KR101492196B1

KR101492196B1 - 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101492196B1
Application number: KR20130107029A
Authority: KR
Inventors: 김문무; 오영희; 남향; 권은정; 박혜정; 이수경; 홍수경; 김상민; 이경록
Original assignee: 주식회사 아미코스메틱
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-03-05
Also published as: CN103599020A

Abstract

본 발명은 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 식물 추출물을 단독으로 사용하였을 때는 DPPH 라디칼 소거능, 지질과산화 억제능력 및 환원력이 눈에 띄게 나타나지 않았으나 이들의 혼합 추출물에서는 DPPH 라디칼 소거능, 지질과산화 억제능력 및 환원력 모두에서 월등히 높은 결과를 보였으며, 혼합 추출물에서 멜라닌 생성 초기 단계에 관여하는 단백질인 티로시나아제의 활성을 억제시키고 TRP-1를 유의성 있게 감소시켜 미백 기능성 성분으로 알려져 있는 알부틴보다 더 뛰어난 효과를 보여 미백기능성 화장품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물{Composition for skin whitening comprising the mixed extract of poria cocos wolf, ulmi cortex and licorice root}

본 발명은 피부 미백 효과를 지닌 새로운 천연식물 혼합 추출물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되어 지는데 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소이다. 멜라닌은 피부(표피)내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되며 주변 각질세포(Keratinocyte)로 전이되어 사람의 피부색을 나타낸다. 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증(Vitiligo)과 같은 피부 병변이 유발된다. 반대로 과잉 생산은 중년 여성들의 주요 고민 중 하나인 기미, 주근깨를 형성하며 또한 피부암과도 밀접한 관계가 있다.

미백 작용을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다. 멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트라는 세포에서 티로신(Tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이된다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(Tyrosinase), 티로시나제 관련 프로테인 1(Tyrosinase-Related protein 1) 및 도파크롬 토토머라제(dopachrome tautomerase)가 있다. 티로시나아제 외에 이 두 효소는 주목을 끌고 있으나 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나아제이다. 멜라닌의 생합성 첫단계는 티로시나아제에 의하여 유발된다. 티로시나아제에 의해 티로신이 도파(Dopa)로 되고 이 도파를 도파퀴논(Dopa-quinone)으로 만든다. 이 두 반응의 다음단계 과정들은 비효소적인 반응에 의해서도 가능한 것으로 알려져 있으며 티로시나아제 단독으로도 멜라닌 생성이 가능하다고 알려져 있다.

최근에는 피부 세포내의 신호 전달물질의 발현에 따른 멜라닌 형성과정에 대한 새로운 이론이 제시되고 있다. 피부가 자외선에 노출되면 염증을 유발시키는 인터루킨-알파(Interlukin-)가 상피(Epidermis)내에 있는 케라티노사이트(Keratinocyte)로부터 발현되고, 이 인터루킨-알파가 케라티노사이트 엔도셀린(Endothelin) 발현을 촉진시킨다. 이러한 일련의 과정이 멜라노사이트의 형성을 증가시키고 멜라노사이트를 활성화시킨다. 이렇게 형성된 멜라노사이트내 멜라노좀에서 티로신이 티로시나아제에 의해 멜라닌이 형성된다.

또, NF-κB는 여러 가지 자극에 대해 응답적으로 활성화되어, 면역이나 증식, 염증 등에 관하여 여러 가지 유전자의 발현을 높여준다. NF-κB의 과잉 활성화가 암이나 류마티스, 건선 등과 관계있다는 것이 보고되어, 현재 세계적으로 NF-κB의 억제제 개발이 이루어지고 있다. NF-κB는 피부의 표피각화세포나 진피 섬유아세포에도 존재하고, 자외선이나 염증 등의 자극에 의해 NF-κB가 과잉으로 활성화, 전사활성이 항진하는 것으로 확인되고 있다. NF-κB의 과잉활성화는 세포에서의 염증성 사이토카인을 생성시키고 그 사이토카인에 의해 더욱 NF-κB의 발현이 일어난다. 또한, 세포증식인자인 bFGF(basic fibroblast growth factor)나 세포외 매트릭스 분해효소 MMP-1의 신생을 항진하여 표피각화세포의 과증식이나 각화이상에 의한 표피의 비후, 멜라노사이트의 증식에 의한 색소 침착, MMP-1의 진피 콜라겐 분해에 의한 피부 탄력의 저하 등을 일으키고 피부의 광노화와 관계있다.

피부의 멜라닌 세포인 색소를 만드는 표피 멜라노사이트는 자외선이나 만성적인 염증 등으로 증가하여, 그것이 피부에 있어서 멜라닌 생성량의 증대로 이어진다.

NF-κB는 염증시에 표피 각화세포에서 과잉 발현하고 멜라닌 세포증식작용이 있는 bFGF의 표피 각화세포에서의 생성을 촉진한다. 즉, NF-κB의 작용을 억제하는 물질은 염증이나 자외선에 의한 기미나 주근깨 등의 색소침착을 막는 효과를 나타낸다.

이미 아스코르빈산(특개평 4-9320), 하이드로퀴논(특개평 6-192062), 코직산(특개 56-7710), 알부틴(특개평 4-9315) 및 일부의 화합물들이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타나며 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다.

따라서 안정성이 뛰어나며 뛰어난 피부 미백 활성을 가지고 있는 천연물질의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제0562348호 한국등록특허 제0850686호

본 발명자들은 피부 미백 개선에 효능이 있는 물질을 찾고자 자연의 여러 가지 천연물질들 중에서 피부 미백에 유효한 물질을 스크리닝한 결과, 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물에 매우 우수한 피부 미백 효과가 있음을 규명하고 이에 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백복령 추출물은 화장료 조성물 총 중량부 대비 0.001 내지 2 중량 %, 유백피 추출물은 화장료 조성물 총 중량부 대비 0.001 내지 2 중량 %, 감초 추출물은 화장료 조성물 총 중량부 대비 0.001 내지 5 중량 %로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물은 물, 탄소수 1 ~ 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 티로시나아제 활성 저해 및/또는 멜라닌 생합성 저해를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 식물 추출물을 단독으로 사용하였을 때는 DPPH 라디칼 소거능, 지질과산화 억제능력 및 환원력이 눈에 띄게 나타나지 않았으나 이들의 혼합 추출물에서는 DPPH 라디칼 소거능, 지질과산화 억제능력 및 환원력 모두에서 월등히 높은 결과를 보였으며, 혼합 추출물에서 멜라닌 생성 초기 단계에 관여하는 단백질인 티로시나아제의 활성을 억제시키고 TRP-1를 유의성 있게 감소시켜 미백 기능성 성분이 있다고 알려져 있는 알부틴보다 더 뛰어난 미백 효과를 보여 미백기능성 화장품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 세포독성이 있는지 유무를 알아보기 위하여 MTT assay 분석을 한 결과이다.
도 2는 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 항산화 활성이 있는지를 알아보기 위하여 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 항산화 활성이 있는지를 알아보기 위하여 환원력을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 항산화 활성이 있는지를 알아보기 위하여 하이드록실라디칼(hydroxyl radical)에 의한 DNA의 산화적 손상 여부를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 항산화 활성이 있는지를 알아보기 위하여 지질과산화 정도를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 미백 활성이 있는지를 알아보기 위하여 티로시나아제 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 미백 활성이 있는지를 알아보기 위하여 멜라닌 생성 정도를 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 미백 활성이 있는지를 알아보기 위하여 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 및 SOD-1의 단백질 발현 정도를 확인한 결과이다.

본 발명은 피부 미백 개선에 효능이 있는 물질을 찾고자 자연의 여러 가지 천연물질들 중에서 피부 미백에 유효한 물질을 스크리닝한 결과, 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물에 매우 우수한 피부 미백 효과가 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

특히 본 발명자들은 천연물질로부터 유래되어 인체에 안정하면서도 탁월한 미백효과와 항산화 효과를 나타낼 수 있는 소재를 찾고자 모색하던 중, 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물에 주목하였으며 실제로 미백 효과가 있는지 실험을 통해 확인하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 대상으로 DPPH 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 Brand-Williams 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 PCEE, GUEE, UMEE, PGUE 군의 소거능력을 측정한 결과, 각각 단독으로 처리한 그룹과 혼합용액을 처리한 그룹의 DPPH 라디칼에 대한 소거능이 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 이들 혼합물인 PGUE는 15.6 μg/ml 농도 이상에서 78%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다. 이것은 양성대조군인 100 μg/ml의 비타민 C와 비교하였을 때 PGUE의 소거능이 10% 더 높음을 알 수 있었다(도 2 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 대상으로 환원력을 측정한 결과, 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에서는 환원력이 나타나지 않았으나 GUEE, UMEE, PGUE 군의 환원력은 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. GUEE는 62.5 μg/ml 농도에서 150%의 환원력을 나타내었으며 UMEE와 PGUE는 62.5 μg/ml 농도에서 UMEE는 350%, PGUE는 270%의 환원력을 나타내어 양성대조군으로 사용된 10 μg/ml의 비타민 C보다 환원력이 우수함을 알 수 있었다(도 3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 혼합 추출물에 지질과산화에 대한 항산화 활성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 다양한 농도의 리놀렌산 에멀전을 처리한 뒤 항산화 활성을 측정한 결과, 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물을 각각 처리한 군에서는 유효성 있는 억제효과를 나타내지 않았으나 백복령 주정추출물, 유용성 감초추출물 및 우백피 주정추출물의 혼합물인 본 발명의 PGUE는 7.8 μg/ml 이상의 농도에서 지질과산화를 17% 억제시킴을 알 수 있었으며, 15.6 μg/ml의 농도에서는 양성대조군으로 사용된 1000 μg/ml의 비타민 E와 비슷하게 지질과산화를 20% 정도 억제시켰음을 알 수 있었다(도 5 참조).

따라서 항산화 활성이 있는 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물은 기능성 화장료로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물은 백복령, 감초 및 우백피 추출물을 단독으로 처리한 군보다 티로시나아제 활성 억제효과 및 멜라닌 합성 억제 효과가 우수함을 알 수 있었다(도 6 및 7 참조).

나아가 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에 멜라닌 생성에 중요한 효소인 티로시나아제와 멜라닌 생성 신호전달기전에 중요한 TRP-1(tyrosinase related protein-1)와 TRP-2(tyrosinase related protein-2) 및 항산화 효소 중에서 가장 중요한 SOD(Superoxide dismutase)인 SOD-1의 단백질 발현이 있는지 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅 분석을 한 결과, 본 발명의 혼합 추출물은 대조군에 비하여 3.12 μg/ml 농도에서 TRP-2와 티로시나아제 단백질 발현에는 영향을 주지 않았으나 TRP-1 및 SOD-1의 발현을 감소시켰다는 것을 알 수 있었다(도 8 참조).

이와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물에 항산화 효과 및 피부 미백 효과를 가지고 있으며, 이러한 효과는 백복령, 유백피 또는 감초 추출물 단독에 의한 효과보다 월등하다는 사실을 실험적으로 입증하였다.

그러므로 본 발명은 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연물로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 ‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 백복령, 유백피 및 감초로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 백복령, 유백피 및 감초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.

상기 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 박층 크로마토 그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

한편, 본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물 이외에 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 인간의 피부에 적용하여 피부미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

재료 및 시료의 제조

<1-1> 재료 준비

세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), 트립신-EDTA, 페니실린(penicillin)/ 스트렙토마이신(streptomycin)/ 암포테리신(amphotericin)(각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. 또한, B16F1 세포주(cell line)는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였으며, MTT 시약, 젤라틴(gelatin), 아가로스(agarose)와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다.

<1-2> 시료의 제조

백복령 주정추출물(본 발명에서는 백복령 주정추출물을“PCEE”으로 명명함), 유용성 감초추출물(본 발명에서는 유용성 감초추출물을 “GUEE”으로 명명함), 우백피 주정추출물(본 발명에서는 우백피 주정추출물을 “UMEE”으로 명명함) 내지 세가지 혼합물(본 발명에서는 백복령 주정추출물, 유용성 감초추출물 및 우백피 주정추출물의 혼합물을 “PGUE”으로 명명함)는 하기와 같은 방법으로 추출하여 얻었다.

먼저, 백복령, 유백피을 흐르는 물에 깨끗이 세척한 다음 완전히 자연 건조시켰다. 세척·건조된 상기 백복령, 유백피를 주정에 3일간 추출하였으며, 상기 추출물을 여과한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 분말 형태의 백복령, 유백피 주정추출물을 얻었다. 감초 추출물의 경우 감초 뿌리를 무수 에탄올로 추출하여 얻은 추출물을 다시 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 다음 추출액을 감압농축하여 건조한 유용성 추출물을 분말형태로 만들었으며, 제조된 분말형태의 시료들을 시험농도로 희석하여 본 발명에 사용하였다.

< 실시예 2>

MTT assay 분석

본 발명자들은 실시예 1의 방법으로 제조된 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물의 MTT assay를 분석하기 위하여 Hansen [10]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 PCEE, GUEE, UMEE, PGUE의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.

B16F1세포에 대한 각 시료의 세포 독성을 측정한 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 PCEE, GUEE, UMEE, PGUE는 3.12 μg/ml 이하의 농도에서 대조군과 비교하였을 때 어떠한 독성효과가 없음을 알 수 있었다(도 1 참조).

< 실시예 3>

DPPH 라디칼 분석

본 발명자들은 실시예 1의 방법으로 제조된 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 Brand-Williams 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 PCEE, GUEE, UMEE, PGUE의 소거능력을 측정하였다. 각 시료를 시험농도로 처리하고 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, DPPH 라디칼 함량은 시료 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.

흔히 DPPH 라디칼 소거법은 항산화 물질에 의한 DPPH 라디칼의 탈색 정도를 지표로 하여 산화억제 정도를 예측할 수 있는 척도로 많이 사용되고 있는데 각각 단독으로 처리한 그룹과 혼합용액을 처리한 그룹의 DPPH 라디칼에 대한 소거능이 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 이들 혼합물인 PGUE의 15.6 μg/ml 농도 이상에서 78%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다. 이것은 양성대조군인 100 μg/ml의 비타민 C와 비교하였을 때 PGUE의 소거능이 10% 더 높음을 알 수 있었다(도 2 참조).

< 실시예 4>

환원력 분석

본 발명자들은 실시예 1의 방법으로 제조된 백복령, 유백피 및 감초의 혼합 추출물의 환원력을 분석하기 위하여 Oyaizu의 방법에 따라 측정하였다.

PCEE, GUEE, UMEE, PGUE 1 ml에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충용액 및 1%의 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide)을 각 1 ml씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1ml에 증류수 및 염화제2철(ferric chloride) 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 0.01% 바티민 C를 사용하였으며, 시료의 환원력은 시료 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에서는 환원력이 나타나지 않았으나 GUEE, UMEE, PGUE의 환원력은 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. GUEE는 62.5 μg/ml 농도에서 150%의 환원력을 나타내었으며 UMEE와 PGUE는 62.5 μg/ml 농도에서 UMEE는 350%, PGUE는 270%의 환원력을 나타내어 양성대조군으로 사용된 10 μg/ml의 비타민 C보다 환원력이 우수함을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한, 본 발명자들이 B16F1 세포로부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 Fenton 반응에 의하여 발생된 하이드록실라디칼(hydroxyl radical)에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 PGUE의 항산화 효과를 조사한 결과, 대조군의 genomic DNA는 도 4에서 보여지는 바와 같이 분해되었음을 알 수 있었다. 그러나 PGUE를 첨가한 군에서는 농도의존적으로 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과가 증가하였으며, 62.5μg/ml에서는 130%의 높은 보호효과를 보임을 알 수 있었다(도 4 참조).

< 실시예 5>

지질과산화에 대한 항산화 활성 분석

본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에서 지질과산화에 대한 항산화 활성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 PCEE, GUEE, UMEE, PGUE을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1%의 농도가 되게 리놀렌산 에멀전(linolenic acid emulsion)과 30분 동안 혼합한 후 0.8 mM H₂O₂ 및 0.8 mM FeSO₄를 혼합한 용액을 5 시간 동안 반응 시킨 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2시간 동안 반응시켜 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음, 15:1 비율의 n-부탄올 : 피리딘 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.

그 결과, 각 시료들을 처리했을 때 PCEE, GUEE, UMEE은 유효성 있는 억제효과를 나타내지 않았으나 백복령 주정추출물, 유용성 감초추출물 및 우백피 주정추출물의 혼합물인 본 발명의 PGUE는 7.8 μg/ml 이상의 농도에서 지질과산화를 17% 억제시킴을 알 수 있었으며, 15.6 μg/ml의 농도에서는 양성대조군으로 사용된 1000 μg/ml의 비타민 E와 비슷하게 지질과산화를 20% 정도 억제시켰음을 알 수 있었다(도 5 참조).

< 실시예 6>

티로시나아제 활성 분석

티로시나아제는 인체내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에 미백활성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 티로시나아제 활성을 측정하였다.

먼저 시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 ㎕와 시료액 20 ㎕ 그리고 머쉬룸타이로시나제(1500U/mL)액 20 ㎕를 순서대로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM 타이로신 액 40 ㎕를 넣고 37℃에서 10～15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 백복령 주정추출물(PCEE)과 우백피 주정추출물(UMEE)은 티로시나아제 억제효과를 나타내지 않았으나 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에서는 처리 농도 의존적으로 티로니아나제 억제 효능이 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 혼합물(PGUE)은 31.2 μg/ml농도에서 양성 대조군으로 사용된 2000 μg/ml의 알부틴(arbutin)의 효능보다 티로시나아제 활성 억제효과가 더 우수한 것으로 나타났다(도 6 참조).

따라서 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)은 백복령, 감초 및 우백피 추출물을 단독으로 처리한 군보다 티로시나아제 활성 억제효과가 월등히 우수함을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

멜라닌 생성 분석

본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에 미백활성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 멜라닌 생성 정도를 측정하였다.

먼저, 6-웰 플레이트에 3×10⁵cells/well로 세포를 분주하였고, 시료를 처리하고 1시간후에 L-dopa로 멜라닌 생성을 자극 후 48시간 동안 세포를 배양 하였다. 세포를 수집하여 1,200rpm에서 5분간 원심 분리하여 침전한 후, 1 ml 균질화 버퍼(homogenization buffer, 50 mM Sodium phosphate pH 6.5, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF)로 용해시켰다. 여기서 얻은 펠렛에 1N NaOH (10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 섞은(vortex) 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였으며, 멜라닌 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 웰에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(10⁴cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.

또한, 본 발명자들은 도파(DOPA) 자극을 통한 멜라닌 생성조절효과를 조사하기 위해 B16F1 세포를 사용하여 멜라닌 함량을 측정하였는데 그 결과, 백복령 주정추출물(PCEE)은 3.12 μg/ml 농도에서 멜라닌 생성이 대조군에 비해 9% 억제되었으며, 6.25 μg/ml 농도에서는 양성 대조군으로 사용된 알부틴(arbutin)과 억제효과가 유사한 것으로 나타났다.

본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)의 경우 6.25 μg/ml 농도에서 멜라닌 생성억제 효과가 대조군에 비하여 유의성 있는 것으로 나타났으며(P<0.01), 1N NaOH를 이용하여 세포내 멜라닌을 측정한 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이 색소의 영향을 받아 증가하는 양상을 보이는 감초추출물(GUEE) 그룹을 제외하고 백복령 주정추출물(PCEE)은 0.39 μg/ml 이상의 농도에서 멜라닌 합성을 25%이상 억제시켰음을 알 수 있었다.

본 발명에서 양성대조군으로 사용된 2000 μg/ml의 알부틴은 멜라닌 합성을 25% 정도 억제 시켰다. 우백피 주정추출물(UMEE) 역시 백복령 주정추출물(PCEE)와 비슷한 효과를 나타내었으며 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)의 경우 0.78 μg/ml 농도 이상에서 멜라닌 합성을 23% 억제 시킬 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 8>

웨스턴 블롯팅 분석

본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)에 멜라닌 생성에 중요한 효소인 티로시나아제와 멜라닌 생성 신호전달기전에 중요한 TRP-1(tyrosinase related protein-1)와 TRP-2(tyrosinase related protein-2) 및 항산화 효소 중에서 가장 중요한 SOD(Superoxide dismutase)인 SOD-1의 단백질 발현이 있는지 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅 분석을 하였다.

먼저, B16F1 세포를 5% CO₂ 및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% 소태아혈청, 2 mM 글루타민 및 100 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.

B16F1 세포에 용출 완충용액(50 mM TrisHCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 μg/ml leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 10 μg의 세포용출액을 10% TrisHCl 겔에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)으로 전이 시켰다.

그 다음 10% 탈지유를 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-tyrosinase, anti-TRP -1, anti-TRP -2, anti-SOD -1, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. 웨스턴 블롯의 밴드는 LAS3000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 백복령 주정추출물(PCEE)은 SOD-1의 단백질 발현을 감소시키는 것으로 나타났으나 멜라닌 생성 관련 다른 단백질의 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 항산화효소인 SOD-1의 단백질발현 감소는 백복령의 산화력에 기인된 것으로 보인다.

그러나 본 발명의 백복령, 감초 및 우백피 주정추출물의 혼합물(PGUE)은 대조군에 비하여 3.12 μg/ml 농도에서 TRP-2와 티로시나아제 단백질 발현에는 영향을 주지 않았으나 TRP-1 및 SOD-1의 발현을 감소시켰다는 것을 알 수 있었다(도 8 참조).

< 실시예 9>

통계처리

각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균± 표준편차로 나타내었다. 각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 P < 0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백복령 추출물은 화장료 조성물 총 중량부 대비 0.001 내지 2 중량 %, 유백피 추출물은 화장료 조성물 총 중량부 대비 0.001 내지 2 중량 %, 감초 추출물은 화장료 조성물 총 중량부 대비 0.001 내지 5 중량 %로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백복령, 유백피 및 감초 혼합 추출물은 물, 탄소수 1 ~ 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 티로시나아제 활성 저해 및/또는 멜라닌 생합성 저해를 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.