KR20160119967A

KR20160119967A - 에키네시아 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160119967A
Application number: KR1020150048819A
Authority: KR
Inventors: 김민진; 문지영; 이욱현; 이지원; 박진오
Original assignee: 유씨엘 주식회사
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2016-10-17
Also published as: KR101780486B1

Abstract

본 발명은, 에키네시아 추출물, 특히, 줄기, 잎, 꽃 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물은 세포 독성이 없고, 염증반응과 매개된 다양한 사이토카인(cytokine) 및 NO 활성을 저해하며, 이를 포함하는 조성물은 항염효과가 있는 화장료 조성물 등으로 응용될 수 있으며, 본 발명에 따른 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물은 뛰어난 항산화효과, 항염증 효과, 피부장벽강화효과를 가짐으로서 화장료 및 피부외용제로서 매우 유용하다.

Description

에키네시아 추출물을 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ECHINACEA PURPUREA EXTRACT}

본 발명은, 에키네시아 추출물, 특히, 줄기, 잎, 꽃 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 산업통상자원부, 한국산업기술진흥원, (재)제주지역사업평가원의 지원으로 수행된 광역경제권 선도산업 육성사업의 연구결과이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화 (intrinsic aging)와 광노화 (photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다.

특히, 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼(free-radical)이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

사람의 신체방어는 면역반응을 통하여 병원체로부터 보호받을 수 있는데, 바이러스나 박테리아와 같은 외래 미생물에 대한 생체방어 기작으로는 자연면역 (innate immunity)과 특이면역 (specific immunity)으로 나뉘어지며, 이는 면역관련 세포에서 주로 분비되는 사이토킨 (cytokine)에 의해서 매개된다 (Klaus, B., Immunology Letters., 19, pp. 183- 192,1988).

내독소 (endotoxin)로 잘 알려진 LPS (lipopolysaccaride)는 그람-음성세균의 세포외막에 존재하며, 단핵식세포 (macrophage 또는 monocyte)로부터 다양한 염증 발병 인자로 알려진 TNF- (tumor necrosis factor-), IL-6 (interleukin-6), IL-1 (inter leukin-1)와 같은 염증 전구 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (An, S. J. et al., Int. Immunopharmacol., 2 , 1173 - 1181. 2002; Scott, M. G. et al., Crit. Rev.Immunol., 20 , pp. 407 - 431, 2000; Ashutosh, K. M. et al., Cell Immunol., 219 , pp1 - 10, 2002). TNF-와 같은 다기능성 (multifunctional) 사이토카인은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암 촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다 (Groves, R. W. et al., J. Dematol., 32, pp. 345 -352 1994;Wakefield, P. E., et al., J. Am. Acad. Dermatol., 24, pp. 675- 685, 1991). TNF-가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고 되어있다 (Pigue P. F., et al., J. Exp. Med., 173, pp. 673- 679, 1991).

또 하나의 강력한 염증 매개물인 나이트릭 옥사이드 (Nitric oxide, NO)는 NO 합성효소 (NOS)에 의해 L-알지닌으로부터 생성되며, UV와 같은 외부 스트레스나 엔도톡신 또는 사이토카인과 같은 물질에 의해 많은 종류의 세포에서 생성된다. 상기와 같은 염증 자극들은 세포 내의 유도성 NOS (iNOS)의 발현을 증가시키고, 이를 통하여 세포내에서 NO 생성을 유도하여, 대식 세포를 활성화시킴으로써 염증 반응을 일으킬 수 있다.

최근 효과적인 염증 완화를 위하여, NO의 생성을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 이러한 연구에 의해 개발된 항염물질의 경우 몇 가지 부작용이 문제되고 있다.

체내로부터 배출되는 피지 성분, 땀 성분 및 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 등이 피부상에 존재하는 피부 상재 균들에 의해 독성이 강한 물질로 분해되면, 이들에 의해 피부 염증이 유발될 수도 있으며, 태양으로부터 나오는 자외선에 의해서도 피부 염증이 유발된다는 것은 잘 알려진 사실이다.

이렇듯 화장품에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있으며 이를 해결 하고자 여러 가지 연구가 진행되어 왔다. 천연물질 유래 물질로 이러한 부작용이나 세포독성에 대한 위험이 없거나 적으면서, 효과적으로 NO의 생성을 억제할 수 있어 항염 효과가 우수하여, 부작용 없이 염증을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 그 함량의 제한 없이 화장품에 사용될 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

특히, 최근에는 소비자들의 욕구에 부응하기 위하여 천연 원료를 이용한 화장료에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 에키네시아 (줄기, 잎, 꽃)를 연구하고 이로부터 추출물을 제조하여, 항산화효과, 항염 효과를 측정한 결과가 우수하므로 화장품과 피부외용제로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

에키네시아 (Echinacea purpurea)는 국화과의 다년생 허브식물로 북미가 원산이며, 크기가 60 150 cm 내외로 자란다. 에키네시아는 꽃과 잎의 모양이 루드베키아와 흡사한데, 잎은 긴 타원형으로 길이가 4 10 cm이고, 너비는 2 4 cm이며, 가장자리에는 톱니가 있다. 6월과 9월에 걸쳐 줄기나 가지 끝에 자홍색의 지름 10 cm 정도의 꽃이 핀다. 에키네시아는 꽃이 화려해서 전 세계적으로 관상용으로 널리 재배되고 있으며, 면역력을 증강시켜 감기나 각종 바이러스 감염의 치료제로도 사용되고 있다.

등록특허 제10-1078888 B1 (특허문헌 1)에는 조직 배양한 에키네시아 부정근 추출물이 세포 증식 효과 및 자극에 대한 세포 보호 효과를 가지고, 상기 추출물을 함유한 화장료 제형은 피부 자극을 유발하지 않으면서 피부 보습 효과를 가지므로, 피부손상에 대한 피부보호 및 피부개선을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

등록특허 제10-0431076 B1 (특허문헌 2)에는 백급 (Bletilla striata R EICHB . fil.), 자소 (Perilla ocymoides), 에키나시아 (Echinacea purpurea) 및 발효대두 추출물을 일정비율로 혼합함으로써, 항균효과, 보습효과, 항염효과, 자유 라디칼 (Free radical) 소거효과 등이 나타나 아토피 피부의 치유 개선 효능을 갖는 화장료에 관한 것이다.

그러나 상기문헌 어디에도 에키네시아 (Echinacea purpurea) 지상부 (뿌리를 제외한 줄기, 잎, 꽃)의 항산화 및 항염 화장료 조성물에 대한 개시가 없었다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 소재들에 있어서 화장료로의 응용 가능성을 연구한 결과, 에키네시아 뿌리를 제외한 줄기, 잎, 꽃을 포함하는 추출물을 제조할 수 있고, 그 추출물은 화장료로서의 항산화 및 항염 효능이 뛰어남을 알 수 있었다.

에키네시아 추출물은 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 대식세포를 염증유도 물질인 Lipopolyssacharide(LPS)로 자극하는 염증반응의 주체가 되는 단핵 식세포 모델에서 염증 전구 사이토카인인 TNF-, IL-6, IL-1 형성 억제 및 iNOS, COX-2의 발현 및 NO의 생성억제를 나타냄과 동시에 높은 항산화효과를 나타내므로, 이를 포함하는 상기 조성물은 항산화, 항염 효과가 있는 화장료 조성물 등으로 응용될 수 있다.

KR 10-1078888 B1 (2011.10.26.) KR 10-0431076 B1 (2004.04.29.)

따라서 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 상기 종래의 연구나 시도가 없었던, 에키네시아 줄기, 잎, 꽃 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 화장학적 용도를 제공하려는 것이며, 보다 바람직하게는 항산화, 항염 효과가 뛰어난 에키네시아 줄기, 잎, 꽃 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

본 발명은, 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하고 상기 목적을 달성하기 위하여, 에키네시아의 꽃, 잎, 및 줄기에서 선택된 하나 이상의 추출물 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 있어서, 항산화, 항염, 및 피부장벽 강화에서 선택된 하나 이상 용도를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 에키네시아 추출물은 50 내지 95% 에탄올 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 에키네시아 추출물은 70% 에탄올 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형 제형, 유중수형 제형, 또는 연고의 제형을 제공한다.

본 발명에 따른 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물은 뛰어난 항산화효과, 항염증 효과, 피부장벽강화효과를 가짐으로서 화장료 및 피부외용제로서 매우 유용하다.

도 1은,, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물, 및 에케네시아 (뿌리) 추출물에 대하여 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 세포독성평가를 나타낸 그래프이다.
도 3는, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70% 에탄올 추출물과 에케네시아 (뿌리) 70% 에탄올 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70% 에탄올 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 PGE2 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70% 에탄올 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 IL-1β 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70% 에탄올 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 IL-6 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70% 에탄올 추출물에 대하여 RAW 264.7 세포에서 TNF-α 생성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 항산화 활성과 항염증 활성을 갖는 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물에 관한 것이다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 시험예의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예로 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

실시예

실시예 1 - ( 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 열수 추출물 및 용매별 에 탄올 추출물, 에케네시아 (뿌리) 에탄올 추출물 제조)

에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 열수 추출물은 증류수로 수세한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃)을 믹서기로 분쇄하여 미세분말 시료 40 g에 증류수 4 L를 가한 후, 100 ℃에서 3 시간 동안 가열하면서 열수 추출을 수행하였다. 상기 추출을 수행한 후, 400 메쉬 여과포로 여과한 다음, 수득한 여액을 동결 견조기 (Freeze dryer)에서 동결 건조 하였다. 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 에탄올 용매별 추출물은 증류수로 수세한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃)의 미세분말 시료를 각각 40 g에 30 %, 50 %, 70 %, 95 % 에탄올 4 L에 침적하고 3 일간, 2 회 추출하였으며 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축하여 동결 건조하였다. 에케네시아 (뿌리) 역시 위와 같은 조건에서 70 % 에탄올 추출물을 제작하였다.

상기 동결건조를 통하여 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 열수 추출물 7.1 g과 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 30 % 에탄올 추출물 3.2 g, 50 % 에탄올 추출물 5 g, 70 % 에탄올 추출물 4.7 g, 95 % 에탄올 추출물 2.9 g을 얻었다. 또한 에케네시아 (뿌리) 70 % 에탄올 추출물은 4.2 g을 얻었다.

이와 같이 수득된 것을 하기 시험예에서 사용하였다.

실험예 1 - 항산화 효과 측정 실험

본 발명의 상기 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물과 에케네시아 (뿌리) 추출물에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼소거시험을 실시하였다.

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540 nm에서 최대 흡광도를 나타는 것을 이용, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 540 nm파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 하기와 같은 검정시험방법에 의해 진행하였다.

먼저 0.1 mM 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical (DPPH, Sigma)용액 1 mL에 상기의 실시예 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1 mL를 혼합하고, 37 ℃에서 15 분간 방치한 후 microplate reader (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼소거시험에서 대조군은 DPPH 1 mL과 메탄올 1 mL을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1 mL과 시료 1 mL을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼 소거율을 계산하여 하기 도 1에 나타낸 봐와 같이, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 열수 추출물, 30 % 에탄올 추출물, 50 % 에탄올 추출물, 70 % 에탄올 추출물, 95 % 에탄올 추출물은 500 μg/mL에서 각각 90.7 %, 92 %, 80.2 %, 60.8 %, 96.8 %, 85.2 %의 DPPH 소거 활성을 나타내었다. 특히 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 70 % 에탄올 추출물과 열수 추출물, 에케네시아 (뿌리) 70 % 에탄올 추출물은 대조군인 ascorbic acid 만큼이나 높은 DPPH 환원력을 가짐을 확인 할 수 있었다.

실험예 2 - 세포독성 실험

실시예 1에서 제조한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 세포 독성을 측정하기 위하여, 쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국 세포주 은행에서 구입하여 사용하였다.

상기 세포의 배양에 사용된 Antibiotic , Fetal bovine serum (FBS), Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)는 Gibco/RBL(USA)에서 구입하였다.

상기 RAW 264.7 세포는 1 % antibiotic과 10 % FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였으며, 2 일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.

RAW 264.7 세포를 24 웰 플레이트에 웰 당 1.8 × 105 cells/mL 세포로 분주하여 부착시킨 후 37 ℃, 5 % 농도의 CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 배양 후 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 용매별 추출물과 열수 추출물에 대한 세포독성 유발 유무를 MTT 분석을 통해 확인하였다.

상기 MTT분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. MTT 분석은 세포 생존율을 측정하는 대표적인 방법으로, 대사가 왕성한 살아있는 세포는, 세포 내 mitochondria의 탈 수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 환원시켜 자주색을 띠는 비수용성 formazan을 형성 한다. RAW 264.7 cell를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8 × 105 cells/mL로 96 well plate에 넣고 18 시간 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하고 24 시간 배양하였다. 이후 MTT 용액 50 μL를 첨가하여 4 시간 동안 반응 시켰다. 배양배지를 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 200 μL를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 평가하였다.

도 2에 나타낸 봐와 같이, 상기 실기예 1에서 제조된 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 추출 용매별 추출물과 열수 추출물은 200 μg/mL의 처리농도에서 모두 세포독성을 거의 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 3 - 추출 용매별 일산화 질소 (NO) 생성 억제 활성 측정 실험

상기 실시예 1에서 제조된 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 추출 용매별 시료에 대한 항염 효과를 확인하기 위하여, 염증을 일으키는 물질 중 하나인 일산화질소 (NO)의 생성억제능을 분석하고자 하였다. 상기 실험예 2에서 배양한 RAW 264.7 세포를 이용하였으며, 실시예에서 제조된 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 추출 용매별 시료와 Lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL)를 함께 처리하여 NO 생성을 유도한 다음, 그리스 반응 (Greiss reaction)을 통하여 NO 생성 저해능을 분석하였다.

그리스 반응은 배양 세포로부터 생성되어 배지로 방출된 NO의 양을 정량적으로 분석하는 방법으로 24 시간의 시료 처리 후 세포 배양 배지 100 μL를 96-웰 플레이트에 분주한 후 그리스 반응용액 A (5 % 인산용액에 용해시킨 1 % 설파닐아미드 용액), B (0.1 % 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드) 완충액을 1:1로 섞어 96-웰 플레이트에 100 μL씩 분주하고 NO 생성에 따른 색의 변화를 멀티-플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서의 흡광도로 측정하였으며, 그 값은 3 회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

하기 도3 에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, iNOS inhibitor인 2-amino- 4-methylpyridine은 NO의 생성을 95.7 % 억제함을 확인할 수 있었다. 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 추출 용매별 시료 중에서는 70 % 에탄올 추출물이 다른 조건의 추출물 보다 LPS 단독 처리군과 비교해 볼때 NO의 생성을 51.9 % 억제하는 것으로 나타나 높은 NO 생성 억제 활성을 나타냄을 확인 할 수 있었다.

실험예 4 - 70 % 에탄올 추출물에 대한 일산화 질소(NO) 생성 억제활성 측정 실험

상기 실험예 3를 통하여 NO 생성 억제능이 가장 우수하였던 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물과 항염 효과가 우수하다고 알려진 에케네시아 (뿌리) 70 % 에탄올 추출물에 대하여 일산화질소 (NO)의 생성 억제능을 비교 분석하였다.

상기 실험예 2에서 배양한 RAW 264.7 세포를 이용하였으며, 실험예에서 제조된 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃)의 70 % 에탄올 추출물, 에케네시아 (뿌리) 70 % 에탄올 추출물과 Lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL)를 함께 처리하여 NO 생성을 유도한 다음, 그리스 반응 (Greiss reaction)을 통하여 NO 생성 저해능을 분석하였다.

그리스 반응은 배양 세포로부터 생성되어 배지로 방출된 NO의 양을 정량적으로 분석하는 방법으로 24시간의 시료 처리 후 세포 배양 배지 100 μL를 96-웰 플레이트에 분주한 후 그리스 반응용액 A (5 % 인산용액에 용해시킨 1 % 설파닐아미드 용액), B (0.1 % 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드) 완충액을 1:1로 섞어 96-웰 플레이트에 100 μL씩 분주하고 NO 생성에 따른 색의 변화를 멀티-플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서의 흡광도로 측정하였으며, 그 값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

도 4 에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, iNOS inhibitor인 2-amino- 4-methylpyridine은 NO의 생성을 95.7 % 억제함을 확인할 수 있었다. 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물과 에케네시아 (뿌리) 70 % 에탄올 추출물은 300 μg/mL의 처리농도에서 각각 NO 생성을 61.1 %, 45.3 % 억제함으로써 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물이 NO 생성 저해효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

따라서 이후 실험은 에케네시아 (뿌리) 70 % 에탄올 추출물 보다 NO 생성 저해효과가 더 우수한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물에 대하여 염증 반응 관여 인자들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 조사해 보았다.

실험예 5 - 프로스타글란딘 ( PGE2 ) 생성에 미치는 영향 측정 실험

Cyclooxygenase (COX)는 아라키돈산 (arachidonic acid)을 프로스타글란딘(prostaglandins, PGs)으로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장 기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하며, COX-2는 염증매개물질인 PGE2를 형성시킨다. PGE₂는 염증반응, 면역반응, 그리고 맥관형성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

상기 실험예 4를 통하여 NO 생성 억제능이 가장 우수하였던 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물에 대하여 PGE2의 생성 억제능을 분석하였다. 쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서의 염증성 PGE2의 억제효과는 ELISA kit를 이용하여 정량하였다.

RAW 264.7 cell를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8 × 105 cells/mL로 24 well plate에 접종하고, 18 시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10 배 농도 (1 mg/mL)로 조제된 시료 50 μL와 LPS (1 μg/mL)를 함유한 450 μL의 배지를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상층액의 PGE2 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20℃) 하였다. PGE2는 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

도 5 에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 PGE2의 생성을 유도하였고, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물은 PGE2의 생성을 100, 200, 300 μg/mL의 처리농도에서 각각 88.1 %, 70.8 %, 57.2 % 억제하여 농도 의존적인 저해효과를 나타내었다.

실험예 6 - 전염증성 cytokines ( TNF -α, IL-6, IL- 1β ) 생성 억제 활성 측정 실험

상기 실험예 4를 통하여 NO 생성 억제능이 가장 우수하였던 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물에 대하여 염증반응과 관련된 사이토카인(cytokine)인 TNF-α, IL-6, IL-1β 의 억제효과를 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.

RAW 264.7 cell를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8 × 105 cells/mL로 24 well plate에 접종하고, 18 시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10 배 농도 (1 mg/mL)로 조제된 시료 50 μL와 LPS (1 μg/mL)를 함유한 450 μL의 배지를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상층액의 전염증성 cytokine 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20℃) 하였다. 전염증성 cytokines은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

도 6에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 IL-1β의 생성을 유도하였고, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물은 IL-1β의 생성을 300 μg/mL의 농도에서 42.8 % 억제하였으며 농도의존적인 저해효과를 나타내었다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 IL-6의 생성을 유도하였고, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물은 IL-6의 생성을 300 μg/mL의 농도에서 48.2 % 억제하였으며 농도의존적인 저해효과를 나타내었다.

도 8에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 TNF-α의 생성을 유도하였고, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물은 TNF-α의 생성을 300 μg/mL의 농도에서 65.1 % 억제하였으며 농도의존적인 저해효과를 나타내었다.

본 발명의 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물은 에케네시아 (Echinacea purpurea)을 준비하여 음건한 후, 분쇄하여 미세분말로 만들어 열수 추출물과 30 %, 50 %, 70 % 에탄올에 침적하고, 이 에탄올 침적물을 추출한 다음, 추출액의 상층액을 회수하여 감압농축하고 동결 건조하였다.

이에 본 발명의 발명자들은 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물에 대한 생리활성을 확인한 바, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 우수한 항산화 활성과 항염증 효과를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에서는 에키네시아 (Echinacea purpurea) (줄기, 잎, 꽃) 추출물을 열수 추출물과 30 %, 50 %, 70 % 에탄올로 추출하여 DPPH radical 소거능을 통해 항산화능을 평가하였고 일산화탄소 생성 억제 효과와 염증성 사이토카인 억제효과를 관찬한 바, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물의 70 % 에탄올 추출물은 우수한 항산화 효과와 항염증 효과를 알아낸 것이다.

염증 반응은 생체 내에 이물질의 침입, 대사 장애, 화상, 기계적 화학적 외상 등을 입었을 때 일어나는 정상적인 방어 반응으로서 병인 요소를 무독화 하거나 손상 받은 조직을 회복시킨다.

염증반응에 관여하는 세포종으로서 대식세포, 임파구, polymorphornuclear leukocyte (PMN), 단구, 비만세포, 혈소판, 섬유아세포 등이 있으며 염증 매개 인자에는 염증 반응으로 인한 자극을 통하여 유리되는 물질과, 생성되는 물질로 크게 나뉘어지는데 전자는 비만 세포에서 분비되는 혈관 확장성 아민류로서 히스타민, 세포토닌, 후자는 비만세포와 PMN에서 생성되는 아라키돈산 (arachidonic acid) 대사체, 단구에서의 사이토카인, 대식세포와 호중구에서 생성되는 활성 산소종 등이 있다.

박테리아에 대한 대식세포는 활성산소종, 혈소판 활성화 인자 (PAF), 인터페론, 인터루킨, 종양괴사인자 등을 생성하는데, 대식세포의 대사산물 중 활성 산소종은 세포간극에서 살균작용을 나타내는 한편, 아라키돈산 (arachidonic acid) 대사를 활성화시켜 화학적 매개인자와 PGs의 생성을 증가시킴으로써 염증 부위에서 활성 산소종 생성을 가속화한다.

이때 세포간극에 존재하는 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide anion)의 분해효소인 슈퍼옥사이드 디스뮤테아제 (super oxide dismutase, SOD)와 H₂O₂의 분해효소인 카타라아제(catalase, CAT)의 활성이 낮으면 슈퍼옥사이드음이온에 대한 세포간극 구성요소들의 감수성이 증가하게 되어 염증 부위에서 슈퍼옥사이드 음이온 농도 의존성염증 매개 인자와 하이드록시 라디칼 (hydroxyl radical) 생성이 촉진되고 결과적으로 염증 매개 인자들의 주위에는 호중구와 같은 과립구의 농도가 과다하게 된다.

이러한 상태는 염증 반응을 번식시켜서 세포 간극에 존재하는 생체 거대분자의 파괴, 조직 세포막 지질의 과산화, 세포막 유동성 증가에 의한 부종 등 정상세포에 대한 손상을 유발할 수 있다.

따라서 본 발명에서서는 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼소거시험을 실시하였다.

그 결과, 전자공여능 측정에 사용된 DPPH의 자유라디칼 (free radical) 소거활성은 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물이 열수 추출물과 30 %, 50 % 에탄올 추출물에 비해 높은 라디칼 (radical) 소거활성을 나타내었다(도 1).

일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

이에 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 일산화질소 (nitric oxide, NO) 생성에 대한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물들의 효과를 알아보았다.

그 결과, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었고, 열수 추출물과 30 %, 50 % 에탄올 추출물은 NO 생성에 관여하지 않음을 확인하였다(도 3, 4).

PGE₂는 염증반응, 면역반응, 그리고 맥관형성 (angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. NO 생성저해효과가 우수하였던 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물이 RAW 264.7 세포에서 염증성 PGE₂ 발현에 관여하는지 알아보기 위해 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/mL)를 사용하여 PGE₂의 생성을 유도한 후 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물을 300 μg/mL 이하의 농도로 처리하여 확인한 결과, 농도 의존적으로 PGE2 생성 억제 효과를 나타내었다(도 5).

또한, 내독소로 잘 알려진 지질다당류 (lipopolysaccaride, LPS)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, RAW 264.7 세포와 같은 마크로파지 (macrophage) 또는 모노사이트 (monocyte)에서 종양괴사인자 (TNF-α), IL-6 (Interleukin-6), IL-1β (Interleukin-1β)와 같은 염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

따라서, RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)의 발현 정도를 ELISA kit을 통해 졍량하였다.

그 결과, LPS 자극과 함께 처리하여 IL-1β, IL-6, TNF-α 생성 억제에 대한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물은 300 μg/mL 농도로 처리하였을 때, IL-1β을 42.8 %, IL-6을 48.2 %, TNF-α을 65.1 % 저해함을 확인하였다(도6, 7. 8).

상기의 실험 결과로부터 본 발명의 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 추출물이 항산화활성과 항염증활성이 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 2, 및 비교예 1 - 에케네시아 추출물을 함유하는 크림 제제(제형)

상기 실시예 1에서 수득한 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물, 또는 뿌리 70% 에탄올 추출물을 함유하는 크림의 성분구성을 하기 표 1와 같이 구성하여 제조하였다. 하기 표 1의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	실시예 2	실시예 3	비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0	3.0
16	에케네시아(줄기,잎,꽃) 70% 에탄올 추출물	1.0	-	-
17	에케네시아(뿌리) 70% 에탄올 추출물	-	1.0	-
18	증류수	잔량	잔량	잔량
19	방부제, 향	미량	미량	미량

상기 표 1의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 15 및 17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11 및 16을 80℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 15 및 17의 용액에 투입하고 호모믹서 (Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

실험예 7 - 피부 일차 자극 평가

상기 실시예 2에서 제조된 크림의 인체피부 일차 자극 평가 시험은 전문 임상시험 기관인 P&K에 의뢰하여 수행하였다. 피험자 선정은 선정조건을 만족하고 제외조건에 해당사항이 없는 성인 30명 이상 선정하여 수행하였으며, 피험자의 척추를 제외한 등의 평평한 부위로 착색이나 피부손상이 없는 부위에 첩포하였다. 피부 자극정도 평가는 Frosch & Kligman, CTFA(Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) guideline에 의해 평가하였으며 결과 계산은 하기 표 2의 등급 판정 기준에 따라 아래의 수학식 2을 이용하여 피부반응도를 판정하였다. 또한 시험 물줄의 피부자극정보는 아래의 수학식 3을 이용하여 하기 표 3의 피부 자극 지수표를 참조하여 판정하였다.

기호	등급	판정 기준
+	1	약간의 홍반, 반점 또는 미만성(diffuse)
++	2	증등도의 균일한 홍반
+++	3	부종을 동반한 심한 홍반
++++	4	부종과 소수포를 동반한 심한 홍반

피부자극지수	구분	비고
0.00 ~ 0.25	비 자극성	6.25 %
0.26 ~ 1.00	약한 자극성	25.00 %
1.01 ~ 2.50	중등도 자극성	62.50 %
2.51 ~ 4.00	강한 자극성	100.00 %

하기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 크림을 24시간 첩포하고, 첩포 제거 1시간, 24시간 후의 피부반응을 연구자가 육안으로 평가하여 피부자극 지수 및 피부자극 정도를 관찰 한 결과, 비자극성으로 판정되었다.

시험제품	피부자극지수	피부자극정도
실시예 2	0.02	비 자극성
실시예 3	0.11	비 자극성

실험예 8 - 피부장벽 강화 효과 측정

피부장벽기증의 측정방법 중 진피에서 각질층을 통한 수분손실을 측정하는 경표피수분손실 (TEWL:transepidermal water loss)측정은 각질층 상태의 평가와 피부장벽기능의 간전평가로 흔히 이용되고 있으며, 피부 표면의 수분함량은 수분함량에 따른 정전 용량 (capacitance)을 측정함으로써 수분 함량의 상대적 크기를 측정하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 크림의 피부장벽 강화 측정은 전문 임상시험 기관인 P&K에 의뢰하여 수행하였다. 피험자 선정은 선정조건을 만족하고 제외조건에 해당사항이 없는 성인 30명 이상 선정하여 수행하였으며, 피부 손상 개선 도움 측정은 실시예 2와 비교예 1의 사용 전 TEWL 측정하고 SLS 손상을 유도한 뒤의 Vapometer 경표피 수분손실량 (TEWL) 측정하였다.

하기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물이 함유되지 않은 비교예 1에서 피부 TEWL 측정값은 처음 측정 시 16.32±11.27, 2주 후 15.48±9.62였고, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물 함유된 제형 실시예 1에서는 처음 측정시 17.22±5.60, 8주 후 10.85±10.11이었다. 크림 사용 전후의 TEWL의 평균 변화량은 대조제품에서 -0.84±8.53, 시험제품에서 -6.37±5.67로, 시험제품 사용 2주 후에 감소된 것으로 관찰되었다. 이는 2주간 사용 이후 수분 손실량이 감소되었고, 이는, 에케네시아 (줄기, 잎, 꽃) 70 % 에탄올 추출물이 함유된 제형 실시예 1의 크림을 사용함으로써 수분 손실이 감소됨으로 피부장벽이 강화되었음을 보여주는 결과이다.

실험		0주	2주	개선효과
TEWL	비교예 1	16.22±11.2	15.48±9.62	-0.84±8.53
	실시예 2	17.22±5.60	10.85±10.11	-6.37±5.67
	실시예 3	16.45±10.60	13.21±8.62	-3.24±6.72

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

제형예 1 - 유연화장수

번호	성 분	함량(중량%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	에케네시아(줄기,잎,꽃) 70% 에탄올 추출물	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

제형예 2 - 수렴화장수

번호	성 분	함량(중량%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	에케네시아(줄기,잎,꽃) 70% 에탄올 추출물	1.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

제형예 3 - 영양화장수

번호	성 분	함량(중량%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	에케네시아(줄기,잎,꽃) 70% 에탄올 추출물	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

제형예 4 - 에센스

번호	성 분	함량(중량%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	에케네시아(줄기,잎,꽃) 70% 에탄올 추출물	1.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

제형예 5 - 팩

번호	성 분	함량(중량%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	에케네시아(줄기,잎,꽃) 70% 에탄올 추출물	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

※ 본 발명은 산업통상자원부, 한국산업기술진흥원, (재)제주지역사업평가원의 지원으로 수행된 광역경제권 선도산업 육성사업의 연구결과입니다(This invention was financially supported by the Ministry of Trade, Industry and Energy(MOTIE), Korea Institute for Advancement of Technology(KIAT), and Jeju Institute for Regional Program Evaluation through the Leading Industry Development for Economic Region).

Claims

에키네시아의 꽃, 잎, 및 줄기에서 선택된 하나 이상의 추출물 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 항산화, 항염, 및 피부장벽 강화에서 선택된 하나 이상 용도를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 에키네시아 추출물은 50 내지 95% 에탄올 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 에키네시아 추출물은 70% 에탄올 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1 내지 4의 어느 한 청구항의 화장료 조성물을 포함하는 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형 제형, 유중수형 제형, 또는 연고의 제형.