KR20180064848A - 백수오 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

피부 미백 또는 주름 개선에 탁월한 효능을 보이는 백수오 유래의 특정 생리활성 물질을 밝히고, 이러한 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 조성물로서, 의약품, 화장료 또는 건강기능식품 용도로 활용 가능한 조성물이 개시된다. 본 발명은 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)을 포함하는 피부 미백용 조성물과 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)을 포함하는 주름 개선용 조성물을 제공한다.

Description

백수오 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물{COMPOSITIONS FOR IMPROVING SKIN WHITENING AND SKIN WRINKLE COMPRISING PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES DERIVED FROM EXTRACT OF CYNANCHUM FILFORDII}
피부 미백 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백수오 추출물을 이용한 피부 미백 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 나이가 들면서 피부 노화와 색소 침착에 의해 끊임없이 변한다. 이러한 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다.
피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 일차적으로는 유전적 영향을 크게 받으며 부분적으로는 호르몬과 자외선 등에 영향을 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남, 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.
다음으로, 피부색과 함께 노화의 특징을 나타내는 인자는 주름의 생성과 탄력의 저하이다. 피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다(Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)). 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다(Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)). 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다(Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)). 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.
또한, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase; 이하 'MMP'라 칭함)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사와 자유 라디칼에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 기질 금속단백질 분해효소는 사람 피부의 각질형성세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)를 비롯한 체내 다양한 세포로부터 분비되는데, 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며 기질로써 여러 가지 세포외 기질을 이용한다. MMP는 그 기질특이성에따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류되는데, MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅹ 및 젤라틴이 있으며, 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(gelatinase)의 작용이 용이하도록 한다. MMP-2는 72 kD의 젤라티네이즈(A)가 이에 속하며 기질로는 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ, Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ, 엘라스틴 및 피브로넥틴을 분해한다. 또한 메탈로엘라스타아제(Metalloelastase)는 MMP-13으로 엘라스틴을 분해한다. 사람 피부의 진피층 대부분을 차지하는 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ, 엘라스틴, 피브로넥틴 등은 피부에 강도와 장력을 부여하는데 자외선과 자유 라디칼 등에 의해 비정상적으로 활성화된 MMP에 의해 단백질이 분해되면 주름과 탄력저하, 피부 처짐 등의 노화현상이 가속화된다. 특히 결합 단백질 중 가장 큰 비중을 차지하는 타입Ⅰ콜라겐을 분해하는 MMP-1의 활성과 생합성을 억제함으로써 피부 결합단백질을 보호하여 주름생성과 탄력저하를 예방할 수 있다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장료의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.
최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.
한편, 백수오(Cynanchum wilfordii)는 은조롱이라는 박주가리과(Asclepiadaceae) 식물의 덩이뿌리를 통칭하는 한약재명이다. 은조롱은 박주가리에 가까운 생김새를 가진 여러해살이 덩굴성 식물로서, 줄기는 시곗바늘과 같은 방향으로 돌아가면서 다른 물체를 감아 올라가고, 줄기는 가늘지만 꽤 질긴 편이며 길이 1~3m 정도로 자라며, 희고 살찐 덩이뿌리를 가지고 있는데 이 덩이뿌리를 말린 것이 바로 백수오이다. 열매는 익으면 갈라져서 길고 흰털이 붙어 있는 씨가 나온다. 제주도를 비롯하여 전국적으로 분포하고 있으며 산의 덤불 속에 난다.
생약명으로는 백수오는 백하수오(白何首烏), 백수오(白首烏) 또는 산백(山伯)이라고도 하며, 매체에 따라 하수오와 혼동되기도 하는데 양자는 전혀 별개의 식물이다. 백수오는 주로 늦가을 또는 이른봄에 굴취하여 햇볕에 말린다. 잘게 썰어서 사용하며, 함유 성분에 대해서는 아직 밝혀진 것이 없으나, 약효로는 자양, 강장, 보혈, 정력 증진 등의 효능이 있고 종기를 가라앉히는 작용도 한다. 적용질환은 빈혈증, 병후의 허약증세, 양기부족, 신경통, 만성풍비(뇌와 척수에 이상이 생겨 몸과 팔다리가 마비되고 감각과 동작에 장애가 있는 병), 허리와 무릎이 쑤시고 아픈 증세, 선질병(체질박약, 임파선종양, 습진, 수포성결막염 등이 생겨나는 전신질환) 등이다. 기타 일찍 머리카락이 하얗게 되는 증세와 궤양이 오래도록 아물지 않을 때에도 쓰인다. 용법으로 말린 약재는 1회에 2~5g씩 200 cc의 물로 뭉근하게 달이거나 또는 곱게 가루로 빻아 복용한다.
이러한 백수오의 용도와 관련하여, 등록특허 제1666348호, 공개특허 제2010-0028601호 등에서는 백수오 추출물의 피부 노화 방지, 피부 주름 개선 효능 등에 관해 개시하고 있다. 그러나, 백수오의 다양한 생리활성 물질 중 어떠한 물질이 특히 피부 미백 또는 주름 개선에 영향을 미치는 것인지 명확히 알려지지 않고 있다.
따라서 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 피부 미백 또는 주름 개선에 탁월한 효능을 보이는 백수오 유래의 특정 생리활성 물질을 밝히고, 이러한 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 조성물로서, 의약품, 화장료 또는 건강기능식품 용도로 활용 가능한 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 양태에 따르면, 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
또한 상기 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)은 백수오 추출물로부터 획득된 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한 상기 백수오 추출물은 에탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 다른 양태에 따르면, p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)을 포함하는 주름 개선용 조성물을 제공한다.
또한 상기 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 및 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)은 백수오 추출물로부터 획득된 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한 상기 백수오 추출물은 에탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 피부 미백과 주름 개선에 탁월한 효능을 나타내는 백수오 유래 생리활성 물질이 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N), p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)임을 명확히 제시함으로써 백수오 추출물을 활용한 피부 미백 또는 주름 개선용 조성물 제조 시 상기 물질 함량 조절 등을 통해 효율적인 제조기준을 제공하는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따른 조성물은 천연물로부터 추출한 추출물에서 유래하여 부작용이 거의 없고, 피부 세포의 콜라게나제 활성 및 티로시나제 활성을 억제하기 때문에, 이를 주름 및 피부색소침착 등을 치료하거나 개선하기 위한 의약품, 화장료 또는 건강기능식품으로 사용할 경우 우수한 항주름 및 피부미백효과를 기대할 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 백수오 추추물의 유효물질인 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone)과 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 2는 백수오의 물, 30, 70, 95% 에탄올(EtOH) 및 에틸아세테이트(EA) 추출물의 10, 50, 100 및 500㎍/mL 농도에서 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 소거 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 3은 백수오의 물, 30, 70, 95% 에탄올(EtOH) 및 에틸아세테이트(EA) 추출물의 10, 50, 100 및 500μg/mL 농도에서 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 소거 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 4는 백수오의 물, 30, 70, 95% 에탄올(EtOH) 및 에틸아세테이트(EA) 추출물의 10, 50, 100 및 500μg/mL 농도에서 TBA 측정을 통한 항산화 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 5는 백수오 추출물 자체의 직접적인 티로시나아제(tyrosinase) 억제능을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 백수오 추출물의 세포독성 및 멜라닌 생합성 억제효과를 나타낸 결과를 나타낸 그래프,
도 7은 백수오 추출물의 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 8은 B16F10 세포주에서 백수오 추출물에 의한 티로시나아제(tyrosinase), MITF, TRP1, TRP2 단백질의 발현을 측정한 결과를 나타낸 사진,
도 9는 B16F10 세포주에서 백수오 추출물에 의한 티로시나아제(tyrosinase), MITF, TRP1의 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 10은 백수오 추출물의 주요 성분 4종에 대한 세포독성 및 멜라닌 생합성 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 11은 섬유아세포 HS68에서 백수오 추출물 24, 48시간 처리에 따른 세포 생존율 결과를 나타낸 그래프,
도 12는 백수오 추출물의 프로-콜라겐(pro-collagen) 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 13은 TNF-α 처리 후 MMP-1 발현을 유도시켜 백수오 추출물을 처리하여 MMP-1효소 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 14는 TNF-α 처리 후 MMPs의 발현을 유도시켜 백수오 추출물을 처리하여 MMP-1, 2, 9의 단백질 변화량을 측정한 결과를 나타낸 사진,
도 15는 TNF-α 처리 후 MMPs의 발현을 유도시켜 백수오 추출물을 처리하여 MMP-1, 2, 9의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 16은 백수오 추출물의 주요 성분 4종에 대한 프로-콜라겐(pro-collagen) 양 및 MMP-1효소 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 백수오 추출물이 멜라닌 합성을 저해 및 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해를 통해 미백 개선에 탁월한 효과를 보이고, 티로시나아제(tyrosinase), MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 및 TRP1(tyrosinase related protein 1)의 단백질과 유전자 발현을 억제시키는 것을 확인하였고, 또한 인체유래 섬유아세포에서 타입 1 프로콜라겐(type 1 procollagen) 생합성량을 증가시키고, TNF-α에 의한 MMP-1 및 MMP-2의 단백질과 유전자 발현을 억제시키는 것을 확인하였고, 이러한 백수오 추출물에 포함된 생리활성 물질 중 피부 미백, 주름 개선에 특이적 활성을 보이는 물질을 탐색하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 미백 기능성을 나타내는 유효물질은 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)이고, 주름 개선 기능성을 나타내는 유효물질은 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)임을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)을 포함하는 피부 미백용 조성물과, p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)을 포함하는 주름 개선용 조성물을 개시한다.
본 발명에서 상기 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N), p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 및 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)은 특별히 한정되는 것은 아니나, 백수오 추출물로부터 획득되는 것이 바람직하다.
상기 백수오 추출물은 백수오로부터 당 업계에 알려진 방법을 적절히 채택하여 제조될 수 있고, 따라서 추출시간, 용매, 온도 등의 조건은 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 또는 에틸아세테이트를 사용하여 추출할 수 있다.
본 발명에 따른 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)을 포함하는 피부 미백용 조성물과, p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)을 포함하는 주름 개선용 조성물은 그 목적에 따라 의약품, 화장료 또는 건강기능식품 형태로 활용될 수 있다.
상기 의약품으로 활용 시 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물로 활용 시 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함될 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체가 포함될 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있다. 또한 상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 또한 상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 또한 상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 또한 상기제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 건강기능식품으로 활용 시 상기 유효성분 이외에 건강기능식품에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함될 수 있으며, 예컨대 건강기능성 음료로 제조 시 구연산, 올리고당, 타우린, 과실농축액 등이 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1: 백수오 추출물 제조
(1) 백수오 증류수 추출(샘플 번호 NO.1)
백수오 시료 50g에 증류수를 10배수 가하여 95℃로 24시간 가열한 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조물 8.9g을 수득하였다(추출수율 17.8%).
(2) 백수오 30% 에탄올 추출(샘플 번호 NO.2)
백수오 시료 50g에 30%(v/v) 에탄올을 10배수 가하여 20℃로 24시간 추출 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조물 6.7g을 수득하였다(추출수율 13.4%).
(3) 백수오 70% 에탄올 추출(샘플 번호 NO.3)
백수오 시료 50g에 70%(v/v) 에탄올을 10배수 가하여 20℃로 24시간 추출 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조물 6.9g을 수득하였다(추출수율 13.8%).
(4) 백수오 95% 에탄올 추출(샘플 번호 NO.4)
백수오 시료 50g에 95%(v/v) 에탄올을 10배수 가하여 20℃로 24시간 추출 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조물 4.8g을 수득하였다(추출수율 9.6%).
(5) 백수오 에틸아세테이트(Ethyl acetate; EA) 추출(샘플 번호 NO.5)
백수오 시료 50g에 95%(v/v) 에틸아세테이트를 10배수 가하여 20℃로 24시간 추출 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조물 0.5g을 수득하였다(추출수율 1.0%).
실시예 2: 생리활성 물질 분리
백수오 추추물의 유효물질인 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone)과 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)을 HPLC를 통해 분석하였다. 분석장비는 Agilent 1260 HPLC system 및 YMC-Triart C18(150×4.6mm, 5㎛) 컬럼을 사용하였다. 분석에는 이동상 A(0.1% trifluoroacetic acid(in water)), 이동상 B(1% trifluoroacetic acid(in 100% acetonitrile))를 사용하였다. 이동상의 속도는 1ml/min이었으며, 샘플은 20㎕ 주입하였고, 흡광도는 278nm에서 측정하였다. HPLC 분석 결과를 도 1a 내지 도 1e에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 분리된 물질이 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone)과 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)임을 확인하였으며, 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)은 측정 조건을 변화시켜 분리될 수 있다(Kim 등, Wilfoside K1N isolated from Cynanchum wilfordii inhibits angiogenesis and tumor cell invasion. Intl. J. Oncol. 26. 2005. 1533-1539).
실시예 3: 기능성 유효물질 선정
백수오 추출물 중 피부 미백 또는 주름개선 기능성을 나타낼 것으로 예상되는 후보 유효물질로서 시나노네사이트 B(Cynanoneside B)(물질 A), 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)(물질 B), p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone)(물질 C) 및 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)(물질 D)을 선정하였으며 각 물질은 천연물 물질은행 또는 Sigma社로부터 공급받아 이하의 실험에 사용되었다.
실험예 1: 백수오 추출물의 항산화능 검증
(1) 실험 과정
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과(radical scavenging effect)를 측정하는 Blois법을 활용하였다. DPPH를 메탄올(MeOH)에 녹여 0.2mM DPPH 용액을 제조하여, 준비된 DPPH 용액에 시료용액을 1:1로 섞은 후 차광, 실온에서 30분간 방치하였다가 520nm에서 흡광도를 측정하였다.
SOD 활성 측정에는 분석장치(SOD assay kit-WST, Dojindo, Tokyo, Japan)가 사용되었다. 96 웰 플레이트(well plate)를 이용하여 각각의 시료를 WST-1 용액 및 효소(enzyme) 용액과 37℃에서 20분간 반응시키고 난 후, ELISA 리더(reader)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 비타민 C(vitamin C) 50μM 및 트롤록스(trolox) 500μg/mL를 사용하였다.
TBA(Thiobarbituric acid) 측정은 시료를 에탄올에 녹인 후 취해 0.04M 포스페이트 완충액(phosphate buffer) 및 에탄올에 녹인 2.51% 리놀렌산(linoleic acid)과 함께 혼합하여 반응 혼합물을 만든 후 40℃의 암소에서 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 취하여 0.75% TBA 및 35% TCA를 혼합하여 15분간 95~100℃ 항온조(water bath)에서 가열 후 바로 얼음물에서 냉각시켰다. 이를 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액에 대하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2) 실험 결과
도 2는 백수오의 물, 30, 70, 95% 에탄올(EtOH) 및 에틸아세테이트(EA) 추출물의 10, 50, 100 및 500㎍/mL 농도에서 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 소거 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 양성 대조군으로 비타민 C(Vit C) 50μM을 사용하였으며, 도 2를 참조하면 모든 백수오 추출물은 농도 의존적으로 항산화 효과가 있었으며, 특히 모든 농도의 EA 추출물(NO.5)에서 유의적인 라디칼 소거활성을 보였으며, 상기 EA 추출물의 경우 고농도에서 양성 대조군 수준의 뛰어난 항산화 효능을 보였다.
도 3은 백수오의 물, 30, 70, 95% 에탄올(EtOH) 및 에틸아세테이트(EA) 추출물의 10, 50, 100 및 500μg/mL 농도에서 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 소거 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 양성 대조군으로 비타민 C(Vit C) 10, 50, 100 및 500μM을 사용했으나 효과가 없었다. 백수오 추출물 역시 농도 의존적으로 항산화 효과가 있었으며, 특히 EA 추출물에서 8, 21.5, 42.6 및 93.6% SOD 라디칼 소거능을 보여 높은 항산화 효과를 나타내었다.
도 4는 백수오의 물, 30, 70, 95% 에탄올(EtOH) 및 에틸아세테이트(EA) 추출물의 10, 50, 100 및 500μg/mL 농도에서 TBA 측정을 통한 항산화 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 반응시간 5일째의 항산화 효과를 비교한 결과 물, 30% 에탄올 추출물에서 250μg/mL인 저농도에서 50, 60%의 저해율을 보였고, 70, 95%, EA 추출물에서 농도 의존적으로 항산화 효과가 증가하였다.
실험예 2: 미백 기능성 평가
(1) 실험 과정
머쉬룸 티로시나아제(Mushroom tyrosinase)는 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(Potassium Phosphate Buffer(PPB), pH 6.81)에 증류수를 가한 용매에 25,000unit을 녹여 효소액으로 사용하고, 기질은 L-DOPA(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)를 0.01%로 증류수에 녹여 사용하였다. 시료는 0.1M PPB에 녹여 사용하고, 양성 대조군으로 코직산(kojic acid)을 사용하였다. 96 웰(well)에 0.1M PPB, 시료, 기질액, 효소액을 넣고 실온에서 2분간 반응시켜 475nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포내 멜라닌 생합성 억제효과는 B16F10을 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 24시간 배양한 후, α-MSH(멜라닌세포 자극 호르몬, 100nM)를 처리하여 24시간 더 배양하였다. 시료와 α-MSH를 처리하고 48시간 동안 배양한 후 배양액을 모두 제거하고 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 회수한 후 10,000~13,000rpm으로 15분간 원심분리 한 다음 얻은 펠렛(pellet)을 알코올로 세척한 후, 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH 용액으로 60℃ 항온조에서 1시간 방치하여 멜라닌을 녹여내고 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포내 티로시나아제(tyrosinase) 활성 측정은 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 α-MSH(100nM)를 24시간 처리한 후, α-MSH와 함께 여러 농도의 시료를 처리하여 수행되었다. 시료와 함께 48시간 배양한 후 트립신(trypsin)으로 세포를 얻어 PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거한 다음 EDTA와 트리톤(triton) X-100, PMSF를 포함하는 0.1M 완충액(sodium phosphate buffer(SPB), pH 6.8)으로 얼음에서 30분간 세포를 용해시켰다. 이후 4℃에서 15,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액에서 티로시나아제(tyrosinase)를 얻은 다음 단백질 양을 계산하였다. 0.1M SPB에 희석한 동량의 단백질과 L-DOPA를 37℃에서 1 시간 반응시키고 475nm에서 흡광도를 측정하였다.
Tyrosinase, MITF, TRP1, TRP2에 대한 단백질 및 DNA 변화 분석은 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 α-MSH(100nM)를 처리하여 수행되었다. 24시간 뒤에 α-MSH와 함께 시료를 여러 농도로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 세포를 모두 수거하였다. 트립신(Trypsin)으로 세포를 얻어 PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거하였다. 단백질 분리는 PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거한 후 프로테이나제 저해제(proteinase inhibitors)를 포함한 용균 버퍼(lysis buffer)로 얼음에서 20~30분간 용해시켰다. 용해물(lysate)을 13,000rpm에서 20분간 원심분리 한 후 상층액을 취해 얻은 단백질을 정량하여 웨스턴 블롯(western blot)에 사용하였다. Eszy-Blue™ Total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Korea)로 mRNA를 추출 후, TaqMan RNA-to-Ct™ 1-Step Kit를 사용하여 추출물과 프라이머(primer)를 혼합하고 StepOne 기계에서 48℃에서 15 분, 95℃에서 10분 1회, 95 ℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 40~60회 반복하여 Ct(threshold cycle) 값을 측정하였다.
(2) 실험 결과
도 5는 백수오 추출물 자체의 직접적인 티로시나아제(tyrosinase) 억제능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 양성대조군으로 사용한 코직산(kojic acid)은 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소하였으며 유의적으로 감소를 보였으나, 모든 백수오 추출물의 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 억제 활성은 없는 것으로 나타났다.
도 6은 백수오 추출물의 세포독성 및 멜라닌 생합성 억제효과를 나타낸 결과를 나타낸 그래프이다. 24시간 후 세포생존율을 측정한 결과 모든 백수오 추출물은 모든 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았다. 세포내 멜라닌 생합성 억제효과는 α-MSH 처리한 그룹을 100% 기준으로 해서 미백효과를 확인하는 것으로 하였다. 양성대조군으로 사용한 코직산(kojic acid)과 비타민 C(Vit C)는 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소하였으며 유의적으로 감소를 나타내었다. 또한 모든 백수오 추출물에서 유의적 감소를 보였으며, 특히 EA 추출물(NO.5)에서 농도 의존적 감소를 나타내었다.
도 7은 백수오 추출물의 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. α-MSH를 처리한 그룹을 100% 기준으로 해서 활성을 측정하였다. 그 결과 70% 주정(NO.3), EA(NO.5) 추출물에서 유의적 감소를 나타내었다.
도 8은 B16F10 세포주에서 백수오 추출물에 의한 티로시나아제(tyrosinase), MITF, TRP1, TRP2 단백질의 발현을 측정한 결과를 나타낸 사진이다. 30%(NO.2), 95%(NO.4) 에탄올 추출물에서 티로시나아제(tyrosinase) 발현을 억제하였으며, MITF는 물(NO.1), 30%(NO.2), 70%(NO.3), 95%주정(NO.4) 추출물에서 α-MSH 처리군에 비해 발현이 감소되었다. 물(NO.1), 30%(NO.2), 70%(NO.3), 95%(NO.4) 에탄올 추출물에서 TRP-1 발현 감소를 보였고, 모든 처리군에서 TRP-2의 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
도 9는 B16F10 세포주에서 백수오 추출물에 의한 티로시나아제(tyrosinase), MITF, TRP1의 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 백수오 에탄올 추출물들의 MITF mRNA 발현은 α-MSH 처리군에 비해 약 40% 발현 감소를 보였다. 물(NO.1), 30%(NO.2), 95%(NO.4) 에탄올 추출물에서 티로시나아제(tyrosinase) mRNA 발현은 α-MSH 처리군에 비해 약 20% 발현 감소를 나타내었다.
도 10은 백수오 추출물의 주요 성분 4종에 대한 세포독성 및 멜라닌 생합성 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 물질 A(Cynanoneside B), 물질 C(p-Hydroxyacetophenone), 물질 D(2,4-dihydroxyacetophenone)에서 세포독성은 보이지 않았다. 물질 B(Wilfoside K1N)에서는 농도 의존적으로 세포감소율을 보였다. 25μg/mL, 50μg/mL 및 100μg/mL 농도에서 각각 86%, 60%, 7% 세포생존율을 보였으며 유의성을 나타내었다. 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 마우스 흑색종 B16F10 세포에서 주요 성분 4종이 독성을 보이지 않은 농도인 25μg/mL에서 수행되었다. α-MSH를 처리한 그룹을 100% 기준으로 해서 미백효과를 확인하였으며 양성대조군인 코직산(kojic acid) 및 비타민 C(Vit C)는 약 20% 멜라닌 함량 감소를 보였으며, 물질 B(Wilfoside K1N)에서 α-MSH 그룹 대비 20% 멜라닌 감소를 보여 양성대조군(positive control)과 유사한 수준의 멜라닌 생합성 억제효과를 나타내었다.
실험예 3: 주름 개선 기능성 평가
(1) 실험 과정
백수오 추출물의 세포 안전성을 확인하기 위해 섬유아세포 HS68 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 2×10cells/well이 되도록 분주한 후 24시간 배양하였다. 배지는 제거 후 추출물의 농도를 10μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml, 200μg/ml로 처리하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 상층액은 제거하고, MTT(3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)를 1mg/ml 만들어 100μl/well 넣고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 배양한 후 상층액을 제거하고, DMSO(Sigma-Aldrich Co., St. Louis,MO, USA) 100μl/well를 가하여 540nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader, TECAN, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
콜라겐 생합성 정도는 PIP(procollagen type-ⅠC peptide) EIA kit(Takara, MK101)를 사용하여 측정하였다. 용액(antibody-POD conjugate solution) 100㎕를 각 웰(well)에 첨가하고, 샘플과 스탠다드(standard)를 20㎕씩 넣은 후 잘 섞어 37℃에서 3시간 방치한 후 반응이 끝나면 내용물을 제거한 후 PBS로 4회 세척 후 기질용액 100㎕를 첨가하여 실온에서 15분간 반응 후 종결 용액(stop solution) 100㎕을 첨가하여 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준곡선을 통해 계산식을 구하여 콜라겐 양을 측정하였다.
MMP-1(Matrix Meralloproteinase-1)저해 활성은 섬유아세포 HS68 세포를 2×10cells/well 농도로 6-웰 플레이트(well plate)에 접종한 후, 각 웰(well)에 시료를 25μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml의 농도로 첨가하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10ng/ml의 농도로 첨가하였다. 이렇게 처리된 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였다. Gross B. E. 등의 방법에 따라 MMP-1 Biotrack activity Assay Kit(Amersham Bioscience)을 이용하여 플레이트(plate reader)로 흡광도를 측정하고 표준곡선을 통해 계산식을 구하여 세포 배양액 내 콜라게네이즈 활성을 수치화하였다.
MMP-1, 2, 9에 대한 단백질 및 DNA 변화 분석은 24시간 동안 부착시킨 섬유아세포 HS68에 TNF-α(10ng/mL)를 처리한 후, 24시간 뒤에 TNF-α와 함께 시료를 농도별로 처리하여 수행되었다. 시료와 함께 24시간 동안 배양한 후 트립신(trypsin)으로 세포를 얻어 PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거하였다. 단백질 분리는 PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거한 후 프로테이나제 저해제(proteinase inhibitors)를 포함한 용균 버퍼(lysis buffer)로 얼음에서 20~30분간 용해시켜 수행되었다. 용해물(lysate)을 13,000rpm에서 20분간 원심분리 한 후 상층액을 취해 얻은 단백질을 정량하여 웨스턴 블롯(western blot)에 사용하였다. Eszy-Blue™ Total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Korea)로 mRNA를 추출 후, TaqMan RNA-to-Ct™ 1-Step Kit를 사용하여 추출물과 프라이머(primer)(MMP-1, MMP-2, MMP-9)를 혼합하고 StepOne 기계에서 48℃에서 15분, 95℃에서 10분 1회, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 40~60회 반복하여 Ct(threshold cycle) 값을 측정하였다.
(2) 실험 결과
도 11은 섬유아세포 HS68에서 백수오 추출물 24, 48시간 처리에 따른 세포 생존율 결과를 나타낸 그래프이다. 도 11을 참조하면 백수오 샘플 모든 농도에서 48시간 처리까지 세포독성은 관찰되지 않았다.
도 12는 백수오 추출물의 프로-콜라겐(pro-collagen) 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 백수오 물 추출물을 제외한 모든 추출물에서 대조군(control)보다 높은 프로-콜라겐(pro-collagen)이 측정되었다. 대조군(control)을 100%로 했을 때 30%(NO.2), 70%(NO.3), 95%(NO.4) 에탄올, EA(NO.5) 추출물에서 각각 17, 11, 5, 4, 6%의 프로-콜라겐(pro-collagen) 양이 증가되었다.
도 13은 TNF-α 처리 후, MMP-1 발현을 유도시켜 백수오 추출물을 처리하여 MMP-1효소 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. TNF-α을 저해율 100%로 했을 때 30% 에탄올 추출물(NO.2)은 75%, 95% 에탄올 추출물(NO.4)은 48%, EA 추출물(NO.5)은 33.5%를 나타내었고, 백수오 95% 에탄올 추출물과 EA 추출물에서 유의적 차이를 나타내었다.
도 14는 TNF-α 처리 후, MMPs의 발현을 유도시켜 백수오 추출물을 처리하여 MMP-1, 2, 9의 단백질 변화량을 측정한 결과를 나타낸 사진이다. MMP-1의 단백질 발현을 측정한 결과 TNF-α를 처리하여 MMP-1 발현이 증가됨을 확인하였고, 30%, 95% 에탄올 추출물에서 MMP-1 발현 감소를 나타내었다. MMP-2는 물(NO.1), 30%(NO.2), 95%(NO.4) 에탄올 추출물에서 TNF-α 처리군에 비해 발현 감소를 나타내었다. 모든 처리군에서 MMP-9의 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
도 15는 TNF-α 처리 후, MMPs의 발현을 유도시켜 백수오 추출물을 처리하여 MMP-1, 2, 9의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. TNF-α를 10ng/mL를 처리하여 MMP1, 2, 9의 발현량이 대조군(control)과 비교해서 모두 증가되었음을 관찰할 수 있었다. 백수오 추출물이 MMP-1 발현에는 영향을 주지 않았으며 MMP-2 발현 저해율은 물(NO.1), 70%(NO.3) 에탄올 추출물에서 각각 12.3, 4.9% 유의적 감소를 보였고, MMP-9 발현 관찰 결과 물(NO.1)에서 41.9% 유의적 감소를 나타내었다.
도 16은 백수오 추출물의 주요 성분 4종에 대한 프로-콜라겐(pro-collagen) 양 및 MMP-1효소 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 물질 B(Wilfoside K1N)를 제외한 모든 성분에서 대조군(control)보다 높은 프로-콜라겐(pro-collagen)이 측정되었다. 대조군(control)을 100%로 했을 때 물질 A(Cynanoneside B), 물질 C(p-Hydroxyacetophenone), 물질 D(2,4-dihydroxyacetophenone)에서 각각 18, 8, 27%의 프로-콜라겐(pro-collagen)이 증가되었고, 물질 D(2,4-dihydroxyacetophenone)에서 유의적 차이를 나타내었다. MMP-1효소 저해 활성을 측정한 결과 물질 C(p-Hydroxyacetophenone)에서 40% 저해율을 보였으며 유의적 차이를 나타내었다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)을 포함하는 피부 미백용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 윌포사이드 K1N(Wilfoside K1N)은 백수오 추출물로부터 획득된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 백수오 추출물은 에탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 또는 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)을 포함하는 주름 개선용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 p-히드록시아세토페논(hydroxyacetophenone) 및 2,4-디히드록시아세토페논(2,4-dihydroxyacetophenone)은 백수오 추출물로부터 획득된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 상기 백수오 추출물은 에탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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