KR20140126205A

KR20140126205A - 명감나무 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 미백 및 주름개선 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20140126205A
Application number: KR1020130044470A
Authority: KR
Inventors: 이진영; 이수연
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2014-10-30

Abstract

본 발명은 명감나무(Smilax China L.) 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 미백용 및 주름개선용 화장료 조성물에 대한 것으로, 본 발명자들은 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 전자공여능, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성 측정, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 측정, 콜라게나아제(collagenase) 저해활성 측정을 통하여 명감나무 줄기 추출물이 뿌리 추출물보다 활성이 우수함을 확인하였으며, 이에 따라 명감나무 줄기 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 종래보다 우수한 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

명감나무 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 미백 및 주름개선 화장료 조성물{Anti-whitening and anti-wrinkle cosmetic composition comprising the extract of Smilax China L. Stem as active ingredient}

본 발명은 명감나무(Smilax China L.) 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 미백용 및 주름개선용 화장료 조성물에 대한 것으로, 종래보다 우수한 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

자외선은 노화뿐만 아니라 피부 멜라닌 생성을 유발하며 일반적으로 멜라닌은 자외선과 같은 외부자극으로부터 피부를 보호하기 위해 만들어지지만, 과도한 멜라닌 합성과 축적은 기미, 주근깨와 같은 질병을 일으키게 된다. 멜라닌 생성은 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2의 세 효소에 의해 조절된다. 그 중 멜라닌 생성과정에서 주요 효소인 tyrosinase는 L-DOPA가 합성되는 단계와 L-DOPA로부터 DOPA quinone이 합성되는 단계를 촉진하여 멜라닌 합성을 촉진한다. 멜라닌 생합성에 관여한 인자로는 tyrosinase, dopachrome conversion factor, prostaglandin (PG), interferon (IFN), melanocyte stimulating hormone (MSH), Vit. D₃,histamine등이 보고되어 있으며, 현재 tyrosinase 저해제로서 kojic acid와 albutin이 미백제로 많이 사용되고 있으나 세포독성, 돌연변이 유발 등의 부작용 등이 보고되고 있다.

또한, 자외선에 의해 증가되는 여러 단백질 분해효소 중에서 기질을 분해하는 matrix metalloproteinase (MMPs)는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다. 피부 진피 내 세포 외 기질단백질(extracellular matrix)은 피부의 구조와 탄력성을 유지하는데 중요한 역할을 하는데, 그 중 80~85%가 제 1형 교원질(type Ⅰ procollagen)로 이루어져 있다. 제 1형 교원질은 전구체인 procollagen 형태로 합성이 된 후 세포 밖으로 배출되어 아미노 말단과 카복실말단이 잘려나간 후 완성된 교원질을 만들게 된다. 기질 단백질의 재구성에는 여러 생체 반응이 관여하며, 이 중 특히 MMPs가 기질 단백질들을 분해하는 중요한 역할을 하고 있으며 intestitial collagenase (MMP-1), 72kD gelatinase (MMP-2), 92kD gelatinase (MMP-9), neutrophil collagenase (MMP-8), collagenase (MMP-13) 등 26가지 이상의 MMPs가 이미 알려져 있다. 자외선에 노출된 피부에서는 MMPs의 발현이 증가되며, 증가된 MMPs가 피부를 구성하고 있는 교원질을 분해하여 기질 단백질의 결핍을 초래하게 됨으로써 피부노화가 일어난다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 stress-activated mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway가 관여한다고 보고되어 있으며, 또한 MAP kinase 신호전달 경로는 cell growth, MMP 발현, 교원질 합성 등을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 자외선에 의해 세포표면에 있는 growth factor와 cyrokine receptor가 활성화 되면 ERK (extracellular signal-regulated kinase), p38을 포함한 MAP kinase signal transduction pathway를 경유하여 신호를 조절하게 된다. 따라서 노화된 세포에서는 전사인자인 AP-1의 활성도가 증가되어 있다. 증가된 AP-1 활성도는 교원질 분해 효소인 MMP들의 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래하는 것이다. 그러므로 stress-activated MAP kinase pathway는 전사인자인 AP-1을 활성화 시키고 결과적으로 MMPs의 발현을 증가시킨다.

한편, 명감나무(Smilax China L.)는 한국, 일본, 중국, 필리핀 및 인도차이나 등의 지역에 분포하며, 우리나라 대부분의 산야에서 서식하는 백합과(Lilaceae)에 속하는 덩굴성 관목으로 지역에 따라 청미래덩굴, 명감나무, 매발톱가시, 참열매덩굴, 종가시덩굴 등 다양하게 불리고 있으며 원예 분야에서는 멍개나무 또는 망개나무로 잘 알려져 있다. 잎은 넓은 타원형으로 광택이 있으며 두껍고, 5월에 황록색의 꽃이 피며, 9-10월에 둥근 열매가 빨갛게 익는다. 어린순과 열매는 식용을 하고, 뿌리와 나무는 해열, 해독, 이뇨 등의 증상 완화, 체력증강 및 피부염, 신장염, 방광염, 항균작용, 관절염, 유방암 등에 효과가 있다고 알려져 있다. 명감나무의 함유 성분으로는 pseudoprotodioscin, dioscin, protodioscin, sieboldogenin, glycoside등이 있다.

또한, 명감나무(Smilax China L.)의 근경을 지칭하는 토복령의 성분에 관한 연구는 아직 많지는 않지만 saponin, tannin 등이 주성분이라고 알려져 있으며, 뿌리에서 분리된 배당체 ophiopogonin과 점액성 물질이 많이 포함되어 인체의 면역 증진과 각종 세균의 감염으로부터 장기를 보호하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며 또한 중금속 중독에 대한 해독 작용에 효과적이라고 알려져 있다.

이와 같이, 명감나무를 이용한 기존의 연구는 대부분 명감나무의 뿌리에 대한 것이었고, 명감나무의 뿌리를 이용하더라도 화장료 조성물로서의 효과는 미흡한 실정이었다. 이에 따라, 명감나무 추출물을 포함하되 더욱 효과가 우수한 화장료 조성물에 대한 필요성은 항시 존재하고 있는 실정이다.

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 종래보다 더욱 우수한 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성, 및 콜라게나아제(collagenase) 저해활성을 갖는 명감나무 추출물을 제공하는 것이 목적이다.

그리고, 본 발명은 멜라노마 및 섬유아 세포에서의 세포 생존율이 우수할 뿐만 아니라, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrpsinase의 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과도 우수해서, 더욱 증진된 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 섬유아 세포에서 pro-collagen type-1 생합성량과 MMP-1 저해활성, MMP-1 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과도 우수하여, 더욱 개선된 효과를 가지는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 명감나무(Smilax China L.) 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 또는 주름개선용 화장료 조성물이다.

여기서, 상기 명감나무 줄기 추출물은 명감나무 줄기의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

그리고, 상기한 본 발명은 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해 활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 및 콜라게나아제(collagenase) 저해활성이 증진된 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 명감나무 줄기 추출물은 500~1,000 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것이 가능하다.

또한, 상기 명감나무 줄기 추출물은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.05~3 중량부 범위 내로 포함되는 것이 바람직하다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 명감나무 줄기 추출물을 포함함으로서, 명감나무의 다른 부분(뿌리) 추출물보다 더욱 우수한 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성, 및 콜라게나아제(collagenase) 저해활성을 갖는 효과가 있다.

그리고, 본 발명에 따른 명감나무 줄기 추출물은 멜라노마 및 섬유아 세포에서의 세포 생존율이 우수할 뿐만 아니라, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrpsinase의 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과도 우수해서, 더욱 증진된 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 명감나무 줄기 추출물은 섬유아 세포에서 pro-collagen type-1 생합성량과 MMP-1 저해활성, MMP-1 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과도 우수하여, 더욱 개선된 효과를 가지는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 및 뿌리 조성물이 전자공여능의 활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 2 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 및 뿌리 조성물이 잔틴옥시다아제의 저해활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 3 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 및 뿌리 조성물이 티로시나아제 저해활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 4 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 및 뿌리 조성물이 콜라게나아제의 저해활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 5 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물이 멜라노마 세포의 세포 생존율에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 6 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물이 섬유아 세포의 세포 생존율에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 7 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 미백 효과 실험을 위한 RT-PCR에서 사용한 프라이머 순서의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 8 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 MITF 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 9 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-1 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 10 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-2 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 11 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 tyrosinase 단백질 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 12 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 MITF의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 13 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-1의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 14 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-2의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 15 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 멜라노마 세포에서 tyrosinase의 mRNA 단백질 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 16 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 RT-PCR에서 MITF의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 17 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 RT-PCR에서 TRP-1의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 18 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 RT-PCR에서 TRP-2의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 19 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 RT-PCR에서 tyrosinase의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 20 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물이 프로 콜라겐 생합성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 21 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물이 MMP-1의 저해활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 22 는 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 주름개선 효과를 위한 RT-PCR에서 사용한 프라이머 순서의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 23 은 본 발명에 따른 명감나무 줄기 조성물의 웨스턴블롯을 통한 단백질 발현량과 RT-PCR에서 mRNA발현량의 일례를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명은 명감나무(Smilax China L.) 줄기 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 대한 것으로, 특히 명감나무 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 또는 주름개선용 화장료 조성물이다. 상기 화장료 조성물은 피부 화이트닝(whitening) 기능을 갖거나 주름을 예방 또는 제거할 수 있는 기능을 갖는 화장품 또는 피부 외용제일 수 있다.

본 발명자들은 명감나무 줄기와 명감나무 뿌리 각각의 에탄올 추출물을 대상으로 in vitro 효소 실험을 통하여 그 효과를 검증하였고, 그 결과 명감나무 뿌리 추출물보다 줄기 추출물에서 더욱 활성이 우수하다는 것을 알게 되었으며, 이를 바탕으로 명감나무 줄기 추출물을 세포차원에서 미백 및 주름개선 메커니즘을 검증한 후, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명자들은 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 전자공여능, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성 측정, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 측정, 콜라게나아제(collagenase) 저해활성 측정을 통하여 명감나무 줄기 추출물이 뿌리 추출물보다 활성이 우수함을 확인하였다. 그리고, 이에 따라 명감나무 줄기 추출물을 이용하여 미백 및 주름개선 메커니즘 분석을 통하여 활성을 검증한 결과 멜라노마 및 섬유아 세포에서의 세포 생존율이 우수하였으며, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrpsinase의 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과를 측정한 결과 우수한 억제효과를 나타내어 명감나무 줄기 추출물의 미백활성을 확인할 수 있었다. 또한, 섬유아 세포에서 pro-collagen type-1 생합성량과 MMP-1 저해활성, MMP-1 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과를 측정한 결과 피부주름개선 효과에서도 활성을 보여 기능성 화장품 성분으로 적합함을 확인하였고, 그 효과 또한 우수하다.

구체적으로, 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 전자공여능을 측정한 결과 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 68.3%, 74.3%의 활성을 나타내었다(도 1 참조).

그리고, 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 xanthine oxidase 저해효과를 측정한 결과 명감나무 줄기 1,000 ppm에서 63.2%의 저해활성을 나타내었으며, 뿌리 추출물에서는 34.4%의 활성을 나타내어 줄기 추출물의 활성이 높음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

또한, 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해효과를 측정한 결과 명감나무 줄기 추출물은 1,000 ppm에서 78%의 효능을 뿌리 추출물은 61%의 활성을 나타내어 명감나무 줄기 추출물의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

또한, 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 collagenase 저해효과를 측정한 결과 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 활성이 거의 유사하게 나타났으나, 줄기 추출물이 1,000 ppm에서 96.3%의 저해활성을 나타내어 95.8%의 뿌리 추출물보다 활성이 높았다(도 4 참조).

이러한 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 화장품 약리활성 측정 결과 줄기 추출물의 활성이 전반적으로 우수하여 미백 및 주름개선 메커니즘 분석은 명감나무 줄기 추출물을 이용하여 측정하였다. 그 결과는 다음과 같다.

즉, 명감나무 줄기 에탄올 추출물의 멜라노마 세포와 섬유아 세포의 세포 생존율을 확인하기 위하여 MTT 검색법을 96 well plate를 사용하여 ELISA reader를 이용하여 측정한 결과, 멜라노마 세포에서는 50 ug/mL 이하에서 100%에 가까운 생존율을 나타내었으며(도 5 참조), 섬유아 세포는 50 ug/mL 농도에서 모두 70% 이상의 생존율을 나타내었다(도 6 참조).

그리고, 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리 한 후 24시간 뒤에 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein 발현을 western blotting으로 확인한 결과, 명감나무 줄기 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10군에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein의 발현이 추출물을 처리하지 않은 군보다 감소하였고 대조군인 kojic acid와 비교적 비슷한 발현을 나타내었음을 확인할 수 있었다(도 8, 도 9, 도 10, 도 11 참조).

또한, 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여, B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리한 후 24시간 뒤에 polymerase chain reaction (PCR)으로 mRNA 발현량을 측정한 결과, 명감나무 줄기 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10군에서는 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA 발현이 처리하지 않은 군보다 감소하였음을 확인하였다(도 12, 도 13, 도 14, 도 15 참조).

또한, Real-time polymerase chain reaction (PCR)을 이용하여 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA을 실시간으로 분석한 결과 명감나무 줄기 에탄올 추출물에서 모두 농도 의존적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 16, 도 17, 도 18, 도 19 참조). 특히 MITF, TRP-1, tyrosinase의 mRNA 발현이 현저하게 줄어들었으며, mRNA 역전사 반응을 실시간으로 정량 분석을 시행한 결과, 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 멜라닌 생성 억제에 효과가 있는 것을 확인할 수 있어 명감나무 줄기 추출물이 미백화장품 소재로 이용이 가능할 것으로 확인하였다.

또한, 명감나무 줄기 에탄올 추출물의 pro-collagen 생합성량을 확인한 결과 5 ug/mL의 농도에서 112% 이상의 효과를 나타내었고, 50 ug/mL의 농도에서는 139% 이상의 우수한 효과를 나타내었다(도 20 참조).

또한, 명감나무 줄기 에탄올 추출물을 5, 10, 25 ug/mL의 농도로 첨가하여 MMP-1 저해활성을 측정한 결과 각각의 농도에서 91.3%, 81.9%, 74.9%의 저해활성을 나타내었다(도 21 참조). 이러한 결과로 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 피부 탄력 및 주름개선 효능에 기여할 것으로 보여진다.

또한, 명감나무 줄기 에탄올 추출물에서 주름과 관계되어 진 전사인자의 단백질 발현을 측정한 결과 50 ug/mL의 농도에서 35%의 저해율을 나타내었고, mRNA 발현을 측정한 결과 50 ug/mL의 농도에서 45%의 저해율을 나타내었다(도 23 참조). 따라서 명감나무 줄기 에탄올 추출물은 주름생성 억제 활성을 보이는 것으로 보여진다.

본 발명에 따른 명감나무 줄기 추출물은 명감나무 줄기와 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매를 혼합하여, 상기 명감나무 줄기의 유효성분을 효과적으로 추출함으로써 명감나무 줄기 용매추출액을 형성할 수 있다. 그 중에서도 에탄올 추출물을 이용하는 것이 미백 및 주름개선 효과에 유용한 성분을 다량으로 추출할 수 있어서 바람직하다.

상기와 같은 명감나무 줄기 용매추출액을 그대로 사용하여 명감나무 줄기 추출물 함유 화장료 조성물을 구성할 수 있으나, 화장료 조성물을 정량적으로 용이하게 구성하려면 고체 상태인 명감나무 줄기 추출물을 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 본 발명에서는 명감나무 줄기 용매추출액으로부터, 감압농축이나 감압증발과 같은 기 공지된 용매 휘발 방법에 의해 용매를 휘발시켜서 분리함으로써 고체 상태, 바람직하게는 분말 상태인 명감나무 줄기 추출물을 구성할 수 있다. 즉, 명감나무 줄기의 유효성분이 용매에 의해 추출되고 고/액 분리된 상등액인 명감나무 줄기 용매추출액이 형성되고, 상기 명감나무 줄기 용매추출액으로부터 감압농축이나 감압증발과 같은 기 공지된 용매 휘발 방법에 의해 용매가 휘발되어 분말 상태인 명감나무 줄기 추출물이 구성되는 것이다.

명감나무 줄기 용매추출액을 구성하기 위한 명감나무 줄기와 용매의 추출용 혼합물은, 상기 명감나무 줄기가 건조중량 기준으로 100 중량부, 용매 100∼1,500 중량부가 혼합되어 이루어질 수 있다. 추출용 혼합물을 형성하도록 명감나무 줄기 건조중량 기준으로 100 중량부에 혼합되는 용매의 양이 100 중량부 미만이면 상기 명감나무 줄기의 유효성분이 충분하게 추출되지 않으며, 추출용 혼합물을 형성하도록 명감나무 줄기의 건조중량 기준으로 100 중량부에 혼합되는 용매의 양이 1,500 중량부를 초과하면 상기 용매의 과다 사용에 따른 명감나무 줄기 용매추출액의 용매 제거비용 증가 등의 이유로 인하여 화장료 조성물의 제조원가가 상승하게 된다.

구체적인 예를 들면, 명감나무 줄기, 또는 명감나무 줄기가 건조되고 분쇄되어 형성된 명감나무 줄기 건조분말과 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매가 혼합되어 추출용 혼합물이 형성되고, 싱기 추출용 혼합물이 15∼40 ℃로 1∼15 일간 유지되어 명감나무 줄기가 용매추출된 추출 조성물이 형성되고, 상기 추출 조성물이 고/액 분리되어 액상 성분인 명감나무 줄기 용매추출액이 수득될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 명감나무 줄기 추출물은 화장료 조성물에 대하여 500~1,000 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것이 바람직한데, 500 ppm 미만이면 잔틴산화효소 저해활성, 티로시나아제 저해활성, 및 콜라게나아제 저해활성 등이 미흡하고, 1,000 ppm 초과하면 그 효과 상승이 크지 않아 제조비용만 높아지기 때문이다.

그리고, 상기와 같은 명감나무 줄기 용매추출액을 4∼15 ℃에서 1∼7 일간 숙성시키는 것이, 상기 명감나무 줄기 용매추출액의 유효성분이 포함된 피부 미백용 및 주름개선용 화장료 조성물의 피부에 대한 친화력을 향상시키는 측면에서 바람직하다. 이러한 명감나무 줄기 용매추출액에서 감압증발 등에 의해 용매가 증발되어 명감나무 줄기의 고상 추출물이 준비될 수 있다.

본 발명에서는 상기에서 기술된 명감나무 줄기 추출물이 건조 고형분 기준으로 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.05~3 중량부 범위 내로 포함되는 것이 바람직하다. 화장료 조성물에 함유되는 명감나무 줄기 추출물의 함량이 0.05 중량부 미만이면 상기 화장료 조성물의 피부 미백 및/또는 주름개선 효과가 저하되며, 화장료 조성물에 함유되는 명감나무 줄기 추출물의 함량이 3중량부를 초과하면 상기 화장료 조성물은 명감나무 줄기 추출물의 함량 대비 피부 미백 및/또는 주름개선효과가 저하된다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 명감나무 줄기 추출물 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으되, 유효성분인 명감나무 줄기 추출물과 함께, 물, 생리식염수, 글리세롤, 유분, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 및 향료 등과 같은 기 공지된 화장료용 부형제가 혼합되어 로션제(lotiones), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsules) 형태를 이루는 화장료 조성물이 형성된다. 상기 화장료 조성물을 사용하여 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 바디오일 등의 기초 화장료 및 화운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료를 제조할 수 있으며, 또한 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.

이러한 화장료 조성물의 명감나무 줄기 추출물이 피부에 흡수 및 고정되는 것을 촉진하도록, 화장료용 부형제 중에서 글리세린 1∼7 중량%가 포함되어 명감나무 줄기 추출물 함유 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 화장료 조성물에 포함되는 글리세린의 함량이 1 중량% 미만이면 상기 화장료 조성물의 명감나무 줄기 추출물이 피부에 제대로 흡수 및 고정되지 않으며, 화장료 조성물에 포함되는 글리세린의 함량이 7 중량%를 초과하면 상기 화장료 조성물에서 글리세린 이외의 다른 화장료용 부형제의 함량이 상대적으로 저하되므로 실용적인 피부 미백용 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조가 곤란하게 된다.

또한, 화장료 조성물에게 항산화 기능을 제공하도록, 화장료용 부형제 중에서 선플라워 오일(sunflower oil)이 포함되어 명감나무 줄기 추출물 함유 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 선플라워 오일은 해바라기씨에서 추출된 천연오일로서, 불포화지방산과 항산화제로 잘 알려진 디알파토코페롤이 다량으로 함유되어 있는데, 상기 디알파토코페롤은 활성산소(free radical)과 과산화물에 의해 야기된 손상으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다.

그런데, 본 발명의 화장료 조성물은 명감나무 줄기 추출물과 각종 화장료용 부형제가 포함되어 있으므로 성상이 변화되기 쉽고, 이러한 경향은 유연화장수 등과 같이 수분 함량이 높아서 농도가 낮은 화장료 조성물보다 영양로션, 영양크림, 에센스 등과 같이 수분 함량이 낮아서 농도가 높은 화장료 조성물에서 심하게 발생하는 경향을 나타내고 있다. 따라서, 피부 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물의 성상을 안정화시키도록, 화장료용 부형제 중에서 안정화제인 디세틸포스페이트 0.1∼1 중량%가 포함되어 명감나무 줄기 추출물 함유 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다.

이와 함께, 본 발명은 명감나무 줄기 추출물에 기호성 식품 성분을 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 건강기능식품을 제조할 수 있고, 또한 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 제형에 따라 당업자가 적의 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 : 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 제조

본 실시예에서 사용된 명감나무 줄기 및 뿌리는 ㈜청명약초에서 구입하여 에탄올 추출을 실시하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 시료 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 EYELA evaporator로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 동결 건조하여 -20℃에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.

실험예 1 : 전자공여능 측정

전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. DPPH용액(sigma, U.S.A) 60 uL와 농도별 추출물을 120 uL씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

전자공여능 측정에 사용된 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 free radical로서 cystein, glutathion과 같은 함 유황아미노산과 ascorbic acid, BHA 등에 의해 환원되어 탈색되므로 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다. DPPH를 첨가하여 반응시켜 추출물이 DPPH의 비공유전자를 소거하였을 때 그것의 비공유전자로 인해 517 nm 부근에서 최대 흡수치를 나타낸다. 전자 또는 수소를 받으면 517 nm 부근에서 흡광도가 감소하여, 인체 내에서 지질 또는 단백질 등과 결합하여 노화를 일으키기 쉬운데 페놀성 화합물의 경우 free radical을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강해 인체 내에서 free radical에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용할 수 있다.

이러한 방법으로 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 전자공여능을 측정한 결과 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 68.3%, 74.3%의 활성을 나타내었다(도 1 참조).

실험예 2 : Xanthine oxidase 저해활성 측정

Xanthine oxidase 저해활성 측정은 Stirpe와 Corte의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도별 시료용액 100 uL에 potassium phosphate 완충용액(0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0) 600 uL와 xanthine (2 mM)을 녹인 기질액 200 uL를 첨가하고, xanthine oxidase (0.2 U/mL) 100 uL를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응정지를 시키고 반응액중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하였다. Xanthine oxidase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Xanthine oxidase는 생체 내 유리기 생성계의 하나로 purine 대사에 관여하는 효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine으로부터 urate를 형성하며 urate가 혈장 내에 증가되면 골절에 축적되어 심한 통증을 유발하는 통풍과 신장에 침착되어 신장질환을 일으키는 효소로 알려져 왔다. 통풍의 치료에 사용되는 약물로는 hypoxanthine의 유사체인 allopurinol과 alloxanthine이 있는데 alloxanthine은 xanthine oxidase에 의하여 alloxanthine으로 산화된 다음 이것이 xanthine oxidase에 결합하여 urate생성의 최종단계에 관여하는 xanthine oxidase의 효소활성을 저해함으로서 urate의 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그 외에 효소활성을 저해할 목적으로 천연물을 대상으로 하여 많은 연구가 진행되어 왔는데, 식물계에 존재하는 flavonoid류는 hydroxyl기의 위치에 따라 xanthine oxidase 저해효과가 다르며, galloyl기를 함유한 flavonoid 화합물이 xanthine oxidase 저해효과가 우수하였으며 경쟁적으로 저해한다는 사실을 보고하였다.

이러한 방법으로 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 xanthine oxidase 저해효과를 측정한 결과 명감나무 줄기 1,000 ppm에서 63.2%의 저해활성을 나타내었으며, 뿌리 추출물에서는 34.4%의 활성을 나타내어 줄기 추출물의 활성이 높음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

실험예 3 : Tyrosinase 저해활성 측정

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) 80 uL에 10 mM L-DOPA (Sigma, U.S.A)를 녹인 기질액 40 uL 및 시료용액 40 uL의 혼합액에 200 U/mL mushroom tyrosinase (Sigma, U.S.A) 40 uL을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 492 nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

피부는 자외선에 노출되면서 tyrosinase의 작용으로 melanosome에서 멜라닌이 합성되어 피부노화가 촉진되며, 이때 생성된 free radical은 지질, 단백질, 당 및 핵산을 손상시키고 세포막의 파괴에 관여함으로써 돌연변이 유발, 피부암을 포함한 발암, 성인병 및 노화 등을 촉진시키는 원인 요소로 알려져 있다. 이런 피부 색소 침착뿐만 아니라 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포 사멸 촉진의 부정적인 기능을 하고 있다.Tyrosinase는 tyrosin으로부터 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (DOPA)과 DOPA-quinone을 거쳐 최종적으로 흑갈색의 melanin색소 생성에 관여하는 효소로 자외선에 의하여 melanocyte의 유사분열이 일어나고 이어서 melanocyte가 활성화 된다. 활성화 된 melanocyte에서는 tyrosinase 합성이 촉진되고 melanin의 생성이 항지되어 이를 표피 밖으로 운반 배출하게 되어 기미, 주근깨와 같은 색소 침착이 일어나게 된다. 그러므로 tyrosinase 활성 억제제는 피부 내에서의 melanin polymer 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다.

이러한 방법으로 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해효과를 측정한 결과 명감나무 줄기 추출물은 1,000 ppm에서 78%의 효능을 뿌리 추출물은 61%의 활성을 나타내어 명감나무 줄기 추출물의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

실험예 4 : Collagenase 저해활성 측정

Collagenase 저해활성 측정은 Wnsch E, Heindrich HG 의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 0.3 mg/mL의 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (sigma, U.S.A)를 녹인 기질액 125 uL 및 시료용액 50 uL의 혼합액에 0.2 mg/mL의 collagenase (sigma, U.S.A) 75 uL를 첨가하여, 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 250 uL을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5 mL을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아 세포에서 생성되는 주요 기질 단백질이다. 또한 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. Collagen은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부의 진피에 그 포함량이 높다. Collagen의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.

이러한 방법으로 명감나무 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 collagenase 저해효과를 측정한 결과 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 활성이 거의 유사하게 나타났으나, 줄기 추출물이 1,000 ppm에서 96.3%의 저해활성을 나타내어 95.8%의 뿌리 추출물보다 활성이 높았다(도 4 참조).

상기한 바와 같이, 명감나무 줄기 및 뿌리 추출물의 화장품약리활성 결과, 줄기 추출물의 활성이 전반적으로 우수하여 미백 및 주름개선 메커니즘 분석은 명감나무 줄기 추출물을 이용하여 측정하였다. 그 방법 및 결과는 다음과 같다.

실험예 5 : 멜라노마 세포 및 섬유아 세포에서의 세포생존율 측정

각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. 세포 독성 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. 멜라노마(B16F10)와 섬유아(CCD-986sk) 세포를 96 well plate에 5 10 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 셍존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Yellow tetrazolium salt MTT는 담황색 기질로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 reductase에 의해 환원되어 formazan을 생성하는데 죽어있는 세포에서는 형성되지 않고 살아있는 세포의 수가 많을수록 formazan의 생성도 많아지고 세포의 성장을 측정할 수 있다.

이러한 원리를 바탕으로 명감나무 줄기 에탄올 추출물의 멜라노마 세포와 섬유아 세포의 세포 생존율을 확인하기 위하여 MTT 검색법을 96 well plate를 사용하여 ELISA reader를 이용하여 측정한 결과 멜라노마 세포에서는 50 ug/mL 이하에서 100%에 가까운 생존율을 나타내었으며(도 5 참조), 섬유아 세포는 50 ug/mL 농도에서 모두 70% 이상의 생존율을 나타내었다(도 6 참조).

실험예 6 : Western blot 을 통한 미백인자 단백질 발현 측정

미백인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 활성을 보기 위하여 cell line인 B16F10을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24∼48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척해주었다. Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer 10mL에 complete mini 1 tab를 가한 100 uL로 용해해서 4℃ 13,200 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하여 20 uL의 단백질을 10% SDS-PAGE사에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 배양시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3회 washing하고 2차 항체를 1 : 1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 washing한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.

명감나무 줄기 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리 한 후 24시간 뒤에 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 그 결과 명감나무 줄기 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10군에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein의 발현이 추출물을 처리하지 않은 군보다 감소하였고 대조군인 kojic acid와 비교적 비슷한 발현을 나타내었음을 확인할 수 있었다(도 8, 도 9, 도 10, 도 11 참조).

실험예 7 : 멜라노마 세포에서 mRNA 발현 억제 효과 측정

실험예 7-1 : 총 RNA 분리 및 cDNA 합성

세포를 100 mm culture dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 sample을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis한 후 chloroform 200 mL를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 13,200 rpm 에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol 500 mL이 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 1 mL씩 분주하여 13,200 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC를 50 uL씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 uL와 멸균수 195 uL를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 ug/mL) 1 uL, 추출한 RNA (2 ug)와 nuclease free water로 10 uL를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl₂, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, ruclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.

실시예 7-2 : Reverse transcription - polymerase chain reaction

미백인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 도 7과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초 (35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초 (40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초 (40 cycles)을 하였으며, MMP-1은 94℃에서 30초, 56℃에서 60초, 72℃에서 1분 (35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.

상기한 바와 같이, 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리한 후 24시간 뒤에 polymerase chain reaction (PCR)으로 mRNA 발현량을 측정하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다.

이러한 방법으로 명감나무 줄기 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10군에서는 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA 발현이 처리하지 않은 군보다 감소하였음을 확인하였다(도 12, 도 13, 도 14, 도 15 참조).

실험예 8 : Real - time PCR

멜라노마 세포로부터 추출되어 진 RNA를 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 추출한 RNA (2 ug)와 Oligo (dT) 15primer (500 ug/mL) 1 uL, nuclease free water와 혼합한 뒤 75℃에서 5분, ice에서 5분 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl₂, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 합성한 cDNA와 2X SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one pluse (Applied biosystem, USA)기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 한 뒤 analysis program을 이용하여 결과를 분석하였다.

Real-time polymerase chain reaction (PCR)은 thermal cycler와 분광형광 광도계가 일체화된 장치로 실시간으로 target DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 분석하는 실험이다. 본 실험에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA을 실시간으로 분석한 결과 명감나무 줄기 에탄올 추출에서 모두 농도 의존적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 16, 도 17, 도 18, 도 19).

특히 MITF, TRP-1, tyrosinase의 mRNA 발현이 현저하게 줄어들었으며, mRNA 역전사 반응을 실시간으로 정량 분석을 시행한 결과, 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 멜라닌 생성 억제에 효과가 있는 것을 확인할 수 있어 명감나무 줄기 추출물이 미백화장품 소재로 이용이 가능할 것으로 판단된다.

실험예 9 : Pro - collagen type I 생합성 측정

세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 이렇게 실험한 세포의 배양액을 모아 실험에 사용하였다. 세포 배양액 내 collagen 생합성 정도는 procollagen type-Ⅰ C peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan)을 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.

Collagen은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 전조중량의 약 70~80%를 차지하고 있어, 세포 외 기질의 대부분을 차지하면서 피부를 지지하는 역할을 한다. 보통 피부에서 typeⅠ collagen의 합성과 그 분해효소인 MMP-1의 활성이 균형을 이루고 있지만, 내외인적인 원인으로 type Ⅰ, Ⅲ collagen의 합성이 저하되고 MMP-1의 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다.

이에 따라, collagen의 전구체인 pro-collagen의 c-말단을 인지하는 항체를 이용하여 콜라겐의 생성 양을 측정하는 방법을 이용하여 명감나무 줄기 에탄올 추출물의 pro-collagen 생합성량을 확인한 결과, 5 ug/mL의 농도에서 112% 이상의 효과를 나타내었고, 50 ug/mL의 농도에서는 139% 이상의 우수한 효과를 나타내었다(도 20 참조).

실험예 10 : MMP -1 저해활성 측정

세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α 를 10 ng/mL의 농도로 첨가하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Gross B.E 등의 방법에 따라 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) biotrack activity assay kit을 이용하여 측정하였다.

피부 세포의 결합조직을 구성하는 성분 중 collagen은 피부 건조 중량의 70~90% 정도를 차지하는 주요 구성 단백질이다. 따라서 collagen의 분해는 결합조직의 탄력저하와 주름생성 등에 직접적인 영향을 미친다. 체내에서 생성되는 수십 종의 MMPs 가운데 MMP-1은 collagen에 특이적으로 작용하는 proteinase로서 MMP-1의 활성을 억제하여 collagen의 분해를 감소시키며 피부조직의 탄력을 유지하고, 주름 생성을 예방할 수 있다.

명감나무 줄기 에탄올 추출물을 5, 10, 25 ug/mL의 농도로 첨가하여 MMP-1 저해활성을 측정한 결과, 각각의 농도에서 91.3%, 81.9%, 74.9%의 저해활성을 나타내었다. 이러한 결과로 명감나무 줄기 에탄올 추출물이 피부 탄력 및 주름개선 효능에 기여할 것으로 판단된다(도 21 참조).

실험예 11 : Western blot 을 통한 주름개선 인자 단백질 발현 측정

MMP-1 활성을 보기 위하여 cell line (CCD-986sk)을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도 별로 처리한 배지로 24~48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10 mL에 complete mini 1 tab를 가한 100 uL로 용해해서 4℃ 12,000 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30 uL의 단백질을 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 2차 항체를 1 : 1000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 washing한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.

실험예 11-1 : 총 RNA 분리 및 cDNA 합성

세포를 100 mm dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 추출물을 농도별로 처리하여 24~48시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis 한 후 70℃에 보관하였다. 보관된 시료를 실온에서 녹인 후 chloroform 200 uL를 분주하여 20초간 inverting하였다. 그 후 4℃ 13,200 g에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol 500 uL이 들어 있는 tube에 옮겨 섞었다. 다시 4℃ 13,200 g에서 15분간 원심 분리하였고, 그 상층액을 제거 한 후 75% EtOH DEPC water를 각 tube에 1 mL씩 분주하여 4℃ 13,200 g에서 5분간 원심 분리한 뒤 상층액을 제거한 후 실온에서 건조 시켰다. Diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 20~40 uL씩 분주하여 녹인 후 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 ug/mL) 1 uL, dNTP mix (10 mM) 1 uL, 추출한 RNA (2 ug)와 RNase free water로 11 uL를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5 reaction buffer, MgCl₂, dNTP, Recombinant rnasin, Reverse transcriptase을 첨가하여 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.

실험예 11-2 : 총 RNA 분리 및 cDNA 합성

MMP-1의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 도 22와 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA Polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. MMP-1은 94℃ 30초, 56℃ 60초, 72℃ 1분 (35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1.5% agarose gel에 100V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.

Matrix metalloproteinases (MMPs)는 활성 중심부에 아연을 갖는 금속 단백질 분해효소로서 현재까지 약 20여종 이상의 종류가 있는 것으로 알려져 있으며, 구조와 기능에 따라 interstitial collagenase, gelatinase, stromelysin, membrane type MMP 등으로 구분하기도 한다. 특히 MMPs는 피부의 각질형성세포, 섬유아 세포를 비롯한 많은 세포들로부터 분비되어 지지구조체인 세포외 기질과 기저막을 구성하는 주요 단백질 구성요소들을 가수분해함으로서 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름 과 탄력 저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 MMP family 중 MMP-1의 단백질 발현과 mRNA발현을 측정하였다. 명감나무 줄기 에탄올 추출물에서 주름과 관계되어 진 전사인자의 단백질 발현을 측정한 결과 50 ug/mL의 농도에서 35%의 저해율을 나타내었고, mRNA 발현을 측정한 결과 50 ug/mL의 농도에서 45%의 저해율을 나타내었다(도 23 참조). 따라서 명감나무 줄기 에탄올 추출물은 주름생성 억제 활성을 보이는 것으로 판단된다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims

명감나무(Smilax China L.) 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 명감나무 줄기 추출물은 명감나무 줄기의 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해 활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 및 콜라게나아제(collagenase) 저해활성이 증진된 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 명감나무 줄기 추출물은 500~1,000 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 명감나무 줄기 추출물은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.05~3 중량부 범위 내로 포함되는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
명감나무(Smilax China L.) 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 명감나무 줄기 추출물은 명감나무 줄기의 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해 활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 및 콜라게나아제(collagenase) 저해활성이 증진된 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 명감나무 줄기 추출물은 500~1,000 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 명감나무 줄기 추출물은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.05~3 중량부 범위 내로 포함되는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.