KR20170110358A - 장뇌삼 발효액을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 순차 발효시킨 장뇌삼 발효액을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 장뇌삼 발효액은 장뇌삼을 바실러스속 균주(Bacillus subtilis) 또는 효모(Saccharomyces cerevisiae)로 배양하여 얻은 1차 발효액을 유산균 균주 Lactobacillus plantarum)를 이용하여 2차 발효하여 얻은 것이다. 본 발명의 장뇌삼 발효액은 피부 세포 활성을 증진시키고, 콜라겐 등의 피부 세포 단백질의 합성을 촉진시켜 주며, 콜라겐 분해 효소의 생성을 억제해줌으로써 노화로 인해 발생하는 피부 주름 개선 및 탄련 개선 효능을 갖고 있다. 또한 본 발명의 장뇌삼 발효액은 보습 및 미백효능을 가지고 있다.

Description

장뇌삼 발효액을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition Comprising the Fermented Extract of Panax ginseng}

본 발명은 장뇌삼 발효액을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화 (intrinsic aging)와 광노화 (photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 자유라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다.

좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성 물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히, 단백질의 산화는 피부의 결합 조직인 콜라겐 (collagen), 히아루론산 (hyaluronic acid), 엘라스틴 (elastin), 프로테오글리칸 (proteoglycan), 피브로넥틴 (fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증 반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역 기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 이러한 자유라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소 (Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다.

그러므로, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 조절하고자 하였다.

한편, 색소 침착에 의한 피부 변화가 생긴다. 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은, 부분 또는 전체적인 색소 침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강 상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소 침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데, 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로서, 이 멜라닌의 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다.

멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대 흡수 파장이 없고 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성 산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성 산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을　나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 형성 세포의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화 과정을 거쳐 갈색 (pheomelanin), 흑색 (eumelanin)의 중합체로 형성된다.

이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포 내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 각질 세포의 식세포 작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 각질 세포의 핵 주변에 축적된다.

멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 각질 세포로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인 (cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있다. 하지만, 이들은 화장품 제형 중에서의 안정성이 낮으므로 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 상기한 물질들은 그 티로시나제 억제 효과가 입증되었으나 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 흑색종 세포 배양에 의한 저해효과 평가가 요구되고 있는 실정이다. 또한, 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 화장품에서는 그 사용이 금지 또는 제한되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 상기 성분들을 소량 함유한 화장료는 실온에서 수 주 동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다.

이러한 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학 물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발 가치가 한층 늘어나고 있다.

본 발명자들은 노화로 인해 손상된 다양한 피부 트러블들을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 장뇌삼을 바실러스속 미생물 또는 효모균을 이용하여 발효시킨 1차발효액을 유산균을 이용하여 2차 발효한 발효액이 피부 노화로 인해 발생하는 피부의 문제점, 특히 피부 주름을 효과적으로 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은 피부 주름 개선효과가 뛰어난 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 피부 탄력 개선, 보습, 미백 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제는 순차 발효시킨 장뇌삼 발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 장뇌삼 발효액은 장뇌삼을 바실러스속 균주 또는 효모를 이용하여 1차 발효하고, 상기 1차 발효액을 비피더스(Bifidus)균 및 불가리스(Bulgaricus)균, 락토바실러스(Lactobacillus)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 유산균 균주를 이용하여 2차 발효하여 수득한 바실러스-유산균 발효액 또는 효모-유산균 발효액일 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 바실러스속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이고, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 보습 또는 미백 효과를 갖는다.

바람직하게는 상기 장뇌삼 발효액은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001-30.0%(w/w)로 함유될 수 있다.

본 발명 화장료 조성물은 유효성분으로서 장뇌삼 발효액을 포함하며, 상기 장뇌삼 발효액은 장뇌삼을 효모-유산균 발효액 또는 바실러스-유산균 발효액으로서, 세포 활성 및 콜라겐 합성을 촉진해주며, 자외선등에 의해 생성이 증가되는 콜라겐 분해 효소(MMP-1)의 생합성을 효과적으로 억제하여 주는 효과를 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 장뇌삼 발효액은 외부 자극에 의한 피부 세포 자극을 완화해 주고 피부를 밝게 하며, 피부 보습 효과를 갖는다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 장뇌삼 발효액을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 장뇌삼(Panax Ginseng)은 산삼의 일종으로서, 산삼은 크게 천종, 지종 및 장뇌(인종) 3종류로 분류되며, 천종은 천연 산삼으로 조류가 종자를 먹은 뒤 산속에 배설하여 자생한 것, 지종은 천종의 씨앗이 주위에 떨어져 자생한 것, 그리고 장뇌삼은 산삼의 종자를 채취하여 깊은 산속에 씨를 뿌려 야생 상태로 인위적으로 재배한 산삼을 가리킨다. 이러한 산삼 중에서 비교적 구입이 용이한 장뇌삼은 인삼에 비하여 주성분인 사포닌이 더 많고 약리 효능이 더 높다고 알려져 있다. 장뇌삼의 공지된 약리학적 효능은 당뇨, 간질환, 고혈압, 부인병 및 갱년기 증상의 치료이다.

한편, 본 명세서에서 용어 “장뇌삼”은 장뇌삼의 다양한 기관(예: 잎, 열매, 꽃, 줄기 및 뿌리 등)을 의미하며, 바람직하게는 장뇌삼의 뿌리를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "순차 발효시킨 장뇌삼 발효액"은 바실러스속 균주(Bacillus sp)를 이용하여 발효한 1차 발효액에 유산균 균주를 배양하여 2차 발효한 바실러스-유산균 발효액, 또는 효모를 이용하여 발효한 1차 발효액에 유산균 균주를 배양하여 2차 발효한 효모-유산균 발효액을 가리킨다.

본 발명에서, 바실러스 균주는 그람양성의 미생물이며, 내생포자 형성이 가능하고, 장간균(rod shape)의 형태를 가지고 있다. 본 발명의 장뇌삼을 1차 발효시키는데 유용한 바실러스 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다.

또한, 본 발명의 효모균은 진핵미생물(핵과 세포질이 핵막에 의하여 나누어져 있는 생물)에 속하며 세포벽, 세포막, 핵, 사립체, 과립 등 세포 소기관을 갖추고 있다. 성의 구별이 없는 이들은 주로 budding(출아법)으로 번식하는데, 분리된 많은 효모들 중에는 발효능이 없는 것, budding 대신 fission(분열) 혹은 bud-fission 방법으로 증식하는 것, ascospore(자낭포자)가 아닌 ballistospore를 형성하거나 spore(포자)형성이 관찰되지 않는 것 등 다양한 그룹의 효모도 존재한다. 크기는 보통 5^-10×5^-12㎛로 세균의 5^-10배 크기이며, 적정 pH는 4.5 내지 5.5이나 1 내지 10에서도 생존한다. pH 1에서 12시간 생존하는 효모는 박테리아보다 산에 강하므로 배지의 pH를 3.5 내지 3.8 정도로 맞추면 박테리아의 오염을 어느 정도 억제할 수 있다.

효모는 균 종에 따라서 조금씩 차이가 있으나, 대부분 20~30℃에서 잘 자란다. 보통은 50℃ 이상에서는 효모가 사멸한다고 하지만, 그 온도 이상에서 합성이 되지 않는 성장요소를 배지에 직접 첨가해 줌으로서 어느 정도 극복이 가능하다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 40℃ 이상에서 사멸하지만, 배지에 올레익산(oleic acid)과 에르고스테롤(ergosterol)을 첨가해 줌으로서 이를 방지할 수 있다. 효모 균체 자체는 단세포 식물로서 단백질과 미량광물질을 다량 함유하고 있다.

본 발명의 장뇌삼을 1차 발효시키는데 유용한 효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)이다.

본 발명에서 2차 발효에 사용되는 유산균 균주는 당을 발효시켜 유산을 생성하는 간균으로 그람 양성을 나타내며 포자(胞子)를 가지지 않으며 미호기성(微好氣性) 또는 혐기성이다. 유산균에는 유산균 음료 제조에 유용한 아시도필러스균, 모유영양아(母乳營養兒)의 장에 많이 서식하는 비피더스스균, 불가리아유(乳)라 불리는 발효물을 만드는 불가리아균 등이 있다. .

본 발명의 장뇌삼을 2차 발효시키는데 유용한 유산균는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이다.

본 발명에서, 순차 발효시킨 장뇌삼 발효액은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:

a) 장뇌삼 분말을 100 내지 500 메쉬를 이용하여 미세하게 만드는 단계;

b) 상기 단계 a)에서 제조한 장뇌삼 분말을 통상적인 미생물 배양액에 1 내지 50 g/L 첨가하고, 바실러스 균주 또는 효모를 10,000 내지 100,000 cfu/L의 양으로 첨가하는 단계;

c) 상기 단계 b)의 배양물을 30 ~ 37℃에서, pH 5 ~ 7로 호기적 또는 통성 혐기적인 조건으로 약 5 내지 10 일간 배양하는 단계;

d) 단계 c)의 배양액을 80℃ ~ 85℃에서 진공 멸균하는 단계;

e) 상기 단계 d)의 멸균 배양액을 여과한 후 5 내지 10일 동안 저온 숙성시켜 여과하는 단계;

f) 상기 단계 e)의 여과액을 동결건조하여 파우더를 얻는 단계;

g) 유산균 배지에 락토바실러스 균주를 100,000 내지 1,000,000 cfu/L의 양으로 첨가하는 단계;

h) 상기 단계 g)의 유산균 배지에 상기 단계 f)의 발효액 파우더를 1 내지 30 g/L 첨가하고 30 ~ 37℃에서, pH 3 ~ 6으로 미호기적 또는 혐기적인 조건으로 약 5 내지 10일간 배양하는 단계;

i) 상기 단계 h)의 배양액을 80℃ ~ 85℃에서 진공 멸균하는 단계;

j) 상기 단계 i)의 멸균 배양액을 여과한 후 5 내지 10일 동안 저온 숙성시켜 여과하는 단계;

k) 동결건조하여 장뇌삼 발효액 파우더를 얻는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 본 발명에서 사용한 장뇌삼 발효액은 다음과 같이 하여 얻었다:

장뇌삼 분말을 300메쉬로 분말화 한 뒤 배양액에 10 g/L 첨가하고, 바실러스 균주 또는 효모 균주를 500,000 cfu/L로 첨가하여 30 ~ 37℃에서, pH 5-7로 호기적 또는 통성 혐기적인 조건으로 발효조에서 약 7일간 배양한다. 배양 후 얻은 배양액을 85°C에서 진공멸균한 뒤 0.25μM의 여과지를 이용하여 여과한 후 7일간 저온숙성하여 여과한다. 이 여액을 동결건조하여 효모발효액의 파우더를 얻고 유산균 배지에 상기 파우더를 5g/L로 첨가한 뒤, 락토바실러스 균주를 1,000,000 cfu/L로 첨가하여 30 ~ 37℃에서, pH 3 ~ 6로 미호기적 또는 혐기적인 조건으로 발효조에서 약 7일간 배양한다. 이 배양액을 85°C에서 진공멸균한 뒤 0.25μM의 여과지를 이용하여 여과한 후 7일간 저온숙성하여 여과하고 동결건조하여 장뇌삼 발효액을 얻었다. 상기 장뇌삼 발효액은 사용하기 전에 최종 고형분의 농도를 10g/L가 되게 유지하였다

본 발명에서, 장뇌삼 발효액은 세포 활성을 촉진시켜 주며, 콜라겐 합성을 증진시켜 주고, 콜라겐 분해 효소의 생성을 억제하며, 보습을 개선하고, 주름을 개선하며, 피부를 밝게 해주며, 피부 자극을 완화해주는 다양한 특징을 갖고 있다. 따라서, 본 발명은 장뇌삼 발효액을 화장료에 첨가함으로써 노화로 인해 발생하는 피부 손상, 즉 피부주름, 탄력 저하, 미백 및 보습에 대해 매우 우수한 효과를 보여준다.

본 발명에서, 장뇌삼 발효액의 함량은 전체 화장료 조성물에 대하여 0.0001~30.0 %(w/w)이고, 보다 바람직하게는 0.001~10%(w/w)이다. 장뇌삼 발효액의 함량이 0.0001 %(w/w) 미만일 경우에는 뚜렷한 주름개선 효과, 탄력 개선효과, 보습 및 미백 효과를 기대할 수 없고, 장뇌삼 발효액의 함량이 30.0%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않으며, 피부자극을 유발하거나 제형의 안정성에 있어서 문제가 생긴다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 장뇌삼 발효액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어,용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

비교 제조예 1. 효모를 이용한 장뇌삼 효모 발효액 제조

정제수로 세척하고 건조한 장뇌삼을 분말화 한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 효모 배양액(Potato Dextrose Broth, 아큐메디아, 미합중국)에 첨가하였다. 발효에 사용한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였으며, 배양액당 500,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 30℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 85℃에서 진공멸균 한 뒤 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25 μM 여과지를 이용하여 최종여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과액을 동결건조하여 '장뇌삼 효모 발효액' 분말을 얻었다.

비교 제조예 2. 바실러스를 이용한 장뇌삼 바실러스 발효액 제조

정제수로 세척하고 건조한 장뇌삼을 분말화 한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 바실러스 배양액(Tryptic soy Broth, 아큐메디아, 미합중국)에 첨가하였다. 발효에 사용한 바실러스 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 사용하였으며, 배양액당 1,000,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 85℃에서 진공멸균한 뒤 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25 μM 여과지를 이용하여 최종여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과액을 동결건조하여 '장뇌삼 바실러스 발효액' 분말을 얻었다.

제조예 1 및 2. 유산균을 이용한 장뇌삼 발효액 제조

상기 비교제조예 1 및 2의 '장뇌삼 효모 발효액' 또는 '장뇌삼 바실러스 발효액'의 분말을 5g/L가 되게 유산균 배양액(MRS broth, Difco, 미합중국)에 첨가하였다. 발효에 사용한 유산균 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 사용하였으며, 배양액당 1,000,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 3 ~ 6로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 85℃에서 진공멸균한 뒤 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25 μM 여과지를 이용하여 최종 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과액을 동결건조하여 '장뇌삼 효모-유산균 발효액'(제조예 1)과 '장뇌삼 바실러스-유산균 발효액'(제조예 2)의 분말을 얻었다. 통상 상기 제조예 1과 제조예 2를 장뇌삼 발효액으로 칭한다.

실험예 1: 장뇌삼 발효액의 MMP -1 생성 억제 효과

상기 제조예 1 및 2, 비교제조예 1 및 2에서 얻은 시료를 이용하여 다음과 같이 실험하였다. 먼저, 인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)의 각 웰에 1× 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 제조예 1 및 2 또는 비교제조예 1 및 2의 농도를 각각 0.1% 및 0.5% (중량%)로 하여 무혈청(serum-free) DMEM 배지로 교체한 실험과, 장뇌삼 발효액이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지로 교체한 대조군을 48시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양을 측정한 뒤, MMP-1의 양은 ng/㎖ 환산하였다. 양성 대조군으로 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)을 사용하였으며 MMP-1 생성 억제율은 하기 수학식 1에 따라 구하였으며 결과는 표 1에 나타내었다.

시험 물질농도(중량%)	MMP-1 생성 억제율(%)
양성 대조군(TGF-β) 10 ng/ml	67.4
비교제조예1 0.1 중량%	24.8
비교제조예1 0.5 중량%	61.8
비교제조예2 0.1 중량%	22.1
비교제조예2 0.5 중량%	59.1
제조예1 0.1 중량%	59.4
제조예1 0.5 중량%	89.3
제조예2 0.1 중량%	54.8
제조예2 0.5 중량%	85.8

실험예 2: 장뇌삼 발효액의 콜라겐 합성 증진 효과

인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 x 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 제조예 1 및 2, 비교제조예 1 및 2를 각각 최종 농도 0.1 중량% 및 0.5 중량%로 하여 무혈청 DMEM 배지로 교체한 실험군과 장뇌삼 배양액이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 키트 (Takara, 일본)를 이용하여 새로 합성된 콜라겐양을 측정하였다. PICP 양은 ng/㎖ 환산하였으며, 양성대조군으로 역시 TGF-β를 사용하였다. 콜라겐 생합성 증가율은 하기 수학식 2에 의해 구하였으며 결과는 표 2에 나타나 있다.

시험 물질농도(중량%)	콜라겐 생성 증가율(%)
양성 대조군(TGF-β) 10 ng/ml	76.6
비교제조예1 0.1 중량%	20.8
비교제조예1 0.5 중량%	62.5
비교제조예2 0.1 중량%	18.7
비교제조예2 0.5 중량%	59.4
제조예1 0.1 중량%	67.1
제조예1 0.5 중량%	94.7
제조예2 0.1 중량%	64.7
제조예2 0.5 중량%	89.8

이상의 실험예 1 및 2를 통해, 본 발명에 따른 장뇌삼 발효액이 콜라겐 분해 특징을 갖는 MMP-1의 생합성을 억제해 주고, 콜라겐 합성 촉진 효과가 우수하며, 장뇌삼 바실러스 발효액 및 장뇌삼 효모 발효액에 비해 그 효과가 훨씬 더 우수함을 알 수 있었다.

실험예 3: 장뇌삼 발효액의 섬유아세포 증식 효과

인체 정상 섬유아세포를 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 x 10⁴세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 제조예 1 및 2, 비교제조예 1 및 2를 각각 최종 농도 0.1 중량%, 0.5 중량%로 하여 혈청이 2.5 중량% 함유되어 있는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 장뇌삼 발효액이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 세포의 생존율을 비교하기 위하여 MTT(시그마, 미합중국) 솔루션(3mg/ml)을 첨가하여 세포 생존율을 ELISA READER(Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 3에 따라 세포 생존율(%)을 계산하였으며 실험 결과는 하기 표 3에 기재하였다.

시험 물질농도(중량%)	세포 생성증가율(%)
양성 대조군(TGF-β:10 ng/ml)	131.6
비교제조예1 0.1 중량%	48.8
비교제조예1 0.5 중량%	129.5
비교제조예2 0.1 중량%	39.3
비교제조예2 0.5 중량%	121.3
제조예1 0.1 중량%	130.3
제조예1 0.5 중량%	181.7
제조예2 0.1 중량%	130.7
제조예2 0.5 중량%	180.8

상기 실험 결과를 통해, 본 발명에 따른 장뇌삼 발효액이 장뇌삼 효모 발효액 및 장뇌삼 바실러스 발효액에 비해 세포 생성 증가율이 훨씬 뛰어났으며, 양성 대조군인 TGF-β와 유사하거나 훨씬 우수한 세포 생성 증가율을 보임을 알 수 있었다.

실험예 4. 장뇌삼 발효액의 락트산에 의한 세포자극 완화 효과 시험

인간 피부 세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 T-75 플라스크(Falcon, 미합중국)에서 80% 정도 성장할 때까지 배양하였다. 이것을 다시 96-웰 플레이트(Falcon, 미합중국)에 3× 10⁴ cells/well이 되게 옮겨 24시간 배양하였다. 배양 후 현미경을 통해 세포가 완전히 부착되어 잘 자라는지 여부를 확인하고 피부세포 자극원으로 락트산을 이용하여 실험을 진행하였다. 이때 락트산은 0.2 중량%를 사용하였다. 즉, 96웰의 각각에 0.2 중량% 락트산이 함유된 DMEM(시그마, 미합중국) 배지를 200㎕씩 첨가하고 제조예 1 및 2, 비교제조예 1 및 2를 각각 0.1 및 0.5 중량%로 조절하여 첨가하였다. 이때 락트산 및 장뇌삼 발효액을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하였고, 락트산만 첨가한 것을 비교군으로 하였다. 시험물질을 첨가하고 12시간 경과 후 세포의 생존율을 비교하기 위하여 MTT(시그마, 미합중국) 솔루션(3mg/ml)을 첨가하여 세포 생존율을 ELISA READER(Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 4에 따라 세포 생존율(%)을 계산하였으며 실험 결과는 하기 표 4에 기재하였다.

시험 물질농도(중량%)	세포 생성 증가율(%)
대조군	99.8
비교군(락트산 0.2%)	0.00
락트산 (0.2%)+ 비교제조예1 0.1 중량%	30.8
락트산 (0.2%)+ 비교제조예1 0.5 중량%	68.9
락트산 (0.2%)+ 비교제조예2 0.1 중량%	32.8
락트산 (0.2%)+ 비교제조예 2 0.5 중량%	67.9
락트산 (0.2%)+ 제조예1 0.1 중량%	74.6
락트산 (0.2%)+ 제조예1 0.5 중량%	91.6
락트산 (0.2%)+ 제조예2 0.1 중량%	70.5

상기 결과를 통해, 장뇌삼 발효액을 처리한 경우는 락트산 처리에 의한 세포생성 억제를 완화시켜주어 세포 생성을 크게 증가시켰으며, 장뇌삼 효모 발효액 및 장뇌삼 바실러스 발효액 에 비해 세포 생성 증가율이 훨씬 뛰어남을 알 수 있었다.

실험예 5: 장뇌삼 발효 추출물의 B16F1 멜라닌형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과

본 실험예 5는 상기 장뇌삼 발효액의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다. 본 실험예 3에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공 배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁵ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 제조예 1 및 2, 비교제조예 1 및 2를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율을 (%)은 하기 수학식 5에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 5에 기재하였다.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

처리농도 (중량%)	멜라닌 생성 저해효과 (%)
	비교 제조예1	비교 제조예2	제조예1	제조예2
0.01	7.17	5.75	22.75	22.54
0.05	15.67	16.19	36.19	39.12
0.1	24.14	21.24	57.24	51.54
0.5	39.16	35.01	85.01	84.05
200ppm 알부틴	66.15

상기 표 5의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 제조예 1 내지 2에 의해 제조된 장뇌삼 발효액은 B16F1 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해했으며 비교 제조예 1 또는 2의 멜라닌 생성 저해 효과와 비교하여 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

제형예 1 :장뇌삼 발효액을 함유하는 화장료 조성물의 제조

장뇌삼 발효액을 포함하는 화장료는 제조예 1 및 2의 장뇌삼 발효액 포함하는 화장료 조성물(제형예 1 및 2)을 제조하였으며, 효능의 비교를 위해 장뇌삼 발효액 대신에 비교제조예 1의 장뇌삼 효모 발효액을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1), 장뇌삼 발효액 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 2), 장뇌삼 발효액 대신에 주름개선 원료로서 아데노신을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 3), 장뇌삼 발효액이나 보습제를 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 4)을 하기 표 6에 나타내었다.

(단위:중량%)

구분	성분	제형예 1	비교제형예 1	비교제형예 2	비교제형예 3	비교제형예 4
A	장뇌삼 발효액 (제조예 1)	2.0	-	-	-	-
	장뇌삼 효모발효액 (비교제조예 1)	-	2.0	-	-	-
	글리세린	-	-	5.0	-	-
	1,3부틸렌글리콜	-	-	5.0	-	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	adenosine	-	-	-	0.04	-
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7
	스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
	사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	BHT	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
C	향,방부제	적량	적량	적량	적량	적량

실험예 6: 장뇌삼 발효액의 보습 효과

상기 제형예 1의 화장료 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 100 명을 무작위로 25 명씩 4개 그룹 (A, B, C 및 D)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 화장료 조성물을, B그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, C 그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을, D 비교제형예 4의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

구분	사용 전	사용 2주 후	사용 4주 후
제형예 1	23.1	39.5	54.2
비교제형예 1	24.3	29.1	35.9
비교제형예 2	23.5	36.3	48.7
비교제형예 4	23.7	24.4	24.2

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 일반 다른 보습제를 함유한 화장료(비교제형예 2)와 비교하여도 본 발명의 장뇌삼 발효액 함유한 화장료(제형예 1)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 7. 장뇌삼 발효액의 피부 주름 개선효과

본 발명의 장뇌삼 발효액을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 즉, 임상실험은 40-60세 여성 100 명을 무작위로 25 명씩 4개 그룹 (A, B, C 및 D)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 화장료 조성물을, B그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, C그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을, D 비교제형예 3의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 8주 후의 주름 개선 효과를 육안으로 평가하여 주름 개선 정도를 확인하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 8에 나타내었다.

실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 3개월간 사용 후의 각 피검자의 주름 개선 효과를 숙련된 의사의 육안 관찰 및 기기측정(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co.,Germany)을 통하여 평가하였으며, 실험 결과는 하기의 표 8에 나타낸 바와 같다.

	주름 개선 효과			유효율(%)
	우수	약간	없음
제형예 1	19	4	2	92.0
비교제형예 1	5	7	13	48.0
비교제형예 2	4	4	17	32.0
비교제형예 3	15	6	4	84.0

상기 표 8의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 장뇌삼 발효액을 함유한 제형예 1 의 장뇌삼 효모 발효액을 함유하는 비교제형예 1에 비하여 약 1.9배 높은 주름개선 효과를 보여주었다. 또한, 장뇌삼 발효액 대신 주름 개선 효과가 있는 것으로 알려진 아데노신을 함유하는 비교 제형예 3의 화장료와 유사한 결과가 나타나, 장뇌삼 발효액이 우수한 주름 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 8: 피부 탄력 개선 효과 측정

본 실험예 8은 제조예 1에서 수득한 장뇌삼 발효액을 포함하는 제형예 1 및 비교제형예에 따른 화장료 조성물의 피부 탄력 개선 효과를 알아보기 위하여, 30~40대의 탄력이 감소한 여성 30명을 대상으로 측정하였다. 10명씩 A, B, C의 4그룹으로 나눈 뒤, A 그룹에는 제형예 1을, B그룹에는 비교제형예 1를, C그룹에는 비교 제형예 4를 안면에 매일 아침, 저녁으로 2회씩 12주간 도포하게 한 후, 12주 후 피부 탄력을 측정하였다. 얼굴 부위의 탄력을 cutometer SEM575 (MPA 580, Courage+Khazaka GmbH, Germany)를 이용하여 측정하였으며, 피부 탄력을 나타내는 R2(biological elasticity)를 도포 전과 도포 후를 측정한 뒤 개선도(%)로 평가하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었으며, 결과는 각 군에 대한 개선도의 평균치이다.

실험제품	피부 탄력 개선도(%)
제형예1	40.4
비교 제형예 1	23.4
비교제형예 4	3.6

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 장뇌삼 발효 추출물이 함유된 제형예 1은 비교제형예 1 또는 4에 비하여 피부 탄력이 매우 향상됨을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 순차 발효시킨 장뇌삼 발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 장뇌삼 발효액은 장뇌삼을 바실러스속 균주 또는 효모를 이용하여 1차 발효하하고, 상기 1차 발효액을 비피더스(Bifidus)균 및 불가리스(Bulgaricus)균, 락토바실러스(Lactobacillus)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 유산균 균주를 이용하여 2차 발효하여 수득한 바실러스-유산균 발효액 또는 효모-유산균 발효액인, 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 바실러스속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이고, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인, 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선용인 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 탄력 개선용인 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 보습용인 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백용인 화장료 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 장뇌삼 발효액은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.