KR101293066B1 - 당귀 후박 양강 관계 추출물이 포함되고 약리활성이 있는 기능성 조성물 및 이를 포함하는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물 그리고 모발제품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약리활성이 있는 기능성 조성물 및 이를 포함하는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물 및 모발제품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 약재인 당귀, 후박, 양강 및 관계를 열수추출 또는 에탄올 추출함으로써 약리활성을 갖는 기능성 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 기능성 조성물은 항산화제로서 우수한 기능을 가지며, 안정성 및 안전성이 매우 뛰어나 화장품 조성물, 악취제거 조성물, 모발제품 조성물 등에 유용하게 포함될 수 있는 약리활성이 있는 기능성 조성물 및 이를 포함하는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물 및 모발제품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 기능성 조성물은 당귀, 후박, 양강 및 관계의 유효조성물을 포함하는 바, 상기 기능성 조성물은 상귀 당귀, 후박, 양강 및 관계를 열수추출 또는 에탄올 추출하고, 여과, 농축, 동결건조하여서 되는 것을 특징으로 한다.

Description

당귀 후박 양강 관계 추출물이 포함되고 약리활성이 있는 기능성 조성물 및 이를 포함하는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물 그리고 모발제품 조성물{A FUNCTIONAL COMPOSITION WITH PHARMACOLOGICAL ACTIVITY AND A COSMETIC COMPOSITION, AN ORAL CLEANSING COMPOSITION AND A HAIR CARE COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 약리활성이 있는 기능성 조성물 및 이를 포함하는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물 및 모발제품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 한약재인 당귀, 후박, 양강 및 관계를 열수추출 또는 에탄올 추출함으로써 약리활성을 갖는 기능성 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 기능성 조성물은 항산화제로서 우수한 기능을 가지며, 안정성 및 안전성이 매우 뛰어나 화장품 조성물, 악취제거 조성물, 모발제품 조성물 등에 유용하게 포함될 수 있는, 당귀 후박 양강 관계 추출물이 포함되고 약리활성이 있는 기능성 조성물 및 이를 포함하는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물 및 모발제품 조성물에 관한 것이다.

최근 동안피부와 웰빙(well-being)이 큰 관심을 받고 있는 시점에서 그와 관련된 노화에 대해 현재까지 많은 연구가 진행되고 있지만, 다양한 현상과 복합적인 특징으로 인해 현재까지 정확한 기전은 규명되지 못하고 있다. 다만, 수많은 현상학적 연구를 통해 노화에 관한 여러 가지 가설이 제기 되었는데, 그 중 대사과정에서 발생하는 활성산소가 노화의 원인이 된다는 가설이 중요하게 받아들여지고 있다. 즉 정상적인 대사과정에서 부수적으로 생성되는 활성산소들이 세포 구성성분인 지질, 단백질, 당, 디엔에이(DNA) 등을 비 선택적, 비가역적으로 파괴함으로써 암을 비롯하여 뇌졸중, 동맥경화 같은 심혈관계 질환, 류마티스 같은 만성염 질환, 호흡기질환, 자가 면역질환 등 각종 질병을 유발할 뿐만 아니라, 이러한 산화적 손상들이 오랜 시간 축적되어 노화와 죽음에 이르게 된다는 것이다.

생체는 산화적 손상으로부터 방어하기 위한 항산화물질들과 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase), 페록시다아제(peroxidase)와 같은 항산화 효소들이 있는데 나이가 들어감에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 감소한다는 사실이 보고되었다. 따라서 활성산소를 소거(free radical scavenging)하거나 지질과산화를 억제시키는 역할을 가지는 항산화제는 활성산소에 의해 유발되는 각종 질환 치료제 및 노화 억제제로 기대되고 있다.

피부노화는 여러 가지 구조적 기능적 변화를 보이며, 자외선 등의 내외적인 여러 가지 스트레스는 피부의 탄력성과 윤택성을 감소하여 주름을 생성시키고, 표면을 거칠게 하며 기미, 주근깨 등 피부 색소 침착 등의 피부노화 현상을 촉진 한다. 이러한 피부노화를 방지하기 위해서 한의학 이론에서는 선천의 신정(腎精)을 자양하지 못하거나 장부(臟腑)의 영양 공급에 이상이 초래되면 인체는 정상적으로 생장발육하지 못한다고 알려져 항산화, 항노화 물질을 이용하여 피부 세포를 보호하려는 노력이 필요하고, 노화 예방 및 방지책으로 한방 원료를 이용한 물질의 연구가 활발히 진행되고 있다.

그리고 한방 의학에 중요한 기초를 두고 있는 천연 약재를 이용한 기능성 조성물의 개발이 필요한 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 당귀, 후박, 양강, 관계를 효과적으로 배합함으로써, 항산화효과가 우수한 기능성 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 독성이 없고 세포보호효과가 뛰어난 것은 물론, 안정성 및 안전성이 매우 뛰어난 기능성 조성물을 제공하여, 상기 기능성 조성물을 함유하는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

또한 충치균에 효과적인 구강청결용 조성물을 제공하고, 세포재생에 효과적이고 혈액순환을 촉진시키는 모발제품 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 약리활성을 갖는 기능성 조성물은 당귀, 후박, 양강 및 관계의 유효조성물을 포함하여서 되는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계는, 당귀 100중량부, 후박 50∼150중량부, 양강 200∼300중량부, 관계 100∼200중량부로 되는 것을 특징으로 한다.

그리고 상기 기능성 조성물은 상황, 감초 및 알로에로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상의 약재가 포함되어 추출된 유효조성물을 추가로 포함하여서 되는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계의 유효조성물은, 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계의 열수추출 또는 에탄올 추출하여서 추출되는 것임을 특징으로 한다.

이에 상기 유효조성물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물을 여과, 농축 및 동결건조하여서 되는 것임을 특징으로 한다.

그리고 상기한 기능성 조성물을 유효조성물로 포함하여 이루어지는 화장품 조성물, 구강청결용 조성물, 모발제품 조성물을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 당귀, 후박, 양강, 관계를 포함하는 약재를 열수 또는 에탄올 추출시킴으로써 항산화성이 우수하고 세포보호효과가 우수한 기능성 조성물을 간단하게 제공할 수 있게 되는 유용한 효과를 갖는다.

또한 상기한 기능성 조성물은 우수한 안정성 및 안전성을 갖기 때문에 화장품 조성물로서의 활용이 가능하며, 구강청결용 조성물로서 활용하면 우수한 충치예방효과를 가지며, 모발제품 조성물로서 활용하면 세포재생에 효과적이고 혈액순환을 촉진시키게 되는 효과를 갖는다.

따라서 본 발명의 기능성 조성물은 화장품, 구강청결제품, 모발제품 등에의 다양한 활용이 가능한 것이다.

도 1은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 전자공여능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 2는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 전자공여능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 ABTS·+radical 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 4는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 ABTS·+radical 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 5는 실시예1 및 비교예1 내지 4의 superoxide anion radical 소거능 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 6은 실시예2 및 비교예5 내지 8의 superoxide anion radical 소거능 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 7은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 H₂O₂ 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 8은 실시예2 및 비교예5 내지 8의 H₂O₂ 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 9는 실시예1 및 비교예9의 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 10a는 H₂O₂를 10~1000 μM의 농도로 처치하여 MTT assay를 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 10b는 H₂O₂와 DHW, MOW를 처치하여 MTT assay를 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 11은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 12는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 13은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 collagen 저해활성 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 14는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 collagen 저해활성 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 15는 DHW 또는 DHE를 포함하는 크림의 제조공정도.
도 16a는 control cream의 입자를 광학현미경으로 촬영한 사진.
도 16b는 DHW를 포함하는 cream의 입자를 광학현미경으로 촬영한 사진.
도 16c는 DHE를 포함하는 cream의 입자를 광학현미경으로 촬영한 사진.
도 17은 DHWC 및 DHEC의 시간에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프.
도 18은 DHWC 및 DHEC의 점도를 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 19는 DHWC 및 DHEC의 온도순환(Cycle chamber)에 따른 안정성 측정방법을 나타낸 그래프.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저 본 발명의 약리활성이 있는 기능성 조성물은 당귀, 후박, 양강 및 관계의 4가지 약재의 유효조성물을 포함하여 이루어지는 것으로, 상기한 기능성 조성물은 우수한 항산화효과, 피부보호효과 및 충치균에 대한 효과를 갖는 것이다.

아울러 본 발명에서는 상기한 약재 이외에도 다양한 보조첨가물의 유효조성물을 포함할 수 있는 데, 본 발명에서는 항염, 진정작용이 있는 상황, 감초 및 알로에로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 상기 보조첨가물을 반드시 제한하지 않는다.

이러한 본 발명의 기능성 조성물은, 당귀(當歸), 후박(厚朴), 양강(良薑), 관계(官桂)의 4가지 약재로부터 추출되어 조성된 것으로써, 당귀(當歸), 후박(厚朴), 양강(良薑), 관계(官桂) 등이 포함된 조성물은 대체로 여성의 기와 혈을 풀어주고 치료하는데 도움을 주는 한방 의학에서의 중요한 천연 약재인 것이다.

이와 같은 당귀(當歸), 후박(厚朴), 양강(良薑), 관계(官桂) 등으로 하는 약제들에 의하면, 간경(肝經)에 한사(寒邪)의 침입을 받아 얼굴빛이 파랗게 질리는 증상을 치료하고, 이러한 약제들 모두 한의학적으로 따뜻한 성질을 가지며, 여성의 혈액의 순환과 조혈작용을 도와 혈색을 좋게 하고 어혈을 풀어 주는 역할을 하는 방제로 사용되어 왔다.

그리고 당귀는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본으로 1~2년 생근을 말하며, 국내에서는 뿌리를 가을에 채취하여 건조한 것을 이용하고 있다. 또한 오래전부터 조혈, 진통, 진정작용으로 인하여 여성의 부인과 질환과 빈혈에 사용되고 있고, 자궁기능조절, 면역기능 활성화, 항염, 진통, 항균, 혈액순환개선, 항산화, 면역조정, 항종양 등의 효능이 보고되었으며 당귀의 주성분으로 decursin, decursinol angelate, nodakenin, β-sitosterol 등이 알려져 있다.

다음으로 후박(厚朴)은 목엽교목으로 5월 상순에서 6월 상순 사이에, 20년 이상 자란 중국후박나무 (Magnolia officinalis)나 일본 후박나무(Magnolia obovata)의 줄기, 가지, 뿌리의 마른 껍질을 선별 후 가공하여 사용한다. 중국과 일본에서 오래전부터 사용되어져 왔으며, 온중(溫中), 하기(下氣), 건위, 정장(整腸), 수렴, 이뇨, 조습, 소담의 효능이 있고, 흉협비만창통, 번위, 구토, 숙식불소(宿食不消), 담음천해(痰飮喘咳)를 치료한다. 주요성분으로는 magnolol 및 honokiol 등의 lignan계 화합물을 함유하며 항염증, 항균, 항산화 및 free radical 소거능의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.

상기 양강(良薑)은 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 여러해살이풀로서 예로부터 방향성 건위, 진통, 진토약으로 소화불량, 구토, 복통, 하리에 응용하는 약제이다. 주요성분은 정유가 0.5∼1%로써 1,8-cineol, methyl cinnamate, α-cadinene 등과 신미성분으로서 galangol, flavonoid 성분으로 galangin, kaempfride, alpinin 등을 함유하고 있다. 또한 양강은 지질과산화억제효과, free radical 소거작용, 항염증 및 항균 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

상기 관계(官桂)는 녹나무과에 속하는 다년생 식물로 계피나무의 5-6년 재배 한 것을 채취하여 원통형 또는 쌍원통 모양으로 두께 3mm이하, 넓이 1.5~3cm 크기로 말린 것을 사용한다. 주요성분으로는 phenylpropanoid 인 cinnamic aldehyde를 주성분으로 하여 cinnamyl acetate, phenylpropyl acetate, cinnamic acid, salicylaldehyde, anhydrocinnzeylanol 등을 함유하고 있다. 관계의 효능으로 항산화 효과, 항당뇨 효과가 있는 것을 알려져 있다.

상기와 같이 당귀, 후박, 양강, 관계는 앞서 명시한 것과 같이 효능이 있으며, 그리하여 이러한 약제들로부터 추출되어 조성된 조성물로 본 발명에 따른 기능성 조성물을 이용하게 되는 것이다.

그리고 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계의 혼합비는 당귀 100중량부를 기준으로, 후박 50∼150중량부, 양강 200∼300중량부, 관계 100∼200중량부를 포함하여서 될 수 있다. 여기서 상기 후박이 50중량부 미만을 첨가될 경우 항산화 효과에 영향을 많이 주는 것으로 항산화 효능이 감소될 수도 있는 문제점이 있으며, 150중량부를 초과하면 약취가 강하여 화장품 제품 개발에 문제점이 있을 수 있고, 상기 양강이 200중량부 미만으로 첨가될 경우 후박의 효능을 뒷받침하는 것으로 항산화 관련 효능이 감소될 우려가 있고, 300중량부를 초과할 경우 4가지 약재 중 가장 피부에 사용시 뜨거운 성질을 띠게 되어 피부 자극의 우려가 있으며, 상기 관계가 100중량부 미만으로 첨가될 경우 주름개선의 효과가 감소될 수 있고 200중량부를 초과할 경우 구성 비율 중 cinnamic acid 성분이 높게 차지하기 때문에 피부의 열감으로 인한 피주 자극의 문제점이 있을 수 있으므로, 상기한 혼합비를 갖는 것이 바람직하다.

또한 상기 보조첨가물인 상황, 감초 및 알로에는 그 혼합비를 제한하지는 않으나, 바람직하게는 보조첨가물의 총합이 10∼300중량부가 되도록 실시될 수도 있을 것이다. 이는 보조첨가물이 10중량부 미만을 첨가될 경우 그 효과가 거의 없으며, 300중량부를 초과할 경우 항산화효과, 피부보호효과 및 충치균에 대한 효과를 갖는 당귀, 후박, 양강 및 관계의 약리활성이 오히려 약해지기 때문이다.

본 발명에서는 상기한 약제들의 유효조성물이란, 즉 당귀, 후박, 양강 및 관계, 또한 선택적인 보조첨가물들을 열수 추출 또는 에탄올 추출하여서 얻어지는 것인 데, 먼저 열수 추출의 경우 상기 약제들과 약제 중량의 10배 양의 물을 가하여 75∼95℃에서 2∼3시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리한다. 그리고 상기한 방법을 3회 반복 추출함으로써, 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계의 유효조성물을 포함하는 기능성 조성물을 얻을 수 있다.

또한 상기 열수 추출물을 그대로 이용할 수도 있으며, 이를 필터 페이퍼(Filter paper) 등을 이용하여 여과하고, 감압 회전 농축 후, 동결건조함으로써 분말 형태의 기능성 조성물을 얻을 수도 있는 것이다. 이때 상기 동결건조의 온도는 제한하지 않으나 -70∼-20℃의 온도범위에서 동결건조하며, 건조된 분말 형태의 조성물은 냉동보관한다.

다음으로 에탄올 추출의 경우 상기 약제들과 약제 중량의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 실온(21∼23℃)에서 20∼30시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리한다. 그리고 상기한 방법을 3회 반복 추출함으로써, 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계의 유효조성물을 포함하는 기능성 조성물을 얻을 수 있다.

또한 상기 에탄올 추출물의 경우 역시 열수 추출물과 동일하게 여과하고, 이를 농축 및 동결건조할 수 있는 데, 상기 농축 시 에탄올 농축기를 이용하고 에탄올을 증발시킴으로써 용매 중 물만 남도록 하여 동결건조하는 것이 바람직하다.

상기한 기능성 조성물은 항산화효과가 우수하고, 피부세포보호 효과가 우수하며, 안전성 및 안정성이 뛰어나 화장품 조성물로서의 활용이 가능함은 물론, 충치균에 대해 효과가 있어 구강청결용 조성물로서의 활용이 가능하며, 세포재생효과 및 혈액순환개선효과가 있어 모발제품 조성물로서의 활용 역시 가능하다.

여기서 상기 화장품이란 스킨(열수추출의 경우), 로션, 에센스, 크림 등을 모두 포함하며, 구강청결제품으로서는 구강청결제 등을 포함하고, 모발제품으로는 샴프, 린스, 트리트먼트, 헤어 에센스 등을 포함하는 것이며, 상기 나열된 제품 이외에도 다양한 상품의 조성물로서 활용이 가능함은 물론이다.

그리고 상기와 같이 분말, 즉 파우더 형태의 조성물은, 이를 화장품, 구강청결용 제품, 헤어제품에 적용할 경우 이를 그대로 사용할 수도 있고, 물에 녹이거나 에탄올에 녹여 사용할 수도 있으며, 그 농도는 10∼500㎍/㎖ 정도가 바람직하나 이를 반드시 제한하는 것은 아니고, 산업상 가장 바람직한 농도는 100㎍/㎖ 이다.

이하, 실시예 및 평가예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예 및 평가예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 평가예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

이하의 실시예에서 사용된 약제인 당귀, 후박, 양강 및 관계 등의 약재는 (주)옴니허브에서 구입하여 사용하였다.

실시예1 (이하 ' DHW' 로 칭한다.): 기능성 조성물의 제조- 열수 추출

(DHW : DanggwiHubaktang extracted with hot Water)

당귀 0.8g, 후박 0.8g, 양강 2.0g 및 관계 1.2g에 증류수 48g을 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하였으며, 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 그리고 그 추출물은 필터 페이퍼(Filter paper)를 이용하여 여과하였으며, 감압 회전 농축 후 -50℃에서 동결건조 하고 -70℃의 냉동보관하였다.

실시예2 (이하 ' DHE' 라 칭한다.): 기능성 조성물의 제조-에탄올 추출

(DHE : DanggwiHubaktang extracted with Ethanol)

당귀 0.8g, 후박 0.8g, 양강 2.0g 및 관계 1.2g에 70% 에탄올을 48g을 가하여 실온(21∼23℃)에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하였으며, 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 그리고 그 추출물은 필터 페이퍼(Filter paper)를 이용하여 여과하였으며, 감압 회전 농축 후 -50℃에서 동결건조 하고 -70℃의 냉동보관하였다. 이때 상기 농축은 에탄올 농축기를 이용하여 에탄올을 증발시켜 용매 중 물만 남도록 하여 동결 건조하였다.

비교예1 (이하 'AG W' 라 칭한다.): 당귀의 열수 추출물 제조

(AGW : Angelica Gigas N. extracted with hot Water)

실시예1과 동일하게 실시하되, 약제로서 후박, 양강, 관계를 사용하지 않고 당귀 4.8g만을 사용하였다.

비교예2 (이하 'M OW' 라 칭한다.): 후박의 열수 추출물 제조

(MOW : Magnolia Officinalis R. extracted with hot Water)

실시예1과 동일하게 실시하되, 약제로서 당귀, 양강, 관계를 사용하지 않고 후박 4.8g만을 사용하였다.

비교예3 (이하 'AO W' 라 칭한다.): 양강의 열수 추출물 제조

(AOW : Alpinia Officinarum H. extracted with hot Water)

실시예1과 동일하게 실시하되, 약제로서 당귀, 후박, 관계를 사용하지 않고 양강 4.8g만을 사용하였다.

비교예4 (이하 ' CCW' 라 칭한다.): 관계의 열수 추출물 제조

(CCW : Cinnamomum Cassia P. extracted with hot Water)

실시예1과 동일하게 실시하되, 약제로서 당귀, 후박, 양강을 사용하지 않고 관계 4.8g만을 사용하였다.

비교예5 (이하 'AG E' 라 칭한다.): 당귀의 에탄올 추출물 제조

(AGE : Angelica Gigas N. extracted with Ethanol)

실시예2와 동일하게 실시하되, 약제로서 후박, 양강, 관계를 사용하지 않고 당귀 4.8g만을 사용하였다.

비교예6 (이하 ' MOE' 라 칭한다.): 후박의 에탄올 추출물 제조

(MOE : Magnolia Officinalis R. extracted with Ethanol)

실시예2와 동일하게 실시하되, 약제로서 당귀, 양강, 관계를 사용하지 않고 후박 4.8g만을 사용하였다.

비교예7 (이하 ' AOE' 라 칭한다.): 양강의 에탄올 추출물 제조

(AOE : Alpinia Officinarum H. extracted with Ethanol)

실시예2와 동일하게 실시하되, 약제로서 당귀, 후박, 관계를 사용하지 않고 양강 4.8g만을 사용하였다.

비교예8 (이하 'CC E' 라 칭한다.): 관계의 에탄올 추출물 제조

(CCE : Cinnamomum Cassia P. extracted with Ethanol)

실시예2와 동일하게 실시하되, 약제로서 당귀, 후박, 양강을 사용하지 않고 관계 4.8g만을 사용하였다.

평가예1 : 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 phosphomolybdic acid가 페놀성 물질과 반응하여 청색으로 발색되는 것을 이용한 Folin-Denis법을 통해 측정하였다. 즉, 상기 실시예1, 2 및 비교예1 내지 8 1500㎕에 1N-Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약을 500 ㎕ 가하고 3분간 반응 후 10%의 포화 Na₂CO₃용액 500 ㎕를 가하였다. 이 혼합액을 1시간 반응 후 640nm에서 흡광도를 측정하였으며, tannic acid를 이용하여 표준곡선으로 함량을 구하였다. 이때 그 기기로는 UV/vis spectrophotometer mini 1240 (Shimadzu Co., Japan), ELISA reader (BioTek Co., USA)를 사용하였다.

그리고 그 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 하기 표 1은 열수 추출법에 의해 제조된 것으로, DHW는 42.4㎎ TAE/g의 함량을 나타내었고, 그 중 MOW가 83.5㎎ TAE/g으로 가장 높게 나타났다. 그리고 표 2는 에탄올 추출법에 의한 것으로, DHE는 51.9㎎ TAE/g의 함량을 나타내었고, 그 중 MOE가 83.2㎎ TAE/g으로 가장 높게 나타났다.

실시예1 및 비교예1 내지 4의 폴리페놀 함량 측정결과

구분	Polyphenol contents (㎎ TAE/g)
AGW	16.2
MOW	83.5
AOW	83.2
CCW	57.5
DHW	42.4

실시예2 및 비교예5 내지 8의 폴리페놀 함량 측정결과

구분	Polyphenol contents (㎎ TAE/g)
AGE	15.7
MOE	83.2
AOE	77.8
CCE	78.0
DHE	51.9

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 하나 또는 두개 이상의 수산기로 치환된 방향족환을 가지고 있으며, 이들은 phenolic hydroxyl(OH)기를 가지고 있는데, 이것은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하는 성질이 있기 때문에 항산화 작용과 관련한 생체 free radical 들을 안정된 화합물로 형성하도록 하여 산화 억제 작용을 한다. 또한 충치 예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 따라서 상기 폴리페놀 함량이 높은 것은 산화 억제, 충치 예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항암 등의 생리활성을 가짐을 의미한다.

평가예2 : 항산화 효과 측정

항산화 효과의 측정에 있어, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), pyrogallol, xanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium(NBT), ascorbic acid, butylated hydroxyanisole (BHA)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)의 시약을 사용하였다. Hydroxy peroxide(H₂O₂)은 Junsei Chemical Co.(Japan)의 시약을 사용하였다.

이하 각 시료들을 평가함에 있어, 그 농도를 10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖로 조절하여 평가하였는 바, 농도의 조절은 물을 이용하였다.

(1) 전자공여능 (EDA) 측정

Blois 방법을 변형한 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) free radical 소거법으로 측정하였다. 각각의 DHW와 DHE 100㎕와 99.9% ethanol에 용해한 0.2mM의 DPPH 50㎕를 넣고 교반한 후 암소에 30분 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성으로 하여 항산화 활성도를 나타내었다. 이때 상대 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 BHA를 사용하였다.

전자공여능(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

그리고 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 먼저 도 1은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 전자공여능을 측정한 결과로서, DHW은 50 ㎍/㎖에서 43%, 100 ㎍/㎖에서 61% 500 ㎍/㎖에서 86% 이상의 값을 나타내었다. 그리고 AGW는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서는 10% 미만의 값을 나타내었으나, 500 ㎍/㎖에서 43%, 1000 ㎍/㎖에서 81%의 값을 나타내었다. MOW는 50 ㎍/㎖에서 53%, 100 ㎍/㎖에서 79%, 500 ㎍/㎖에서 88%이상의 값을 나타내었다. AOW는 50 ㎍/㎖에서 52%, 100 ㎍/㎖에서 70%, 500 ㎍/㎖에서 77% 이상의 값을 나타내었다. CCW는 100 ㎍/㎖ 이하에서는 30% 미만의 값을 나타냈으나, 500 ㎍/㎖에서 74% 이상의 값을 나타내었다. 따라서 DHW의 경우 후박과 양강이 전자공여능과 관련된 항산화효과에 관여하는 것으로 사료 된다.

도 2는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 전자공여능을 측정한 결과로서 DHE는 50 ㎍/㎖에서 38%, 100 ㎍/㎖에서 59%, 500 ㎍/㎖에서 89% 이상의 값을 나타내었다. 그리고 AGE는 10 ㎍/㎖에서 100 ㎍/㎖까지 20% 이하의 값을 나타내었으나 500 ㎍/㎖에서 58%, 1000 ㎍/㎖에서 80%로 나타내었다. MOE는 50 ㎍/㎖에서 70%, 100 ㎍/㎖에서 88%, 500 ㎍/㎖에서 91% 이상의 값을 나타내었다. AOE는 50 ㎍/㎖에서 55%, 100 ㎍/㎖에서 77%, 500 ㎍/㎖에서 90% 이상의 값을 나타내었다. CCE는 50 ㎍/㎖에서 51%, 100 ㎍/㎖에서 77%, 500 ㎍/㎖에서 92% 이상의 값을 나타내었다. 따라서 DHE의 경우 후박과 양강이 전자공여능과 관련된 항산화효과에 관여하는 것으로 사료 된다.

상기와 같이, 본 발명의 실시예1과 실시예2의 비교 시, 열수, 에탄올 추출물 모두 유사한 활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이를 BHA와 비교한 결과 BHA는 100 ㎍/㎖에서 86%로 MOE보다 낮은 활성을 보였으며, 500 ㎍/㎖에서 90%로 이농도 이상에서 실시예1, 2 모두 BHA와 유사한 활성을 보여 전자공여능과 관련된 항산화 효능이 높은 것으로 사료된다.

(2) ABTS cation radical 소거능 측정

ABTS^·+ radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS·+ Cation Decolorization Assay방법에 의하여 측정하였다. ABTS(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline -6-sulphonic acid) 7.4mM과 potassium persulphate 2.6mM을 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS^·+ radical을 형성시키며 이 용액은 냉장 보관하였다. radical stock solution은 734 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 몰 흡광계수 (ε = 1.6 × 104mol-1cm-1)를 이용하여 methanol로 희석하였다. 이 stock solution 100㎕에 시료추출 용액 100 ㎕을 가한 후 상온에서 1분 방치하여 734nm에서 반응액의 흡광도 변화를 측정하였다.

ABTS·+ 소거능(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

그리고 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 ABTS·+radical 소거능을 측정한 결과로서, DHW는 50 ㎍/㎖에서 37%, 100 ㎍/㎖에서 53% 500 ㎍/㎖에서 82%, 1000 ㎍/㎖에서 90%로 값을 나타내었다. 또한 AGW는 100 ㎍/㎖이하의 농도에서는 10% 미만의 값을 보였으나, 500 ㎍/㎖에서 32%, 1000 ㎍/㎖에서 44%의 값을 나타내었다. MOW는 50 ㎍/㎖에서 40%, 100 ㎍/㎖에서 50%, 500 ㎍/㎖에서 94%이상의 값을 나타내었다. AOW는 50 ㎍/㎖에서 40%, 100 ㎍/㎖에서 50%, 500 ㎍/㎖에서 93% 이상의 값을 나타내었다. CCW는 50 ㎍/㎖에서 41%, 100 ㎍/㎖에서 80%, 500 ㎍/㎖에서 99% 이상의 값을 나타내었다. 따라서 DHW의 경우 후박, 관계가 ABTS·+ radical 소거능과 관련된 항산화효과에 관여하는 것으로 사료된다.

도 4는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 ABTS·+radical 소거능을 측정한 결과로서, DHE는 50 ㎍/㎖에서 37%, 100 ㎍/㎖에서 56%, 500 ㎍/㎖에서 94% 이상의 값을 나타내었다. 그리고 AGE는 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 10% 이하의 수치를 나타내었으나 500 ㎍/㎖에서 31%, 1000 ㎍/㎖에서 53%로 나타내었다. MOE는 50 ㎍/㎖에서 70%, 100 ㎍/㎖에서 75%, 500 ㎍/㎖에서 95% 이상의 수치를 나타내었다. AOE는 50 ㎍/㎖에서 42%, 100 ㎍/㎖에서 72%, 500 ㎍/㎖에서 96% 이상의 수치를 나타내었다. CCE는 50 ㎍/㎖에서 27%, 100 ㎍/㎖에서 46%, 500 ㎍/㎖에서 94% 이상의 수치를 나타내었다. 따라서 DHE의 경우 후박, 양강이 ABTS·+radical 소거능과 관련된 항산화효과에 관여하는 것으로 사료된다.

상기 DHW와 DHE의 효능을 비교 시 두 추출물은 유사한 효능을 나타내었으며, 이를 BHA와 비교한 결과 BHA는 500 ㎍/㎖에서 98%로, 이농도 이상에서는 DHW와 DHE모두 BHA와 유사한 활성을 보여 ABTS cation radical 소거능과 관련된 항산화 효능이 높은 것으로 사료된다.

(3) Superoxide anion radical 소거능 측정

Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원 방법에 의해 측정하였다. 각 시료용액 100㎕와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7,5) 600㎕에 xanthin(0.4mM)과 NBT(0.24mM)을 녹인 기질액 100㎕를 첨가하고 xanthine oxidase(0.049U/mL) 100㎕를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 1N HCl 1000㎕를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560nm에서 흡광도 측정을 하였다.

소거능(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

그리고 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5는 실시예1 및 비교예1 내지 4의 superoxide anion radical 소거능을 측정한 결과이다. DHW는 10 ㎍/㎖에서 63%, 50 ㎍/㎖에서 78%, 100 ㎍/㎖에서 80% 이상의 수치를 나타내었다. AGW는 50 ㎍/㎖에서 51%, 100 ㎍/㎖에서 67%, 500 ㎍/㎖에서 80%의 수치를 나타내었다. MOW는 10㎍/㎖에서 59%, 50 ㎍/㎖에서 76%, 100 ㎍/㎖에서 82%이상의 수치를 나타내었다. AOW는 10㎍/㎖에서 53%, 50 ㎍/㎖에서 80%, 100 ㎍/㎖에서 81% 이상의 수치를 나타내었다. CCW는 50 ㎍/㎖에서 76%, 100 ㎍/㎖에서 83%, 이상의 수치를 나타내었다. 따라서 DHW의 경우 후박, 양강, 관계가 superoxide anion radical 소거능과 관련된 항산화효과에 관여하는 것으로 사료된다.

도 6은 실시예2 및 비교예5 내지 8의 superoxide anion radical 소거능 측정한 결과로서, DHE는 50 ㎍/㎖에서 54%, 100 ㎍/㎖에서 83%이상의 값을 나타내었다. AGE는 10 ㎍/㎖에서 100 ㎍/㎖까지 30% 미만의 수치를 나타내었으나, 500 ㎍/㎖에서 83%의 값을 나타내었다. MOE는 50 ㎍/㎖에서 64%, 100 ㎍/㎖에서 90% 이상의 값을 나타내었다. AOE는 50 ㎍/㎖에서 77%, 100 ㎍/㎖에서 84% 이상의 값을 나타내었다. CCE는 50 ㎍/㎖에서 40%, 100 ㎍/㎖에서 63%, 500 ㎍/㎖에서 84%의 값을 나타내었다. 따라서 DHE의 경우 후박, 양강이 superoxide anion radical 소거능과 관련된 항산화효과에 관여하는 것으로 사료된다.

또한 본 발명의 기능성 조성물의 용매별 효능을 비교할 시 열수 추출물이 더 높게 나타났으며, DHW와 DHE를 BHA와 비교한 결과 BHA는 10 ㎍/㎖에서 39%로 DHW 보다 낮게 나타났고, BHA가 100 ㎍/㎖에서 84%로 DHE와 유사한 활성을 보여 superoxide anion radical 소거능과 관련된 항산화 효능이 높은 것으로 사료된다.

(4) Hydrogen peroxide(H₂O₂) 소거능 측정

Hydrogen peroxide 저해활성은 Jayaprakasha등의 방법에 의해 측정하였다. 농도별 시료용액 1000㎕와 phosphate-buffer saline (PBS at pH 7.4)에 녹인 40mM hydrogen peroxide solution 2000㎕를 37℃에서 10분간 반응시킨 후 반응액 중에 저해된 hydrogen peroxide의 양을 230nm에서 흡광도를 측정한 후, 이를 합성 항산화 물질인 BHA와 활성을 비교해 보았다.

H₂O₂ 소거능(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

그리고 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

Hydrogen peroxide(H₂O₂) 소거능은 산소의 환원대사물질로서 미토콘드리아나 peroxisome 등의 정상세포로부터 형성되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성되는데, DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 생체막 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 지질을 생성함으로써 생체기능저하 또는 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다.

도 7은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 H₂O₂ 소거능을 측정한 결과로서, DHW는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 20% 이하의 수치를 나타내었으나, 500 ㎍/㎖에서 99%의 수치를 나타내었다. AGW는 모든 농도에서 20% 이하의 수치를 나타내었다. MOW는 100 ㎍/㎖에서 39%, 500 ㎍/㎖에서 96%의 수치를 나타내었다. AOW는 100 ㎍/㎖에서 31% 500 ㎍/㎖에서 100%의 수치를 나타내었다. CCW는 50 ㎍/㎖이하의 농도에서는 10% 이하의 수치를 나타내었고 500 ㎍/㎖에서 100%의 값을 나타내었다. 따라서 DHW의 경우 H₂O₂ 소거능과 관련된 항산화효능은 500 ㎍/㎖ 등에서와 같이 저농도에 비하여 향상된 효과가 있음을 알 수 있다.

도 8은 실시예2 및 비교예5 내지 8의 H₂O₂ 소거능을 측정한 결과로서, DHE는 50 ㎍/㎖에서 54%, 100 ㎍/㎖에서 83%이상의 값을 나타내었다. AGE는 100 ㎍/㎖이하의 농도에서는 20% 이하의 값을 나타내었으나, 500 ㎍/㎖에서 86%의 수치를 나타내었다. MOE는 50 ㎍/㎖에서 67%, 100 ㎍/㎖에서 100%의 값을 나타내었다. AOE 는 10㎍/㎖부터 50 ㎍/㎖까지 20% 이하의 값을 나타내었으나, 100 ㎍/㎖에서 38%, 500 ㎍/㎖ 100%의 값을 나타내었다. CCE는 10㎍/㎖에서 50 ㎍/㎖이하의 농도에서는 20% 이하의 값을 나타내었으나, 100 ㎍/㎖에서 49%, 500 ㎍/㎖에서 100%의 수치를 나타내었다. 따라서 DHE의 경우 H₂O₂ 소거능과 관련된 항산화효능은 500 ㎍/㎖ 등에서와 같이 저농도에 비하여 향상된 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 용매별 효능을 비교 시 열수와 에탄올 추출물은 유사한 활성을 나타내었다. 또한 본 발명의 추출물을 vitamin C와 비교한 결과 vitamin C는 50 ㎍/㎖에서 30%로 MOE보다 낮게 나타내었고 500 ㎍/㎖에서 DHW, DHE와 vitamin C가 100%로 유사한 활성을 보이는 것으로, 저농도에서보다 항산화효능이 있음을 알 수 있다.

(5) MTT 분석을 통한 fibroblast cell(CCRF S-180Ⅱ)의 생존율 측정

본 실험에 이용한 fibroblast cell(CCRF S-180 Ⅱ)의 배양은 한국 세포주은행으로부터 분양받아 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycin(100U/mL)을 첨가한 Dulbeco's modified eagle 's medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

세포 생존율 측정 시약은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), fetal bovine serum(FBS), penicillin/ streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 PAA Laboratories GmbH Co.(Austria) 및 Haemacytometer (Marienfeld, Germany)를 사용하였으며, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphen yl-tetrazoliumbromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)의 시약을 사용하였다.

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. 세포 주인 fibroblast cell(CCRF S-180Ⅱ)을 96 well plate에 0.6～8×103cells/well이 되게 180㎕ 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 20㎕ 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/mL 농도로 제조한 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 용액 20㎕를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:Ethanol(1:1) 150㎕를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포 생존율(%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

DHW와 높은 항산화 활성을 나타냈던 MOW에 의한 fibroblast cell의 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과 도 9와 같이 나타났다. 즉 DHW와 MOW가 H₂O₂에 의한 자극으로 인하여 세포독성을 일으킨 것인지 아님 추출물의 독성으로 인한 세포 독성인지를 확인하기 위하여 측정하였다. 시료의 농도는 높은 활성을 나타났었던 50, 100, 500 ㎍/㎖ 으로 정하여 실행하였다. 그 결과 농도가 증가되더라도 세포의 생존율은 줄어들지 않았으며 오히려 생존율이 증가되는 것으로 확인되어 fibroblast cell에 대한 시료의 독성이 없음을 확인하였다.

(6) MTT 분석을 통한 H2O2를 처리한 fibroblast cell(CCRF S-180Ⅱ)의 세포보호 효과 측정

산화자극에 노출된 fibbroblast cell들의 세포생존도 변화를 확인하기 위해 각 농도의 H₂O2를 분화된 fibbroblast cell들에 30분간 노출시킨 후 세정하고 정상배지로 교환하여 24시간이 경과한 후 사립체의 기능을 반영하는 MTT 분석을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 같은 조건으로 배양되었지만 아무 처리도 하지 않은 세포들을 대조군으로 하였다. 그 중 여러 가지 농도 중 60~70%의 세포생도를 보인 H₂O₂의 농도로 세포에 전처리를 1시간한 후 시료를 농도별로 처리 후 24시간 뒤에 MTT 분석을 하였다.

산화자극원인 H₂O₂를 10~1000 μM의 농도로 처치하여 MTT assay를 측정한 결과는 도 10a와 같다. 도 10a에서와 같이 H₂O₂의 농도가 증가함에 따라 유의한 MTT 환원 감소를 보였다. 즉 H₂O₂ 농도 변화에 대해 농도 의존적인 세포생존도의 감소를 보인 것이다. 여러 가지 농도 중 72%로 60~70%의 세포 생존율를 보인 500 μM H₂O₂ 를 다음 실험을 위한 농도로 선택하였다.

Fibroblast cell의 세포보호효과를 확인하기 위해 500 μM의 H₂O₂ 를 처리하고 1시간 후 항산화능이 아주 우수하였던 MOW와 DHW의 효능을 나타내었던 농도인 50, 100, 500 ㎍/㎖ 각각의 농도와 시료를 처치하지 않은 것을 0 ㎍/㎖이라 정하여 24시간이 지난 후 MTT 분석을 하였다. 결과는 도 10b에 나타내었으며 산화자극원인 H₂O₂ 를 처치했음에도 불구하고 농도 의존적으로 세포생존율이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 세포보호 효과는 DHW가 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

평가예3 : 미백 효과 측정

미백 효과 측정은 mushroom tyrosinase 저해 활성 방법으로 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 500 ㎕에 0.01M L-DOPA을 녹인 기질액 200㎕ 및 시료용액 100㎕의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/mL) 200㎕ 첨가하여 37℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그리고 미백 효과 측정시약인 mushroom tyrosinase, L-3,4-dihydroxyphenyl- alanine(L-DOPA)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약을 사용하였다.

Tyrosinase 저해율 (%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)× 100

피부의 색을 결정하는 주요 인자인 melanin은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포내의 melanosome에서 생합성 되며 시작물질은 아미노산의 일종인 tyrosine이다. Tyrosine은 멜라닌 세포에서 tyrosinase에 의해 L-3,4-dihydroxyl phenylalanine(DOPA), DOPA quinone으로 산화된다. 그 후 DOPAquinone이 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyindole, indole-5,6-quinone이 되고, 이어서 indole-5,6-quinone으로의 중합에 의해 melanin을 생성하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 tyrosinase 활성 저해는 피부 내에서의 melanin polymer 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다.

도 11은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과이다. 모든 약제들은 전체 농도에서 20% 이하의 값을 나타내었다. 도 12는 실시예2 및 비교예5 내지 8의 에탄올추출물 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과로서, DHE는 1000 ㎍/㎖이하의 모든 농도에서 30% 이하의 값을 나타내었으며, AGE는 1000 ㎍/㎖이하의 모든 농도에서 30% 이하의 값을 나타내었고, MOE는 500㎍/㎖이하의 농도에서 30% 이하의 값을 나타내었으나 1000 ㎍/㎖에서 50.2%의 값을 나타내었다. AOE는 10 ㎍/㎖에서 1000 ㎍/㎖까지의 모든 농도에서 20% 이하의 값을 나타내었고, CCE는 1000 ㎍/㎖이하의 모든 농도에서 30% 이하의 값을 나타내었다.

즉, DHE의 tyrosinase 저해 결과 DHW 보다는 높았으나 전체적으로 30% 정도의 수치를 나타냄을 알 수 있다.

평가예4 : 주름개선 효과 측정

주름개선 효과측정은 collagenase 저해활성측정으로 Wunsch 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1M tris-HCL buffer (pH 7.5)에 4mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Pro-D-Arg (0.3mg/mL)을 녹인 기질액 250㎕ 및 시료용액 100㎕의 혼합액에 collagenase(0.2mg/mL) 150㎕를 첨가하여 실온에 20분 방치 후 6% citric acid 500㎕를 넣어 반응 정지시킨 다음 ethyl acetate 1500㎕을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 주름 억제 효과 측정 시약인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, collagenase 및 4-phenylazo benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약을 사용하였다.

Collagenase저해율 (%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) × 100

탄력 섬유인 collagen은 elastin과 함께 망상으로 존재하며 털을 세워주는 기모근과 함께 진피를 지지하고 있으며 지금까지 collagen은 19가지 아형이 알려져 있고 1500개의 아미노산을 구성된 α-chain을 가지는 동종 또는 이종 삼중나선 구조를 형성한다. collagen은 많은 섬유아세포에 의해 생성되며 ECM(extracellular matrix)의 70~80%를 차지하고, 2~4%의 elastin, glycosaminoglycans, 당단백 등과 함께 ECM을 구성한다. 이러한 collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 collagen은 collagenase 에 의해 분해된다는 보고가 있다.

도 13은 실시예1 및 비교예1 내지 4의 collagen 저해활성을 측정한 결과로서, DHW는 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 20% 이하의 값을 나타내었고, 500 ㎍/㎖에서 56%, 1000 ㎍/㎖에서 67%의 값을 나타내었다. AGW는 1000 ㎍/㎖ 이하의 모든 농도에서 10% 이하의 값을 나타내었다. MOW는 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 10%이하의 값을 나타내었으나, 500 ㎍/㎖에서 48%, 1000 ㎍/㎖에서 73%의 수치를 나타내었다. AOW는 100 ㎍/㎖에서 33%, 500 ㎍/㎖에서 71% 이상의 수치를 나타내었다. CCW는 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 10%이하의 수치를 나타내었으나, 500 ㎍/㎖에서 39%, 1000 ㎍/㎖에서 62%의 수치를 나타내었다. 따라서 DHW의 경우 collagenase와 관련된 주름개선 효과는 500 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 효능이 있음을 알 수 있다.

도 14는 실시예2 및 비교예5 내지8의 collagen 저해활성 측정한 결과이다. DHE는 100㎍/㎖이하의 농도에서 30%이하의 값을 나타내었으나, 500㎍/㎖에서 60%, 1000㎍/㎖에서 87%의 값을 나타내었다. AGE는 1000 ㎍/㎖이하의 모든 농도에서 20% 이하의 값을 나타내었다. MOE는 50 ㎍/㎖에서 36%, 100 ㎍/㎖에서 59%, 500 ㎍/㎖에서 96%, 1000 ㎍/㎖ 100%의 값을 나타내었다. AOE는 100 ㎍/㎖에서 38%, 500 ㎍/㎖에서 73% 이상의 값을 나타내었다. CCE는 50 ㎍/㎖에서 59%, 100 ㎍/㎖ 65%, 500 ㎍/㎖에서 73%에서 1000㎍/㎖에서86%의 값을 나타내었다. 에탄올 추출물 중 500㎍/㎖에서 50%이상의 결과로 후박, 양강, 관계가 효능을 나타내었으며, 그 중 MOE가 가장 높은 효능을 나타내었다. 따라서 DHE의 collagenase와 관련된 주름개선 효과도 500 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 효능을 나타냄을 알 수 있다.

평가예5 : 항균 효과 측정

Escherichia coli 및 Staphylococcus epidermidis의 배양을 위한 액체배지로는 nutrient broth를 사용하였고, Staphylococcus aureus의 액체배지로는 tryptic soy broth를 사용하였고, Streptococcus mutans의 액체배지로는 brain heart infusion broth용하였으며, Candida albicans의 액체배지로는 YM broth를 사용하였다. 고체배지는 상기 액체배지에 agar를 첨가하여 본 실험에 사용하였다. 균주는 BOD incubator에서 37℃로 배양하였다.

항균력 측정은 paper disc법을 이용하여 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 백금이로 취해서 액체배지 10㎖에서 18～24시간 배양하여 균배양 시킨 후 다시 액체배지 10㎖에 균액을 0.1㎖ 접종하여 3～6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수가 약 1×107 cells되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 filter paper disc(Tokyo, 8mm, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 50㎕/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18～24시간 배양하여 disc주위의 clear zone(cm)의 직경을 측정하였다.

그리고 항균력 검색 실험에서 사용한 균주는 피부상재균으로서 Staphylococus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Escherichia coli KCTC 1039, Candida albicans KCTC 7965를 한국생명공학연구원 유전자은행에서 분양받아 계대 배양하여 사용하였다. 전배양 및 본배양을 위한 배지는 Nutient Broth, Tryptic soy broth, YM broth 등을 Difco Lab. (Sparks, USA)의 시약을 사용하였다.

실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 8의의 항균 효과를 측정하기 위하여 피부 상재균인 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, candida albicans과 충치균인 Staphylococcus mutans에 대한 clear zone 형성을 관찰한 결과는 하기 표3과 같았다.

상기 표 3에서와 같이 DHW와 MOW는 2 mg/disc의 농도로 Staphylococcus aureus에 clear zone이 각 1.12cm, 1.17cm로 형성됨을 확인할 수 있으며, 따라서 DHW는 Staphylococcus aureus에 효과가 있는 것으로 사료된다.

평가예6 : 추출물을 첨가한 화장품의 안정성 및 안전성 측정

열, 빛, 공기 등에 민감한 생리활성 성분들은 입자간의 강한 인력으로 인해 입자 및 그 입자에 안정화된 약리 물질들이 유리되고, 난용성 물질이 재결정되어 석출되고, 열이나 공기에 의해 산화되므로 제형에 영향을 끼칠 수 있으므로 안정성 관찰이 필요하다.

하기의 Cream 제조 및 안정성 실험에 사용된 기기는 광학현미경 (Olympus optical. Co., Japan), pH meter(Metrohm 691, Metrohm Ltd., Switzerland), Viscometer(Brookfield Co., USA), Agi mixer(Daihan Scientific Co., Korea), Homo mixer(PRIMIX Co., Japan), Cycle chamber(Hanbaek Co., Korea), Incubator (Hanbaek Co., Korea), Korea)등을 사용하였다.

피부 안전성 실험에는 Finn chamber on scanpor(Epitest Ltd., Finland)을 사용하였다.

(1) Cream 제조 및 현미경관찰

DHW와 DHE를 앞서 실험한 생리활성 결과를 토대로 뛰어난 활성을 나타내는 농도인 500 ㎍/㎖로 Cream에 첨가하여 제조하였는 바, 본 발명의 기능성 조성물이 함유된 cream은 하기 표 4와 같은 조성으로서 도 15의 공정에 따라 제조하였다. 먼저 수상인 A상과 오일과 유화제가 혼합되어있는 유상인 C, D, E 상을 나누어 90℃까지 가온시킨다. 그리고 수상인 A상에 점증제상인 B상을 투입하고 C상에 D, E 상을 투입하여 두 상이 90℃까지 가열한 후 두 상을 homo mixer를 이용하여 3000 ~ 3500 rpm에서 8분간 유화 후 45℃까지 hand mixing 하면서 냉각시킨다. 여기에 시료상인 F상을 넣고 25 ℃까지 hand mixing 하여 제조한다. 이때 상기 시료상인 F 상은 DHW와 DHE를 각각 사용하여 2종류의 크림을 제조하였다. 이하 DHW를 포함하는 크림을 'DHWC(Cream containing DanggwiHubaktang with hot Water)'라 하고, DHE를 포함하는 크림을 'DHEC(Cream containing DanggwiHubaktang with Ethanol)'라 한다. 또한 비교를 위해 동일하게 제조하되, DHW와 DHE를 제외하고 제조한 무첨가 크림(control cream)을 제조하였다.

크림의 조성물 및 그 배합량

Phase	INCI name	Quantity(g)
A	D.I. water	69.35
A	lycerin	5.00
A	D-Pantothenyl alcohol	0.10
A	Tetrasodiumethylenediaminetetraacetate	0.05
B	D.I. water	10.00
B	1,3- butylene glycol	3.00
B	Xanthan gum	0.12
C	Stearic acid	1.50
C	Glygeryl stearate/PEG-100 stearate	1.50
C	Ceteraryl alcohol/ ceteareth-20	1.50
C	Polyoxyethylenestearylether	0.70
C	aprylic/capric/stearic triglyceride	1.50
C	Methylpolysiloxane	1.00
D	Cethanol	1.50
D	DS-phytosphingosine	0.10
E	2-octyldodecanol	2.00
E	Lecithin	1.00
F	DHW or DHE extract	0.05
Total		100

상기와 같이 제조된 크림의 입자의 형태와 크기 확인하기 위하여 광학 현미경 (Olympus BX51 , Japan)을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과는 도 16a 내지 16c와 같이 나타났다. 그리고 제조 후 58일 동안 분리, 응집 침전 현상이 나타나지 않았다. 도 16a 내지 16c에서와 같이 DHW와 DHE가 크림의 입자 형태에 영향을 끼치지 않았다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) pH 측정

화장품의 pH는 피부표면의 pH 영역인 약산성과 중성에 맞추어져 있다. 피부가 알칼리성이 되면 저항력이 약해지고 세균 번식에 의해 피부병이 생기기 유리하여 피부에는 중성 또는 약산성 화장품을 사용하는 것이 좋다. 또한 pH의 변화가 크지 않고 안정해야 한다.

DHW 또는 DHE가 함유된 cream을 pH meter(Metrohm 691, Metrohm UK Co., Switzerland)를 이용하여 cream의 pH를 측정하였다. 측정하기 전에 유리전극은 미리 염기성 완충액이나 증류수에 수 시간 담구고 pH meter 전원에 연결하고 10분 이상 두었다가 사용하였다. 검출부는 증류수로 잘 씻어 가볍게 닦아 낸 다음 사용하였다. 온도에 따른 pH 변화가 크기 때문에 측정하기 전 시료들의 똑같은 조건을 맞추어 주기 위하여 3시간 이상 25℃에 보관 후 측정하였다.

DHW, DHE를 각각 첨가한 두 크림의 pH를 측정결과는 도 17과 같이 나타났다. DHWC의 경우 pH 측정값이 평균 5.4로 나타내었으며 DHEC의 경우에는 평균 5.3으로 나타내었다. 또한 도 17과 같이 시간이 지나도 pH의 변화가 크게 나타나지 않았으며 온도에 대한 pH변화도 크게 나타나지 않아 DHWC 또는 DHEC는 pH에 대하여 안정함을 확인할 수 있었다.

(3) 점도 측정

점도 측정은 brookfield viscometer LVDV-Ⅱ+(Brookfield Engineering Laboratories, Inc., USA)를 이용하여 점도를 측정하였다. 점도는 cream을 측정하기 전에 25℃에 3시간 이상 보관 후 spindle NO.4를 이용하여 RPM 6.0으로 1분간 측정하였으며 3회 반복하였다. 점도도 pH와 같이 온도에 따른 변화가 크기 때문에 측정 시료들을 3시간 이상 25℃에 보관 후 측정하였다.

본 실험에 사용된 Brookfield viscometer는 비뉴톤 유동적 점성액체의 점도를 측정하는 방법으로서, 점성액을 일정한 가속도로 회전하는 로우더 (spindle)에 움직이는 액의 점성저항을 용수철로 검출하여 점도를 환산한다. 로우더(spindle)의 종류 및 회변수는 가변으로 되어있어 액체에 적합한 것을 사용한다. 점도 단위는 cP를 사용하였다.

DHWC 및 DHEC의 점도를 Brookfield LV-Ⅱ Digital viscometer로 측정한 결과는 도 18과 같았다. 크림 제조 후 부터 58일까지 점도는 DHWC의 경우 평균 약 36000 cP로 측정되었고 DHEC의 경우 평균 약 34000 cP로 측정되었으며 7일전 까지는 점도의 변화가 그림과 같이 크게 구분되나 14일 이후부터는 서서히 안정됨을 확인하였다.

(4) 온도에 따른 안정성 측정

DHWC 및 DHEC의 온도(Incubation)에 따른 안정성 시험법은 온도 조건 (0, 25, 40℃)에 보관하여, 경시적 변화에 따른 상태변화를 표 5와 같이 육안으로 평가하였다.

온도에 따른 안정성 측정방법

Temp.	Period (day)	Check points
0℃ 25℃ 40℃	1 3 5 7 15 28 56	Separation Precipitation Discoloration Creaming deterioration Viscosity pH

화장품의 물리, 화학적 변화를 알아보기 위해서 온도 안정성 평가를 실시한 결과를 하기 표 6과 같이 나타내었다. 하기 표 6에서와 같이, 0, 25, 40℃의 온도에 보관한 DHWC, DHEC는 56일 동안 모든 온도 조건에서 안정성을 나타내었다. 그리고 고온(40℃)에서는 외관의 산패, 변색, 변취, 점도, 증발, 부유, 침전, 탁도(투명도), 분리 등에 대하여 관찰을 하였으며, 저온(0℃)에서는 응고, 침전, 탁도(투명도), 결정, 석출, 분리 등의 물리, 화학적 변화에 대하여 관찰하였는 바, DHWC, DHEC 모두 56일 동안 아무런 경시적, 물리, 화학적 변화없이 안정함이 확인되었다.

DHWC, DHEC의 온도에 따른 안정성 측정 결과

Day	1	3	5	7	14	28	56
0℃	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable
25℃	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable
40℃	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable

(5) 온도순환(Cycle chamber)에 따른 안정성 측정

우리나라는 사계절 구분이 뚜렷하므로 연간이나 일간의 온도변화를 고려한 상태를 만들기 위해 다양한 온도를 정하여 이를 반복하는 cycle 온도 실험을 실시하였다. 도 19와 같이 -15℃, -10℃, -5℃, 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 37.5℃, 40℃의 온도로 각각 24시간 보관 후 이를 1 cycle로 하여 10회 반복 시행하여 온도 순환에 따른 안정성 시험을 하였다.

DHWC와 DHEC를 -15, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 25, 37.5, 40℃에서 각각 24시간 보관한 후 온도 순환에 따른 안정성을 관찰한 결과를 하기 표 7과 같이 나타내었다. 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 10cycle 모두에서 상의 분리와 변색, 변취 없이 안정함을 육안으로 확인할 수 있었다.

DHWC, DHEC의 온도순환에 따른 안정성 측정 결과

Cycle	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Stability	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable	Stable

(6) 광안정성 측정

인공광 (Artificial Sun lamp) 노출 시험

투명 용기에 크림을 담아 sun lamp WL-610(Labtron Co., Korea)에 넣은 후 기내 온도는 40℃, 광원과의 거리는 20cm로 조절하여 인공 UV 조사 후 3시간 동안의 변색, 발색, 변취, 응집, 산패 등의 변화를 관찰하였다.

DHWC 와 DHEC의 인공광에 대한 안정성을 실시한 결과는 표 8과 같았다. 하기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이 0. 5, 1, 2, 3시간 동안의 변색, 변취, 산패, 분리 등의 변화를 육안으로 관찰하였는데 모두 안정함을 나타내었다.

DHWC 와 DHEC의 인공광에 대한 안정성 측정 결과

Condition	Temperature : 40℃ Distance from light source : 20cm Storage 3 hours
Stability	30min	1hr	2hr	3hr
	Color unchanged	Color unchanged	Color unchanged	Color unchanged

자연광 노출

화장품은 출시 후 직접 또는 간접적으로 태양광과 형광등의 빛에 노출되어 변색되는 등 물리, 화학적으로 품질의 특성이 변하는 것을 사전에 조사하여 미연에 방지키 위하여 광안정성 실험을 실시하였다.

DHWC 와 DHEC를 투명용기에 담아 햇빛이 잘 드는 실외에 보관하여 7, 14일 동안의 변색, 발색, 변취, 응집, 산패 등의 변화화를 관찰한 결과를 하기 표 9에 나타냈다. 표 9에서 확인한 바와 같이, DHWC 와 DHEC는 색변화와 냄새 변화 없이 안정함을 보였다.

DHWC 와 DHEC의 자연광에 대한 안정성 측정 결과

Sample	Concentration (㎍/㎖)	7 day	15day
Control cream	0	Color unchanged	Color unchanged
DHWC	500	Color unchanged	Color unchanged
DHEC	500	Color unchanged	Color unchanged

(7) 첩포 시험을 통한 cream 안전성 측정

DHWC와 DHEC의 안전성 실험인 첩포실험은 표 10과 같은 국제 접촉피부염 연구위원회의 기준으로 판정하였다. Finn chamber(on Scanpor tape)에 cream을 도포 후 등의 상부에 수직으로 부착하여, 24시간 후 피부의 반응을 확인하였다.

국제 접촉피부염 연구위원회의 첩포실험 기준

Recording	Interpretation
?	Doubtful reaction : faint macular erythema only
+	Weak (non-vesicular) positive reaction : erythema, infiltration, possibly papules
++	Strong (vesicular) positive reaction : erythema, infiltration, papules, vesicles
+++	Extreme positive reaction : bullous reaction
-	Negative reaction

본 실험은 남, 여 대학생 20명을 대상으로 실시하였으며, 그 결과는 하기 표 11과 같았다. 판정시간은 24시간 후에 첩포를 벗겨내고 국제 접촉 피부염 연구회의 기준으로 피부과 전문의와 측정한 결과 모두 음성반응을 보였다.

DHWC 와 DHEC의 첩포실험 결과

Group	No. of patch tested	24hour
Female Male	20	Negative

평가예7 : 추출물을 첨가한 화장품의 보습효과

상기 평가에6을 통해 제조한 DHWC와 DHEC의 보습효과를 측정하였다.

상기 보습효과 측정을 위하여 접촉 피부염이 없고 피부질환이 없다고 판정된 건강한 대학생 남·여 실험자 10명을 대상으로 경피수분증발량 측정기(회사명: Dermalab USB, 모델명: TEWL application module)과 피부수분 측정기 (모델명: Moisture application module)을 이용하여 크림의 보습효과를 측정하였다. 실내온도 25℃, 상대습도 45% 이하에서 측정을 시행하였으며, 5cm×8cm크기의 직사각형을 3군데(무첨가 크림, DHWC, DHEC) 표시를 하고 동일 부위에 피부 상태를 측정한 후 동일한 양으로 시료를 도포 후 3시간 뒤 측정하였다.

경피수분손실률은 값이 클수록 경피에 수분 증발량이 큰 것을 의미하여 건조하고 보습력이 떨어진 상태를 의미하는 것으로, 시료 도포 전과 도포 후의 값을 뺀 값을 표 12에 나타내었다. 하기 표 12에서와 같이 경피수분 시료 3개 모두 경피수분손실의 감소를 보였으며, 그 중 DHWC와 DHEC가 유사한 측정치로 높은 차이를 보여 경피수분손실률을 감소시켜 DHWC와 DHEC가 더 높은 보습효과를 보이는 것으로 사료된다.

DHWC 와 DHEC의 경피수분손실(TEWL)률의 차

실험자	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	합계
Control cream	0.5	0.1	0.5	0.2	0.7	0.4	0.9	0.2	0.3	0.6	0.44
DHWC	1.8	4.5	0.4	2.1	0.9	1.8	2.4	1.6	1.2	0.8	1.75
DHEC	2.2	1.9	1.7	1.9	1.7	1.2	2.5	2.0	1.7	1.1	1.79

피부수분측정을 하여 보습력이 얼마나 증대되었는지 확인하기 위해, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.이번에는 시료 도포 후 측정값이 증가하여 도포 후와 도포 전을 뺀 값을 표 13에 나타내었다. 그 결과 DHWC와 DHEC는 도포 전과 도포 후 큰 차이를 보이나 세 가지 시료 모두 유사한 측정치를 나타냄을 확인할 수 있었다.

DHWC 와 DHEC의 피부수분측정량 차(측정 값=도포 후-도포 전)

실험자	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	합계
Control cream	41	103	121	50	68	78	64	90	41	74	73.00
DHWC	88	64	66	90	72	64	85	83	74	99	78.50
DHEC	67	114	92	103	80	77	68	87	55	47	79.00

상기한 실험을 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기능성 조성물은 우수한 항산화효과를 가지며, 충치균에 유효한 효과를 가질 뿐 아니라, 피부재생 및 혈액순환효과가 우수하고, 보습력이 우수한 것으로서, 다양한 산업분야에의 활용이 가능하다.

한편, 본 발명을 상기한 실시예에 한하여 설명하였지만 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다.

Claims (7)

1. 당귀 100중량부에 대하여, 후박 50∼150중량부, 양강 200∼300중량부 및 관계 100∼200중량부가 포함되어 추출된 유효조성물을 포함하는 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 유효조성물은,
   상황, 감초 및 알로에로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상의 약재가 포함되어 추출된 것인 화장료 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 유효조성물은 상기 당귀, 후박, 양강 및 관계의 열수추출물 또는 에탄올 추출물인 것인 화장료 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 유효조성물은 상기 열수추출물 또는 상기 에탄올추출물이 여과, 농축 및 동결건조된 것인 화장료 조성물.
   
5. 삭제
6. 당귀 100중량부에 대하여, 후박 50∼150중량부, 양강 200∼300중량부 및 관계 100∼200중량부가 포함되어 추출된 유효조성물을 포함하는 구강청결용 조성물.
   
7. 당귀 100중량부에 대하여, 후박 50∼150중량부, 양강 200∼300중량부 및 관계 100∼200중량부가 포함되어 추출된 유효조성물을 포함하는 모발용 화장료 조성물.

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