KR102405596B1 - 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 화장료 조성물; 및 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부 보습과 더불어 항산화, 미백 또는 주름 개선 효능을 제공한다.

Description

밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{cosmetic composition comprising Milyang20 sorghum extract}

본 발명은 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 화장료 조성물; 및 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 자극으로부터 몸을 보호하며, 내측의 수분을 막아 주는 기능을 하며, 외부에서부터 표피, 진피, 피하 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 체내의 기온 및 습도 변화, 자외선, 물리적, 화학적인 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능이 있다. 피부의 표피층에서는 분화되는 과정을 통하여 수분을 함유하면서 얇은 각질층으로 발달하게 된다. 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 각질층의 세포들은 구조적으로 벽돌과 같은 역할을 하며, 각질세포의 세포간 지지들은 모르타르로 작용하여 피부 장벽을 구성한다.

그러나 인체는 노화되면서 건조한 피부가 증가하는 경향을 보이며, 요즘과 같이 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 인위적인 온도 조절, 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 사회 생활에서 발생되는 각종 스트레스 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며, 피부가 촉촉함을 잃고 푸석거리며, 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다.

수수는 고량(高梁), 촉서, 고랑, 로속(蘆粟)이라고도 불리는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이로서, 높이는 1.5∼3m, 표면은 굳고 흰색의 납질물이 있으며 속이 차 있고, 줄기에는 10∼13개의 마디가 있으며 줄기 끝에 이삭이 달린다. 잎은 마주나고 길이 50∼60cm, 너비 5cm 정도로 1줄기에 10개 정도 달리며, 처음에는 잎과 줄기가 녹색이나 차츰 붉은 갈색으로 변한다. 열대아프리카가 원산지이며 이디오피아와 동부 아프리카에서 유전적으로 다양한 야생 수수들이 많이 발견되고 있다. 수수는 고온, 다조(多照)를 좋아하고 내건성(耐乾性)이 강하여 열대와 그에 준하는 건조지대에서 가장 많이 재배될 뿐만 아니라 흑조위축병에 강한 특성을 가지고 있다.

또한, 수수는 사람의 건강에 상당히 영향을 미치는 것으로 알려진, 탄닌, 석탄산, 안토시아닌, 식물 스테롤, 및 폴리코사놀(policosanols) 같은 2차대사산물이 풍부하다(Awika & Rooney, 2004, Phytochemistry, 65, 1199-1221). 최근의 연구는 수수가 항산화 활성 (Choi et al., 2006, Food Chemistry, 103, 130-138), 항암 효과 (Kwak et al., 2004, Journal of Korean Society Food Science Nutrition, 33, 921-929), 및 콜레스테롤 저하 효과 (Ha et al., 1998, Korean Journal of Food Science and Technology, 30, 224-229)를 가지며, 심혈관 질환을 감소시킬 수 있다고 보고하였다(Cho et al., 2000, Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 14, A249). 더욱이, 수수는 DPPH 라디칼 소거활성이 있으며, 항돌연변이 효과를 갖는 것으로 보고되었다. (Kwak et al., 2004, Journal of Korean Society Food Science Nutrition, 33, 921-929). HMG-CoA 환원효소 저해 활성이 수수의 메탄올 추출물에서 검출되었다. (Ha et al., 1998, Korean Journal of Food Science and Technology, 30, 224-229).

한편, 한국등록특허 제10-534074호는 상기 수수를 포함하고, 검은콩, 백태, 팥, 및 검은깨를 추가로 포함하는 곡류 추출물과 현미 또는 율무발아 상황버섯 추출물을 혼합한 조성물에 관한 것으로, 티로시나아제 활성 저해 및 리놀산에 대한 항산화 효과를 통해 피부 미백 및 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있으나, 본 발명의 밀양 20호에 관하여는 언급조차 하고 있지 않다.

또한, 본 발명의 밀양 20호 수수의 필라그린 생성을 통한 피부 보습 효과에 관하여는 본 발명자에 의해 최초로 규명되었다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 밀양20호 수수 추출물을 피부 세포에 처리하여, 수수의 우수한 피부 보습 효과를 확인하였으며, 이는 타 수수 품종에 비하여 뛰어난 보습 효과 및 미백, 주름개선, 항산화 효능과 같은 피부 개선 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 조성물의 용도는 피부 보습용인 것이며, 피부 보습은 필라그린 생성 증가에 의한 것이고, 상기 항산화는 폴리페놀, 플라보노이드, 또는 안토시아닌 증가에 의한 것이며, 상기 미백은 타이로시나제 억제, DOPA 크롬 억제, 또는 멜라닌 색소 억제에 의한 것이고, 상기 주름 개선은 엘라스타아제 저해, 또는 콜라게나아제 저해에 의한 것일 수 있으며, 상기 조성물 내 밀양20호 수수 추출물의 함량은 0.01 내지 10%인 것일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 기미, 주근깨, 검버섯, 및 잡티로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 예방 또는 개선을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “밀양20호”는 2015년 찰수수인 BTx630과 밀양11호의 인공교배에 의해서 개발된 계통으로 단간이면서 찰성이고 2018년 생산력 검정시험을 위해 수수 밀양20호로 명명되었으며, 2019년 우량계통으로 선발되어 지역적응 시험을 위한 공시계통으로 지정되었다.

상기 밀양20호는, 2020년 6월 25일자로 부다페스트 조약 하의 기탁기관인 국립농업과학원에 기탁하여 기탁번호 KACC 98081P에 의해 수탁된 바 있다.

본 발명에 있어서, 상기 밀양20호의 추출물은 필라그린 생성 증가 효과가 있으며, 기타 수수 품종보다 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌 함량이 뛰어나며, 또한, 기타 수수 품종보다 타이로시나아제, DOPA 크롬 억제, 및 멜라닌 색소 억제 효능, 및 엘라스타아제, 콜라게나아제 저해 효과가 우수하여, 피부 보습 효능, 항산화 효능, 미백 효능, 및 주름 개선 효능이 월등히 우수한 수수 품종임을 확인하였다.

본 발명의 용어, “수수”는 고량(高梁), 촉서, 고랑, 로속(蘆粟)이라고도 불리는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀을 의미하며, 여러 나라에서 빵, 죽, 알코올 및 비알콜성 음료 등으로 다양하게 이용되고 있다고 알려져 있다.

본 발명의 용어, “추출물”은 어떤 물질을 추출 처리하여 얻어지는 물질을 의미하는 것으로, 구체적으로 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나, 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 추출에 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 추출용매는 메탄올 추출물, 보다 구체적으로, 80% 메탄올 추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물 내 밀양20호 수수 추출물의 함량은 1 내지 10%인 것일 수 있다.

본 발명의 용어, “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 용어, “보습”은 피부 등에 수분을 보충하는 것을 의미한다.

상기 용어, “필라그린(filaggrin)”은 각질세포에 포함된 보습성분으로 알려져 있으며, 보다 구체적으로, 포유류의 표피세포에서 분리한 케라틴결합단백질로써, 분자량이 약 260,000의 염기성 단백질이며 케라틴의 단위체와 약 3:2의 비율로 결합하고, 그 섬유를 다발모양으로 응집시켜 거대피브릴을 형성한다. 분자량이 약 50만의 고도로 (세린으로)인산화된 전구체로서 세포 내에 축적되어 분화가 진행되면 단백질가수분해효소에 의한 절단과 탈인산화를 받아 필라그린이 된다고 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 밀양20호 수수 추출물을 피부에 처리 시, 농도의존적으로 피부 내 보습과 관련된 필라그린의 함량 증가를 확인하여, 본 발명의 추출물의 보습 효능을 확인할 수 있었다.

본 발명의 용어, “항산화”는 산화가 진행되는 것을 억제하거나 완하하는 것을 의미하며, 세포의 노화 과정을 예방한다고 알려져 있다.

상기 용어, “폴리페놀(polypheno)”은 신체 내 활성산소(유해산소)를 해가 없는 물질로 바꿔주는 항산화 물질 중 하나이다. 구체적으로, 상기 폴리페놀은 활성산소에 노출되어 손상되는 DNA의 보호나 세포구성 단백질 및 효소를 보호하는 항산화 능력이 커서 다양한 질병에 대한 위험도를 낮춘다고 알려져 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에서는, 밀양20호 수수 추출물의 ABTS 소거능 및 DPPH 소거능을 기타 수수 품종 추출물과 비교하여, 본 발명의 추출물이 기타 수수 품종 추출물 보다 뛰어난 항산화 활성이 있음을 확인하였다.

상기 용어, “플라보노이드(flavonoid)”는 식품에 널리 분포하는 노란색 계통의 색소로, 페닐기 2개가 C₃사슬을 매개하여 결합한 탄소골격구조로 되어 있다고 알려져 있다. 또한, 항균·항암·항바이러스·항알레르기 및 항염증 활성을 지니며, 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 알려져 있고, 생체 내에서 산화작용을 억제하는 효능이 있다고 알려져 있다.

상기 용어, “안토시아닌(anthocyanin)”은 플라보노이드 계열의 물질로서, 두 개의 방향족 고리가 세 개의 탄소와 하나의 산소로 연결되어 있는 구조이다. 구체적으로, 상기 안토시아닌은 안토시아니딘(anthocyanidine)에 하나 이상의 당이 결합되어 있는 구조를 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 밀양20호 수수 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌 함량을 기타 수수 품종 추출물과 비교하여, 본 발명의 추출물이 기타 수수 품종 추출물 보다 뛰어난 항산화 활성이 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어, “미백”은 멜라닌 색소의 합성을 저해하고/하거나 타이로시나제 활성을 억제시킴으로써 피부 톤을 밝게 하는 것을 말한다. 또한 상기 피부 미백은 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨, 검버섯, 잡티 또는 흑생종 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 포함한다.

상기 용어, “타이로시나제(tyrosinase)”는 페놀옥시다아제의 하나로 약 0.2%의 구리를 함유하는 구리단백질이며, 산화하여 멜라닌을 생성하는 효소이다. 구체적으로 티로신(tyrosine)은 타이로시나아제에 의해 도파(DOPA)가 되고, 도파는 티로시나아제에 의해 도파퀴논이 되며, 도파퀴논은 도파 크롬, 도파 크롬은 멜라닌이 되어, 피부 색소 침착을 발생시킨다.

상기 용어, “도파 크롬(DOPA chrome)”은 상술한 바와 같이 멜라닌을 생성하는 중간물질이다.

상기 용어, “멜라닌”은 흑갈색 알갱이의 색소로서, 멜라닌 세포 내 멜라노솜이라는 세포 소기관에 의해 만들어진다. 멜라닌은 피부, 털, 눈 등에 존재하며, 멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부색을 띤다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 밀양20호 수수 추출물의 타이로시나아제 억제 활성 및 멜라닌 색소 억제 활성을 기타 수수 품종 추출물과 비교하여, 본 발명의 추출물이 기타 수수 품종 추출물 보다 뛰어난 미백 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어, “주름”은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미한다. 구체적으로, 피부의 주름은 다양한 원인으로 발생하지만 주로 진피 속의 탄력섬유·결합직섬유·근육섬유의 퇴화·위축 등 노화에 의해 일어나는 것을 주름이라고 한다. 또한 자외선도 피부의 탄력을 잃게 하여 주름을 발생시키는 원인 중 하나이다.

상기 용어, “엘라스타아제(elastase)”는 엘라스틴(elastin)을 분해하는 단백질 용해성 효소로서, 엘라스틴의 펩타이드 결합과 중성 아미노산에 의해 형성되는 다른 펩티드 결합을 가수분해하는 효소이다. 상기 엘라스틴은 탄성 섬유 단백질로서, 엘라스틴이 분해되면 피부의 주름생성의 주원인이 된다고 알려져 있다.

상기 용어, “콜라게나아제(collagenase)”는 콜라겐을 분해하는 효소이다. 상기 콜라겐은 피부 단백질의 80%를 차지하는 성분으로 노화에 의해 자연스럽게 함량이 줄어들게 되며, 피부 진피에서 90%의 콜라겐이 사라지면 피부의 장벽이 무너져 노화를 촉진시키거나 피부가 얇아져 색소침착이 발생한다고 알려져 있다. 따라서 상기 콜라겐의 분해에 관여하는 콜라게나아제의 활성 억제는 피부의 노화 억제에 중요한 요인이다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 밀양20호 수수 추출물의 엘라스타아제 저해 활성 및 콜라게나아제 저해 활성을 기타 수수 품종 추출물과 비교하여, 본 발명의 추출물이 기타 수수 품종 추출물 보다 뛰어난 주름 개선 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어, “개선”은 어떠한 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, “화장료 조성물”은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제 포함 클렌징, 오일, 앰플, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 구체적으로, 저자극성 화장료 피부 보호제, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 세럼, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 크림, 에센스, 스트레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

상기 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 실시양태는 상기 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 항산화, 미백, 또는 주름 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

이때, 상기 용어 “밀양20호”, “추출물”, “유효성분”, “보습”, “항산화”, “미백”, “주름”, 및 “개선”의 의미는 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “의약외품”은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함 된다.

본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부 보습과 더불어 항산화, 미백 또는 주름 개선 효능을 제공한다.

도 1은 밀양20호 수수 추출물이 필라그린 생성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 2는 밀양20호 수수 추출물의 타이로시나아제 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 3은 밀양20호 수수 추출물의 멜라닌 색소 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 4는 밀양20호 수수 추출물이 콜라겐 생성 전구체인 프로-콜라겐 생합성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 밀양20호 수수 추출물이 ECM을 분해하여 주름을 생성하는 MMP 효소 발현에 미치는 영향을 나타내는 사진 및 그래프이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 밀양20호 및 찰수수 준비 및 추출물 제조

실험에 사용된 밀양20호 및 찰수수 시료는 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부에서 2018년 재배된 수수 품종 및 계통을 이용하여 분석을 수행하였다. 구체적으로, 밀양20호 외 찰수수 품종은 남풍찰, 소담찰, 노을찰, 밀양17호, 및 밀양19호를 준비하였다.

또한, 상기 찰수수에 함유된 기능성분을 추출하고 활성을 분석하기 위하여, 80% 메탄올을 이용하여 16시간 동안 상온에서 shaking하였고, 진공 농축하여 추출물을 수득하였다.

실험예 2. 피부 세포 내 필라그린 측정

피부 세포를 보호하는 각질층은 필라그린(filaggrin) 합성 양이 줄면서 피부 장벽의 기능이 약화되고 보습은 줄어 손상을 입게 된다고 알려져 있다. 상기 추출물들에 의한 피부 보습 개선 효능을 평가하기 위하여, CCD-986sk 세포에 상기 추출물을 처리하여 필라그린의 생성 변화를 분석하였다.

구체적으로, UVB 조사 및 추출물 시료를 농도별로 처리한 세포를 이용하여 세포 용해물(lysate)을 준비하고, 96 well plate에 용해물과 스탠다드를 50 ㎕씩 넣고 5 ㎕의 balance solution과 100 ㎕의 conjugate를 넣어 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이후, washing buffer를 이용하여 5회 세척 후 substrate A와 B를 각각 50 ㎕씩 넣어 37℃에서 15분간 반응시키고, 50 ㎕의 stop solution을 추가하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 뒤, standard curve를 기준으로 절대 값으로 표시 하였다.

실험예 3. 항산화 활성 측정

항산화 활성 측정은 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 및 ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) 라디칼 소거능을 통해 확인하였다.

보다 구체적으로, DPPH 소거능은 0.2 mM DPPH 용액 200 μL에 추출물 20 μL를 첨가하고, 30분 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조군으로는 trolox를 사용하여 trolox equivalent (TE)로 표시하였다.

또한, ABTS 소거능은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potasium persulphate를 1:1로 혼합하여 12 ~ 16시간 동안 상온의 암실에서 처리하여 ABTS 양이온을 형성한 후, 반응 용액을 735 nm에서 흡광도 값이 1.0 ± 0.2가 되도록 몰 흡광계수(ε=3.6×10⁴ M^-1cm^-1)를 참고하여 EtOH로 희석한 뒤, 상기 희석된 ABTS 용액 200 μL에 추출물 20 μL를 첨가하고, 30분 후, 735 nm에서 흡광도 측정하였다. 결과 값은 DPPH와 같이 TE로 표시하였다.

실험예 4. 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌 분석

총 폴리페놀 함량은 추출물 20 μL에 10% Folin-Ciocalteu 시료 100 μL를 섞어 5분간 방치하고, 7.5% Na₂CO₃ 80 μL를 넣어 2시간 동안 암실에 보관한 후 750 nm에서 비색정량. 표준물질로 gallic acid (GA)를 사용하여 결과 값을 GA equivalent로 표시하였다.

또한, 총 플라보노이드 함량은 추출물 100 μL과 증류수 400 μL, 5% NaNO₂ 30 μL를 5분간 반응시킨 후 10% AlCl₃ 30 μL를 넣고 다시 6분간 반응시킨 후 1 M NaOH 200 μL와 증류수 240 μL를 넣고 상층액을 이용해 510 nm에서 비색정량하였고, 표준물질로 catechin hydrate를 사용하여 결과 값을 catechin equivalent로 표시하였다.

또한, 총 안토시아닌 함량은 시료 20 μL와 potassium chloride buffer (pH 1.0), 동량의 시료와 sodium acetate buffer (pH 4.5)를 각각 반응시킨 반응액을 15분간 암실에 보관한 후 510 nm와 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 5. 타이로시나아제 생성 억제능 측정

타이로시나아제 억제 활성 측정은 멜라닌 생성세포인 B16F10 멜라노마 세포를 이용하여 측정하였다.

보다 구체적으로, B16F10 멜라노마 세포를 6 well에 5×104 cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 시료를 48시간 동안 처리한다. 처리 후 PBS로 2회 세척한 후 각 well의 세포에 lysis buffer (1% triton X-100, 0.1M Sodium phosphate buffer, 50mM PMSF, pH 6.8)를 가하였다. 얼음 위에서 세포를 파괴시키고 원심 분리한 후 상층액만 따로 모아 효소용액으로 사용하였다. L-DOPA를 2mg/mL 농도로 0.1M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹여 기질을 준비하고 기질 160μL에 효소용액 40μL를 가하고 37℃에서 1시간 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 490nm에서 측정한 후(1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100 에 의하여 억제율을 계산하였다.

실험예 6. 멜라닌 색소 억제능 측정

멜라닌 색소 억제능은 멜라노마 세포를 이용하여 측정하였다.

보다 구체적으로, DMEM 배지로 배양된 멜라노마 세포를 100mm culture dish에 2×10⁶cell/dish가 되게 분주하고, 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 ml을 첨가하고, 48시간 후 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 뒤, 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10⁶세포 당 1ml의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리하였다. 분리된 멜라닌은 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol(1:3) 1ml을 가하여 2회 원심분리 한 후, ether 1ml로 세척 건조시켰다. 건조된 멜라닌에 1N NaOH를 1ml을 가하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생합성 저해는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 계산하였다.

실험예 7. 엘라스타아제(elastase) 저해능 측정

엘라스타아제 저해활성 측정은 Cannell의 방법에 따라 측정 하였다.

보다 구체적으로, 기질로 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37 ℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 각 시험 용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL 씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 돼지 췌장 엘라스타아제(porcine pancreas elastase)(2.5 U/mL) 용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroa nilide(0.5 mg/mL)를 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타아제 저해 활성은 시료 용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 계상하였다.

실험예 8. 콜라게나아제 저해능 측정

콜라게나아제 억제 활성 측정은 Wusch 등의 방법에 따라 측정 하였다.

보다 구체적으로, 반응구는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여 4-phenylazo benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3 mg/ml)를 녹인 기질 액 0.25 ml 및 시료 용액 0.1 ml의 혼합액에 collagenase (0.2 mg/ml) 0.15 ml를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 ml 을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5 ml을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나아제 저해활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 계산하였다.

실험예 9. 프로콜라겐 함량 및 콜라게네이즈(MMP-1) 억제활성 측정

콜라겐은 세포내에서 프로콜라겐으로 합성된 후 세포외로 분리되어 콜라겐 섬유로 중합하는 것으로 알려져 있고, 이때 프로콜라겐의 N-말단과 C-말단의 펩타이드가 유리되는데, C-말단 펩타이드 양을 측정하여 프로콜라겐 함량을 측정하는데 이용된다. 프로콜라겐 타입 I의 함량은 procollagen type I C-peptide assay kit(Takara Bio, Japan)를 이용하여 분석하였다. 콜라게네이즈 억제 활성 측정을 위해서 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) biotrack activity assay kit(Amersham Bioscience, NJ, USA)를 이용하여 분석을 수행하였다. 또한 MMP-1 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. PCR tube에 Taq DNA polymerase (Promega Corporation, USA), primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. MMP-1은 94℃에서 30초, 56℃에서 60초, 72℃에서 1분(35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.

실시예 1. 밀양20호 수수 추출물의 필라그린 생성을 통한 보습활성 확인

밀양20호 수수 추출물이 필라그린 생성에 미치는 효능을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 2의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 상기 밀양20호 수수 추출물이 자외선 자극으로 인해 감소된 필라그린 함량을 농도의존적으로 회복시키는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 자외선 자극으로 인해 손상된 필라그린 생성을 촉진하여, 우수한 피부 보습 개선 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 2. 밀양20호 수수 추출물의 항산화 활성 확인

밀양20호 및 다른 찰수수 추출물의 활성산소 억제능와 항산화 활성을 ABTS 및 DPPH 소거능을 통해 확인하였다.

구체적으로, 실험예 3의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

품종 및 계통명	ABTS 소거능	DPPH 소거능
	(mgTE/100g)	(mgTE/100g)
밀양20호	1561.4 ± 12.3	1642.1 ± 16.2
남풍찰	1477.6 ± 18.0	1229.7 ± 15.7
소담찰	1142.9 ± 12.3	845.9 ± 14.8
노을찰	436.3 ± 10.5	178.4 ± 12.9
밀양17호	384.3 ± 6.6	165.9 ± 10.6
밀양19호	1133.0 ± 12.8	930.7 ± 7.1

그 결과, 표 1에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물의 ABTS 소거능이 1561.4 ± 12.3 이며, DPPH 소거능이 1642.1 ± 16.2 인 것을 확인하였다. 또한, 다른 찰수수 추출물과 비교하여도 밀양20호의 항산화 활성이 가장 높은 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 다른 찰수수 추출물과 비교하여 현저한 항산화 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 3. 밀양20호 수수 추출물 내 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌 함량 확인

밀양20호 및 다른 찰수수 품종에서 기능성 성분인 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌의 함량을 분석하였다.

구체적으로, 실험예 4의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

품종 및 계통명	폴리페놀 함량 (mgGAE/100g)	플라보노이드 함량 (mgCE/100g)	안토시아닌 함량 (mg/100g)
밀양20호	1157.1 ± 19.7	1053.4 ± 34.2	38.3 ± 1.1
남풍찰	933.1 ± 23.4	1064.7 ± 5.2	14.3 ± 3.9
소담찰	658.9 ± 21.2	670.1 ± 11.9	12.1 ± 5.8
노을찰	251.6 ± 14.3	169.7 ± 8.2	1.3 ± 5.4
밀양17호	218.0 ± 14.6	149.4 ± 6.1	0.0 ± 4.4
밀양19호	727.4 ± 18.1	521.8 ± 5.7	49.2 ± 4.8

그 결과, 표 2에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물의 폴리페놀 함량이 1157.1 ± 19.7 이고, 플라보노이드 함량은 1053.4 ± 34.2 이며, 안토시아닌 함량이 38.3 ± 1.1인 것을 확인하였다. 또한, 다른 찰수수 추출물과 비교하여도 가장 높은 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 다른 찰수수 품종과 비교하여 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌 함량이 우수함을 확인하였다.

실시예 4. 밀양20호 수수 추출물의 타이로시나아제 억제 활성 확인

밀양20호 수수 및 다른 찰수수 품종에서 미백 활성 측정을 위한 타이로시나아제 억제 활성을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 5의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

품종 및 계통명	Tyrosinase 억제 활성(%) 농도 1000 (μg/ml)
밀양20호	44.7
소담찰	22.2
남풍찰	23.9

그 결과, 표 3에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물에서 타이로시나아제 억제 활성이 44.7%인 것을 확인하였으며, 이는 다른 찰수수 품종 소담찰 및 남풍찰 추출물에서보다 현저히 높은 효능인 것을 확인하였다.

또한, 도 2에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물의 농도에 의존하여 세포 내 타이로시나아제 활성이 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 타이로시나아제 활성 억제능이 있으며, 이는 다른 찰수수 품종과 비교하여도 이의 억제 활성이 뛰어난 것을 확인하였다.

실시예 5. 밀양20호 수수 추출물의 멜라닌 색소 억제능 확인

밀양20호 수수 추출물의 미백 활성 측정을 위한 멜라닌 색소 억제능을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 6의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물은 세포 내 멜라닌 색소 억제능이 있으며, 농도의존적으로 이의 억제 활성이 높아지는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 뛰어난 멜라닌 색소 억제능이 있음을 확인하였다.

실시예 6. 밀양20호 수수 추출물의 주름 개선 효능 확인

밀양20호 수수 추출물의 주름 개선 효능 측정을 위한 엘라스타아제 저해 활성 및 콜라게나아제 저해 활성을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 7 내지 8의 방법을 통해 실험을 실시하였다. 또한, 양성 대조군으로는 EGCG를 사용하였다.

품종 및 계통명	처리 농도(1,000 μg/ml)
	Elastase 억제 활성(%)	Collagenase 억제 활성(%)
밀양20호	63.7	93.7
소담찰	-33.3	28.8
남풍찰	-185.9	33.2

그 결과, 표 4에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물의 엘라스타아제 저해 활성이 63.7%이며, 콜라게나아제 저해 활성은 93.7%인 것을 확인하였으며, 이는 다른 찰수수 품종인 소담 및 남풍찰 보다 현저하게 뛰어난 효능임을 확인하였다.

또한, 콜라겐 생성 전구체인 프로-콜라겐 생합성 비율을 측정하여, 콜라겐 생성 활성을 확인하였다. 구체적으로, 실험예 9의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물이 콜라겐 생성 전구체인 프로-콜라겐 생합성 비율을 농도의존적으로 증가시켜 콜라겐 생성이 증가하는 것을 확인하였다.

또한, ECM을 분해하여 주름을 생성하는 MMP 효소 발현 정도를 mRNA의 발현 측정을 통해 확인하였다. 구체적으로, 실험예 9의 방법을 통해 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 밀양20호 수수 추출물의 농도의존적으로 MMP의 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 엘라스타아제 억제, 콜라게나아제 억제, 및 MMP 효소 발현 억제를 통해 주름 억제 활성이 있으며, 이는 다른 찰수수 품종보다 효능이 뛰어남을 확인하였다.

다시 말해, 본 발명의 밀양20호 수수 추출물이 필라그린 생성을 통해 우수한 피부 보습 효과가 있음을 확인하여, 피부 보습용 화장료 조성물로서의 활용이 가능함을 확인하였으며, 또한, 다른 수수 품종과 비교하여서도 월등한 ABTS 소거능, DPPH 소거능을 확인하였으며, 폴리페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌 함량이 우수한 것을 확인하여, 밀양20호 수수 추출물이 타 수수 품종 추출물과 비교하여 우수한 기능성 효능이 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

국립농업과학원 KACC98081P 20200625

Claims (9)

1. 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 미백, 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것인, 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 피부 보습 효과는 필라그린 생성 증가에 의한 것인, 화장료 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 미백 효과는 타이로시나제 억제, DOPA 크롬 억제, 또는 멜라닌 색소 억제에 의한 것인, 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 주름 개선 효과는 엘라스타아제 저해, 또는 콜라게나아제 저해에 의한 것인, 화장료 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 기미, 주근깨, 검버섯 및 잡티로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 예방 또는 개선하기 위한 것인, 화장료 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 밀양20호는 수탁번호 KACC 98081P에 의해 기탁된 것인, 화장료 조성물.
   
9. 밀양20호 수수 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 미백, 또는 주름 개선용 의약외품 조성물.

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