합성에 관여하는 티로시나제의 효소활성이 유의적으로 감소되었고, 세포 내 멜라닌 색소의 함유량도 유의적으로 감소하였다. 또한 멜라닌 색소형성에 관여하는 단백질의 유전자 및 단백질 발현 량을 실험한 결과 티로시나제 및 TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 유전자 및 단백질 발현이 억제되는 것을 발견하였다. 이러한 결과로 보아 Pachymic acid가 피부세포에서 멜라닌 합성을 감소시킨다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

또한 본 발명자들 천연물 사용시의 제한요소인 활성성분의 미량함유 및 비 균질성을 개선하고 안전성 및 효능을 극대화하기 위하여 고함량 Pachymic acid 제조법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다. 즉 Pachymic acid 배당체로부터 효소를 이용하여 Pachymic acid를 분리 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 식물, 특히 백복령에 다량 함유되어 있는 Pachymic acid 배당체(glycosides)로부터 Pachymic acid를 고함량화하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Pachymic acid는 백복령으로부터 추출한 Pachymic acid 배당체 혼합액에 당분해 효소를 첨가 후, 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 당분해 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제 (arabinosidase), 셀룰라제 (cellulase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase) 및 아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 한다.

따라서 본 발명은 미백효과가 우수한 백복령의 Pachymic acid를고함량화한 것을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 백복령의 Pachymic acid 를 유효성분으로 하는 미백 화장료 조성물은 제형내에서의 불안정성을 개선시키고 뛰어난 멜라닌 생성 억제 효과를 가지는 미백 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Pachymic acid의 미백효능을 발견하고 이를 고함량화하여 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 멜라닌 색소형성에 관여하는 티로시나제 및 TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 유전자 및 단백질 발현을 억제시켜 피부 미백효능을 발휘하는 것과 백복령의 Pachymic acid를 고함량으로 제조 하는 것을 특징으로 한다. 이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

보다 상세하게는, 상기 Pachymic acid는 백복령으로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 Pachymic acid 배당체를 함유하는 추출물을 수득하는 1 단계 및 상기 추출물을 효소 가수분해하여 Pachymic acid를 분리하는 2 단계로 제조하는 것을 특징으로 한다.

상기 제 1 단계에서, 상기 식물 추출물은 백복령으로부터 유래된 것이다. 또한, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매, 바람직하게는 70 % 에탄올을 사용할 수 있다. 상기 효소는 당 결합을 분해하는 효소를 사용하며, 상기 효소는 Pachymic acid 배당체에서 당 부분을 제거하여 Pachymic acid을 분리하는 것임을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 셀룰라제(cellulase), 글루쿠로니다제 (glucuronidase), 펙티나제(pectinase) 및 아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 Pachymic acid는 총 중량에 대하여 0.0001-10.0 중량을 함유하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

백복령(Poria cocos)은 구멍장이버섯과에 속하는 버섯과의 일종으로 소나무 땅속뿌리에 자생하며 예로부터 진정, 이뇨, 강장 등의 목적으로 사용되어 왔으며 항암활성, 항염증 활성 등이 보고되어 있다. 동의보감에 의하면 백복령의 맛은 달고 심심하며 성질이 평(平)하여 보(補)하는 작용이 있다고 한다. 복령의 성분과 효능에 관한 연구로는 복령자실체중 트리터페노이드 (triterpenoid) 성분의 차이에 의한 연구(Kanematsu, A. and Natori, S. Chem. Pharm. Bull 18(4), 779, 1970) 복령균사체로부터 분리한 폴리사카라이드(polysaccharide)의 항암효과 (Takaki, K., Kimura, M., et. al., Wasaiyaku Bussu Kaku, 100, 1982), 백복령의 성분과 약리효능(Chemical Constituents and Pharmacological Properties of Poria cocos, Jose-Luis Rios Planta Med 77: 681-691, 2011)등이 보고되어 있다

그러나 백복령의 Pachymic acid의 멜라닌 합성 저해에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 또한 백복령으로부터 효소 가수분해하여 Pachymic acid를 제조한 예도 보고된 바가 없다.

Pachymic acid 제조 제 1 단계에서, 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 Pachymic acid 배당체를 함유하는 식물 추출물을 수득하기 위하여, 식물에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3 배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣고, 1 내지 5회 추출한 후, 여과하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 수층을 에틸아세테이트 등을 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 상기 식물 추출물을 수득할 수 있다.

상기 제 2 단계에서, 상기 식물 추출물을 효소를 이용하여 가수분해하여 Pachymic acid를 제조한다. 즉, 식물 추출물을 5 내지 20 배, 바람직하게는 약 10 배의 산성완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 첨가하여 약 37 ℃ 수욕상에서 약 40 내지 55 시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 교반후, 기질이 완전히 소실되면 열수(80 ~ 100 ℃) 중에서 5 내지 15 분 동안 가열하여 가수분해 반응을 종료 시키고 반응액을 수득할 수 있다. 상기와 같이 효소를 이용하여 가수분해 한 후, 수득한 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 소량의 알코올을 가하여 여과하고, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 Pachymic acid을 수득할 수 있다.

본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 Pachymic acid는 총 중량에 대하여 0.0001-10.0 중량, 바람직하게는 0.0005-5.0중량이 적당하다. 0.0001중량이하의 농도에서는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없었고, 5.0 중량이상의 농도에서는 함유량의 증가에 따라 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않았다.

본 발명에 따른 조성물은 화장품학 및 피부과학적으로 허용 가능한 매질 및/또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 또는 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

다음으로 실시예에 의거하여 본 발명을 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 실시예에 의해서 한정되지 않는다는 것은 명백하다

[제조예 1] 백복령추출물 제조

건조된 백복령 1Kg에 물, 물을 포함한 유기용매(에탄올) 3L를 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출한다. 위 공정을 2회 반복하여 추출액을 얻으며, 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한후 에틸아세테이트로 3회 추출한다. 유기용매층을 수집하여 감압농축하여 건고물을 40g을 얻었다.

Pachymic acid 제조

제조예 1에서 얻은 건고물 5g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 1.5g(arabinosidase 0.3g, cellulose 0.3g, glucuronidase 0.3g, amyloglucosidase 0.3g Sigma社製)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 에틸아세테이트로 추출, 여과, 농축하여 생성물 2.4을 얻었다.

상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 Pachymic acid 1.4 g을 얻었다.

Pachymic acid 제조

제조예 1에서 얻은 건고물 5g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 1.5g(pectinase 0.3g, cellulase 0.3g, β-glucuronidase 0.3g, β-galactosidase 0.3g, Sigma社製)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료 시킨 다음, 반응액은 동량의 에틸아세테이트로 추출, 여과, 농축하여 생성물 2.8g을 얻었다.

상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 Pachymic acid 1.6 g을 얻었다.

[시험예 1] 백복령의 Pachymic acid 동정

상기 실시예 1 내지 2에서 제조된 생성물은 하기와 같은 특성을 나타내므로 Pachymic acid로 동정하였다.

< Pachymic acid의 물리화학적 성상>

성상 : 흰색 침상 결정

녹는점 293-294 °C

양성(Positive) FAB-MS : 529[M+H]+

1H-NMR : 0.92 (3H, s,), 0.94 (3H, s), 0.97 (3H, s), 0.99, 1.01 (ea. 3H, d), 1.13 (3H, s), 1.49 (3H, s), 2.07 (3H, s,), 2.27 (1H, m), 2.84 (1H, dd,), 2.94 (1H, m) 4.54(1H, t), 4.68 (1H, dd),

13C-NMR : 16.8, 17.8, 18.4, 19.2, 20.9, 21.9, 22.0, 24.5, 25.4, 26.7, 28.0, 29.7, 31.6, 33.2, 34.1, 35.3, 37.1, 38.0, 43.6, 46.2, 48.8, 80.7, 50.7, 57.3, 76.6, 107.0, 156.1, 178.8

[시험예 2] 백복령의 Pachymic acid의 세포독성 측정

마우스 유래 B16 흑색종 세포를 96-웰 플레이트에 5 × 10 세포가 되도록 접종하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양 후 실시예1과 실시예2의 시료를 농도별로 첨가한 배지로 교체하였다. 48시간 추가 배양한 후 배지를 제거하고 DPBS(D-phosphate buffered saline)로 세척한 후 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 500 ㎍/㎖를 웰 당 50 ㎕ 씩 첨가하였다. 37 ℃의 10 % CO2 조건하에서 4시간 동안 반응시킨 후 MTT 용액을 제거하고 웰 당 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 200 ㎕ 씩 첨가하여 살아있는 세포와 반응하여 생긴 formazan 침전물을 용해시킨 다음 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

B16 melanoma 세포에서 MTT 실험을 수행한 결과, 그림1 에서 나타난 바와 같이 백복령의 Pachymic acid 는 100ppm의 농도 내에서 세포독성이 없음을 확인하였다.

그림 1. 실시예1의 백복령의 Pachymic acid의 세포독성

[시험예 3] 백복령의 Pachymic acid 의 B16 melanoma 세포에서 멜라닌 합성저해 효과

멜라닌 정량은 호소이 등 (Hosoi J et al., Cancer Res., 45(4), pp1474-1478, 1985)의 방법을 변형하여 사용하였다. DMEM 배지로 배양된 B16 melanoma세포를 100mm culture dish에 1×106cell/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×106 세포 당 1 mL의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리 한 후 분리된 멜라닌을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether : ethanol(1:3) 1 mL을 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1mL로 세척 건조 시켰다. 건조된 멜라닌에 1N NaOH를 1 mL 가하여 80℃에서 1시간 반응 시킨 후 분광 광도계 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생합성 저해는 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

멜라닌 합성저해율(%) = (1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

백복령의 Pachymic acid 와 3b-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid 혼합물의 melanoma 세포에서의 멜라닌 생합성 저해효과를 측정한 결과를 그림 2에 나타내었다.

그림 2. 백복령의 Pachymic acid의 멜라닌 합성저해

[시험예 4] 백복령의 Pachymic acid의 B16 melanoma 세포에서 Tyrosinase/TRP-1/TRP-2의 mRNA 발현 저해 효과

Total RNA 추출은 TRIzol-reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리(12000rpm, 15min)하였다. 상등액에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 원심분리(12000rpm, 5min)하여 RNA를 침전시키고 0.1% DEPC(diethylpyrocarbonate)가 처리된 75%에탄올로 세척한 후 건조시켜 0.1% DEPC 증류수로 녹였다. 260nm의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, 흡광도260/흡광도280nm의 비율이 1.6~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 선발하여 사용하였다. cDNA 합성은 Improm-Ⅱ TM cDNA kit (promega, USA)를 이용하여 1㎍의 total RNA를 oligo(dT) primer, dNTP(0.5μM), 1unit RNase inhibitor 그리고 Improm-Ⅱ TM reverse transcriptase(2U)로 25℃ 에서 5분, 42℃에서 60분, 그리고 75℃에서 10분간 heating 시킴으로써 반응을 중지 시켰다.

Polymerase chain reaction (PCR)은 cDNA로부터 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, β-actin을 증폭하기 위하여 1㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3' primer, 10X buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM MgCl2, 1unit Taq poylmerase (promega, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃ 30초, 57~62℃ 45초, 72℃ 45초 25 cycles로 반응시켰다. PCR에 의해 생성된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고, 각 밴드의 density는 Quantity One 1-D Image Analysis Software (Bio-rad. USA)를 이용하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 β-actin의 primer 서열은 아래와 같다.

내부 표준물질로 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다

본 발명에 따른 백복령의 Pachymic acid는 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2와 Tyrosinase의 유전자 발현을 억제하여 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 확인되었다.

Primer pair
유전자 Gene ID		Primer sequence
GAPDH	Forward	5' CTGGGACGACATGGAGAAAA 3’
	Reverse	5' AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3’
TRP-1	Forward	5' GACTCCTGGGTCAGCTTCCTAAG 3'
	Reverse	5' GTAGAACAGACGCAGCACAG 3'
TRP-2	Forward	5' GCTACCAGTTTATCCAAACG 3'
	Reverse	5' GTGACTCATCTGTCTCACCG 3'
Tyrosinase	Forward	5' GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGT 3'
	Reverse	5' TGGTGCTTCATGGGCAAAATC 3'

그림3. 백복령의 Pachymic acid 의 유전자 발현 측정

[시험예 5] 백복령의 Pachymic acid 의 Nitric oxide 저해활성 측정

Nitric oxide(NO) 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide(NO)의 양을 nitrite and griess로서 측정하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원 된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 5×10⁵개의 cell confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing 한 후에 무 혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 LPS 1 mμg/mL을 control군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 24시간 후에 supernatant를 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 540nm에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성 된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.

Raw264.7 cell의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 시료를 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정한 결과를 그림 4에 나타내었다. Control은 LPS 10 ㎍/㎖을 처리하였다.

LPS 처리군은 높은 NO발현 양을 나타내었으며 시료의 경우 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 대식세포주에서의 NO 생성 억제는 저농도에서도 80%에 가까운 효과를 나타내는 것을 확인, 효과가 뛰어난 것을 확인 할 수 있었다.

그림4. 백복령의 Pachymic acid 의 NO 저해능

영양크림

배합성분	중량%
	제형예 1	제형예 2
실시예 1	1.0	-
실시예 2	-	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄세스퀴올리에이트	0.5	0.5
PEG60 경화피마자유	2.0	2.0
유동파라핀	10.0	10.0
스쿠알란	5.0	5.0
카프릴릭/카프락트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	5.0	5.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제	적량	적량
색소	적량	적량
향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

그 외 화장품 제형에 사용되는 예를 들면 다음과 같다.

유연화장수(스킨로션)

배합성분	중량%
실시예 1	0.5
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
PEG 12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

영양화장수(밀크로션)

배합성분	중량%
실시예 1	0.5
스쿠알란	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

마사지크림

배합성분	중량%
실시예 1	2.0
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
PEG 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

팩

배합성분	중량%
실시예 1	1.0
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
PEG 12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

젤

배합성분	중량%
실시예 1	1.0
에틸렌디아민초산나트륨	0.05
글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.3
에탄올	5.0
PEG 60 경화피마자유	0.5
트리에탄올아민	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

Claims (3)

1. 유효성분으로 백복령의 Pachymic acid를 조성물 총중량에 대해 0.0001 ~ 5중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 유효성분으로써 백복령의 Pachymic acid가 티로시나아제 및 TRP-2의 유전자 발현 저해시킴을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물
3. 제1항에 있어서 백복령의 Pachymic acid 가 물, 물을 포함한 유기용매(에탄올, 메탄올, 부탄올,) 또는 유기용매로 1차 추출한 후, 효소 가수분해반응에 의해 제조되고, 효소 가수분해반응에 사용되는 효소는 당결합을 분해하는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 셀룰라제(cellulase), 글루쿠로니다제 (glucuronidase), 펙티나제(pectinase) 및 아밀로글루코시다제 (amyloglucosidase)등 당결합분해효소 및 이들을 함유하고 있는 복합효소제임을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물