KR102325393B1 - 소계 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

소계 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소계(Breea segeta) 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 소계 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 이용하여 우수한 피부 미백 효능을 발휘할 수 있다.

Description

소계 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Skin whitening cosmetic composition with bioconversion of Breea segeta extract}
본 발명은 소계(Breea segeta) 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부 미백은 기미, 주근깨를 없애고 칙칙함을 개선하여 피부를 본래의 색으로 되돌리는 일을 일컫는다. 깨끗하고 맑은 피부에 대해 소비자들의 관심이 높음에 따라 화장품 산업에서도 더 나은 피부 미백효과를 발휘하는 화장품을 개발하는 것이 중요한 이슈이다. 피부 미백에 높은 효과를 발휘하기 위해서는 사람의 피부를 구성하고 있는 세포 중 하나인 멜라닌을 관리하는 것이 중요하다.
멜라닌은 사람의 피부색을 좌우하는 결정적인 역할을 하는데, 멜라닌 세포의 활성도가 높으면 색소를 많이 만들어내고 활성도가 낮으면 색소를 적게 만들어낸다. 멜라닌은 멜라닌 생성 세포의 세포 소기관인 멜라노솜에서 생성되며, 자외선 등의 외부자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만 과도한 멜라닌 생성은 피부 흑화와 피부암의 원인이 되기도 한다.
멜라닌 생성을 억제하는 소재를 찾기 위한 노력이 계속되어 왔으며 현재까지 코지산, 알부틴, 나이아신아마이드, 닥나무 추출물, 감초 추출물 등이 개발되었으나 효능의 한계 및 관련 시장의 확대로 인해 새로운 멜라닌 생성 억제 소재에 대한 사회적 요구가 증대되고 있다. 따라서, 기존에 알려진 멜라닌 생성 억제 소재들의 문제점을 극복하면서 인체에 안전하고 피부 미백효과가 탁월한 소재를 개발하는 것이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0003011호(공개일자: 2019.01.09)는, 오이풀 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 색소 침착 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 오이풀(Sanguisorba officinalis L.) 뿌리 부위(지유)의 수 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물이 개시되어 있다.
본 발명은 천연물 유래 소재를 활용하여 피부 미백능이 뛰어난 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 소계 추출물에 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되, 상기 베타-글루코시다아제는, 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus Kawachii) 유래의 베타-글루코시다아제인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소계 추출물에 라카아제(Laccase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되, 상기 라카아제는, 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor) 유래의 라카아제인것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소계 추출물에 리파아제(Lipase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되, 상기 리파아제는, 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) 유래의 리파아제인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 소계 추출물은, 바람직하게 소계 전초에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 추출용매로 사용하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명은 소계 추출물의 생물전환물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 이용하여 우수한 피부 미백 효능을 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 세포 생존율(cell viability)을 측정한 결과 그래프이다. 결과값은 3번의 데이터의 평균 ± 표준편차(S.D.)로 나타냈다.
도 2는 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 세포 내 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 멜라닌 합성 저해 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 멜라닌 합성 관련 단백질 발현량을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 멜라닌 합성 관련 mRNA 발현량을 PCR로 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물들의 멜라닌 합성 관련 mRNA 발현량을 Real-time PCR로 측정한 결과 그래프이다.
피부 미백은 기미, 주근깨를 없애고 칙칙함을 개선하여 피부를 본래의 색으로 되돌리는 일을 일컫는 것으로, 피부 미백에 높은 효과를 발휘하기 위해서는 사람의 피부를 구성하고 있는 세포 중 하나인 멜라닌을 관리하는 것이 중요하다.
멜라닌은 사람의 피부색을 좌우하는 결정적인 역할을 하며, 멜라닌 생성을 억제하기 위해 코지산, 알부틴, 나이아신아마이드, 닥나무 추출물, 감초 추출물 등이 개발되었으나 효능의 한계 및 안정성 등의 문제가 있어왔다. 멜라닌 생성을 억제하기 위해서는 멜라닌 합성 과정의 인자들을 조절하는 것이 중요하며, 이들을 조절하여 피부 미백 효능이 뛰어나면서도 인체에 안전한 소재를 개발하는 것이 필요하다. 이에 본 발명은 멜라닌 합성 과정의 인자들을 조절함으로써 피부 미백 효능이 뛰어나면서도 인체에 안전한 새로운 천연물 소재를 제공하고자 한다.
본 발명은 소계 추출물에 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되, 상기 베타-글루코시다아제는, 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus Kawachii) 유래의 베타-글루코시다아제인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 바람직하게는 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus Kawachii)의 배양액으로부터 수득한 베타-글루코시다아제 활성을 가지는 조효소액을 사용하는 것이 좋으며, 더 바람직하게는 조효소액을 첨가하고 25~35℃에서 20~28시간 배양하는 것이 좋다. 조효소액을 사용함으로써, 정제효소를 사용하는 것에 비해 경제적일 수 있다.
또한, 본 발명은 소계 추출물에 라카아제(Laccase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되, 상기 라카아제는, 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor) 유래의 라카아제인것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 바람직하게는 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor)의 배양액으로부터 수득한 라카아제 활성을 가지는 조효소액을 사용하는 것이 좋으며, 더 바람직하게는 조효소액을 첨가하고 25~30℃에서 20~28시간 배양하는 것이 좋다. 조효소액을 사용함으로써, 정제효소를 사용하는 것에 비해 경제적일 수 있다.
또한, 본 발명은 소계 추출물에 리파아제(Lipase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되, 상기 리파아제는, 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) 유래의 리파아제인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 바람직하게는 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) 유래 배양액으로부터 수득한 리파아제 활성을 가지는 조효소액을 사용하는 것이 좋으며, 더 바람직하게는 조효소액을 첨가하고, 25~35℃에서 20~28시간 배양하는 것이 좋다. 조효소액을 사용함으로써, 정제효소를 사용하는 것에 비해 경제적일 수 있다.
소계(Breea segeta)는 국화과(Compositae)에 속하는 조뱅이의 전초를 말하며, 각지의 밭, 산길, 논둑 등에서 널리 자라는 여러해살이 풀이다. 잎은 긴 타원형이며 가장자리에 가시가 있고 가지 끝에 가지색을 띤 꽃이 5~6월에 핀다. 소계는 꽃필 때 베어 그늘에 말려 약으로 사용한다. 소계의 효능으로는 양혈지혈 및 활혈해독이 있으며, 약리 기전으로 지혈작용, 혈압 상승효과, 항균작용이 있음이 보고되고 있다.
한편, 본 발명의 소계 추출물은 당업계에서 공지된 추출방법이라면 어느 것이든 한정하지 않으며, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법, (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다. 본 발명에서는 바람직하게는 추출 용매를 이용한 용매 추출법을 이용하였으며, 바람직하게는 소계 전초에 70% 에탄올을 추출용매로 사용하여 얻어진 것이다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일례로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소리비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실라카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성부능로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.
[실시예 1 내지 4: 본 발명의 소계 추출물 및 이의 생물전환물 제조]
500g의 소계 전초에 10배의 에탄올(70%)을 넣어 상온에서 24시간 추출하였다. 상기 추출물의 상등액을 1 ㎛ 크기의 마이크로필터를 이용하여 여과하여 1차 여과액을 수득하였다. 이때, 남은 잔사를 동일 조건으로 2, 3차 추출하여 여과함으로써 2차 여과액 및 3차 여과액을 각각 수득하였다. 이렇게 수득한 1차, 2차, 3차 여과액을 혼합한 후, 감압농축과 건조를 통해 건조물 110 g(수율 22%, 여기에서 '수율'은 에탄올을 완전히 휘발시킨 후의 건조 함량을 나타냄)을 얻었고, 이렇게 얻은 건조물을 소계 추출물(BSE)로 명명하였다 (실시예 1).
한편, 상기에서 수득한 소계 추출물(BSE)을 하기의 방법에 의해 생물 전환하여 각각의 샘플(생물 전환물)을 제조하고자 하였다.
(1) 소계 추출물 라카아제 반응물 제조
상기에서 수득한 소계 추출물(BSE)에 라카아제(Laccase) 활성을 갖는 조효소액을 처리하여 반응을 유도함으로써 소계 추출물 라카아제 반응물을 수득하고자 하였다.
구체적으로는, 성장 배지에 배양된 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor)(KCTC 26203, 생물자원센터에서 분양받아 사용함)를 50 mM 글루코오스(glucose)와 0.2 mM 페룰산(ferulic acid)이 각각 첨가된 유도원배지에 넣고 25℃에서 3일간 배양하여 라카아제 조효소액을 만들었다.
이후, 상기에서 수득한 소계 추출물(BSE) 10%에 2배(v/v)의 라카아제 조효소액을 넣고 25℃에서 24시간 배양한 후, 소계 추출물 라카아제 반응물 (BSE-L)을 얻었다 (실시예 2).
(2) 소계 추출물 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 반응물 제조
상기에서 수득한 소계 추출물(BSE)에 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 활성을 갖는 조효소액을 처리하여 소계 추출물(BSE) 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 반응물을 수득하고자 하였다.
구체적으로, 먼저 밀기울 10g에 10 ml의 증류수를 첨가하여 500 ml 삼각플라스크에 담아 밀기울에 수분이 잘 흡수되도록 혼합해준 후 121℃에서 30분간 멸균한 후 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus Kawachii)(KCCM 32819, 한국미생물보존센터에서 분양받아 사용함)를 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 발효된 밀기울을 100 ml의 100 mM의 sodium phosphate buffer (pH 7.0)에 현탁시켜 4℃에서 18시간 방치시킨 후 거즈로 여과하였으며, 여과액을 10,000 rpm에서 15분동안 원심분리(centrifuge)하여 상등액을 조효소액으로 사용하였으며, 조효소액의 효소는 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해 아스파질러스 가와치(Aspergillus Kawachii)를 이용한 조효소액을 제조하였다.
이후, 상기에서 수득한 소계 추출물(BSE) 건조분말을 증류수 400 ml에 재현탁하여 삼각플라스크에 분주하고, 아스파질러스 가와치(Aspergillus Kawachii)를 이용한 조효소액을 첨가하여 30℃에서 200 rpm으로 24시간동안 배양하여 생물전환된 소계추출물을 얻었다. 상기 생물전환된 소계추출물을 동결건조하여 소계 추출물(BSE) 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 반응물(BSE-A)을 얻었다(실시예 3).
(3) 소계 추출물 리파아제 반응물 제조
상기에서 수득한 소계 추출물(BSE)에 리파아제(Lipase) 활성을 갖는 조효소액을 처리하여 반응을 유도함으로써 소계 추출물 리파아제 반응물을 수득하고자 하였다.
구체적으로는, 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래된 리파아제(lipase) 유전자가 재조합된 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) X-33 균주(Invitrogen, C18000)를 배양한 후 효소 과발현 유도를 위해 BMM broth에서 30℃, 200 rpm, 1.5 bar의 조건하에서 5일간 배양하여 리파아제 조효소액을 만들었다.
이후, 상기에서 수득한 소계 추출물 10%에 동일량(v/v)의 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)를 이용한 리파아제 조효소액을 넣고 30℃에서 24시간 배양한 후, 소계 추출물 리파아제 반응물 (BSE-LI)을 얻었다(실시예 4).
[실험예 1: 본 발명의 소계 추출물 및 이의 생물전환물에 의한 세포 생존율 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 소계 추출물 및 이의 생물전환물에 의한 멜라노마(melanoma) 세포의 생존율을 측정하고자 하였다.
세포 생존율을 측정하기 위해 사용한 멜라노마 세포는 B16F10 멜라노마 세포는 ATCC로부터 분양받은 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 10% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 세포 생존율 측정은 디메틸 티아졸일 디페닐 테트라졸륨(dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium, MTT) assay를 이용하였는데, 이는 세포 증식(cell proliferation)과 생존능(viability)의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있는 방법 중 하나이다. 측정 방법은 'Carmichael J et al., "Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing", Cancer Res, 47: 936-942, 1987)'의 방법을 변경하여 사용하였다.
먼저 상기 배양된 멜라노마 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 1 x 103 cells/well이 되게 200 ㎕ 분주하고 24시간 후에 각각의 시료('소계 추출물(BSE)', '소계 추출물+라카아제(Laccase) (BSE-L)', '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)', '소계 추출물+리파아제(Lipase) (BSE-LI)')를 20, 40, 60, 80 ㎍/ml 농도로 처리하고 48시간 배양하였다. 배양 후 5 mg/㎖ MTT 용액을 넣어 2시간 동안 37℃ 배양한 후 상층액을 제거하고 포마잔(formazan) 침전물에 200 ㎕ DMSO를 넣어 약 5 ~ 10 분간 방치한 후 540 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.
그 결과, 도 1과 같이 소계 추출물(BSE)와 소계 추출물의 생물전환물들(BSE-L, BSE-A, BSE-LI)은 20, 40 ㎍/㎖의 농도에서는 90% 이상의 세포 생존율을 확인하였으며, 60, 80 ㎍/㎖의 농도에서 90% 이하의 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 따라서 멜라노마 세포의 미백 관련 신호전달 인자 측정은 생존율이 100%에 가까운 농도인 40 ㎍/ml의 농도로 확인하였다.
[실험예 2: 본 발명의 소계 추출물 및 이의 생물전환물의 티로시나제(tyrosinase) 저해 활성 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 소계 추출물 및 이의 생물전환물의 티로시나제(tyrosinase) 저해 활성을 측정하였다.
측정방법은 'Yagi et al., "The effect of tyrosinase inhibition for aloe", Planta Medica, 3981: 517-519, 1986'의 방법에 따라 측정하였다. 반응군은 0.175 M 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer) (pH 6.8) 0.5 ml에 10 mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2 ml과 각각의 시료('소계 추출물(BSE)', '소계 추출물+라카아제(Laccase) (BSE-L)', '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)', '소계 추출물+리파아제(Lipase) (BSE-LI)') 0.1 ㎖의 혼합액에 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) (110 U/ml) 0.2 ㎖을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 측정하였다. 티로시나아제(Tyrosinase) 저해 활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
측정 결과, 도 2와 같이 1,000 ㎕/㎖에서 소계 추출물(BSE)이 45%로 가장 우수한 티로시나아제 저해 활성을 나타냈으며, 소계 추출물의 생물전환물들 중에는 '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)'가 42.7%로 우수한 티로시나아제 활성을 나타냈다.
다음으로 실제 멜라노마 세포 내 티로시나아제 저해 활성을 측정하고자 하였다. B16F10 멜라노마 세포를 각 컬쳐 디쉬(culture dish)에 가득 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 각 디쉬(dish)에 용해 버퍼(lysis buffer) (67mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer), 1% triton X-100, 0.1mM 페닐메틸 술포니플루오르화물(phenylmethyl sulfonyfluoride))를 100 ㎕l 첨가한 후 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 세포를 수집하여 울트라 소니케이션(ultra sonication)하였다. 이를 1시간 동안 방치한 후 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용하였다. 이를 67mM 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) (pH 6.8)에 녹인 8.0 mM의 L-DOPA 120 ㎕와 시료용액 40 ㎕를 96-웰 플레이트(well plate)에 넣은 후, 67mM 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) (pH 6.8)에 녹인 효소용액 40 ㎕을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정하였다.
측정 결과, 도 3과 같이 40 ㎍/㎖의 농도에서 소계 추출물의 생물전환물들(BSE-L(17% 억제), BSE-A(28% 억제), BSE-LI(12% 억제))에 비해 소계 추출물(BSE)(32% 억제)이 가장 우수한 티로시나아제 저해 활성을 나타냈다.
[실험예 3: 본 발명의 소계 추출물 및 이의 생물전환물의 멜라닌(melanin) 합성 저해 활성 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 소계 추출물 및 이의 생물전환물의 멜라닌(melanin) 합성 저해 활성을 측정하였다.
소계 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 측정하기 위해 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/㎖의 농도로 분주 한 후 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하고 각각의 시료('소계 추출물(BSE)', '소계 추출물+라카아제(Laccase) (BSE-L)', '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)', '소계 추출물+리파아제(Lipase) (BSE-LI)') 40 ㎍/㎖로 처리해 72시간동안 재배양하였다. 그 후 1% triton-X 100이 들어있는 PBS 용액으로 세포를 용해시켜 E-tube에 옮겨 담고 4℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이때 상등액을 제거하고 셀 펠렛(cell pellet)에 10% DMSO가 들어있는 1N NaOH 수용액을 첨가하여 65℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4와 같이 40 ㎍/㎖의 농도에서 소계 추출물(BSE) 및 소계 추출물의 생물전환물들(BSE-L, BSE-A, BSE-LI)은 모두 10% 이상의 멜라닌 함량을 감소시키는 것으로 나타났으며, 특히 '소계 추출물(BSE)'이 11%, '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)'가 16%로 멜라닌 합성 저해에 탁월함을 확인하였다.
[실험예 4: 본 발명의 소계 추출물 및 이의 생물전환물에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질 발현량 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 소계 추출물 및 이의 생물전환물에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질 발현량을 측정하였다.
소계 추출물이 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위해 멜라닌 합성에 중요한 효소인 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 효소 및 이들의 전사인자인 MITF의 발현량 변화 및 시간별 발현량 변화를 웨스턴 블롯(western blot)으로 분석하였다.
티로시나아제는 티로신(tyrosine)을 L-3,4-디하이드록시 페닐알라닌(L-3,4-dihydroxy phenylalanine, DOPA)를 형성하고, DOPA를 DOPA 퀴논(quinone)으로 산화시키는 효소이다.
TRP-1은 디하이드록시 인돌 카복실산 옥시다아제(dihydroxy indole carboxylic acid oxidase)로써, 5,6-디하이드록시인돌-2-카복실산(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)를 인돌-5,6-퀴논-2-카복실산(indol-5,6-quinone-2-carboxylic acid)으로 산화시키는 효소이고, 티로시나아제를 안정화시키며 티로시나아제의 활성을 조절하는 역할을 한다.
TRP-2는 DOPA 크롬 타우토메라아제(Chrome tautomerase)로써, DOPA 크롬(chrome)을 DHICA로 변화시켜 멜라닌세포를 이루는 유멜라논(eumelanon)과 피오멜라논(pheomelanon)을 형성한다. 유멜라논(eumelanon)과 피오멜라논(pheomelanon)의 비율에 따라 피부, 머리카락, 눈동자의 색깔 등이 결정된다.
먼저 α-MSK(10 nM)을 처리한 B16F10 멜라노마 세포 각각에 시료('소계 추출물(BSE)', '소계 추출물+라카아제(Laccase) (BSE-L)', '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)', '소계 추출물+리파아제(Lipase) (BSE-LI)')를 40 ㎍/㎖ 처리해 48시간 동안 배양한 후 세포 내 단백질을 리파 버퍼(ripa buffer)로 추출하고 세포용해물의 단백질 농도는 BCA 프로테인 어세이 키트(protein assay kit)를 사용하여 측정하였다. 단백질 20 ㎍을 10% 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)으로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 분리된 단백질을 트랜스퍼(transfer)하였다. 그 후 멤브레인(membrane)을 1차 항체와 4℃에서 오버나잇(overnight)시키고, 멤브레인(membrane)을 세척하고 2차 항체와 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 단백질 발현은 LAS 4000을 이용하여 분석하였다. 이때, 세포의 여러 조건에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 하우스키핑 유전자(house keeping gene)인 GADPH를 양성 대조군(positive control)으로 사용하였다.
그 결과, 도 5와 같이 소계 추출물(BSE) 및 소계 추출물의 생물전환물들(BSE-L, BSE-A, BSE-LI)은 모두 추출물을 처리하지 않을 때와 비교하여 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 및 MITF 단백질 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 특히 '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)'에서 발현 억제 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다.
[실험예 5: 본 발명의 소계 추출물 및 이의 생물전환물에 의한 멜라닌 합성 관련 mRNA 발현량 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 소계 추출물 및 이의 생물전환물에 의한 멜라닌 합성 관련 mRNA 발현량을 측정하였다.
1) Total RNA 분리 및 cDNA 합성
세포를 6 웰(well)에 분주한 뒤, 24시간 동안 배양한 후 샘플을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 트라이졸 라이시스 버퍼(trizol lysis buffer)를 각 웰(well)에 1 ㎖씩 분주하여 세포를 용해(lysis)한 후 클로로포름(chloroform) 200 ㎕를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 13,200 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 이소프로판올(isopropanol) 500 ㎕이 들어 있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 13,200 rpm에서 20분간 원심분리하였고, 그 상층액을 제거한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 1 ㎖씩 분주하여 13,200 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC를 40 ㎖씩 분주하여 녹인 후 96 웰 플레이트(well plate)에 RNA 5 ㎕와 멸균수 195 ㎕를 첨가하여 260, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA 양을 측정하였다. Oligo(dT) 15 primer(500 ㎍/㎖) 1 ㎕ 추출한 RNA(1 ㎍)와 nuclease free water로 10 ㎕를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR nuclotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
2) 멜라닌 합성 관련인자(MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase)의 mRNA 발현 측정
소계 추출물 및 소계 추출물의 생물전환물이 멜라닌 합성에 관계된 주요 효소(key enzyme)인 MITF, TRP-1, TRP-2, 티로시나아제(tyrosinase) mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 마우스 멜라노마 세포(mouse melanoma cell)에 40 ㎍/㎖ 처리한 후 24시간 뒤에 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction)으로 mRNA 발현을 측정하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GADPH를 양성 대조군(positive control)으로 사용하였다. 실험에 사용한 프라이머 서열(primer sequences)은 표 1과 같다.
Gene Primer Sequence(5'→3')
Tyrosinase Forward GAC GGT CAC TGC ACA CTT TG
Reverse GCC ATG ACC AGG ATG AC
TRP-1 Forward ACT TCA CTC AAG CCA ACT GC
Reverse AGC TTC CCA TCA GAT GTC GT
TRP-2 Forward GCT CCA AGT GGC TGT AGA CC
Reverse AAT GCA GTG GCT TGG AAA TC
MITF Forward AGC GTG TAT TTT CCC CAC AG
Reverse TAG CTC CTT AAT GCG GTC GT
GAPDH Forward TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC
Reverse CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC
PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)는 94℃ 에서 30초, 55℃에서 45초, 72oC에서 45초(35 cycles), 티로시나아제(tyrosinase)는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 10,000 X Red safe를 첨가한 1.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에 100 V에서 20분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
그 결과, 도 6과 같이 소계 추출물(BSE) 및 소계 추출물의 생물전환물들(BSE-L, BSE-A, BSE-LI) 처리 군들은 모두 처리하지 않을 때와 비교하여 MITF, TRP-1, TRP-2 및 티로시나아제 mRNA 발현이 억제된 것으로 나타났다. 특히, '소계 추출물(BSE)' 및 '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)'에서 대조군에 비해 40%이상 발현을 억제시키는 것으로 나타났다.
3) Real time PCR 검증
더 나아가, MITF, TRP-1, TRP-2 및 티로시나아제의 mRNA을 실시간으로 분석하기 위해 Real-time polymerase chain reaction(PCR)은 thermal cycler와 분광형광 광도계가 일체화된 장치로, 실시간으로 target DNA 분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 분석하였다. 그 결과, 도 7과 같이 소계 추출물(BSE) 및 소계 추출물의 생물전환물들(BSE-L, BSE-A, BSE-LI) 처리 군들은 모두 처리하지 않은 군에 비해 mRNA 발현량이 억제된 것으로 나타났다. 특히 '소계 추출물(BSE)' 및 '소계 추출물+베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) (BSE-A)'의 경우 MITF, TRP1, 티로시나아제의 mRNA 발현이 현저하게 억제되었으며 이를 통해 멜라닌 생성 억제에 효과가 있는 것으로 가장 우수한 소재임을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

  1. 소계 추출물에 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되,
    상기 베타-글루코시다아제는, 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus Kawachii) 유래의 베타-글루코시다아제인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 소계 추출물에 라카아제(Laccase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되,
    상기 라카아제는, 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor) 유래의 라카아제인것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  3. 소계 추출물에 리파아제(Lipase)를 처리하여 반응시킴으로써 수득한 반응물을 포함하되,
    상기 리파아제는, 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) 유래의 리파아제인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 소계 추출물은,
    소계 전초에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 추출용매로 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023132738A1 (ko) * 2022-01-10 2023-07-13 코스맥스바이오 주식회사 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 손상 예방 또는 개선을 위한 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090044109A (ko) * 2007-10-31 2009-05-07 (주)아모레퍼시픽 고려 인삼 유래의 멜라닌 합성 저해 물질을 함유하는 미백화장료 조성물
KR20100066074A (ko) * 2008-12-09 2010-06-17 한국 한의학 연구원 조뱅이(소계) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 부종 또는 다양한 염증의 예방 또는 치료용 항염증 조성물
KR20190056257A (ko) * 2017-11-16 2019-05-24 장대한 조뱅이가 함유된 일회용 밴드

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090044109A (ko) * 2007-10-31 2009-05-07 (주)아모레퍼시픽 고려 인삼 유래의 멜라닌 합성 저해 물질을 함유하는 미백화장료 조성물
KR20100066074A (ko) * 2008-12-09 2010-06-17 한국 한의학 연구원 조뱅이(소계) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 부종 또는 다양한 염증의 예방 또는 치료용 항염증 조성물
KR20190056257A (ko) * 2017-11-16 2019-05-24 장대한 조뱅이가 함유된 일회용 밴드

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
대한민국 공개특허 제10-2019-0003011호(공개일자: 2019.01.09)는, 오이풀 수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 색소 침착 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 오이풀(Sanguisorba officinalis L.) 뿌리 부위(지유)의 수 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물이 개시되어 있다.
대한화장품학회지. 2006 *
천상욱 외 3명. 수종의 국화과 식물의 항산화 효과. 한국자원식물학회지, 2004 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023132738A1 (ko) * 2022-01-10 2023-07-13 코스맥스바이오 주식회사 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 손상 예방 또는 개선을 위한 조성물

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