KR101295336B1

KR101295336B1 - 쓴메밀 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR101295336B1
Application number: KR1020110036324A
Authority: KR
Inventors: 최종완; 정민석; 박창민; 윤해원; 배지영
Original assignee: 주식회사 한국화장품제조
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2013-08-08
Also published as: KR20120118752A

Abstract

본 발명은 쓴메밀 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 쓴메밀(Fagopyrum Tataricum)을 포함함으로써 피부 미백 효과 및 항산화 효과를 가지는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

쓴메밀 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조 방법{A Cosmetic Composition Comprising Fagopyrum Tataricum Extract And Preparing Method Thereof}

일반적으로 사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트 (Melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈과 같은 인체 내외의 색소 함유의 유무와 같이 여러 요인들에 의해 결정된다. 특히 멜라노사이트에서 타이로시나제(Tyrosinase) 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소가 가장 중요한 요인이다.

사람의 피부가 검게 변화되는 것은 여러 가지 원인을 들 수 있지만, 주된 요인은 자외선에 피부가 노출되면 피부세포의 일종인 멜라노사이트 내에서 멜라닌의 합성이 증가되고 방출되기 때문이라고 알려져 있다. 멜라노사이트에서 멜라닌이 합성되는 과정을 구체적으로 살펴보면, 세포내의 타이로신(Tyrosine)을 기질로 하여 타이로시나아제(Tyrosinase)라는 효소가 작용하고, 이에 따라 도파(Dopa)에서 효소 반응을 거쳐 도파퀴논(Dopaquinone)을 생성한다. 이 도파퀴논은 불안정하며 용이하게 중합하여 흑색 색소인 고분자의 멜라닌 색소로 변화한다. 따라서 피부가 검게 변화되는 것을 막기 위해서는 멜라닌 생성과정 중의 일부 반응을 억제시킴으로써 멜라닌의 생성을 감소시켜 주는 방법이 일반적이며 용이하다고 할 수 있다.

이를 위해 종래에는 미백 물질로서 아스코르브산(Ascorbic acid), 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 하이드로퀴논(Hydroquinone) 및 각종 식물 추출물 등이 사용되어 왔다. 이 중에서 아스코르브산은 쉽게 산화되어 파괴되는 단점 때문에 시간이 경과하면서 그 유효 성분의 활성도가 떨어지는 문제점이 있고, 코지산과 하이드로퀴논은 성능이 좋은 반면 발암성물질로 밝혀져 배합시 안전성 문제로 현재 화장료로 사용하지 못하고 있다. 또한 알부틴은 고산 지대의 월귤나무에서 추출하거나 합성을 통하여 얻을 수 있으며 타이로시나아제에 대한 억제 능력이 검증되고 있지만, 알부틴 자체는 하이드로퀴논에 당이 붙어있는 상태로서 화장료에 적용 시 당 분해 효소에 의해 당이 분리되어 하이드로퀴논에 의한 피부 자극이 유발되는 문제점이 있다.

그밖에 천연물 특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구가 계속 이루어지고 있다. 최근 다수의 식물 추출물에서 타이로시나아제 억제활성이 있다는 사실은 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 미백 효과에 있어서는 명백하지 않다는 한계가 있다. 특히, 대부분의 식물 추출물의 경우 고농도에서만 유효한 타이로시나아제 활성 저해 효과를 나타내며, 저농도에서는 저해 효과가 거의 나타나지 않는다는 문제점이 나타난다.

따라서, 화장료 조성물 중에서 안정성이 우수하며, 피부에 대한 자극이 거의 없으면서 미백 효과가 우수한 천연 원료에 대한 연구가 지속되고 있으며, 이에 본 발명자들은 종래의 미백 원료들이 가지고 있는 문제점을 해결하고 보다 미백 효과가 뛰어난 원료를 찾기 위하여 쓴메밀을 연구 대상으로 결정하였다.

일반적으로 쓴메밀은 메밀(학명: Fagopyrum esculentum)과 구별되는 것으로, 그 학명은 Fagopyrum tataricum 이다. 메밀의 종(species)에는 재배종과 야생종을 포함하여 20여종이 지구상에 분포하고 있다. 재배종에는 단메밀과 쓴메밀 두 종이 주류를 이루고 있다. 우리나라에 도입되어 지금까지 재배 이용되는 것은 단메밀(sweet buckwheat)이며 보통종이라고 불리어지기도 한다. 학명으로는 Fagopyrum esculentum이다. 반면 쓴메밀(bitter buckwheat)은 중국, 네팔 등지에 많이 자생하거나 재배되는 종으로서 달단종이라고 한다. 학명은 Fagopyrum tartaricum이며 타타리메밀이라고도 한다.

쓴메밀은 그 생육기간이 짧고, 내한성이나 흡수력이 강하여 산간지방에서 재배가 용이하여 오래 전부터 중국 남부의 해발 200m이상의 고산지대에서 재배되어 왔다.

메밀은 주로 식품으로 사용하여 왔으며 이전부터 높은 약리 작용을 가진 천연 작물이다. 이러한 메밀의 주요성분으로 알려진 루틴(Rutin)은 폴리페놀(Poly phenol) 화합물로써 케르세틴(Quercetin)에 루티노사이드(Rutinoside)가 결합된 물질로서 항산화, 항당뇨 활성, 혈압 강화 작용이 있고, 또한 칼콘(chalcone), 퀘세틴(quercetin), 헤스페리딘(hesperidin)과 같이 비타민(vitamin) P 작용이 있다. 이러한 루틴은 다른 식물에 비해 메밀에 풍부하며, 그 중 쓴메밀은 보통 메밀보다 더욱 많은 양의 루틴을 함유하고 있다.

대한민국 등록특허 제0711077호에는 메밀 추출물을 함유한 기능성 화장료 조성물에 대하여 개시되어 있으나, 피부 미백 효과에 대해서는 개시되어 있지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 쓴메밀과 보통 메밀의 추출물로서 멜라닌 억제 실험을 통한 자료를 비교하여 쓴메밀 추출물의 멜라닌 억제 능력이 보통 메밀의 추출물에 비해 그 효과가 우수하다는 것을 밝혀내고, 이를 함유한 미백 화장료 조성물을 개발하였다.

종래에 메밀 추출물에 대하여 화장품적 효능평가에서 항산화 및 미백 작용에 대한 실험결과는 보고되었지만 쓴메밀의 피부미백과 관련된 비교실험에 대해서는 과학적 실험 결과가 보고된 바 없다. 또한 기존에 메밀은 보통 피부미백 및 화장료 조성물로 사용되고 있지만 쓴메밀에 대해서는 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 일반메밀과 쓴메밀 추출물의 항산화 및 미백효능 비교 평가를 중심으로 하여, 미백효과가 뛰어난 화장료 조성물로 메밀 추출물과 비교하여 쓴메밀 추출물의 높은 응용 가능성에 대한 연구결과를 바탕으로 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 미백 효과 및 항산화가 우수한 쓴메밀 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상술한 바와 같은 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 쓴메밀(Fagopyrum Tataricum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 쓴메밀을 물, C1 ~ C4의 알코올, C1 ~ C4의 다가알코올, 또는 이들의 혼합용매와 혼합하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 10℃ 내지 40℃의 실온에서 3 내지 30일 동안 침적하는 단계;

(c) 상기 침적 단계 후, 침적 용액을 여과하여 그 여액을 얻는 단계; 및

(d) 상기 여액 및 화장료 성분을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 쓴메밀 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 쓴메밀 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 천연 추출물을 사용함으로써 피부 자극을 유발하지 않으며, 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 피부를 부드럽고 윤기있게 해주며, 일반메밀과 비교하여 우수한 미백 효과 및 항산화를 제공하여, 피부미백개선 및 피부보호에 매우 효과적이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 쓴메밀(Fagopyrum Tataricum) 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 쓴메밀 추출물의 유효성분을 포함함으로써 우수한 피부 미백 효과 및 항산화 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은, 화장료 조성물 총 중량에 대하여 쓴메밀 추출물을 0.01 내지 10 중량%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%이다. 상기 쓴메밀 추출물이 상기의 범위로 포함되는 경우에 유의성 있는 효과가 얻어지며, 최종 제품을 제조 시, 추출물의 고유 냄새, 색상 등을 고려했을 때 상기 범위의 함량을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 쓴메밀 추출물을 얻는 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법이면 어느 것이나 이용 가능하나, 바람직하게는 상기 쓴메밀 추출물은 쓴메밀을 정제수, C1 ~ C4의 알코올 및 C1 ~ C4의 다가알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 추출 용매로 이용하여 추출한 여액인 것이 바람직하다.

상기 용매 중 C1~C4의 알코올로는 예컨대, 에탄올이 사용될 수 있고, 상기 C1 ~C4의 다가알코올은 C1 ~C4의 알킬렌글리콜인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜이 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물의 용매는 에탄올 단독; 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜; 또는 에탄올과 프로필렌 글리콜의 혼합용매가 사용되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 용매는 C1 ~ C4의 알코올 및 C1 ~ C4의 다가알코올이 6:4 ~ 9:1의 중량비로 혼합한 용매인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 용매는 혼합한 용매 중 다가알코올 수용액의 함유량이 너무 적으면 극성이 너무 낮아져 식물로부터 유용성분을 수득하기 어려우며, 반면에 함유량이 너무 많으면 극성이 높아져 원치 않는 성분이 함유된 추출물을 수득하게 되므로 상기와 같은 혼합비가 바람직하다.

본 발명의 추출물을 제조 시, 상기 추출 용매는 단독 또는 혼합용매를 이용할 경우 모두 건조된 쓴메밀의 10 중량부에 대하여 150 내지 300 중량부를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기의 추출 용매로 사용되는 C1~C4의 알코올의 농도는 60 내지 100%정도인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 쓴메밀 추출물을 포함함으로써 피부 미백 효과 및 항산화 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 수용성 리퀴드, 로션, 밀크로션, 크림, 젤, 팩, 에센스, 파운데이션, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림; 및 수중유(O/W), 유중수(W/O) 또는 실리콘중수(W/Si)형의 파우더로 이루어진 군에서 선택된 1종의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않고 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 필요에 따라 통상적으로 이용되는 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합될 수 있다. 상기 화장료 조성물는 첨가제로서, 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알코올, 색소, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 안정화제, 용해화제, 향료 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종이상의 혼합물을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상적으로 화장료 성분이면 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 화장료 조성물 제조방법에 있어서,

(a) 쓴메밀을 물, C1 ~ C4의 알코올, C1 ~ C4의 다가알코올 또는 이들의 혼합용매와 혼합하는 단계;

상기 (b) 단계에서 침적기간은 3 내지 30일 동안 침적하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 20일이다. 상기 기간 동안 침적할 때, 쓴메밀 추출물은 효율적으로 추출되며, 적절한 숙성이 진행될 수 있다.

상기 (c) 단계 이후, 상기 여액으로부터 C1 ~ C4의 알코올 성분을 제거하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 여액을 얻는 방법에 있어서는 여과 후, 필요에 따라 탈색 및 탈취과정을 더 수행 할 수 있다.

상기 용매 중 C1~C4의 알코올로는 예컨대, 에탄올이 사용될 수 있고, 상기 C1 ~ C4의 다가알코올은 C1 ~C4의 에틸렌글리콜인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜이 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물의 용매는 에탄올 단독; 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜; 또는 에탄올과 프로필렌 글리콜의 혼합용매가 사용되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 추출물을 제조 시, 상기 추출 용매는 단독 또는 혼합용매를 이용할 경우 모두 건조된 쓴메밀 10 중량부에 대하여 150 내지 300 중량부를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기의 추출 용매로 사용되는 C1~C4의 알코올의 농도는 60 ~ 100% 정도인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 쓴메밀 추출물을 사람 섬유아세포에 처리하여 피부자극에 대한 세포독성효과를 조사하는 단계, 상기 추출물의 타이로시나제 억제 및 쥐의 멜라노마 세포에 처리하여 멜라닌 생성 억제에 따른 미백 개선효과를 조사하는 단계 등을 더 포함할 수 있다.

단, 하기 제조예, 시험예 및 제형예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 제조예, 시험예 및 제형예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예, 시험예 및 제형예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시 제조예 1 내지 4: 쓴메밀 추출물 제조

하기 표 1에 기재된 바와 같이, 잘 건조된 쓴메밀의 분말시료를 표 1에 나타낸 혼합비(w/w)를 갖는 70% 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜의 혼합용매 300g과 혼합하였다. 이 혼합물을 2주간 침적하여 숙성한 후, 여과지(ToyoroshiKaisha, Ltd.에서 시판되는 5C, 185㎜, 일본)에 여과하여 에탄올을 증발시켜 여액 상태인 쓴메밀 추출물을 수득하였다.

	쓴메밀 함량(g)	혼합 용매	혼합 비율 (w/w)
실시 제조예 1	10 g	70% 에탄올 : 1,3-부틸렌글리콜	7:3
실시 제조예 2	10 g	70% 에탄올 : 1,3-부틸렌글리콜	6:4
실시 제조예 3	10 g	70% 에탄올 : 프로필렌글리콜	7:3
실시 제조예 4	10 g	70% 에탄올 : 프로필렌글리콜	6:4

비교 제조예 1 내지 4: 메밀 추출물 제조

쓴메밀 대신 메밀을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 제조예 1 내지 4에 기재된 바와 같은 방법으로, 표 2에 기재된 바와 같이 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물을 수득하였다.

	메밀 함량(g)	혼합 용매	혼합 비율 (w/w)
비교 제조예 1	10 g	70% 에탄올 : 1,3-부틸렌글리콜	7:3
비교 제조예 2	10 g	70% 에탄올 : 1,3-부틸렌글리콜	6:4
비교 제조예 3	10 g	70% 에탄올 : 프로필렌글리콜	7:3
비교 제조예 4	10 g	70% 에탄올 : 프로필렌글리콜	6:4

시험예 1. 세포 배양 (Cell culture)

하기 시험예에서 사용한 세포로는 ATCC사로부터 구입한 CCD-1064sk 사람 섬유아세포(human fibroblast cell line) 및 B16F10 마우스 멜라노마(mouse melanoma)를 사용하였다. CD-1064sk 사람 섬유아세포의 배양 배지로는 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)이 첨가된 Iscove's modified Dulbeco's medium (IMDM)을 사용하여으며, B16F10 마우스 멜라노마의 배양배지로는 10% 우태아혈청 (FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)이 첨가된 Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하였다. 상기 각 세포는 10㎝ 세포 배양접시에 10 ㎖의 배지로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 70~80% 합류(confluency)가 되도록 배양하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, 합류에 도달한 세포는 트립신(trypsin)-EDTA를 사용하여 트립신처리(trypsinization)한 후 계대배양하여 유지하였다.

시험예 2. 쓴메밀 추출물의 세포독성 측정 (MTT assay)

상기 실시 제조예 1 내지 4의 쓴메밀 추출물 및 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물에 대한 세포독성 시험을 통해, 쓴메밀 추출물의 피부 안전성을 평가하였다.

상기 시험예 1에 기재된 방법으로 사람 섬유아세포를 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 Iscove's modified Dulbeco's medium(IMDM)으로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양된 사람 섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트(96-multiwell plate)에 각각 1 > 10⁴세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양 후, 배양된 세포의 배지를 2% FBS가 첨가된 IMDM으로 교체하고, 실시 제조예 1 및 4의 쓴메밀 추출물과 비교 제조예 1 및 4의 메밀 추출물을 하기 표 3에 나타낸 각각의 처리 농도로 배지에 희석하여 처리한 후 48 시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 MTT stock 용액(5 mg/㎖)을 새로운 배지에서 10배 희석하고, 이 용액을 세포 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT[3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5 -diphenyltetrazolium-bromide]가 비수용성의 MTT-포르마잔(formazan) 결정으로 환원되므로 이것의 양을 재면 세포 생존율을 측정할 수 있다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO(dimethylsufoxid) 200㎕를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포르마잔 결정체를 용해시킨 후 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)로 포르마잔의 흡광도가 최대가 되는 테스트 필터(Test filter)인 540 ㎚의 파장에서의 O.D값과 대조 필터(Reference filter)인 630nm 파장의 O.D값을 측정하여 그 차이값을 구하였다(The EMBO Journal(2002)21, 2407-2417 등 참고). 세포 독성은 흡광도의 백분율로 나타내었다.

실험결과는 상기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, Raw 데이터를 토대로 무처리군의 흡광도와 시료 처리군의 흡광도의 평균을 계산하여 표준편차를 구하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

MTT assay	세포 생존율
MTT assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.5	0.1	0.05	0.01
실시 제조예 1	0.392±0.019 (100.00)	0.381±0.028 (97.19)	0.405±0.022 (103.32)	0.399±0.036 (101.79)	0.396±0.015 (101.02)
실시 제조예 2	0.405±0.024 (100.00)	0.399±0.013 (98.52)	0.410±0.032 (101.23)	0.408±0.031 (100.74)	0.411±0.028 (101.02)
실시 제조예 3	0.389±0.025 (100.00)	0.394±0.036 (101.29)	0.403±0.031 (103.60	0.405±0.032 (104.11)	0.410±0.036 (105.40)
실시 제조예 4	0.401±0.019 (100.00)	0.389±0.021 (99.25)	0.401±0.026 (100.00)	0.406±0.037 (101.25)	0.400±0.041 (99.75)
비교 제조예 1	0.403±0.021 (100.00)	0.388±0.019 (96.28)	0.392±0.031 (97.27)	0.410±0.025 (101.74)	0.399±0.028 (99.01)
비교 제조예 2	0.398±0.031 (100.00)	0.374±0.028 (96.14)	0.394±0.024 (101.29)	0.407±0.018 (104.64)	0.403±0.014 (103.60)
비교 제조예 3	0.401±0.025 (100.00)	0.378±0.037 (94.26)	0.394±0.020 (98.25)	0.413±0.035 (103.00)	0.409±0.027 (102.00)
비교 제조예 4	0.388±0.029 (100.00)	0.365±0.031 (94.07)	0.392±0.025 (101.03)	0.410±0.027 (105.67)	0.404±0.033 (104.12)

상기 표 3 에서 보는 바와 같이, 본 발명의 쓴메밀 추출물의 MTT₅₀₀값은 검액농도 0.5% 이상이며, 종래의 화장품 원료로 이용되는 비교 제조예의 메밀 추출물과 같이 안전한 원료임을 알 수 있다.

시험예 3. 쓴메밀 추출물의 항산화 효과 실험

상기 실시 제조예 1 내지 4의 쓴메밀 추출물과 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물에 대한 하기 시험을 통하여 항산화 효과를 비교 평가하였다.

3-1. DPPH (1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl) 라디칼에 의한 항-하이드록실 라디칼 활성(%) 측정

상기 실시 제조예 1 내지 4에서 제조된 쓴메밀 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼이 있다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재한다. 517nm에서 최대 흡수를 나타내며 환원되면 517nm에서 흡수가 없어진다. DPPH(D9132, SIGMA)를 메탄올과 증류수의 6:4(v/v) 혼합용매에 녹이고, 상기 DPPH 용액을 513nm에서 흡광도가 0.6 정도 되도록 맞추었다. DPPH 용액 2ml를 상기 실시 제조예 1 내지 4를 하기 표 4에 나타낸 농도별로 희석한 시료 1ml에 각각 첨가하여 혼합하였다. 상온에서 약 1시간 동안 반응시킨 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 사용하여 513nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 본 발명의 쓴메밀 추출물의 항산화 효과의 정도를 확인하기 위하여 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물을 사용하여 동일한 방법으로 실험하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

DPPH assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.5	0.1	0.05
실시 제조예 1	0.643±0.015 (00.00)	0.131±0.011 (79.63)	0.202±0.017 (68.58)	0.369±0.009 (42.61)
실시 제조예 2	0.643±0.015 (00.00)	0.158±0.014 (75.43)	0.255±0.017 (60.34)	0.411±0.017 (36.08)
실시 제조예 3	0.643±0.015 (00.00)	0.143±0.021 (77.76)	0.222±0.028 (65.47)	0.403±0.021 (37.33)
실시 제조예 4	0.643±0.015 (00.00)	0.166±0.018 (74.18)	0.290±0.025 (54.90)	0.443±0.024 (31.04)
비교 제조예 1	0.643±0.015 (00.00)	0.326±0.014 (49.30)	0.437±0.021 (32.04)	0.539±0.015 (16.17)
비교 제조예 2	0.643±0.015 (00.00)	0.345±0.019 (46.35)	0.456±0.026 (29.08)	0.548±0.016 (14.77)
비교 제조예 3	0.643±0.015 (00.00)	0.337±0.025 (47.58)	0.404±0.014 (37.17)	0.530±0.021 (17.57)
비교 제조예 4	0.643±0.015 (00.00)	0.378±0.018 (41.21)	0.489±0.019 (23.95)	0.568±0.022 (11.66)

3-2. NBT (1,1-디페닐-2-피크릴히드라질) 분석법에 의한 항-수퍼옥사이드 음이온 라디칼 활성(%) 측정

300mM 포스페이트 버퍼(pH 7.8)에 트리톤 X-100 (triton X-100) 1.6ml, EDTA 2.9mg, 니트로블루-테트라졸륨 (nitroblue-tetrazolium, NBT, Sigma 사) 1mg, 하이포크산틴 (hypoxanthine) 5.4mg을 넣어 기질/반응 용액을 만들었다. 크산틴 옥시다제 12㎕를 300mM 포스페이트 버퍼(pH 7.8) 10ml에 녹여 효소 용액을 만들었다. 분광 광도계 셀 내에 버퍼 1.0ml을 넣은 다음, 상기 제조한 기질/반응 용액을 0.5ml 첨가하였다. 그 후, 실시 제조예 1 내지 4의 추출물을 하기 표 5에 기재된 농도에 따라 희석한 시료를, 각각 100㎕씩 처리하였다. 여기에 상기 제조된 효소 용액 0.5ml을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 표 6에 나타내었다. 본 발명의 쓴메밀 추출물의 항산화 효과의 정도를 확인하기 위하여 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물을 사용하여 동일한 방법으로 실험하였으며, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

NBT assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.5	0.1	0.05
실시 제조예 1	0.243±0.016 (00.00)	0.142±0.009 (41.56)	0.161±0.012 (33.74)	0.185±0.019 (23.87)
실시 제조예 2	0.243±0.016 (00.00)	0.156±0.013 (35.80)	0.191±0.017 (21.40)	0.203±0.021 (16.46)
실시 제조예 3	0.243±0.016 (00.00)	0.149±0.014 (38.68)	0.183±0.019 (24.69)	0.198±0.023 (18.52)
실시 제조예 4	0.243±0.016 (00.00)	0.165±0.015 (32.10)	0.206±0.021 (15.23)	0.217±0.022 (10.70)
비교 제조예 1	0.243±0.016 (00.00)	0.178±0.017 (26.75)	0.191±0.015 (21.40)	0.211±0.023 (13.17)
비교 제조예 2	0.243±0.016 (00.00)	0.189±0.013 (22.22)	0.209±0.019 (14.00)	0.237±0.018 (3.70)
비교 제조예 3	0.243±0.016 (00.00)	0.184±0.021 (24.28)	0.197±0.011 (18.93)	0.219±0.013 (9.88)
비교 제조예 4	0.243±0.016 (00.00)	0.198±0.016 (18.52)	0.211±0.012 (13.17)	0.231±0.021 (4.94)

상기 표 4와 표 5에 나타난 바와 같이, 실시 제조예 1 내지 4의 쓴메밀 추출물이 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물 보다 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

시험예 4. 쓴메밀 추출물의 미백 효과 측정

4-1. 타이로시나제 활성 저해 시험

쓴메밀 추출물의 미백 효과를 조사하기 위해 타이로시나제 활성 저해 시험을 실시하였다. 실험을 위해, 타이로시나제 효소액은 버섯 타이로시나제 (mushroom tyrosinase, T-3824, 1530U/㎎, Sigma)를 1000 U/㎖이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였으며, 기질액은 L-타이로신(L-tyrosine, 45160-0410,Junsei chemical co. Ltd)을 1.5 mM이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였다.

완충액에 상기 실시 제조예 1 내지 4의 쓴메밀 추출물 및 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물을 하기 표 6에 기재된 농도별로 희석하여 검액을 준비하였다. 검액 170 ㎕, 타이로시나제 효소액 10 ㎕를 넣고 37 ℃에서 10분간 반응시켰다. 여기에 상기 제조한 기질액 20 ㎕를 넣은 다음 37 ℃에서 10분간 반응시킨 후, 바로 얼음 중에 5분간 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기에서 측정된 흡광도를 하기 수학식 2에 대입하여 타이로시나제 활성저해율을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다.

공시험액은 검액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 동량 넣어 제조한 것이며, 보정액은 기질액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 동량 넣어 제조한 것으로 사용하였다.

A: 검액 반응 후의 흡광도

B: 공시험액의 반응 후의 흡광도

A': 검액의 보정액

B': 공시험액의 보정액

타이로시나아제 활성저해시험	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.5	0.1	0.05
실시 제조예 1	0.268±0.017 (00.00)	0.117±0.013 (56.34)	0.149±0.014 (44.40)	0.195±0.018 (27.24)
실시 제조예 2	0.268±0.017 (00.00)	0.106±0.009 (60.45)	0.138±0.012 (48.51)	0.194±0.020 (27.61)
실시 제조예 3	0.268±0.017 (00.00)	0.128±0.015 (52.24)	0.159±0.018 (40.67)	0.223±0.024 (16.79)
실시 제조예 4	0.268±0.017 (00.00)	0.122±0.016 (54.48)	0.158±0.017 (41.04)	0.212±0.014 (20.90)
비교 제조예 1	0.268±0.017 (00.00)	0.161±0.019 (39.93)	0.190±0.011 (29.10)	0.224±0.021 (16.42)
비교 제조예 2	0.268±0.017 (00.00)	0.178±0.012 (33.58)	0.211±0.021 (21.27)	0.245±0.025 (8.58)
비교 제조예 3	0.268±0.017 (00.00)	0.172±0.014 (35.82)	0.198±0.023 (26.12)	0.233±0.021 (13.06)
비교 제조예 4	0.268±0.017 (00.00)	0.195±0.018 (27.24)	0.222±0.028 (17.16)	0.246±0.025 (8.21)

4-2. 쓴메밀 추출물의 농도에 따른 멜라닌 합성 억제 측정 실험

상기 실시 제조예 1 내지 4에서 얻은 쓴메밀 추출물에 대하여 B16F10 멜라노마 세포를 이용하여 미백효과를 측정하였다. 측정방법으로는 마우스로에서 유래된 B16F10 멜라노마 세포를 10% FBS(GIBCO, USA)을 첨가한 DMEM으로 6 웰 조직 배양 접시에 2 x 10⁴ 세포/웰 농도로 2mL씩 첨가하고 5% CO₂, 37℃조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 10% FBS, 2uM α-MSH(Sigma., USA, Melanocyte stimulating Hormone)과 2mM 테오필린(Sigma., USA, theophylline)이 함유된 DMEM으로 교체한 후, 실시 제조예 1 내지 4의 쓴메밀 추출물을 동일배지로 표 7에 기재된 농도로 희석하여 각각 첨가한 후, 5% CO₂ ,37℃ 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS(Sigma. USA, Phosphate buffered Saline)로 세척하고 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 5000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 세포를 60℃ 항온기에서 24시간 건조시킨 후 1N NaOH를 첨가하여 세포내의 멜라닌을 용해시켰다. 용해된 멜라닌을 흡수분광광도계(Uvmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물에 대해서도 동일한 방법으로 실험하여 본 발명의 결과와 비교하였다.

상기 실험으로 얻은 결과로 하기 수학식 3를 이용하여 계산하여 멜라닌 생성 저해율을 구했으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

A: 검액 반응 후의 흡광도

B: 공시험액의 반응 후의 흡광도

A': 검액의 보정액

B': 공시험액의 보정액

멜라닌 합성 억제 측정	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.1	0.05
실시 제조예 1	0.612±0.042 (00.00)	0.378±0.037 (38.24)	0.449±0.043 (26.63)
실시 제조예 2	0.612±0.042 (00.00)	0.369±0.036 (39.71)	0.433±0.041 (29.25)
실시 제조예 3	0.612±0.042 (00.00)	0.355±0.047 (42.00)	0.413±0.031 (32.52)
실시 제조예 4	0.612±0.042 (00.00)	0.381±0.029 (37.75)	0.443±0.038 (27.61)
비교 제조예 1	0.612±0.042 (00.00)	0.442±0.054 (27.78)	0.540±0.038 (11.76)
비교 제조예 2	0.612±0.042 (00.00)	0.433±0.051 (29.25)	0.509±0.046 (16.83)
비교 제조예 3	0.612±0.042 (00.00)	0.456±0.039 (25.49)	0.543±0.041 (11.27)
비교 제조예 4	0.612±0.042 (00.00)	0.443±0.043 (27.61)	0.547±0.040 (10.62)

상기 표 6 및 표 7에 나타난 바와 같이, 비교 제조예 1 내지 4의 메밀 추출물과 비교하여 실시 제조예 1 내지 4의 쓴메밀 추출물은 타이로시나제 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 세포내 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하였다.

제형예 1. 쓴메밀 추출물을 함유하는 에센스의 제조.

하기 표 8의 조성에 따라, 실시 제조예 1의 쓴메밀 추출물을 포함하는 에센스를 제조하였다.

	성분명	함량(중량%)
A	1,3-부틸렌글리콜	1.0
	글리세린	1.0
	카보머	0.2
	글리세릴 메타크릴레이트	0.35
	파라벤	0.20
	정제수	잔량
B	수산화칼륨	0.06
C	PEG-6-하이드로 제네이티드 캐스터 오일	1.0
C	향료	미량
D	쓴메밀 추출물	5.0
	계	100.00

A를 충분히 분산, 습윤하여 균일한 겔(Gel)상이 되도록 혼합한 후, B를 첨가하여 중화하였다. (A+B)에 C를 첨가하여 균일교반하여 가용화시킨 후, D를 실온에서 첨가하여 균일하게 분포되도록 교반하고, 용기에 담아 제품화하였다.

제형예 2~4: 쓴메밀 추출물을 포함하는 유연화장수(스킨)의 제형예

하기 표 9에 나타낸 조성에 따라, 실시 제조예 1의 쓴메밀 추출물을 포함하는 유연화장수(스킨)를 제조하였다.

성분	제형예 2	제형예 3	제형예 4
성분	함량(중량%)	함량(중량%)	함량(중량%)
쓴메밀 추출물	5.00	2.50	1.00
부틸렌글리콜	2.00	2.00	2.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
올레일알코올	2.00	2.00	2.00
폴리솔베이트 20	1.00	1.00	1.00
에탄올	6.00	6.00	6.00
방부제	0.5	0.5	0.5
향	0.5	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.00	100.00	100.00

제형예 5~7: 쓴메밀 추출물을 포함하는 영양유액(밀크로션)의 제형예

하기 표 10에 나타낸 조성에 따라, 실시 제조예 1의 쓴메밀 추출물을 포함하는 영양유액(밀크로션)을 제조하였다

성분	제형예 5	제형예 6	제형예 7
성분	함량(중량%)	함량(중량%)	함량(중량%)
쓴메밀 추출물	5.00	2.50	1.00
부틸렌글리콜	4.00	4.00	4.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
올레일알코올	1.00	1.00	1.00
폴리솔베이트20	1.00	1.00	1.00
방부제	0.5	0.5	0.5
향	0.5	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.00	100.00	100.00

제형예 8~10: 쓴메밀 추출물을 포함하는 크림의 제형예

하기 표 11에 나타낸 조성에 따라, 실시 제조예 1의 추출물을 포함하는 크림을 제조하였다.

성분	제형예 8	제형예 9	제형예 10
성분	함량(중량%)	함량(중량%)	함량(중량%)
쓴메밀 추출물	5.00	2.50	1.00
부틸렌글리콜	2.00	2.00	2.00
글리세린	4.00	4.00	4.00
포타슘하이드록사이드	0.10	0.10	0.10
토코페릴 아세테이트	1.0	1.0	1.0
유동파라핀	5.0	5.0	5.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0
마카디미아넛트오일	10.0	10.0	10.0
폴리솔베이트 60	1.0	1.0	1.0
소르비탄세스퀴올레이트	1.0	1.0	1.0
카보머	0.3	0.3	0.3
방부제	0.5	0.5	0.5
향	0.5	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.00	100.00	100.00

Claims

쓴메밀(Fagopyrum Tataricum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서,
상기 추출물은 상기 쓴메밀을 정제수, C1 ~ C4의 알코올 및 C1 ~ C4의 다가알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 혼합물을 추출 용매로 이용하여 추출한 여액이고,
상기 추출 용매는 C1 ~ C4의 알코올 및 C1 ~ C4의 다가알코올이 6:4 ~ 9:1의 중량비로 혼합한 용매이고,
상기 다가알코올은 1,3-부틸렌글리콜 및 프로필렌 글리콜 중 어느 하나이거나 둘의 혼합물이고,
상기 화장료 조성물은 피부 미백 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 쓴메밀 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은, 쓴메밀 10 중량부에 대하여 150 내지 300 중량부의 상기 용매를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
청구항 1, 청구항 2 및 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 수용성 리퀴드, 로션, 밀크로션, 크림, 젤, 팩, 에센스, 파운데이션, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림; 및 수중유(O/W), 유중수(W/O) 또는 실리콘중수(W/Si)형의 파우더로 이루어진 군에서 선택된 1종의 제형인 것을 특징으로 하는, 쓴메밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
(a) 쓴메밀을 물, C1 ~ C4의 알코올 및 C1 ~ C4의 다가알코올의 혼합용매와 혼합하는 단계;
(b) 상기 혼합물을 10℃ 내지 40℃의 실온에서 3 내지 30일 동안 침적하는 단계;
(c) 상기 침적 단계 후, 침적 용액을 여과하여 그 여액을 얻는 단계; 및
(d) 상기 여액 및 화장료 성분을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 청구항 1, 청구항 2 및 청구항 6 중 어느 한 항에 기재된 화장료 조성물의 제조 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 (c) 단계 이후, 상기 여액으로부터 C1 ~ C4의 알코올 성분을 제거하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물 제조 방법.