KR102442714B1

KR102442714B1 - 중/원적외선 조사를 이용한 에키네시아 전초 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102442714B1
Application number: KR1020210109453A
Authority: KR
Inventors: 한태영; 이재호
Original assignee: 주식회사 에이치엔비랩스
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2022-09-14

Abstract

본 발명은 에키네시아 전초 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 에키네시아 전초를 3㎛~1,000㎛의 파장 범위를 특징으로 하는 중/원적외선을 이용하여 건조한 후, 열수 추출한 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 특징으로 하는 것으로, 매우 우수한 항산화, 자극완화 및 피부장벽강화 효과를 가진다.

Description

중/원적외선 조사를 이용한 에키네시아 전초 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Echinacea whole bodies extract using mid/far-infrared(MIR/FIR) irradiation as an active ingredient}

화장품은 피부에 아름다움을 부여하는 목적으로 사용되어 왔다. 그러나 최근에는 기능성을 강조하여 기존의 단순한 미용 효과를 넘어서 피부주름이나 탄력개선, 항산화, 미백 등 다양한 기능을 가지는 기능성 화장품이 각광을 받고 있다. 이에 따라 다양한 활성을 가지는 성분들이 많이 함유되면서, 이는 피부 트러블이나 염증을 유발하기도 한다.

이에 따라 안전한 천연물 성분을 이용하는 화장료에 대한 관심 높아지고 있으며, 피부 보습 및 피부 보호 효과를 가지면서 피부에 대한 자극이 없고 인체에 대해서 안전성이 확보되는 천연물 소재로부터 유용한 성분을 얻고자 많은 노력을 기울이고 있는 실정이다.

에키네시아(Echinacea purpurea)는 쌍떡잎식물 국화과 허브의 한 종으로 다년생 초본이며 높이가 60cm~120cm까지 자라며 잎은 진한 녹색으로 어긋나기 하고 7월~9월에 줄기 끝에서 자주색의 꽃이 핀다. 가뭄에 잘 견디고 내한성이 매우 강해 전국 노지 월동이 가능한 품종이다. 북미 중심부가 원산지로, 원색세계약용식물도감(한미허브연구소, 김기현 지음)에 의하면 면역력을 강하게 하고 세균에 의한 염증, 진통, 풍사, 인플루엔자, 카타르, 기관지염, 상처, 궤양, 화상, 구내염을 치료하며, 꽃필 무렵의 뿌리, 잎을 채취하여 탕제로 복용한다고 알려져 있다. 에키네시아는 1998년에 미국 보건의료제품 중 최상위 판매목록에 올랐으며, 이 종의 뿌리는 공식적인 기원식물 내원종으로 미국 약전(28개정판)에 등재되어 있다.

국내등록특허 제10-1780486호(특허문헌 1)에는 에키네시아 추출물, 특히 줄기, 잎, 꽃 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있다. 또 국내등록특허 제10-1078888호(특허문헌 2)에는 조직배양한 에키네시아 부정근 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

그러나 에키네시아 전초 추출물을 대상으로 한 연구결과는 아직까지 보고된 바 없으며, 특히 에키네시아를 채집 후 건조과정을 거치게 되는데, 일반적으로 단순히 햇볕에 말리는 천일 건조법이나 열풍을 이용하는 고온 건조법이 주로 이용되고 있다.

특히 열풍 건조는 피건조물보다 높은 온도의 고온 물체로부터 전도, 대류에 의한 열전달 방식에 의하여 일차적으로 공기를 가열시킨 다음, 피건조물의 표면에 열을 전달시키는 간접 가열방식이다. 따라서 열풍건조는 필요 이상의 많은 열량과 시간을 요구하여 건조효율이 떨어지고, 건조 중의 기류 흐름 및 온도분포가 균일하지 않아 피건조물의 품질이 저하될 우려가 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 동결건조법을 이용하기도 하지만, 이 또한 상대적으로 건조시간이 길고 비용이 비싸다는 단점을 가지고 있다.

한편 전자기파의 일종인 적외선은 파장이 0.75㎛~1,000㎛의 파장대를 가지며, 세라믹의 표면에 열을 가하여 얻을 수 있다. 적외선은 직접 피건조물의 표피 내부로 침투하여 흡수 및 가열되므로 가열효과가 높으며(가열시간 단축도 가능), 전자기파의 에너지 수준이 낮으므로 피건조물에 대한 화학작용 및 변질이 적어 순수한 가열효과를 기대할 수 있으며, 시료의 성분 및 성상을 그대로 유지하는 특성을 가지고 있다. 더구나 적외선 건조는 살균효과까지도 있어 건조제품의 장기보관에 유리한 장점을 가지고 있다.

이러한 연구개발의 일례로서, 국내등록특허 제10-1902988호(특허문헌 3)는 카카오 닙스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 카카오 닙스 추출물에 원적외선을 조사한 후 증기에 찌는 과정을 통해 제조하는 방법이 개시되어 있다.

이와 같이 원적외선 건조 방식은 통상적으로 농산물 또는 분쇄물 등의 다양한 재질을 건조시키는 방법 중의 하나로 널리 사용되고 있지만, 에키네시아 전초 추출물에 특정 파장대의 원적외선을 특정 조건에서 조사 처리하여 열수 추출하는 방법은 아직까지 개시된 바 없었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 중/원적외선 건조를 이용한 피부유용 활성을 가지는 천연물 소재를 탐색하여 왔으며, 기존에 연구 개발된 천연물 소재의 원물 가공적성의 변화를 통해 피부 주름개선 및 미백, 피부자극완화 효과 등의 활성에 영향을 미치는 물질을 찾기 위하여 노력하였다. 그 결과 에키네시아 전초에 중/원적외선 조사를 통한 건조를 실시하여 더욱 우수한 항산화, 피부자극완화, 피부탄력개선, 피부장벽강화 효과를 나타냄을 규명하여, 이를 함유하는 화장료 조성물을 완성하기에 이르렀다.

국내등록특허 제10-1780486호 국내등록특허 제10-1078888호 국내등록특허 제10-1902988호 국내등록특허 제10-1022705호 국내공개특허 제2020-0121707호 국내공개특허 제2018-0054628호

박창민 외 4인, "에키네시아 조직 배양체 추출물의 생리활성에 관한 연구", 대한화장품학회지, 제37권 제3호, 2011, p219-226.

본 발명은 에키네시아 전초를 3㎛ ~ 1,000㎛의 파장 범위를 특징으로 하는 중/원적외선을 이용하여 건조하고 이를 열수 추출한 추출물을 함유한, 우수한 항산화, 자극완화 및 피부장벽강화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 에키네시아 전초를 3㎛ ~ 1,000㎛ 파장의 중/원적외선을 150℃에서 60분동안 조사하는 건조 단계; 70℃에서 60분동안 용매 추출하여 여과 및 회수하는 단계; 감압 농축하는 단계; 에탄올을 가하여 교반하는 단계; 침전물을 여과하여 제거하는 단계; 및 여액을 진공 농축하는 단계;를 거쳐서 수득하는 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 에키네시아의 전초 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 60.0중량% 함유된다.

상기 중/원적외선의 파장은 바람직하게는 3㎛~15㎛인 것을 특징으로 한다.

상기 추출물에 사용되는 용매는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 추출 용매 중에서 물이 가장 바람직하다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 에키네시아 전초 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 항산화용, 자극완화용, 피부탄력개선용 및 피부장벽강화용으로 사용될 수 있다.

본 발명은 에키네시아의 전초 추출물을 중/원적외선으로 건조하여 열수추출한 경우, 우수한 항산화능, Nitric oxide 생성억제 효과, 자외선에 의해 발생한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, 피부 탄력 개선 평가 및 피부장벽강화능 효과를 나타낸다.

또한 건조 처리에 있어서 중/원적외선을 이용하므로 에너지 절감 효과, 건조시간 단축 및 생산성 향상과 건조의 균일화로 제품의 부가가치를 높이는데 효과가 있다.

도 1은 중/원적외선 건조한 후 열수 추출한 에키네시아 전초의 DPPH 자유라디칼 소거율에 대한 결과이다.
도 2는 열풍 건조한 후 열수 추출한 에키네시아 전초의 DPPH 자유라디칼 소거율에 대한 결과이다.
도 3은 건조 처리 방식을 달리하여 열수 추출한 에키네시아 전초의 Nitric oxide 생성율에 대한 비교 결과이다.
도 4는 중/원적외선 건조한 후 열수 추출한 에키네시아 전초의 염증성 사이토카인 생성율에 대한 결과이다.
도 5는 열풍 건조한 후 열수 추출한 에키네시아 전초의 염증성 사이토카인 생성율에 대한 결과이다.

본 발명은, 에키네시아 전초를 중/원적외선을 이용하여 건조하는 방식이 열풍 건조하는 방식보다 우수한 항산화 및 자극 완화 효능이 나타나게 되는 것으로서, 에키네시아 전초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 자극 완화, 피부탄력개선 및 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

중/원적외선은 전자파의 일종으로 적외선(0.75㎛ ~ 1,000㎛) 중 파장이 긴 것을 지칭하고 특히 파장영역이 3㎛ ~ 15㎛ 범위의 것을 의미하는데, 가시광선보다 강한 열작용을 하고 직접적이고 순간적으로 열전달을 하므로, 에너지 절약효과가 커서 다양한 응용분야에서 사용되고 있다. 이 중 근/단적외선 파장(0.75㎛ ~ 3.0㎛)은 가시광선과 근접하여 피가열체에 흡수되지 않고 반사될 가능성이 있으며, 특히 목탄, 나무 등의 천연물은 3㎛ ~ 15㎛ 파장대에서 흡수율이 약 90%~95%에 달한다는 보고가 있으므로, 본 발명은 이에 근거를 두고 3㎛ ~ 1,000㎛의 선택적인 파장이 설정된 중/원적외선 건조기의 적용을 고려하게 되었다.

본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 상기 에키네시아의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석 액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼 합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.

본 발명의 상기 에키네시아의 추출에 있어서, 상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 예로는, 용매 추출법, 초임계 추출법, 초음파 추출법, 포제법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

보다 바람직하게는 본 발명에 사용되는 추출용매로 물(또는 증류수)를 사용할 수 있다(이하 '열수 추출법'이라 한다). 상기 용매를 사용하여 1회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 용매 추출물을 감압 증류한 후 동결건조 또는 분무건조하여 얻은 건조 추출물을 제조할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 물(또는 증류수)를 사용하여 에키네시아의 추출물을 제조하였다.

초임계 추출법은, 초임계 유체를 이용하여 지용성 물질을 추출하는 방법으로, 일반적으로 이산화탄소가 특정조건에서 초임계 유체가 되고 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나오는 방식이다.

초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출 효율을 증가시키게 된다

또한 포제법을 이용하여 추출물을 추출할 수 있다. 포제란 한방이론에 근거하여 약재를 가공 처리함으로써 약재 본래의 성질을 변화시키는 제약 기술이다. 주로 찌거나, 삶거나, 불에 볶거나, 불에 굽거나 달구는 공정 또는 이들이 혼합된 공정의 방법을 말한다. 처리 조건은 삶는 경우 온도 50 내지 100℃, 30분 내지 6시간이고, 찌는 경우 100℃ 내지 130℃, 10분 내지 2시간이고, 굽는 경우 70℃ 내지 100℃, 10분 내지 2시간에서 용이하게 선정한다.

본 발명은 중/원적외선 건조 처리한 에키네시아의 전초를 열수에 의해 추출하는 방법에 관한 것으로, 특히, 가시광선과 근접하여 피가열체에 흡수되지 않고 반사될 가능성이 있는 0.75㎛ ~ 3.0㎛을 제외시킨, 3.0㎛ ~ 1000㎛ 파장대를 선정하여 건조 처리하였고, 이후 추출용매로 물을 사용하여 열수 추출하였다.

상기 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 60.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 60.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않는다.

또한 상기 파장대의 중/원적외선 조사는 140~160℃에서 10~60분간 처리하는 것이며, 바람직하게는 150℃에서 60분동안 조사하는 경우에 항산화 활성이 가장 크게 증가하였다.

에키네시아 전초는 중/원적외선으로 건조하는 경우 열풍 건조물에 비해 우수한 항산화, 자극 완화, 피부 탄력개선 및 피부장벽강화 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 구체적으로는 중/원적외선으로 건조하여 열수추출한 경우, 우수한 항산화능(실험예 1), Nitric oxide 생성억제 효과(실험예 2), 자외선에 의해 발생한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(실험예 3), 피부 탄력 개선 평가(실험예 4) 및 피부장벽강화능 효과(실험예 5)를 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따르면, 에키네시아 전초 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항산화용, 피부노화 방지용, 피부 자극완화용, 피부탄력개선용 및 피부장벽강화용으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 다른 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

[실시예]

실시예 1~4 : 원적외선 건조기를 이용한 에키네시아 전초 추출물의 제조

정제수로 수세한 에키네시아 전초 100g을 일정한 크기의 절편으로 분쇄한 후, 분쇄한 조분쇄 절편을 원적외선 건조기를 이용하여 150℃에서 각각 0분, 10분, 30분, 60분동안 건조하였다. 얻어진 건조물을 정제수 1000g에 투입 후 70℃로 1시간 동안 열수 추출하여 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10 ~ 1/3이 되도록 감압 농축하는 단계를 거쳐, 최종 농축액의 4배 부피의 에탄올을 가하여 침전반응이 생길 때까지 교반하는 단계를 거쳐, 가라 앉은 침전물을 여과하여 제거하였다. 이렇게 얻은 여액을 진공 농축하여 건조 추출물을 얻었으며, 에키네시아 전초 추출물을 수득하였다. 이 추출물의 최종 시험농도는 각각 0.1%, 0.5%, 1%, 2%가 되게 유지하며 사용하였다.

비교예 1~4 : 열풍 건조기를 이용한 에키네시아 전초 추출물의 제조

상기 실시예에서 원적외선 건조기 대신에 열풍 건조기를 사용한 점에만 차이가 있다.

실험예 1 : DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

중/원적외선 건조 또는 열풍 건조를 이용한 에키네시아 전초 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해, 항산화 효과가 있다고 널리 알려진 비타민 C를 양성대조군으로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화효과를 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질(열풍건조와 중/원적외선 건조 처리 후 열수 추출한 에키네시아 전초 추출물, 및 비타민 C)에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560 nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical (Sigma aldrich, MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 에탄올에 용해하여 100 mL로 한다. 96웰(well) 마이크로 플레이트에 에탄올에 용해한 DPPH 용액 100 ㎕(0.4 mM)과 상기 실시예에서 얻은 에키네시아 전초 추출물을 0.1% ~ 2%의 농도로 동량의 시료를 가하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 560 nm에서 효소 면역 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)으로 흡광도를 측정하여 DPPH radical 소거활성을 측정하였다.

자유라디칼 소거율(%)의 결과는 하기 식에 의하여 산출하였으며, 측정 결과는 하기 표 1 및 도 1, 2와 같다.

자유라디칼 소거율(%) = 〔1-(S_t - S₀)/(B_t- B₀)〕 × 100

S_t: 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560 nm에서의 흡광도

B_t: 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560 nm에서의 흡광도

S₀: 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560 nm에서의 흡광도

B₀: 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560 nm에서의 흡광도

구분	시료명	시험농도	건조시간 별 DPPH 자유라디칼 소거율(%)
구분	시료명	시험농도	0분	10분	30분	60분
실시예 1	에키네시아 추출물 (중/원적외선 건조, 150℃)	0.1%	2.5	8.2	13.6	18.2
실시예 2		0.5%	5.9	18.8	28.3	34.0
실시예 3		1%	7.7	24.1	31.9	39.2
실시예 4		2%	9.8	29.5	35.9	45.7
비교예 1	에키네시아 추출물 (열풍 건조, 150℃)	0.1%	2.5	6.2	7.8	3.2
비교예 2		0.5%	5.9	12.7	15.3	7.0
비교예 3		1%	7.7	15.4	16.9	8.2
비교예 4		2%	9.8	18.4	22.9	12.2
양성 대조군	비타민 C (Ascorbic acid)	25 ppm	77.8

상기 표 1 및 도 1, 2에서 확인되는 바와 같이, 상기 실시예들에서 중/원적외선 건조 처리한 에키네시아 전초 추출물은, 열풍 건조 처리한 에키네시아 전초 추출물에 비해 자유라디칼에 의한 산화를 더욱 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 중/원적외선 건조의 경우, 건조 시간이 길어질수록 에키네시아 전초 추출물의 항산화능이 증가하는 반면에, 열풍 건조의 경우 30분 건조시 보다 60분 건조시의 항산화능이 감소한 것이 확인되었다.

구체적으로 비교해보면, 시료의 농도 2%에서 건조시간을 60분으로 한 경우, 실시예 4의 DPPH 자유라디칼 소거율이 45.7%인 반면에, 비교예 4는 12.2%로 측정되어 3.7배정도 차이가 나며, 건조시간을 30분으로 한 비교예 4의 소거율 22.9%와 비교해보더라도 2배정도 차이가 있다.

이는 공기를 열전달의 매개체로 사용하는 열풍건조와는 달리 중/원적외선 복사에너지를 이용함으로써 전자파의 에너지 수준이 낮으므로, 피건조물에 대한 화학작용 및 변질이 적어 에키네시아 유효 성분의 손상이 적었기 때문이라고 판단된다. 따라서 이후에는 열풍 건조 및 중/원적외선 건조의 시간을 60분으로 고정하여 실험을 진행하였다.

실험예 2 : Nitric Oxide 생성 억제 효과

에키네시아 전초 추출물의 항산화 및 항염 효능을 평가하기 위해 상기 실시예 및 비교예에서 제조된 에키네시아 전초 추출물을 사용하여 체내 대식세포 매개의 일차적인 산화반응 및 염증반응에 관여하는 Nitric oxide의 생성 억제 효과 여부를 측정하였다.

이는 대식세포의 중요한 기능 중의 하나인 대식작용과 관련된 활동을 얼마나 활발하게 하는지 확인하는 방법으로, MTT assay 와 함께 유효물질의 최초 적정농도 설정이나 초기 활성물질 분획의 검색에 많이 이용된다. 대식세포는 외부로부터 침입한 세균이나 곰팡이를 탐식하기 위해 세포막에서 활성산소를 내뿜어서 이물질을 용해시킨다. 그러나 대식세포의 활성이 지속적으로 증가하여 활성산소의 분비량이 많아지면 활성산소가 세포 밖까지 유출되어 다른 혈관벽이나 조직을 공격하여 병에 걸리게 된다. 이러한 대식세포의 특징을 이용하여 미지의 물질의 항산화능 및 항염 효능을 측정할 수 있다.

본 발명에 사용된 대식세포는, 마우스에서 유래한 RAW 264.7 세포주로서, 면역반응에 관여하는 대식세포이며, 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 사용하였다.

RAW 264.7 세포를 96웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1×10⁵ 농도 세포가 되도록 분주하고, 세포를 부착시킨 후 각 군별 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 시료를 처리한 새 배지로 교환한 후 30분간 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 추가 배양한 후 LPS(Lipopolysaccharide)를 최종농도가 1 ㎍/mL이 되도록 처리하여 동일 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후 상층액을 100 ㎕씩 취하여 새 96웰 마이크로 플레이트에 옮겨 놓는다. 100 mM 아질산나트륨(sodium nitrite)과 배양배지를 사용하여 standard를 제조한다. 각각의 농도로 standard를 제조하여 96웰 마이크로 플레이트의 빈 웰에 100 ㎕씩 분주한다(0, 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM).

Standard와 상층액을 각각 분주해 놓은 96웰 마이크로 플레이트에 griess 시약 A와 B를 1:1로 혼합한 후 100 ㎕씩 분주한다. Griess 시약을 처리한 즉시 ELISA READER를 사용하여 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

Nitric Oxide의 생성율(%)의 결과는 하기 식에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기 표 2 및 도 3과 같다.

NO 생성율(%)=시료첨가구의 흡광도/대조구의 흡광도 × 100

구분	시료명	시험농도	Nitric oxide 생성율(%)
실시예 5	에키네시아 추출물 (중/원적외선 건조, 60분)	0.1%	93.7
실시예 6		0.5%	77.2
실시예 7		1%	66.5
실시예 8		2%	56.4
비교예 5	에키네시아 추출물 (열풍 건조, 60분)	0.1%	100.8
비교예 6		0.5%	85.2
비교예 7		1%	79.0
비교예 8		2%	70.1
대조군		-	100

실시예 5~8(중/원적외선 건조) 및 비교예 5~8(열풍 건조)의 건조 시간은 모두 60분으로 동일하게 처리하였다.

상기 표 2 및 도 3의 결과에서 보는 바와 같이, 에키네시아 전초를 중/원적외선 건조한 후의 열수 추출한 경우가 열풍 건조한 후의 열수 추출한 경우보다 Nitric oxide 생성 억제 효과가 더 높은 것이 확인되었다. 참고로 시료 2% 농도에서 비교해보면, 실시예 8의 Nitric Oxide 생성율이 56.4%인 반면에 비교예 8의 생성율은 70.1%이므로, 억제 효과는 확연한 차이를 보여주고 있다.

실험예 3 : 염증성 사이토카인 발현 억제 효과

사람의 표피 조직에서 분리한 각질 형성 세포(Keratinocyte)를 24웰 플레이트에 5×10⁴ 농도 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 mL의 PBS를 넣었다. 세척한 각질 형성 세포에 자외선-B 램프를 이용하여 10 mJ/cm²를 조사한 다음 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(FBS가 첨가되지 않은 DMEM) 350 mL를 첨가하였다. 그리고 에키네시아 전초 추출물을 첨가하고 24시간 배양하였다. 배양 상층액을 150 mL 취하여 염증성 사이토카인(TNF-a, COX-2, 1L-1a, IL-6)을 정량함으로써 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. 염증성 사이토카인의 양은 효소 면역 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)을 이용하여 정량화하였다.

염증성 사이토카인의 발현율(%)은 하기식에 의해 계산하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 4, 5에 나타내었다.

염증성 사이토카인 발현율(%) = [(S_t-B₀)/(B_t-B₀)] X 100

여기서, S_t는 자외선을 조사하고 시료를 처리한 웰의 염증성 사이토카인 생성량을 나타내고, B₀는 자외선을 조사하지 않고 시료를 처리하지 않은 웰의 염증성 사이토카인 생성량을 나타내며, B_t는 자외선을 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 염증성 사이토카인 생성량을 나타낸다.

구분	시료명	시험농도	염증성 사이토카인 발현율(%)
구분	시료명	시험농도	TNF-a	COX-2	IL-1a	IL-6
실시예 9	에키네시아 추출물 (중/원적외선 건조)	0.1%	97.4	102.1	89.4	92.4
실시예 10		0.5%	85.7	86.5	73.3	78.2
실시예 11		1%	71.3	78.4	58.4	64.5
실시예 12		2%	62.7	66.2	44.7	53.2
비교예 9	에키네시아 추출물 (열풍 건조)	0.1%	100.1	99.3	95.4	100.5
비교예 10		0.5%	93.9	98.4	88.6	90.4
비교예 11		1%	88.6	90.8	71.5	81.9
비교예 12		2%	72.4	79.1	58.8	66.4
대조군	control 자외선 램프 사용	-	100.0

실시예 9~12(중/원적외선 건조) 및 비교예 9~12(열풍 건조)의 건조 시간은 모두 60분으로 동일하게 처리하였다. 건조 온도는 150℃이다.

상기 표 3 및 도 4, 5의 결과에서 보는 바와 같이, 에키네시아 전초는 중/원적외선 건조 후 열수 추출한 경우가 열풍 건조한 후 열수 추출한 경우보다 자외선에 의한 염증성 사이토카인 생성 억제 효과가 더 높은 것이 확인되었다.

제형실시예 1 : 크림의 제조

하기 표 4의 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다. 이에 비교제형예는 열풍 건조한 추출물을 동일 중량% 사용한 것과 단지 추출물없이 정제수로만 크림을 제조한 것을 함께 비교하였다.

성 분	제형실시예1 (중/원적외선 건조 추출물)	비교제형예1-1 (열풍 건조 추출물)	비교제형예1-2 (추출물 없음)
성 분	함량 (중량%)
에키네시아 추출물	10.00	10.00	-
부틸렌글라이콜	5.00	5.00	5.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
알란토인	0.10	0.10	0.10
아데노신	0.04	0.04	0.04
디소듐이디티에이	0.03	0.03	0.03
소듐폴리아크릴레이트	0.42	0.42	0.42
토코페릴아세테이트	0.05	0.05	0.05
디메치콘	0.50	0.50	0.50
사이클로펜타실록산	2.00	2.00	2.00
펜타에리스리틸 테트라에틸헥사노에이트	3.00	3.00	3.00
네오펜틸 글리콜 디헵타노에이트	6.00	6.00	6.00
글리세릴스테아레이트	0.50	0.50	0.50
솔비탄스테아레이트	0.30	0.30	0.30
글리세릴 스테아레이트/피이지100 스테아레이트	1.50	1.50	1.50
폴리소르베이트60	1.20	1.20	1.20
세테아릴알코올	1.50	1.50	1.50
스테아르산	1.00	1.00	1.00
소듐아크릴레이트/아크릴로일디메틸타우레이트 코폴리머 & 이소헥사데칸 & 폴리소르베이트80	0.60	0.60	0.60
병풀추출물	0.10	0.10	0.10
폴리글루탐산	0.10	0.10	0.10
마름열매추출물	0.10	0.10	0.10
정제수	62.96	62.96	72.96
합 계	100.00	100.00	100.00

제형실시예 2 : 에멀젼의 제조

하기 표 5의 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다. 이에 비교제형예는 열풍 건조한 추출물을 동일 중량% 사용한 것과 단지 추출물없이 정제수로만 에멀젼을 제조한 것을 함께 비교하였다.

성 분	제형실시예2 (중/원적외선 건조 추출물)	비교제형예2-1 (열풍 건조 추출물)	비교제형예2-2 (추출물 없음)
성 분	함량 (중량%)
에키네시아 추출물	10.00	10.00	-
부틸렌글라이콜	5.00	5.00	5.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
알란토인	0.10	0.10	0.10
베타인	2.00	2.00	2.00
디소듐이디티에이	0.03	0.03	0.03
카보머	0.10	0.10	0.10
히드록시에틸 아크릴레이트/소듐아크릴로일디메틸 타우레이트 코폴리머	0.10	0.10	0.10
소듐히알루로네이트	1.00	1.00	1.00
잔탄검	0.05	0.05	0.05
팔미토일트리펩타이드-5	0.20	0.20	0.20
콜레스테롤	0.30	0.30	0.30
토코페릴아세테이트	0.10	0.10	0.10
디메치콘	0.50	0.50	0.50
시어버터	1.00	1.00	1.00
하이드로제네이티드폴리데센	5.00	5.00	5.00
소르비탄스테아레이트	0.50	0.50	0.50
글리세릴 스테아레이트/피이지100 스테아레이트	1.00	1.00	1.00
폴리소르베이트60	1.20	1.20	1.20
세테아릴알코올	1.00	1.00	1.00
스테아르산	1.00	1.00	1.00
디메치콘/비닐디메치콘크로스폴리머	0.80	0.80	0.80
사이클로펜타실록산	2.00	2.00	2.00
보스웰리아오일	0.05	0.05	0.05
정제수	63.97	63.97	73.97
합 계	100.00	100.00	100.00

실험예 4 : 피부탄력개선 평가

상기 실시예를 중심으로 에키네시아 전초 추출물을 함유하는 화장료의 피부 탄력 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

실험은 상기 표 4 및 표 5에 제시한 중/원적외선 건조 후 열수 추출한 에키네시아 전초 추출물을 함유하는 크림(제형실시예 1), 열풍건조 후 열수 추출한 에키네시아 전초 추출물을 함유하는 크림(비교제형예 1-1), 에키네시아 전초 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교제형예 1-2)과, 중/원적외선 건조 후 열수 추출한 에키네시아 전초 추출물을 함유하는 에멀젼(제형실시예 2), 열풍건조 후 열수 추출한 에키네시아 전초 추출물을 함유하는 에멀젼(비교제형예 2-1), 에키네시아 전초 추출물을 정제수로 대체한 에멀젼(비교제형예 2-2)을 사용하여, 사람을 대상으로 화장료의 사용으로 인한 피부 탄력 개선효과를 확인 및 비교 평가하였다.

실험자(30세 ~ 45세의 여성) 60명을 대상으로 맹검 시험을 진행하였으며, 이 중 30명씩 나누어 크림과 에멀젼에 대한 테스트를 진행하였다. 각 30명의 실험군은 다시 10명씩 세 부류로 나누어, 각각 제형실시예 1, 2 및 비교제형예 1-1 ~ 2-2를 각각 1일 2회씩 연속 8주간 도포하였다.

실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는, 제품 사용 전과 8주간 사용 후의 피부 탄력을 각각 피부 탄력 측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하고, 실험결과를 하기 표 6에 Cutometer SEM 575의 ΔR8값으로 나타내었다. 이러한 ΔR8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

형상	구분	피부 탄력 개선 효과(ΔR8)
크림	제형실시예 1	0.20
	비교제형예 1-1	0.15
	비교제형예 1-2	0.06
에멀젼	제형실시예 2	0.17
	비교제형예 2-1	0.11
	비교제형예 2-2	0.05

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 에키네시아 전초 추출물을 함유한 제형실시예 1, 2(비교제형예 1-1, 2-1 포함)는, 에키네시아 전초 추출물을 함유하지 않은 비교제형예 1-2, 2-2에 비하여 높은 피부탄력개선 효과를 보여주었으며, 특히 중/원적외선 건조 처리한 제형실시예 1, 2는, 열풍 건조 처리한 비교제형예 1-1, 2-1에 비해서도 우수한 피부 탄력개선 효과를 나타내었다.

실험예 5: 피부장벽강화능 평가(TEWL)

상기 제형예에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 임상 피부장벽강화 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 30명을 선정한 후 상박을 1cm x 1cm 크기의 사이트로 나눈 후 각 시료를 1일 2회씩 4주간 도포하게 하였다. 피부장벽강화 효과는 실 사용 직전, 그리고 종료 후의 개선 효과를 AquaFlux(Biox, UK)를 사용하여 평가하였으며, 측정 시 주위 환경으로 인한 오차를 최소화하기 위해, 피험자는 기온 25℃, 습도 35%가 유지되는 방에 30분 동안 대기한 후 측정하였다. 상기 경피수분손실(TEWL, Transepidermal water loss) 실험 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

	TEWL (g/m²h)		ΔTEWL
	Before (T₀)	After (T_w)	T_w - T₀
제형실시예 1	15.358	14.667	-0.691
비교제형예 1-1	15.214	14.446	-0.772
비교제형예 1-2	14.224	12.968	-1.256
제형실시예 2	14.771	13.836	-0.935
비교제형예 2-1	14.847	13.754	-1.093
비교제형예 2-2	14.556	13.142	-1.414

상기 표 7의 결과에서도 알 수 있듯이, 에키네시아 전초 추출물을 함유한 실시예 1, 2(비교제형예 1-1, 2-1 포함)는 에키네시아 전초 추출물을 함유하지 않은 비교제형예 1-2, 2-2에 비하여 낮은 경피수분손실량을 보여주었으며, 특히 중/원적외선 건조 처리한 제형실시예 1, 2는 열풍 건조 처리한 비교제형예 1-1. 2-1보다도 우수한 경피수분손실 저해능을 보임으로써, 피부장벽강화 효과가 더 뛰어난 것을 확인하였다.

Claims

1) 줄기, 잎, 꽃, 뿌리를 모두 포함한 에키네시아 전초를 3㎛~15㎛ 파장의 중/원적외선으로 150℃에서 60분동안 조사하는 건조 단계; 2) 70℃에서 60분동안 용매 추출하여 여과 및 회수하는 단계; 3) 감압 농축하는 단계; 4) 에탄올을 가하여 교반하는 단계; 5) 침전물을 여과하여 제거하는 단계; 및 6) 여액을 진공 농축하는 단계;를 거쳐서 수득하는 에키네시아 전초 추출물의 제조방법

삭제

제 1항에 있어서, 상기 추출물에 사용되는 용매는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법

제 4항에 있어서, 상기 추출물에 사용되는 용매는 물, 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법

제 1항, 제4항, 제 5항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된, 중/원적외선 건조방식의 줄기, 잎, 꽃, 뿌리를 모두 포함한 에키네시아 전초 추출물

화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 제 6항의 에키네시아 전초 추출물을 6.0 ~ 60.0 중량% 함유하는 화장료 조성물

제 7항에 있어서, 상기 조성물은 항산화용, 염증성 사이토카인의 발현이 억제된 자극완화용, 피부탄력개선용 또는 피부장벽강화용 화장료 조성물