KR20220114210A

KR20220114210A - 백수오 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220114210A
Application number: KR1020210017440A
Authority: KR
Inventors: 김기영; 김민호
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2022-08-17
Also published as: KR102501845B1

Abstract

본 발명은 백수오 추출물(Cynanchum wilfordii extract)을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 세포 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 백수오 추출물은 자연 식물 유래 추출물로써 케라틴 세포에 대한 독성이 낮고, JNK1/2의 활성화를 통한 케라틴 세포의 유전자 발현을 조절하여 세포 성장을 촉진하는 효과를 가지므로 피부 재생용 화장료 조성물 또는 상처 치료용 피부 외용제 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

백수오 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 조성물{Composition for skin regeneration and wound healing comprising the extract of Cynanchum wilfordii as an active ingredient}

본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분을 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부의 상처 치유는 순서대로 크게 상처 부위의 출혈을 막는 지혈 단계, 상처 발생 시 침입한 병원균을 없애는 염증 단계, 상처 부위를 케라틴 세포, 섬유아세포, 혈관 세포, 대식세포, 혈소판 및 여러 세포외 기질과 같은 주요 피부 조직 세포들의 증식으로 다시 메꾸어주는 증식단계, 마지막으로 채워진 세포들의 성숙 및 분화로 상처 전 상태의 조직으로 동화되는 성숙 단계 등 4단계로 분류된다. 피부를 구성하는 주된 세포는 케라틴 성분을 생산하는 케라틴 세포(Keratinocyte)와 섬유아세포(Fibroblast) 두 가지이며, 따라서 상처 복구 시 가장 많은 양의 분열이 요구되는 세포는 이 두 가지 세포이다. 또한 상처치유 과정에서 증식단계와 성숙단계는 시간이 많이 소요되는 단계로, 케라틴 세포의 증식 속도의 촉진은 상처치유의 효능을 좋게 하는 데 중요하다.

피부의 재생은 인체의 항상성을 유지하기 위하여 매우 중요한 역할을 수행한다. 외부의 환경으로부터 MAP(mitogen-activated protein) kinase pathway는 세포 외 신호전달물질인 mitogen에 의해 자극을 받아, 세포내 신호전달로 연결하는 메카니즘으로, ERK1/2, JNK1/2/3, p38, ERK5등 여러 주요 kinase등이 포함된다. 세포 증식과 관련된 주된 자극은 성장인자를 예시로 들 수 있으며, 해당 자극으로 관련 유전자를 down regulation 하여 유전자 발현을 조절하는 방식으로 증식을 촉진하게 된다. 세포 증식뿐만 아니라, 분화 및 이동, 스트레스 반응, 세포사멸 등 매우 다양한 세포의 운명을 결정하는 매우 중요한 pathway로 알려져 있다. 특히 JNK1/2의 활성화(인산화)는 앞서 언급한 상처치유 과정 중 면역 단계(염증 단계) 와도 연계되어, 면역 단계 중 TNF-a 단백질에 의해 활성화되어 세포 분열 및 증식 혹은 세포사멸까지 조절하는 기능을 가진 것으로 알려져 있다.

피부 상처 치유 및 피부 재생을 촉진하기 위해 종래에는 호르몬제 또는 화합물 제제를 이용한 치료법이 있었으나 이는 신체에 부작용을 일으킬 수 있다는 한계가 있다. 따라서 인체에 무해하면서도, 부작용이 적고 피부 상처 치유 및 피부 재생 촉진에 뛰어난 효능을 가지는 새로운 물질을 개발하는 것이 필요한 실정이다.

한편, 백수오(Cynanchum wilfordii)는 한국 중부 이남의 산이나 들의 양지바른 풀밭, 바닷가 경사지에 나는 박주가리과 백미꽃속의 덩굴성 여러해살이풀이다. 백수오는 한국에서는 식약처에서 건강식품 2등급으로 분류된 식품이다. 한방에서는 자양강장, 보혈, 강근골, 노화방지, 신경쇠약 등에 효능이 있어, 민간약으로도 많이 사용되고 있다. 또한 최근 연구 자료로는 백수오 추출액이 고지혈증 및 당뇨에 효능을 가진 것으로 확인되었다. 하지만, 백수오 추출물이 피부 세포 재생 또는 상처 치료에 효능이 있다는 점은 알려지지 않았다.

이에 본 발명자들은 상처 치료에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 케라틴 세포에 주목하여, 백수오 추출물의 증식 촉진 능력을 확인하고, 본 백수오 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 세포 재생 또는 상처 치료용 조성물로 제시하려 한다.

10-2013-0055367

본 발명은 일반적으로 상처 치료에 쓰이는 화학 복합물 대신 상대적으로 인체에 무해한 자연 유래의 백수오 식물 추출물을 이용하여 케라틴 세포(keratinocyte)의 생장 및 이동을 증진시키는 효과를 확인하고, 이로 인해 상처 치료까지 가능한 백수오 추출물을 피부 재생용 화장료 조성물 또는 상처 치료용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ‘추출물’은 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ‘유기용매 추출법’은 50 내지 80% 에탄올을 이용한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ‘조성물’은 백수오 추출물이 1 내지 100㎍/ml로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ‘조성물’은 케라틴 세포(keratinocyte)의 생장 및 이동을 촉진하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ‘조성물’은 케라틴 세포에서 활성화된 단백질 키나제(MAPK)인 JNK1/2의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ‘조성물’은 케라틴 세포에서 세포 증식과 관련된 유전자들의 발현을 증가시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 백수오 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 조성물은 자연유래 식물 추출물로써 인체에 대한 독성이 낮고, 케라틴 세포의 증식 촉진 능력이 효과적이어서 피부 재생용 화장료 조성물 또는 상처 치료용 피부 외용제 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml) MTT assay 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 10 및 100㎍/ml) In vitro wound-healing assay 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명 도 2의 실험결과를 대조군 대비 fold change로 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 5 및 10㎍/ml) MAP kinase pathway의 kinase 및 AKT의 인산화 변화에 대한 western blot 사진이다.
도 5는 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 세포 성장 조절 메커니즘을 확인하기 위하여 proliferation marker들에 대한 quantitative real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 세포 영향 메커니즘을 확인하기 위하여 케라틴 단백질들에 대한 quantitative real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 7은 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 세포 영향 메커니즘을 확인하기 위하여 cyclin, cdk들에 대한 quantitative real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 8은 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 세포 영향 메커니즘을 확인하기 위하여 성장인자들에 대한 quantitative real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 9는 본 발명의 백수오 추출물의 농도별(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 세포 영향 메커니즘을 확인하기 위하여 AP-1 transcription factor들에 대한 quantitative real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 10은 본 발명의 백수오 추출물의 상처에 대한 치유 능을 확인하기 위해 진행한 In vivo wound-healing assay 결과이다.

또한, 본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w) %, 고체/액체는(w/v) %, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.

일 측면에서, 본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 백수오(Cynanchum wilfordii)으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 백수오(Cynanchum wilfordii)으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 화장품학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.

본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 백수오(Cynanchum wilfordii)에서 추출한 추출물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 백수오(Cynanchum wilfordii)에서 추출한 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 성분은 상기 백수오 추출물 이외에 피부 외용제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 의약품에 적용할 경우에는 본 발명에 따른 백수오 추출물을 유효성분으로 하고, 통상 사용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제로 제제화할 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존제, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용화하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤지방족에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제,에톡실화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드에테르설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산글리세리드, 지방산디에탄- 5 -올아미드, 식물성유, 라놀린유도체 또는 에톡실화글리세롤 지방산 에스테르등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

<실시예 1> 백수오 추출물의 제조

백수오(원산지 : 강원도)를 건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 백수오 가루를 추출 용기에서, 10배수의 70% 에탄올과 함께 10시간 동안 교반하였다. 교반 후 여과지로 여과하여 추출액만 모은 다음, 여과액이 완전히 증발할 때까지 50℃에서 감압 농축하여 백수오 추출물을 제작하였다. 백수오 추출물의 수율은 약 15%로 나타났다. 백수오 추출물은 10mg/ml의 농도로 DW(demineralized water)에 녹인 후 사용하였다.

<실시예 2> 세포 독성 및 증식 평가(MTT assay)

백수오 추출물의 케라틴 세포에 대한 독성 및 증식 촉진 효과를 확인하기 위해 케라틴 세포에서 MTT assay를 진행하였다.

구체적으로, 백수오 추출물 처리 후 세포 독성 및 세포 증식 변화를 확인하기 위해 백수오 추출물을 농도(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml)에 따라 HaCaT cell에 각각 처리하고 MTT assay를 수행하였다. 96-well tissue culture plates(SPL)에 각 well 마다 5×10³cells을 seeding 후 24시간 배양하고, 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml)의 백수오 추출물을 포함한 Serum free media로 교체하였다. 백수오 추출물 처리 24시간 경과 후 MTT(sigma Cat. M2128)를 5mg/㎖ 농도로 처리하고 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응 후 0.1ml의 DMSO에 녹여 15분 동안 교반, microplate reader (BioTek Instruments, Korea)를 이용하여 540nm 흡광도에서 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었다.

그 결과, 백수오 추출물의 처리에 따라 모든 농도(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml)에서 세포의 viability가 감소하지 않았으므로 백수오 추출물의 독성이 없는 것을 확인하였다. 세포 증식 촉진 관점에서는 백수오 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포의 viability가 증가하였으므로, 본 백수오 추출물은 케라틴 세포의 생장을 촉진하는 것이 확인되었다(도 1).

<실시예 3> 생체 외 상처 회복 실험( In vitro wound-healing assay)

백수오 추출물의 케라틴 세포의 생장 및 이동 촉진에 대한 효과를 확인하기 위해 in vitro wound-healing assay를 진행하였다.

구체적으로, 백수오 추출물(0, 1, 10 및 100㎍/ml)의 상처치유 능력을 확인하기 위해 in vitro 조건에서 가상의 상처를 형성하여 상처치유 실험을 수행하였다. 상처를 형성하기 위해 피부조건과 비슷하게 HaCaT cell을 6-well cell culture plates(SPL)에 seeding 후 90~100% confluence로 monolayer 상태로 가득 차게 배양 하였다. 인위적으로 형성된 피부층에 White tip(Sorenson)을 이용하여 상하로 상처를 형성하였다. 상처 형성 후 PBS를 이용해 well을 씻어준 뒤 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml)의 백수오 추출물을 포함한 Serum free media로 교체하였다. 인공 상처 부위의 closure는 Microscopy(Thermo fisher scientific, USA)를 이용해 촬영되었다. 상처형성 직후와 24시간 후를 관찰 및 비교 하여 성능을 확인하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었다.

그 결과, 대조군(0㎍/ml)에 비해 백수오 추출물을 추가해 줌에 따라 상처 부위 간격의 closure가 증가함을 확인하였다(도 2 및 도 3).

<실시예 4> 세포 증식관련 신호 전달 단백질 변화 분석(Western blot assay)

백수오 추출물의 케라틴 세포(keratinocyte)의 증식 촉진에 대한 메커니즘을 확인하기 위해 세포 생장 및 이동에 관여하는 kinase들에 대해 Western blot assay를 진행하였다.

구체적으로, 백수오 추출물의 농도(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 처리에 따른 세포 생장 및 이동과 관련된 세포내 신호전달 단백질들의 활성화 변화를 확인하기 위해 주요 타겟 kinase들의 활성에 대한 western blot assay를 하였다. 6well culture dish(SPL)에 HaCaT cell을 well 당 3×10⁵Cells 만큼 seeding 후 24시간 배양 후 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml)의 백수오 추출물을 포함한 Serum free media로 교체하였다. 24시간 추가 배양 후 Cell scraper(SPL)를 이용하여 세포를 수확하고, RIPA buffer(25mM Tris-Cl pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 2mM EDTA)를 이용해 세포를 lysis하여 단백질 샘플을 제작하였다. 단백질 샘플 20㎍을 8% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)의 각 lane에 적재하여 assay를 진행하였다. Membrane은 ECL(Bio-Rad)을 이용하여 developing 하였으며 실험에 사용된 타겟 단백질들의 항체는 santa cruz biotechnology와 cell signaling technology 제품을 사용하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었다.

그 결과, JNK1/2의 인산화(phosphorylation form)가 백수오 추출물 처리 농도에 따라(0, 1, 10 및 100㎍/ml) 증가한 것을 확인할 수 있었다. JNK1/2는 여러 종류의 세포에서 분화 및 생장, 면역, 이동, 세포 사멸 등 세포의 운명에 주된 조절 kinase인 것으로 알려져 있다. 이 실험을 통해 백수오 추출물에 의한 생장 및 이동의 촉진은 JNK1/2의 인산화에 의해 이루어진 것을 확인하였다. 나머지 주요 kinse들인 p38, ERK1/2와 AKT에 대해서는 백수오 추출물의 처리에 의한 단백질의 양 변화 및 인산화에 차이가 나타나지 않았다(도 4).

<실시예 5> 세포 증식 관련 유전자 발현 분석(quantitative Real-Time PCR)

백수오 추출물의 케라틴 세포에 대한 세포 증식 관련 유전자 발현 변화를 확인하기 위해 quantitative Real-Time PCR을 진행하였다.

구체적으로, 처리한 백수오 추출물의 농도(0, 1, 10 및 100㎍/ml)에 의한 성장 촉진에 대한 유전자 발현 조절 메커니즘을 확인하기 위해 세포 생장 조절에 관련된 유전자들(Cyclins,CDKs, keratins, growth factors and AP-1 transcription factors)에 대해 quantitative Real-Time PCR을 진행하였다. 6well culture dish(SPL)에 HaCaT cell을 well 당 3×10⁵Cells 만큼 seeding 후 24시간 배양 후 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 50 및 100㎍/ml)의 백수오 추출물을 포함한 Serum free media로 교체하였다. Trizol(Thermo Fisher) 0.5ml을 각 well에 처리하여 세포를 수확 후, Total RNA를 추출하였다. Thermo Reverse Transcriptase(NANOHELIX)를 사용하여 1㎍의 total RNA sample을 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 아래 표 1(Quantitative Real-Time PCR 분석에 사용된 프라이머의 시퀀스 정보)의 프라이머 쌍들을 사용하여 quantitative Real-Time PCR(CFX Connect Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad)을 실시하였다.

Gene	Direction	Sequence (5’-3’)
PCNA	Forward	AACCTCACCAGTATGTCCAA
	Reverse	ACTTTCTCCTGGTTTGGTG
MCM2	Forward	AATCTATGGCGACAGGCAG
	Reverse	ATCACATAGTCCCGCAGAT
KI67	Forward	CCAAAGAAGGCTGAGGACAA
	Reverse	CCCTTAAGCAGACTGACAGC
Cyclin D1	Forward	CTGTGCTGCGAAGTGGAAACC
	Reverse	GACGATCTTCCGCATGGAC
Cyclin A2	Forward	AGTAAACAGCCTGCGTTCACC
	Reverse	GAGGGACCAATGGTTTTCTGG
Cyclin B1	Forward	TAAGGCGAAGATCAACATGG
	Reverse	GCTTCCTTCTTCATAGGCAT
Cyclin E1	Forward	ACACCATGAAGGAGGACG
	Reverse	CACAGACTGCATTATTGTCCC
CDK1	Forward	CAGGTCAAGTGGTAGCCATG
	Reverse	ACCTGGAATCCTGCATAAGC
CDK2	Forward	TTCTCATCGGGTCCTCCACC
	Reverse	TCGGTACCACAGGGTCACCA
CDK4	Forward	CTGAGAATGGCTACCTCTCG
	Reverse	CGAACTGTGCTGATGGGAAG
CDK6	Forward	CCGAAGTCTTGCTCCAGTCC
	Reverse	GGGAGTCCAATCACGTCCAA
KRT5	Forward	AGCAGTGGTACGCTTGTTGATT
	Reverse	GCCTGGACTCAGAGCTGAGAA
KRT14	Forward	GGCCTGCTGAGATCAAAGACTAC
	Reverse	CACTGTGGCTGTGAGAATCTTGTT
KRT6	Forward	CTGAGGCTGAGTCCTGGTAC
	Reverse	GTTCTTGGCATCCTTGAGG
KRT17	Forward	GCTGCTACAGCTTTGGCTCT
	Reverse	TCACCTCCAGCTCAGTGTTG
fos-B	Forward	TTCTGACTGTCCCTGCCAAT
	Reverse	CGGGGTCAGATGCAAAATAC
c-fos	Forward	GGAGGAGGGAGCTGACTGATA
	Reverse	GCAATCTCGGTCTGCAA
c-jun	Forward	TTCTATGACGATGCCCTCAACGC
	Reverse	GCTCTGTTTCAGGATCTTGGGGTTAC
Fra-1	Forward	GGGCATGTTCCGAGACTTC
	Reverse	GCACCAGGTGGAACTTCTG
Elk1	Forward	TGACCCCATCCCTGCTTCCTA
	Reverse	GAAGTGAATGCTAGGAGGCAGCG
FGF2	Forward	AAAAACGGGGGCTTCTTCCT
	Reverse	AGCCAGGTAACGGTTAGCAC
EGF	Forward	AGTCCGTGACTTGCAAGAGG
	Reverse	CCTCTTCTTCCCTAGCCCCT
TGF	Forward	TGGTGGAAACCCACAACGAA
	Reverse	GAGCAACACGGGTTCAGGTA
CTGF	Forward	GTTTGGCCCAGACCCAACTA
	Reverse	GGCTCTGCTTCTCTAGCCTG
VEGF	Forward	CTTGCCTTGCTGCTCTACCT
	Reverse	GCAGTAGCTGCGCTGATAGA
GAPDH	Forward	GTGAAGGTCGGAGTCAACG
	Reverse	TGAGGTCAATGAAGGGGTC

백수오 추출물을 케라틴 세포에 처리한 결과, 세포 증식에 관련된 유전자들의 발현이 확인된 것을 확인하였다. 도 5는 세포 증식 마커(cell proliferation marker) 들의 유전자 발현 변화 결과이며, MCM2의 경우 증가했다가 감소하는 추세를 보였지만, PCNA와 KI67 유전자의 경우 처리해준 추출물의 농도에 따라 발현량이 증가한 것을 확인하여 증식촉진이 이루어진 것을 확인할 수 있다.

도 6은 케라틴 세포의 케라틴 단백질 유전자들의 발현 변화에 관한 결과이다. 케라틴 단백질은 케라틴 세포에서 주로 발현되는 단백질로 피부를 구성하는 주요 요소이다. KRT5/KRT14는 Basal keratinocyte에서 발현되는 케라틴 단백질이며, KRT6/KRT17은 hyper proliferative cellular response에 반응하여 발현되는 케라틴이다. 특히 KRT6의 발현이 매우 증가한 것으로 보아, 백수오 추출물은 케라틴 세포에 증식 촉진 자극을 부여한 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

도 7은 Cyclin 과 CDK라는 세포 분열 주기를 조절하는 단백질들에 대한 유전자 발현 분석 결과이다. Cyclin의 경우 백수오 추출물의 처리에 따라 발현이 대체로 증가하는 추세를 보였으며, CDK 같은 경우에는 모든 CDK4/6의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 8은 Growth factor들의 발현변화 결과이다. 성장인자는 MAP kinase pathway와 같은 pathway를 활성화하는 세포 외 신호전달물질이다. 성장인자 유전자는 세포 증식의 원인이 되기도 하지만, 세포 증식 촉진 후, 증식 신호를 근처 다른 세포에 전달 할 수 있게 증식이 활성화된 세포에서 성장인자 유전자의 발현이 증가하기도 한다. 백수오 추출물에 의해서 성장인자들의 유전자 발현이 달라졌으며, 특히 FGF2와 TGF의 발현이 상당하게 증가한 것을 확인할 수 있다.

MAP kinase들은 활성화된 후, 여러 다양한 전사인자들의 발현 및 활성을 조절하여 세포의 메카니즘을 조절하는 것으로 알려졌다. JNK1/2 또한 AP-1 Transcription factor들의 발현 및 활성화를 조절하여 세포 분열을 조절한다. fos-B, c-fos, c-jun, Fra-1, Elk1 들이 이에 해당한다. 도 9는 이러한 전사인자들의 발현 변화 결과이다. 대부분의 AP-1 Transcription factor의 발현이 증가하였으며, 특히 c-jun의 발현은 백수오 추출물의 농도에 따라 증가한 것으로 확인되었다.

<실시예 6> 생체 상처 회복 실험( In vivo wound-healing assay)

백수오 추출물의 생체에서의 상처치유 촉진능력을 확인하기 위해, 실험동물 Mouse를 이용하여, In vivo wound-healing assay를 진행하였다.

구체적으로, 실험동물 Mouse를 이용하여 인위적으로 상처 형성 후 백수오 추출물을 처리하여 상처의 치유 변화를 확인하였다. Mouse는 BALB/c strain(JA BIO, Korea)을 사용하였으며, 5주령을 구매하여 1주일 적응 기간 후 6주령 때 실험을 진행하였다. 모든 실험은 Avertin(Sigma,T48402) 제품을 125mg/kg 용량으로 복강 내 주사법을 통해 마취하여 진행하였다. Animal Clipper(JEUNG DO BIO & PLANT CO, JD-S-138C, Korea)로 등 부분의 털을 잘라낸 후 Hair Removal Cream(BEAUTY FORMULAS)를 사용하여 제모 하였다. 제모 3일 후 4mm 피부과 펀치(KEYES)를 이용하여 양쪽 견갑골 아랫부분에 피부 전체 두께의 상처를 형성하였다. 개체마다의 차이가 있을 수 있기 때문에, 왼쪽 상처는 대조군으로 사용하였으며, 오른쪽 상처는 백수오 추출물을 PBS에 희석하여, 50ug씩 매일처리하며 상처치유를 유도하였다. 상처치유과정은 1일 간격으로 사진촬영을 통해 기록하였다.

그 결과, 백수오 추출물을 처리한 상처가 대조군 상처에 비해 치유가 촉진된 것을 확인하였다(도 10).

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출한 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 유기용매 추출법은 50 내지 80% 에탄올을 이용한 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 백수오 추출물이 1 내지 100㎍/ml로 포함되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 케라틴 세포(keratinocyte)의 생장 및 이동을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 케라틴 세포에서 활성화된 단백질 키나제(MAPK)인 JNK1/2의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부 재생용 화장료 조성물.
백수오(Cynanchum wilfordii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부 외용제 조성물.