KR101902988B1 - 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물은 우수한 피부 항산화 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성사이토카인 발현 억제 효과, 피부주름 개선 효과 및 피부탄력 개선 효과, 피부보습 효과를 나타낸다.

Description

원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising the extract of cacao nibs irradiated with far-infrared ray and steamed}

본 발명은 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하여 우수한 항산화, 피부노화방지, 피부주름 개선, 피부탄력 개선, 피부미백, 자외선에 의한 피부손상 억제, 피부자극 완화 및 피부보습 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품의 기능은 청결과 단순한 메이크업을 지나, 공해 물질, 스트레스, 자외선, 활성산소, 과산화물 등의 피부 노화 원인을 제거하거나 억제하는 것으로 확장되어 왔다. 최근 산업화와 사회활동 증가에 따라 피부는 각종 환경오염과 스트레스에 노출되어 거칠어지고 건조해지며, 칙칙하게 보이는 등의 피부 노화가 가속되고 있으며 이러한 현상은 피부의 수분공급 및 유지와 밀접한 관련이 있다.

최근 들어 안전한 천연물을 소재로 하여 피부주름을 개선하고, 피부 자극 및 염증을 완화시켜 주어, 피부노화를 방지하는 화장료의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 카카오 닙스(Cacao nibs)는 카카오 열매의 씨앗인 카카오 씨를 발효, 건조, 로스팅 한 후에 껍질을 제거하고 적당히 부순 것이다. 카카오는 아로니아, 강황과 함께 세계 3대 항산화 푸드로 알려져 있다. 세포노화를 촉진하는 활성산소를 억제해주는 항산화 성분인 폴리페놀과 카테킨이 다량 함유하고 있다. 이러한 카카오로 만든 카카오 닙스는 녹차에 비해 폴리페놀의 함량은 3.6배, 카테킨의 함량은 60배가 높아 항산화 효과로 활성산소의 농도를 유지시키고 안정화하는 작용을 하여 세포 손상을 막아 항암효과가 기대된다.

본 발명자들은 천연물 소재인 카카오 닙스를 화장료로 개발하기 위해 노력 해 왔으며, 카카오 닙스를 특정 조건으로 원적외전 조사 처리 후 증기로 찐 후에 이를 추출하는 경우에 우수한 항산화 활성, 피부주름 및 탄력 개선, 피부 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제, 피부자극 완화 및 피부보습활성을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001)대한민국 공개특허 10-2010-0010433(2010.02.01.) (0002)대한민국 등록특허 10-1009957(2011.01.20.)

본 발명은 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화, 피부노화방지, 피부주름 개선, 피부탄력 개선, 피부미백, 자외선에 의한 피부손상 억제, 피부자극 완화 및 피부보습 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 우수한 피부 항산화 효과, MMP-1 생성억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 합성증진 효과, 멜라닌 생성억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성사이토카인 발현억제 효과, 피부주름개선 효과 및 피부탄력개선 효과를 나타내는 카카오 닙스 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 원적외선 조사 처리는 5~20㎛ 파장의 원적외선을 90~130℃에서 30~120분간 처리하는 것이며, 더욱 바람직하게는 5~20㎛ 파장의 원적외선을 110~130℃에서 60~120분간 처리하는 것이다. 상기 증기로 찌는 것은 110~130℃의 증기로 3~12시간 처리하는 것이다.

상기 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물은 화장료 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 ~ 98.0 중량% 함유된다.

이때, 상기 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출된 추출물이다. 또는, 상기 추출물은 초임계 추출법 또는 초음파추출법에 의한 추출물이다. 또는 상기 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물은 효모, 유산균 및 바실러스속 균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 발효균에 의하여 발효되는 발효추출물이다.

상기 화장료 조성물은 항산화용, 피부노화방지용, 피부주름 개선 및 피부탄력 개선용, 피부 미백용, 자외선에 의한 피부손상 억제용, 피부자극 완화용 또는 피부 보습용으로 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어질 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, A)카카오 닙스(Cacao nibs)에 5~20㎛ 파장의 원적외선을 90~130℃에서 30~120분간 처리하는 단계; B)원적외선 처리된 카카오 닙스를 110~130℃의 증기로 3~12시간 처리하는 단계; 및 C)증기로 찐 카카오 닙스를 추출하는 단계를 포함하는 카카오 닙스 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 C)단계는 c1)증기로 찐 카카오 닙스를 건조 후 분쇄하는 단계; 및 c2)70% 에탄올을 5~30배 중량 가하여 실온에서 1~24시간 침출하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

또한, 상기 C)단계는 c1)증기로 찐 카카오 닙스를 건조 후 200~300메시의 크기로 분쇄하여 분말화하는 단계; c2)효모(Saccharomyces cerevisiae) 배양액, 유산균(Lactobacillus plantarum) 배양액 또는 바실러스(Bacillus subtilis) 배양액에 첨가하여 20~50, pH 3~9의 조건에서 발효시키는 단계; 및 c3)배양균 제거 후 여과하는 단계로 이루어 질 수 있다.

또한, 상기 C)단계는 c1)증기로 찐 카카오 닙스를 건조 후 분쇄하는 단계; c2)온도 60~150, 10분~2시간 조건으로 쪄서 음건하는 단계; 및 c3)70% 에탄올 5~30배 중량을 가하여 실온에서 1~24시간 침출하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물은 우수한 피부 항산화 효과, MMP-1 생성억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 합성증진 효과, 멜라닌 생성억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성사이토카인 발현억제 효과, 피부주름개선 효과 및 피부탄력개선 효과를 나타낸다.

본 발명은 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

원적외선은 전자파의 일종으로 적외선(0.76~1,000㎛) 중 파장이 긴 것을 지칭하고, 파장 영역은 보통 5~20㎛ 범위의 것을 의미하며 가시광선보다 강한 열작용을 하고 방사에너지가 직접적이고 순간적으로 열전달에 의해 빠르게 흑체를 가열하며, 에너지 절약효과가 커서 널리 이용되고 있는 유용한 마이크로파이다. 원적외선은 물질의 중심까지 고르게 열을 전달하는 특성이 있으며, 이러한 특성으로 인해 가열시간을 단축함으로써 에너지 절감 등의 효과를 가져 올 수 있고, 열분해에 의한 영양물질 또는 생리활성물질의 손실을 최적화할 수 있다. 중합체인 폴리페놀, 토코페롤, 플라보노이드 등의 천연 항산화 물질들은 고분자를 가지고 있는데, 원적외선 처리가 이들을 저분자로 유리시켜 항산화능을 증가시킨다는 보고가 있다.

본 발명에서는 카카오 닙스를 특정 조건에서 원적외선 조사 처리 후, 증기를 이용하여 카카오 닙스를 처리하고 다양한 방법으로 추출하여 그 추출물들의 피부 개선활성을 평가하였다.

본 발명에 따르면, 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 이때 원적외선 조사 처리는 5~20㎛ 파장의 원적외선을 90~130℃에서 30~120분간 처리하는 것이며, 더욱 바람직하게는 5~20㎛ 파장의 원적외선을 110~130℃에서 60~120분간 처리하는 경우에 항산화 활성이 크게 증가하였다.

상기 원적외선 조사 처리 후 수행되는 증기 처리는 110~130℃의 증기로 3~12시간 처리하는 것이다. 이와 같이 원적외선 조사 처리된 카카오 닙스를 증기로 찌는 경우에 항산화 활성뿐만 아니라 콜라겐 합성증진 효과, 멜라닌 생성억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성사이토카인 발현억제 효과가 크게 증가하는 것으로 확인되었다.

본 발명의 상기 카카오 닙스 추출물은 A)카카오 닙스에 5~20㎛ 파장의 원적외선을 90~130℃에서 30~120분간 처리하는 단계; B)원적외선 처리된 카카오 닙스를 110~130℃의 증기로 3~12시간 처리하는 단계; 및 C)증기로 찐 카카오 닙스를 추출하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 카카오 닙스 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 추출된 것이며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 수용액 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 용매 추출물이다.

이때, 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 C)단계는 c1)증기로 찐 카카오 닙스를 건조 후 분쇄하는 단계; c2)70%(v/v) 에탄올을 5~30배 중량 가하여 실온(15~20℃)에서 1~24시간 침출하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온 조건에서의 초임계 추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출물 일 수 있다. 또한, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등의, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며, 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다. 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서, 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고, 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 본 발명의 초임계 추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매로는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

또한, 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출 효율을 증가시키게 된다. 초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결건조 하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 미생물을 이용한 발효추출물이다. 이때 이용할 수 있는 미생물은 효모, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물로 이루어지는 균 중에서 선택되는 균으로 20~50℃의 온도 조건 하에서 pH 3~9를 유지하면서, 일반적으로 1 ~ 7일간 발효시키나 발효 특성에 따라 몇 개월 혹은 몇 년간 발효시키기도 한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 C)단계는 c1)증기로 찐 카카오 닙스를 건조 후 200~300메시의 크기로 분쇄하여 분말화하는 단계; c2)효모(Saccharomyces cerevisiae) 배양액, 유산균(Lactobacillus plantarum) 배양액 또는 바실러스(Bacillus subtilis) 배양액에 첨가하여 20~50℃, pH 3~9의 조건에서 발효시키는 단계; 및 c3)배양균 제거 후 여과하는 단계로 이루어질 수 있다.

본 발명의 원적외선 조사 처리 카카오 닙스의 발효추출물 제조에 사용되는 효모는, 진핵미생물(핵과 세포질이 핵막에 의하여 나누어져 있는 생물)에 속하며, 세포벽, 세포막, 핵, 사립체, 과립 등 세포 소기관을 갖추고 있다. 성의 구별이 없는 이들은 주로 budding(출아법)으로 번식하는데, 분리된 많은 효모들 중에는 발효능이 없는 것, budding 대신 fission(분열) 혹은 bud-fission 방법으로 증식하는 것, 자낭포자(ascospore)가 아닌 사출포자(ballistospore)를 형성하거나 포자(spore)형성이 관찰되지 않는 것 등 다양한 그룹의 효모도 존재한다. 크기는 보통 5~10㎛로 세균의 5~10배 크기이며, 적정 pH는 4.5~5.5이나, 1~10에서도 생존한다. pH 1에서 12시간 생존하는 효모는 박테리아보다 산에 강하므로 배지의 조건을 pH 3.5 내지 pH 3.8 정도로 맞추면 박테리아의 오염을 어느 정도 억제할 수 있다. 효모는 균종에 따라서 조금씩 차이가 있으나, 대부분 20~25℃에서 잘 자란다. 보통은 50℃이상에서는 사멸한다고 하지만, 그 온도 이상에서 합성이 되지 않는 성장요소를 배지에 직접 첨가해 줌으로써 어느 정도는 극복이 가능하다. 사카로마이세스세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우 40℃이상에서 사멸하지만 배지에 올레산(oleic acid)과 에르고스테롤(ergosterol)을 첨가해 줌으로써 이를 방지할 수 있다. 효모 균체 자체는 단세포 식물로서 단백질과 미량광물질을 다량 함유하고 있다. 본 발명의 원적외선 조사 처리 카카오 닙스를 발효시키는데 사용하기에 바람직한 효모는 사카로마이세스 세레비시애이다.

또한, 본 발명에서 원적외선 조사 처리 카카오 닙스 발효추출물 제조에는 유산균이 사용될 수 있다. 유산균은, 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해하여 유산(젖산)이나 초산과 같은 유기산을 생성하는 인체에 매우 유익한 미생물의 일종이다. 일반적으로, 유산균이 당으로부터 유산을 만드는 것을 발효라 하며, 이러한 발효과정을 거쳐서 발효식품이 만들어진다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유산균은 바람직하게는 락토바실러스, 스트렙토코커스, 비피도박테리움, 류코노스톡, 페디오코커스, 락토코커스 및 이들의 혼합물을 포함하며, 가장 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus)이다. 락토바실러스 중에서도 본 발명의 원적외선 조사 처리 카카오 닙스를 발효시키는데 사용하기에 가장 바람직한 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이다.

또한, 본 발명에서 카카오 닙스 발효추출물의 제조를 위해서, 발효균으로서 바실러스(Bacillus)균을 사용할 수 있다. 바실러스는 포자 형성균으로, 토양이나 물속에 서식하며 대부분 유기물 분해와 관련되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 바실러스는, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 폴리퍼멘티커스, 바실러스 메센테리커스 및 이들의 혼합물을 포함하며, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로서 이 균은 고초균으로도 알려져 있는데, 포도당과 같은 다양한 당류, 전분 등을 대사하여, 메주나 청국장과 같은 발효 식품 제조에 이용되기도 하는 유기물 분해 미생물이다. 특히 상기 바실러스 발효 추출물은 세포재생 효과가 우수하였다(시험예 5).

또한, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 포제법을 이용하여 얻어낸 추출물도 포함한다. 포제란 한방이론에 근거하여 약재를 가공 처리함으로써 약재 본래의 성질을 변화시키는 제약 기술이다. 주로 찌거나, 삶거나, 불에 볶거나, 불에 굽거나 달구는 공정 또는 이들이 혼합된 공정의 방법을 말한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 C)단계는 c1)증기로 찐 카카오 닙스를 건조 후 분쇄하는 단계; c2)온도 60~150, 10분~2시간 조건으로 쪄서 음건하는 단계; 및 c3)70% 에탄올 5~30배 중량을 가하여 실온에서 1~24시간 침출하는 단계를 포함하여 이루어진다. 포제법에 의한 상기 추출물은 자외선에 의한 염증성사이토카인 IL-1α생성억제효과(시험예 11), MMP-1 생성 억제 효과(시험예 6)가 특히 우수하였다.

상기 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 항산화 효과(시험예 2~4), 피부세포재생효과(시험예 5), MMP-1 생성 억제 효과(시험예 6), 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과(시험예 7), 콜라겐 합성 증진 효과(시험예 8), 멜라닌 생성억제효과(시험예 9), 자외선 조사에 의한 세포독성완화 효과(시험예 10), 염증성사이토카인 발현 억제 효과(시험예 11), 피부주름 개선 효과(시험예 12), 피부탄력 개선 효과(시험예 13), 보습 효과(시험예 14)가 뛰어나다.

상기 카카오 닙스 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 98.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 90.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않다.

이러한 다양한 기능을 가진 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 항산화 효과, 피부노화 방지효과, 인간 섬유아세포 활성 효과, 피부 미백 효과, 자외선에 의한 피부 손상 완화 효과 및 자극 완화 효과, 피부주름 개선 및 피부탄력 개선용으로 사용될 수 있다.

본 발명 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤지방족에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

제조예 1~9: 원적외선 조사 처리한 카카오 닙스 추출물의 제조

카카오 닙스(Viva Labs Raw Cacao Nibs)를 정제수로 깨끗이 씻은 후, 건조시켜 준비하였다. 준비된 카카오 닙스를 원적외선 오븐에 온도 90, 110, 130℃에 각각 30, 60, 120분 동안 넣어 원적외선 조사를 받게 하였다(표 1). 카카오닙스 200g에 물과 에탄올의 비율을 7:3으로 조정한 70% 에탄올 1000ml를 가하여 실온에서 1일 동안 침출하였다. 이를 여과하고 여액을 진공 농축하여 건조 추출물을 얻었다. 상기 건조 추출물을 1%(v/v) 농도가 되도록 50% 1,3-부틸렌 글리콜 용액으로 용해하고 여과한 후 본 발명의 실험에 적용하였다.

	FIR(far-infrared irradiation) 조건
	온도 (℃)	시간 (min)
제조예 1	90	30
제조예 2	90	60
제조예 3	90	120
제조예 4	110	30
제조예 5	110	60
제조예 6	110	120
제조예 7	130	30
제조예 8	130	60
제조예 9	130	120

시험예 1: 원적외선 조사 처리한 카카오 닙스 추출물의 NBT법을 이용한 항산화 효과 측정

원적외선 조사 처리한 카카오 닙스 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 BHT(ButylatedHydroxytoluene)를 비교군으로 하여, NBT법으로 항산화 효과를(활성 산소 소거율) 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검 물질(원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물, 비타민 C, BHT)이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거율(%)을 평가한다. 활성 산소가 니트로 블루 테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560 nm에서 측정하는 것으로 활성 산소 소거율(%)을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

①바이알병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료 용액 0.1ml를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 6 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

⑤공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑥공시험의 블랭크(Blank)는 상기 시료 용액 및 6 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

활성 산소 소거율(%)은 하기식에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2와 같다.

활성 산소 소거율( % ) =〔1-(St-So)/ (Bt-Bo〕〕X 100

St : 시료 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

	FIR 조건		처리 농도 (%, v/v)	항산화 효과(%)
	온도 (℃)	시간 (min)
Control (카카오 닙스)	-	-	0.01	43.1
제조예 1	90	30	0.01	49.7
제조예 2	90	60	0.01	55.3
제조예 3	90	120	0.01	59.2
제조예 4	110	30	0.01	52.6
제조예 5	110	60	0.01	59.0
제조예 6	110	120	0.01	66.2
제조예 7	130	30	0.01	55.4
제조예 8	130	60	0.01	67.9
제조예 9	130	120	0.01	75.8
Vit. C	-	-	0.01	83.1
BHT	-	-	0.01	90.6

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 0.01% 농도에서 시험한 시료 모두 Control 보다 높은 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 제조예 1~9는 Vit. C 보다 낮은 항산화 효과를 보였으나, 카카오 닙스에 원적외선 처리를 함에 따라 항산화 효과가 증가 됨을 확인하였다.

실시예 1~4: 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물의 제조

상기 제조예 9의 원적외선 처리가 된 카카오 닙스를 사용하여, 120℃의 증기로 3, 6, 9, 12시간 처리하였다. 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 추출하여 추출물을 제조하였다.

시험예 2: 원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물의 NBT법을 이용한 항산화 효과 측정

원적외선 조사 처리 후 증기로 찐 카카오 닙스 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 시험예 1과 같은 방법으로 항산화 효과를 측정하였다. 또한 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 BHT(Butylated Hydroxytoluene)를 비교군으로 하여, NBT법으로 항산화 효과를(활성 산소 소거율) 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	증기로 찐 시간 (hr)	처리 농도 (%, v/v)	항산화 효과(%)
Control (카카오 닙스)	-	0.01	43.1
제조예 9	0	0.01	75.8
실시예 1	3	0.01	82.6
실시예 2	6	0.01	91.4
실시예 3	9	0.01	91.8
실시예 4	12	0.01	92.3
Vit. C	-	0.01	83.2
BHT	-	0.01	90.5

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 0.01% 농도에서 원적외선 조사 후 증기로 찐 실시예 1~4 모두에서 control과 증기로 찌지 않은 제조예 9 보다 높은 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 또한 실시예 2~4에서는 Vit. C나, BHT 보다도 높은 항산화 효과를 나타내었다. 우수한 항산화 효과를 보인 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4의 경우 증기에 찌는 시간이 각각 6시간, 9시간, 12시간으로 3시간찍 증가 하였으나 항산화의 효과는 미미하게 증가하여 최적의 조건은 6시간 증기에 찐 실시예 2의 조건임을 확인하였다. 이하에서는 상기 실시예 2의 카카오 닙스 추출물을 시험에 사용하였다.

실시예 5: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 제조

하기 표 4의 추출용매를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예와 같은 방법으로 추출하여 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 얻었다. 하기 실시예5-14, 5-15는 통상적인 초임계 추출법, 초음파 추출법을 이용한 추출을 통해 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 제조한 것이다. 실시예 5-14의 경우에는 공용매로 올리브유를 사용하였으며 액상이다.

	추출 용매	카카오 닙스 1 kg으로부터 얻은 추출물의 무게(단위:g)
실시예 5-1	정제수	28.5
실시예 5-2	25% 에탄올	31.8
실시예 5-3	50% 에탄올	33.2
실시예 5-4	100% 에탄올	34.9
실시예 5-5	80% 메탄올	35.9
실시예 5-6	100% 메탄올	33.2
실시예 5-7	아세톤	37.5
실시예 5-8	디에틸에테르	34.7
실시예 5-9	헥산	30.1
실시예 5-10	노말-프로판올	37.2
실시예 5-11	이소프로판올	33.3
실시예 5-12	노말-부탄올	36.4
실시예 5-13	에틸아세테이트	32.6
실시예 5-14	초임계 추출	101.5
실시예 5-15	초음파 추출	43.7

실시예 6: 원적외선 조사 처리 후 증기에서 찐 카카오 닙스 효모 발효추출물 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스(실시예 2의 조건으로 처리된 것)를 분말화한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 효모 배양액(Potato Dextrose Broth, 아큐메디아, 미국)에 첨가하였다. 발효에 사용한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였으며, 배양액 당 50,000 CFU/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 30℃, pH 5∼7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거한 후 0.25㎛ 여과지를 이용하여 최종 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후, 이 여과 숙성액을 다시 0.25㎛의 여과지를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 효모 발효추출물이라 칭하였다. 또한, 이 방법에 의한 추출 수율은 291.5g/1kg이었다. 이하 실험에 사용된 효모 발효 추출물은 최종농도가 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

실시예 7: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 유산균 발효추출물의 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스(실시예 2의 조건으로 처리된 것)를 분말화 한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 유산균 배양배지(Lactobacillus MRS Broth, 디프코, 미국)에 첨가하여 혼합한 후 121℃에서 멸균시킨 뒤 유산균을 접종하였다.

발효에 사용한 유산균 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 사용하였으며, 배양액 당 50,000 CFU/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 3일간, 30℃, pH5∼7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25㎛ 여과지를 이용하여 최종여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 여과 숙성액을 다시 0.25㎛의 여과지를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 유산균 발효 추출물이라 칭하였다. 또한, 이 방법에 의한 추출 수율은 297.1g/1kg이었다. 이하 실험에 사용된 유산균 발효 추출물은 최종농도가 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

실시예 8: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 바실러스균 발효추출물의 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스(실시예 2의 조건으로 처리된 것)를 분말화한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 바실러스 배양배지에 첨가하였다. 발효에 사용한 바실러스균주는 바실러스 서브틸리스(고초균; Bacillus subtilis)를 사용하였으며, 배양액 당 50,000 CFU/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 3일간, 30℃, pH 5∼7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 원적외선 조사 처리 카카오 닙스 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거한 후 0.25㎛ 여과지를 이용하여 최종여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 여과 숙성액을 다시 0.25㎛의 여과지를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 바실러스 발효추출물이라 칭하였다. 또한, 이 방법에 의한 추출 수율은 229.7g/1kg이었다. 이하 실험에 사용된 바실러스 발효 추출물은 최종농도 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

실시예 9: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스의 포제법 추출물의 제조

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스의 포제법 추출물을 얻기 위해 본 실시예에서는 쪄서 건조시키는 공정으로 처리하였다. 즉, 정제수로 세척하고 건조시킨 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스(실시예 2의 조건으로 처리된 것)를 분말화한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만든 후, 온도 100℃, 1시간 조건으로 쪄서 음건하였다. 70% 에탄올을 이용하여 추출하였으며, 그 결과 48.7g/1kg의 추출물을 얻었다.

시험예 3: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스의 다양한 추출 방법을 통한 추출물의 NBT법을 이용한 항산화 효과 측정

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스를 초임계 추출, 초음파 추출, 효모 발효 추출, 유산균 발효 추출, 바실러스 발효 추출, 포제법 추출 등 다양한 추출 방법으로 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 시험예 1과 같은 방법으로 실시하였다. 또한 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 BHT(ButylatedHydroxytoluene)를 비교군으로 하여, NBT법으로 항산화 효과를(활성 산소 소거율) 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

시료명	처리농도 (%, w/v)	항산화 효과(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	0.01	91.4
실시예 5-14 초임계 추출물	0.01	84.6
실시예5-15 초음파 추출물	0.01	81.9
실시예 6 효모 발효 추출물	0.01	83.3
실시예 7 유산균 발효 추출물	0.01	82.1
실시예 8 바실러스 발효 추출물	0.01	83.8
실시예 9 포제법 추출물	0.01	85.8
Vit. C	0.01	83.6
BHT	0.01	90.5

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이 0.01% 농도에서 시험한 실시예 모두에서 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 본 발명의 실시예 모두는 Vit C 보다 우수한 항산화 효과를 가졌으며 특히 실시예 2는 0.01% 농도에서 가장 높은 항산화 효과를 보인 BHT와 비교하여서도 더욱 우수한 항산화 효과를 가지고 있음이 확인되었다.

시험예 4: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해, 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C를 비교군으로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼소거율)를 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질(원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물, 비타민 C)에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼소거율(%)을 측정한다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl),free radical(Sigma aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료용액을 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

④공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

자유라디칼소거율(%)의 결과는 하기식에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 6과 같다.

자유라디칼소거율( % ) = 〔1-(St-So)/ (Bt-Bo〕〕X 100

St :시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt :공시험용액의자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So :시료용액의 자유라디칼무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo :공시험용액의자유라디칼무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	처리농도(%, w/v)	항산화 효과(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	0.01	94.8
실시예 5-14 초임계 추출물	0.01	93.4
실시예 5-15 초음파 추출물	0.01	93.9
실시예 6 효모 발효 추출물	0.01	93.2
실시예 7 유산균 발효 추출물	0.01	91.1
실시예 8 바실러스 발효 추출물	0.01	90.0
실시예 9 포제법 추출물	0.01	90.4
Vit C	0.01	90.2

표 6에서 확인되는 같이 본 발명의 실시예들은 0.01% 농도에서 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C보다 높거나 동등한 항산화 효과를 나타냈으며, 특히 실시예 2에서 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

시험예 5: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 세포재생(Cell Proliferation) 효과

24 웰 플레이트에 HaCaT Kerationcyte(German Cancer Research Institute, Germany)를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 10% FBS가 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화된 37℃, 5% CO₂배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 시료들을 1.0%(v/v) 되게 처리하여 3일 배양하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 양성 대조군으로 TGF-β(10 ng/mL)을 적용하였으며 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

시료명	Abs. At 570 nm
실시예 2 카카오 닙스 추출물	1.114
실시예 5-14 초임계 추출물	1.103
실시예 5-15 초음파 추출물	1.112
실시예 6 효모 발효 추출물	1.107
실시예 7 유산균 발효 추출물	1.112
실시예 8 바실러스 발효 추출물	1.992
실시예 9 포제법 추출물	1.121
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	1.482
대조군	0.912

일반적으로 피부 세포 재생은 세포 활성율로 측정하는데 본 발명의 실시예들에서 세포 재생 효과가 있음을 확인하였다. 또한 세포재생 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10 ng/ml)와의 농도차이를 감안해도 세포재생 효과가 유사한 본 실험결과를 통해 본 발명 실시예의 추출물은 세포재생효과가 우수함을 확인하였으며, 특히 실시예 8의 바실러스 발효 추출물이 가장 세포재생 효과가 우수함을 확인하였다.

시험예 6: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 MMP -1 생성 억제 효과

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과가 있는지 여부를 측정하기 위해, MMP-1의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml)를 비교군으로 하여 MMP-1의 생성을 억제하는 효과를 측정하였다.

인간 정상 피부 세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48 웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1×10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예들을 최종 농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 시료가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 키트(Amersham, 미국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 식에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

시료명	MMP-1 생성 억제율(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	71.0
실시예 5-14 초임계 추출물	70.7
실시예 5-15 초음파 추출물	71.8
실시예 6 효모 발효 추출물	71.1
실시예 7 유산균 발효 추출물	71.1
실시예 8 바실러스 발효 추출물	69.8
실시예 9 포제법 추출물	74.7
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	69.6

상기 표8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 실시예들은 100㎍/㎖ 농도에서 MMP-1 생성 억제율을 측정했을 때, 실시예들의 시료가 70.7~74.7%의 억제율로 TGF-β의 69.6% 보다 우수한 활성을 나타내었다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10ng/ml)와 본 발명의 시료들의 실험 농도(100㎍/㎖) 차이를 감안해도, 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물이 MMP-1 생성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

시험예 7: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 자외선 유도에 의한 MMP -1 생성 억제 효과

일반적으로 MMP-1은 자외선에 의해 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 시험예에서는 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물이 자외선에 의해 생성이 증가되는 MMP-1의 양을 억제하는지를 알아보고자 실험을 실시하였다. 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성 억제 효과 측정은 시료 처리에 앞서 UVB를 일정량 처리하는 것을 제외하고는 상기 시험예 6과 동일하게 실시하였다. 시료들의 MMP-1 생성 억제율(%)은 상기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml)를 비교군으로 사용하였고, 시료들은 0.01%(w/v) 농도로 실험을 실시하였다.

시료명	MMP-1 생성 억제율(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	69.6
실시예 5-14 초임계 추출물	69.0
실시예 5-15 초음파 추출물	69.1
실시예 6 효모 발효 추출물	67.8
실시예 7 유산균 발효 추출물	68.6
실시예 8 바실러스 발효 추출물	68.5
실시예 9 포제법 추출물	65.1
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	63.9

배양된 섬유아 세포에 UVB 조사 후 시료들과 TGF-β를 첨가한 배양액에 분비된 콜라겐 분해효소 MMP-1의 양을 측정한 결과를 상기 표 9에 나타내었다. 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 100㎍/㎖ 농도에서 MMP-1 생성 억제율을 측정했을 때, 실시예 2의 추출물이 69.6%의 억제율을 나타내어 가장 높은 억제율을 나타냈다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10ng/ml)와 본 발명의 시료들의 농도(0.01%(w/v)) 차이를 감안해도, 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물이 자외선 유도로 인한 MMP-1 생성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

시험예 8: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1 x 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 시료들을 최종농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 시료가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드(PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 본 실험의 비교군으로는 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10 ng/ml)를 비교군으로 사용하였고, 시료들은 0.01%(w/v) 농도로 실험을 실시하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

시료명	콜라겐 생합성 증가율(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	88.7
실시예 5-14 초임계 추출물	76.9
실시예 5-15 초음파 추출물	81.1
실시예 6 효모 발효 추출물	81.2
실시예 7 유산균 발효 추출물	83.0
실시예 8 바실러스 발효 추출물	83.3
실시예 9 포제법 추출물	83.1
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	89.2

표 10은 섬유아세포를 이용하여 시료들과 TGF-β를 첨가한 배양액의 콜라겐 합성 증진 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 표 10에 따르면, 본 발명의 실시예 2는 0.01% 농도에서 콜라겐 생합성 증가율을 측정했을 때, 88.7%의 생합성율을 나타내었다. 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10ng/ml)와 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 농도(0.01%(w/v)) 차이를 감안해도, 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 콜라겐 생합성 증가율을 나타낸 것은 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물이 콜라겐 합성 증진효과가 있다는 것을 보여준다.

시험예 9: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 B16F10 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제효과

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F10 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다. 본 시험예 9에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다.

이 세포의 인공 배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다. B16F10 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F10 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료들을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F10 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 11에 기재하였다. 이때 멜라닌 생성 저해 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 하이드로퀴논과 알부틴을 비교군으로 사용하였다.

멜라닌 생성 저해율(%) = [

] X 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명	처리농도(%, w/v)	멜라닌 생성 저해율(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	0.1	4.94
실시예 5-14 초임계 추출물	0.1	4.53
실시예 5-15 초음파 추출물	0.1	3.69
실시예 6 효모 발효 추출물	0.1	4.68
실시예 7 유산균 발효 추출물	0.1	4.10
실시예 8 바실러스 발효 추출물	0.1	3.62
실시예 9 포제법 추출물	0.1	3.86
하이드로퀴논	0.1	7.57
알부틴	0.1	3.61

상기 표 11의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 실시예들은 B16F10 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있다. 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 본 발명 실시예의 카카오 닙스 추출물은 0.1% 농도에서 멜라닌 생성 저해율 값이 3.62~4.94%로 나타났으며, 동일한 농도에서 기존의 미백 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 알부틴 및 하이드로퀴논과 비교했을 때, 하이드로퀴논 보다는 상대적으로 낮은 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었으나, 알부틴 보다는 우수한 멜라닌 생성 저해효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 멜라닌 생성 억제에 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

시험예 10: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다.

섬유아 세포(fibroblast)를 24 웰 시험 플레이트에 5 X 10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 각 웰에 1000 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1 ㎖를 첨가하였다. 여기에 시료들을 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 24시간이 지난 후 배지를 제거하고, 각 웰당 세포 배양 배지 500㎕과 MTT 용액(2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2 시간 동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5 분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96 웰 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로 TGF-β를 사용하였다. 세포 생존율(%)과 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%)을 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

세포 생존율(%) =〔

〕X 100

Bo :세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의565 nm 흡광도

Bt :시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의565 nm 흡광도

St :시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의565 nm 흡광도

자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%) =〔1-

〕X 100

Bo :자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt :자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St :자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

시료명	처리농도(%, w/v)	세포 독성 완화율(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	0.0125	64
	0.025	74
	0.050	82
실시예 5-14 초임계 추출물	0.0125	60
	0.025	67
	0.050	76
실시예 5-15 초음파 추출물	0.0125	55
	0.025	64
	0.050	82
실시예 6 효모 발효 추출물	0.0125	54
	0.025	68
	0.050	71
실시예 7 유산균 발효 추출물	0.0125	56
	0.025	63
	0.050	75
실시예 8 바실러스 발효 추출물	0.0125	54
	0.025	61
	0.050	70
실시예 9 포제법 추출물	0.0125	58
	0.025	64
	0.050	72
양성 대조군 TGF-β	10 ng/ml	85

표 12에 따르면, 실시예들의 처리농도가 증가됨에 따라 농도 의존적으로 세포 독성 완화율이 증가되는 양상을 보여, 자외선에 의한 세포 독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험결과를 통해 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 자외선 조사에 의한 세포손상을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

시험예 11: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 자외선 조사에 의한 염증성사이토카인 발현 억제 효과

원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24 웰 플레이트에 5 X 10⁴개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료들을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1?를 정량함으로써 시료들의 염증성사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소 면역 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 양성대조군으로 IL-1α 억제물질로 알려진 케토프로펜(Ketoprofen)을 사용하였다. 염증성사이토카인(IL-1α)의 발현 억제율(%)은 하기 식에 의해 계산하였다.

염증성사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-

〕X 100

Bo :자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt :자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St :자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

시료명	처리농도(%, w/v)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 2 카카오 닙스 추출물	0.0125	40
	0.025	53
	0.050	62
실시예 5-14 초임계 추출물	0.0125	41
	0.025	50
	0.050	65
실시예 5-15 초음파 추출물	0.0125	38
	0.025	42
	0.050	47
실시예 6 효모 발효 추출물	0.0125	41
	0.025	52
	0.050	70
실시예 7 유산균 발효 추출물	0.0125	44
	0.025	50
	0.050	58
실시예 8 바실러스 발효 추출물	0.0125	20
	0.025	27
	0.050	35
실시예 9 포제법 추출물	0.0125	48
	0.025	56
	0.050	72
Ketoprofen	100 μg/ml	43

표 13에 따르면, 실시예 2, 5-14, 6, 7, 9의 카카오 닙스 추출물이 자외선에 의한 염증성사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.025% 농도에서 Ketoprofen 보다 우수하게 억제하였다. 또한 상기 실시예들의 처리 농도가 증가됨에 따라 농도 의존적으로 염증성사이토카인 발현 억제율이 증가되는 양상을 보여, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물은 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

제형 실시예 1: 유연화장수

하기 표 14에 나타낸 조성으로 통상의 제조방법에 따라 유연화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
카카오 닙스 추출물(실시예 2)	30.0
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트60	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100.0

제형 실시예 2: 크림

하기 표 15에 나타낸 조성으로 통상의 제조방법에 따라 크림을 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
카카오 닙스 추출물(실시예 9)	30.0
친유형모노스테아린산클리세린	2.0
세테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에타올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100.0

제형 실시예3 : 효능 평가용 크림

하기 표 16에 나타낸 조성으로 통상의 제조방법에 따라 효능 평가용 크림을 제조하였다.

성분(중량%)	제형 실시예 3	비교 제형예1	비교 제형예2	비교 제형예3
카카오 닙스 추출물(실시예 2)	3.0	-	-	-
아데노신	-	-	3.0	-
백굴채 추출물	-	-	-	3.0
친유형모노스테아린산클리세린	2.0	2.0	2.0	2.0
세테아릴알콜	2.2	2.2	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6	0.6	0.6
경화식물유	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0	3.0	3.0
트리에타올아민	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0	4.0	4.0
방부제	미량	미량	미량	미량
향	미량	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
계	100.0	100.0	100.0	100.0

시험예 12: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 피부 주름 개선 효과

본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 상기 표 16에 제시한 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 크림(제형 실시예3), 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교 제형예 1), 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물 대신 주름개선 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신을 함유하는 크림(비교 제형예 2)을 사용하였다. 60명의 여성을 대상으로 얼굴 양쪽면을 사용하여 6주 후의 주름 개선 효과를 육안으로 평가하여 주름 개선 정도를 확인하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 17에 나타내었다.

	주름 개선 효과			유효율(%)
	우수	약간	없음
제형 실시예 3 (카카오닙스 추출물)	15	4	1	85.0
비교 제형예1 (정제수)	0	1	19	2.5
비교 제형예2 (아데노신)	12	6	2	75.0

상기 표 17의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유한 제형 실시예 3의 크림은 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하지 않은 비교 제형예 1의 크림에 비하여 높은 주름개선 효과를 보여주었으며, 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물 대신 아데노신을 함유하는 비교 제형예 2의 크림과 유사한 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다. 또한 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료를 피부에 도포한 대부분의 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

시험예 13: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물의 피부 탄력 개선효과

본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료의 피부 탄력 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

실험은 상기 표 16에 제시한 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 영양크림(제형 실시예 3), 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교 제형예 1), 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물 대신 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신을 함유하는 크림(비교 제형예 2)을 사용하여, 사람을 대상으로 화장료의 사용으로 인한 피부 탄력 개선효과를 확인 및 비교 평가하였다.

실험자(30세-45세의 여성) 20명을 대상으로, 실험군을 두 부류로 나누어, 한 군은 얼굴 오른쪽 부위에는 제형 실시예 3을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교 제형예 1, 다른 한 군은 비교 제형예 2를 각각 1일 2회씩 연속 8주간 도포하였다.

실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후의 피부 탄력을 각각 피부 탄력 측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하고, 실험결과를 하기 표 18에 Cutometer SEM 575의 R8값으로 나타내었다. 이러한 R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

	피부탄력효과(△R8)
제형 실시예 3 (카카오 닙스 추출물)	0.20
비교 제형예1 (정제수)	0.06
비교 제형예2 (아데노신)	0.17

상기 표 18에 나타난 바와 같이, 유효성분으로 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유한 제형 실시예 3의 크림은 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하지 않는 비교 제형예1의 크림에 비해 약 2.6배 이상 우수한 피부 탄력 개선 효과를 나타내었고, 아데노신을 함유하는 비교 제형예2의 화장료 조성물과 비교하여 약 1.15배 정도 피부 탄력 개선 효과를 나타내어 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 우수한 피부 탄력 개선 효과가 있음을 알 수 있다.

시험예 14: 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과

14-1. 기기평가

본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 피부 질환이 없는 20-40대 60명을 대상으로 1조당 20명씩 3개조로 나누고, 상기 표 16에 제시한 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 영양크림(제형 실시예 3), 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교 제형예 1), 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물 대신에 보습효과가 있는 것으로 알려진 백굴채 추출물을 함유하는 화장료(비교 제형예 3)를 함께 제조하고, 매일 2회씩 1개월간 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다.

미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24도, 습도 40%)에서 corneometer(CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도를 측정하여 그 증가율을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 19에 나타내었다.

	1주 후	2주 후	4주 후
제형 실시예 3 (카카오 닙스 추출물)	47	49	54
비교 제형예1 (정제수)	11	12	12
비교 제형예3 (백굴채 추출물)	47	50	51

상기 표 19의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 크림(제형 실시예 3)의 경우 비교 제형예 1에 비하여 피부 전도도 증가율이 매우 우수하였다. 또한 보습효과가 있는 것으로 알려진 백굴채 추출물을 함유하는 화장료인 비교 제형예 3과 유사하게 높은 피부 전도도 증가율을 나타내었다.

일반적으로 피부 전도도는 피부 수분량에 비례하므로, 상기의 결과로부터 본 발명에 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료는 정제수를 함유하는 화장료에 비해 피부 수분 함량도 높게 유지한다는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료는 피부 보습력 개선 효과가 탁월하다.

14-2. 임상평가

상기 처방예에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 임상 보습효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 20명을 선정한 후 상박을 10개 사이트로 나눈 후 각 시료를 1일 2회씩 4주간 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820(Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 상기 실험 결과는 하기 표 20에 나타나 있다.

	TEWL(g/h/m2)
	1주 후	2주 후	4주 후
제형 실시예 3 (카카오 닙스 추출물)	32.2	42.7	49.3
비교 제형예1 (정제수)	32.4	33.0	33.2
비교 제형예3 (백굴채 추출물)	32.1	43.0	48.6

상기 표 20에 나타난 바와 같이, 상기 표의 기기 측정에 의한 피부 보습력 개선 효과 평가 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 크림(제형 실시예 3)은 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하지 않는 화장료(비교 제형예 1)에 비하여 피부 보습력 개선 효과가 매우 우수하였다. 또한, 보습효과가 있는 것으로 알려진 백굴채 추출물을 함유하는 화장료(비교 제형예 3)와 비교했을 때에도 유사하게 우수한 보습력 개선효과가 있는 것으로 측정되었다. 또한, 사용 2주 후 및 사용 4주 후 보습력 개선 효과를 측정한 결과도 마찬가지로, 본 발명의 원적외선 조사 처리 후 증기에 찐 카카오 닙스 추출물을 함유하는 화장료를 사용하면 피부 보습력 개선 효과가 개선됨을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

1. 5~20㎛ 파장의 원적외선을 90~130℃에서 30~120분간 처리하는 원적외선 조사 처리 후 110~130℃의 증기로 3~12시간 찐 카카오 닙스를 추출한 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물을 화장료 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 ~ 98.0 중량% 함유하는 피부 주름과 탄력개선용, 피부자극완화용 또는 피부보습용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출된 용매추출물인 것을 특징으로 하는 피부 주름과 탄력개선용, 피부자극완화용 또는 피부보습용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물은 초임계 추출법 또는 초음파추출법에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 주름과 탄력개선용, 피부자극완화용 또는 피부보습용 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 카카오 닙스(Cacao nibs) 추출물은 효모, 유산균 및 바실러스속 균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 발효균에 의하여 발효되는 발효추출물인 것을 특징으로 하는 피부 주름과 탄력개선용, 피부자극완화용 또는 피부보습용 화장료 조성물.
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