하나의 양태로서, 본 발명은 플라티코딘-디(Platycodin D)을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 플라티코딘-디(platycodin-D)는 하기 화학식 1의 구조를 가지고 있는 식물 유래의 트리터펜 사포닌계(triterpenoid saponin)의 일종이다.
본 발명의 플라티코딘-디는 천연 공급원(예를 들어, 도라지 등)으로부터 분리되거나, 천연 공급원으로부터 수득된 트리터펜사포닌을 화학적 개질(modification)에 의해 제조하거나, 또는 화학적으로 합성하여 제조하거나, 상업적으로 제조된 상품(예를 들어, Pharmavan 사의 Platycodin D)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 플라티코딘-디는 도라지 뿌리에서 물, 알코올 또는 아세톤 등의 용매를 사용하여 0℃ 내지 50℃에서 추출 및 분리할 수 있으며, 이러한 추출 및 분리 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 플라티코딘-디의 미백 효과를 알아보기 위하여, 기존의 미백 화장품 원료로 사용되고 있는 비타민 C(vitamin C)와 비교하여 미백물질 스크리닝에 일반적으로 이용되는 세포내 티로시나제 활성 및 멜라닌 생성 억제효능을 측정한 결과, 동일한 농도에서 본 발명의 플라티코딘-디가 비타민 C 보다 약 10% 이상 티로시나제 활성 억제 및 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하였다. 따라서, 본 발명의 플라티코딘-디는 미백 효과가 우수하다.
본 발명의 상기 화학식 1의 플라티코딘-디는 당업계에서 통상적으로 실시되는 치환기의 부가 또는 치환 반응에 의하여 얻어지는 유도체 중 멜라닌 생성 억제 및/또는 티로시나아제 활성 억제에 의한 피부 미백 효과를 나타내는 유도체를 포함한다는 것은 당업계의 기술 수준을 고려하여 당업자에게 명확하다.
본 발명의 피부 미백용 조성물에서, 플라티코딘-디의 양은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 10 중량%가 바람직하다. 0.0001 중량% 미만인 경우에는 미백 효과가 너무 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 플라티코딘-디는 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 5 중량% 포함된다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 유효 성분으로서의 플라티코딘-디 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및/또는 담체를 포함한다. 또한 상기 화장료 조성물은 피부 미백효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가저으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 플라티코딘-디의 양은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량% 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 미백용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 플라티코딘-디의 양은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제형으로는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소 도포가 가장 바람직하다.
상기 제제의 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 투여 방법에 의해 상이하나, 외용제의 경우는 1일당 1.0 내지 3.0㎖로 이를 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋다.
또한, 경구형 제형의 경우도 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100㎎/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 플라티코딘-디에 대한 피부누적 자극시험 결과 플라티코딘-디는 천연 물질로서 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 플라티코딘-디는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물 및 약제학적 조성물 등에 안전하게 적용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 :
플라티코딘
-
디에
의한 멜라닌 생성 억제효과 측정
쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 플라티코딘-디(Sigma)에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 비타민 C에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다.
본 실험은 murine melanoma(B-16 F10) 세포를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1× 105 개로 접종한 후, 5 % CO2 및 37 ℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 교체하고, 5% CO2 , 37 ℃하에서 3일간 배양하였다. 플라티코딘-디의 농도범위는 세포독성이 없는 1 uM, 10 uM, 50 uM로 결정하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 이 세포 pellet을 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60 ℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 가지고 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시료 |
처리 농도 (uM) |
멜라닌 생성 억제율 (%) |
비타민 C |
0.1 |
0 |
비타민 C |
0.5 |
0 |
비타민 C |
1 |
2 |
플라티코딘-디 |
0.1 |
0 |
플라티코딘-디 |
0.5 |
34 |
플라티코딘-디 |
1 |
52 |
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 동일 처리 농도에서 플라티코딘-디가 비타민 C보다 우수한 멜라닌 생성 억제율을 나타내었다.
실시예
2 :
플라티코딘
-
디에
의한
세포내
티로시나제
활성억제 효과 측정
쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 플라티코딘-디에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하고, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 비타민 C에 의한 세포내 티로시나제 활성 억제효과와 비교하였다.
본 실험은 murine melanoma(B-16 F1) 세포를 10%의 FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1× 105 개로 접종한 후 5 % CO2 , 37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 교체한 후 5% CO2 , 37℃ 하에서 3일간 배양하였다. 플라티코딘-디의 농도범위는 세포독성이 없는 1 uM, 10 uM, 50 uM로 결정하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 이 세포 pellet를 lysis buffer를 이용하여 분쇄한 후, 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 이 액을 가지고 microplate reader로 492 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정수당 티로시나제 활성을 구하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
시료 |
처리 농도 (uM) |
세포내 티로시나제 활성 억제율 (%) |
비타민 C |
0.1 |
0 |
비타민 C |
0.5 |
0 |
비타민 C |
1 |
4 |
플라티코딘-디 |
0.1 |
1 |
플라티코딘-디 |
0.5 |
33 |
플라티코딘-디 |
1 |
49 |
상기 표 2에 기재된 바와 같이, 동일 처리 농도에서 플라티코딘-디가 비타민 C보다 우수한 세포내 티로시나제 억제율을 보였다.
실시예
3 : 동물수준에서의 미백 효과 평가
사람과 유사하게 자외선에 의해 색소침착이 생긴다고 알려진 갈색 몰모토(Tortoiseshell guinea pigs; Brown guinea pigs)를 사용하여 플라티코딘-디에 의한 미백효과를 측정하였다.
상기 갈색 몰모토에서 자외선(UV)에 의한 색소침착을 유발하기 위하여, 갈색 몰모토 배위의 털을 제거한 피부에 3 X 3 cm2의 정방형 창문이 뚫린 차광용 알루미늄 호일을 접착시킨 후, SE lamp(파장 290-320 nm, Toshiba)로 자외선을 조사하였다(총조사 에너지량 = 1350 mJ/cm2). 자외선 조사후 알루미늄 호일을 벗겨내고 아래와 같은 방법으로 시료(플라티코딘-디 및 비타민 C)를 도포하였다. 자외선 조사후 2, 3일 후에 색소침착이 나타났으며, 약 2주후에 최고에 도달하였고, 이 때부터 각 시료를 도포하였다.
도포회수는 1일 1회 또는 2회로, 50일간 계속하였다. 시료는 특정한 용매(Propylene Glycol: Ethanol: Water = 5: 3: 2의 혼합용매)를 사용하여 용해 및 희석하였으며, 면봉으로 도포하고, 다른 부위에 반드시 용매를 도포하는 대조부위를 마련하였다. 효과 판정과 함께 누적자극성 여부도 관찰하였다.
색차계(미놀타 CR2002 chromameter)를 사용하여 피부의 흑백정도를 측정하여 효과를 판정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 색을 표시하는데는 L*A*B* 표색계를 사용하며, 본 발명에서는 L*값을 지표로 하였다. L*값은 표준 백판으로 교정하며, L*값은 1개 부위에 5회 이상 반복하여 측정하였고, 색소침착을 균등하게 하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 구하고 이 값으로 효과를 판정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
(실험식 1)
△L* = 도포 00일 후의 L*값 - 도포 개시일의 L*값
△L* 값을 시료도포 부위와 대조군 부위에 대해서 구한 후 비교하면 미백물질의 효과를 알 수 있다.
시료 |
처리 농도 (%) |
미백효과 (△L) |
플라티코딘-디 |
0.2 |
0.42 |
플라티코딘-디 |
1.0 |
0.58 |
비타민 C |
1.0 |
0.44 |
대조군 |
|
0.30 |
상기 표 3에 기재된 바와 같이, 플라티코딘-디는 비타민 C보다 우수한 미백효과를 보였으며, 시험물질 도포시험 중 누적 자극을 보인 것은 관찰되지 않아 안전성 또한 우수한 것으로 나타났다.
실시예 4 : 플라티코딘-디의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험
4-1. 플라티코딘-디를 포함한 피부외용제의 제조
상기와 같이 미백효과가 우수하다고 판명된 플라티코딘-디가 인체피부에도 안전한지 확인하기 위하여, 플라티코딘-디 및 비타민 C을 함유한 피부외용제를 제조하고 이에 의한 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다.
플라티코딘-디와 비타민 C을 함유한 피부외용제는 하기 표 4의 성분함량으로 제조하였다. 하기 표 4에서 대조군은 티로시나제 저해제를 포함하지 않은 피부외용제이며, 각각 시험군 1과 시험군 2는 플라티코딘-디와 비타민 C을 포함한 피부외용제이다.
피부외용제 제조를 위하여, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하고 70 ℃에서 용해하였으며(수상파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 70 ℃에서 용해하였다(유상파트). 상기 오일파트를 수상파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화하였고, 여기에 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부외용제를 제조하였다.
성분 |
함량 (%) |
대조군 |
시험군 1 |
시험군 2 |
정제수 |
72 |
72 |
72 |
글리세린 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
부틸렌글리콜 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
플라티코딘-디 |
0 |
1.0 |
0 |
비타민 C |
0 |
0 |
1.0 |
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
세테아릴 글루쿠사이드 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
소르비탄 스테아레이트 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
세테아릴 알코올 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
트리메탄올아민 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
총중량 |
100 |
100 |
100 |
4-2. 피부누적 자극 시험
상기 실시예 4-1에서 제조한 각 피부외용제를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적첩포를 시행하는 것에 의하여 플라티코딘-디가 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.
첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15ul씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 아래의 공식을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
(실험식 2)
평균반응도=[[반응지수x 반응도/ 총피검자수 x 최고점수 (4점)] x 100 ] ÷ 검사회수 (9회)
이 때, 반응도에서 ± 는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.
시험물질 |
반응이 나타난 피검자 수 |
평균반응도 |
1주 |
2주 |
3주 |
1차
|
2차
|
3차
|
4차
|
5차
|
6차
|
7차
|
8차
|
9차
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
± + ++
|
대조군 |
1 - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
0.09 |
시험군 1 |
1 - -
|
1 - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
0.13 |
시험군 2 |
3 - -
|
1 - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
- - -
|
0.37 |
피검인원 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
|
상기 표 5에서 시험군 1의 경우, ± , +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 1명, 0명, 0명이었고, 그 외 나머지는 반응이 나타나지 않았다. 상기 기재된 식에 따라 계산하면 [(1x2)/(20x4)]x 100/9=0.13로 평균 반응도가 0.37이 되어 3이하가 되어 안전한 조성물로 판단되었다.
상기 표 5에 기재된 바와 같이, 플라티코딘-디(시험군 1)를 포함한 피부외용제는 대조군이나 비타민 C을 포함한 피부 외용제와 같이 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않았으며 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.