KR101382112B1 - 편백다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 편백다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 편백다당체를 함유함으로써 콜라겐의 생성을 촉진하여 피부 탄력 및 주름을 개선하고 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 각질 형성 세포 분화를 촉진하여 피부 보습력을 향상시키고 항염증 및 피부 재생 효과가 우수한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

편백다당체, 항노화, 주름 개선, 탄력 개선, 미백, 보습, 항염증, 피부재생

Description

편백다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물{Composition of skin external application containing Chamaecyparis obtusa polysaccharide}

본 발명은 편백다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 편백다당체를 함유함으로써 콜라겐의 생성을 촉진하여 피부 탄력 및 주름을 개선하고 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 각질 형성 세포 분화를 촉진하여 피부 보습력을 향상시키고 항염증 및 피부 재생 효과가 우수한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하게 되고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가되고, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙하게 안 좋게 되고, 피부트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산, 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유 라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 노화가 진행되거나 자외선에 의해서, 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는, 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시게나제-2(COX-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있는 것이 현실이다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이 중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 과색소 침착에 대한 개선 및 미용상 문제를 해결하고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피 부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

피부(skin) 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은, 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리, 화학적 자극인자)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 그 기능을 유지할 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(Stratum corneum, horney layer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질 세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다. 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 「표피 세포의 분화」 또는 「각화(keratinization)」라고 부른다. 각화과정 중에 각질형성세포는 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여, 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다.

그러나 이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목욕 등의 생활 습관적 요소나, 건조한 대기, 오염물질 등의 환경적인 요인, 그리고 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제적으로 현대 에 들어서 더욱 늘어난 여러 요인들로 인해 최근에는 건조피부증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 인간이 점점 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 적절한 피부수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분손실을 방지하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유능력이 있는 여러 종류의 보습제(moisturizer)가 개발되어 주로 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.

그러나, 생활환경 중에 인간에 대한 위해 요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나면서, 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)가 늦어지고, 각질형성세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로써, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는 상태, 즉 피부장벽기능이 와해된 상태의 피부를 갖고 있는 인간들이 점점 증가하는 추세에 있다.

이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피, 건선 등의 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 이러한 질환들은 수분보유기능만을 갖는 통상적인 보습제만으로는 그 증상을 약간 완화시킬 수는 있으나, 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이다.

피부 질환은 사람을 포함하는 동물의 피부에서 나타나는 모든 이상소견을 의미한다.　그 중, 염증성 피부 질환이란 피부 상피 내에 일련의 염증 반응을 일으키는 다양한 자극 요인들로 인해 가려움, 부종, 홍반, 벗겨짐 등과 같은 일련의 임상적 징후와 증상이 유발되는 질환을 의미한다.　

염증성 피부 질환으로는 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부 염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhoic dermatitis), 여드름 등이 알려져 있다.

현재까지는 상기와 같은 염증성 피부 질환의 치료를 위해 주로 항히스타민제, 비타민 연고, 부신피질호르몬제가 사용되고 있으나, 그 효과가 일시적인 경우가 대부분이고 부작용이 심한 경우도 많다.

그리고 피부는 외부로부터 신체를 보호하는 방어막으로서 역할을 한다. 피부에 상처가 생기면 생체의 자연 치유 작용에 의해 상처자리를 혈액이 채우게 되고 혈소판의 과립감소와 하게만 인자(hageman factor)의 활성화가 시작되어 상처 치유 과정이 진행된다. 혈액의 응고는 임시 방어 작용으로서, 노출된 상처 조직들을 보호하고 치유 과정 동안 세포들이 이동할 수 있는 기반을 제공한다(Lee SH AS, Jung SG. Skin Barrier. Seoul: Ryo Moon Gak, 2004).

상처치유 과정은 크게 염증기, 재상피화기, 증식기 및 성숙기의 4단계로 구분된다. 염증기 동안에는 상처 자리에 면역 세포들이 출현하는데, 이 세포들은 혈관으로부터 상처 부위로 이동한 것이다. 이어 과립조직 형성을 유도하는 성장인자와 신호전달 물질들이 분비된다. 중대한 감염이 없는 상태에서는 염증기가 일반적으로 짧게 진행된다(Care KRGf.Advances in wound Care. Seoul: Korea Medical Book Publisher, 2002). 염증기는 상처치료 과정에 꼭 필요한 단계이다.

증식기는 재상피화기와 비슷하게 일어나게 되는데 상처 부위에서 과립 조직들이 형성되는 특성을 나타낸다(Kubo KKY. Spongy matrix of hyaluronic acid and collagen as a cultured dermal substitute: evaluation in an animal test. J Artif Organs 2003;6(1):64-70). 과립조직들은 섬유아세포(fibroblasts) 및 염증성 세포(inflammatory cells)와 함께 미성숙 콜라겐(immaturity collagen), 피브로넥틴(fibronectin) 및 히알루론산(hyaluronic acid) 등의 세포외기질 구성요소들의 조합으로 이루어져 있고 이 과립조직들이 상처부분을 빠르게 채우고 조직적인 구조를 갖추는 것이 상처치료에 중요하다. 벗겨진 상처 표면이 각질형성세포(keratinocytes) 층에 의해 덮이면서 새로운 표피가 생성되고 상피층이 재건되게 된다. 세포들은 상처 가장자리 또는 남겨진 피부의 진피 잔여물에서 상처를 통하여 떠올라 딱지 아래와 살아있는 결합 조직 위를 통하여 이주를 시작한다.

상처의 재상피화가 완료되면 결합조직의 증가와 재편성을 통해 상처 면적이 감소되는 일련의 과정들이 진행되게 된다. 그 후, 성숙기 동안에는 회복기 조직의 엉긴 세포들과 모세혈관들이 조금씩 사라지게 되는데 이런 조직들이 과형성되거나 정상적으로 분해되지 않을 경우 흉터가 생기게 된다. 이것이 일반적인 상처치료 과정이다. 상처 치유과정에서는 상처를 빠르게 치료하는 것뿐만 아니라 부작용이나 흉터 없이 치료하는 것이 중요하기 때문에 염증의 억제와 성장 인자들의 발현 조절을 통해 조직세포들이 균형 있게 채워져 나가는 것이 더욱 중요하며, 이러한 효능을 가지는 물질을 찾고자 하는 노력이 계속 진행되고 있다.

편백에 대한 연구는 편백 정유에 함유되어 있는 피톤치드 성분의 효과에 집중되어 있다. 피톤치드란 식물을 의미하는 '피톤(phyton)'과 죽인다는 의미를 갖는 '치드(cide)'의 합성어로서 식물성 살균소라고도 하고 나무가 갖는 특유의 향으로 “삼림향” 그 자체라 할 수 있다. 이는 식물이 병원균, 해충, 곰팡이에 저항하려 고 내뿜거나 분비하는 물질로서, 삼림욕을 통해 피톤치드를 마시면 스트레스가 해소되고 장과 심폐기능이 강화되며 살균작용도 이루어진다. 이러한 피톤치드는 테르펜을 비롯한 페놀 화합물, 알칼로이드 성분, 글리코시드 등으로 구성되어 있어 유기용매를 이용하여 추출이 가능한 물질이다. 그러므로 편백나무의 피톤치드는 편백나무에서 추출한 편백정유에 함유된다.

일반적인 편백추출물을 함유하여 피부 상태를 개선하는 화장료 조성물로 이용된 사례가 있었으나, 편백다당체 및 이의 항노화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 건조 질환의 예방 및 개선, 항염증, 피부 재생 등의 효능에 대해서는 알려지지 않은 상황이다.

이에, 본 발명자들은 외부의 유해 환경이나 자외선으로부터 피부를 보호하여 피부 노화를 방지하고 피부 상태를 개선시킬 수 있는 성분을 찾기 위해 노력한 결과, 피부 외용제 조성물에 유효성분으로 편백다당체를 포함하는 경우 피부 탄력과 주름 개선, 미백, 보습, 염증 반응 억제 및 피부 재생 효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 편백다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 편백다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 편백다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물은 콜라겐의 생성을 촉진하고 멜라닌 생성을 억제하며 각질 형성 세포의 분화를 촉진하고 피부 염증 반응과 피부 자극을 개선함으로써 항노화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 건조 질환의 예방 및 개선, 항염증, 피부 재생 등의 피부 트러블 예방 또는 개선 효과가 매우 우수하다.

본 발명은 편백(Chamaecyparis obtusa) 다당체를 유효성분으로 함유하는 피 부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 편백은 측백나무과 상록교목으로서, 높이는 50m, 지름 2m에 달하며, 노송나무라고도 한다. 가지가 수평으로 퍼져 원뿔모양의 수관(俊冠)을 형성하고, 나무껍질은 적갈색이며 세로로 갈라져서 벗겨진다. 곧게 자라 목재의 용도가 매우 넓으며, 주로 건축재, 토목재, 배 또는 조각재 등에 사용되고 있다.

본 발명의 유효성분인 편백다당체는 콜라겐의 생성을 촉진하고 MMP-1의 발현을 억제하여 피부 노화를 막고 피부 주름과 탄력을 개선한다. 또한, 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 우수하고 각질 형성 세포의 분화를 유도함으로써 피부 보습력을 증가시켜 피부 건조 질환을 예방 및 개선할 뿐만 아니라, 염증 반응 유발 인자에 의해 유도된 사이클로옥시게나제-2의 생합성을 억제하여 피부 염증과 자극을 줄이고 피부 트러블을 완화하는 효과가 우수하다.

따라서, 본 발명의 편백다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물은 항노화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 아토피 등의 피부 건조 질환의 예방 및 개선, 항염증, 피부 재생 등의 피부 트러블 예방 또는 개선 용도로 매우 유용하다.

일반적인 편백 추출물은 물 또는 에탄올 수용액 등으로 편백의 다양한 성분을 추출한 혼합 추출물로서, 이에 포함된 엽록소 등으로 인하여 피부 외용제 조성물에 사용시 변색이나 색소 침착 등의 문제를 야기시킨다. 하지만 본 발명의 편백다당체는 편백 추출물에 특수한 분리 공정을 적용함으로써 주로 다당체로만 이루어져 있기 때문에 상기 편백 추출물의 문제점을 해결할 수 있다.

본 발명의 편백다당체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 제조 방법은 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 예를 들면, 건조된 편백잎에서 엽록소를 제거하기 위해서 용매 추출 방법을 사용한다. 추출 용매로는 헥산, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 화장료 적용시 잔존양으로 야기될 수 있는 독성 문제를 방지하기 위해서 에탄올을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

건조된 편백잎에 상기 용매를 넣고 상온에서 충분히 교반한 후, 원심분리를 통해 엽록소가 용해되어 있는 용매를 제거한다. 얻어진 편백잎 잔사를 건조하면 엽록소가 함유되지 않은 편백잎을 얻을 수 있다.

상기에서 제조된 편백잎 잔사로부터 수용성 활성성분을 추출하기 위해 열수 추출시킨다. 열수 추출은 30~40℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 이는 40℃ 초과시 고온으로 인하여 열변성이 생길 수 있으며, 30℃ 미만일 경우는 다당체가 충분히 추출되지 않기 때문이다. 또한, 열수 추출 시간은 6~8시간이 바람직하다. 이는 8시간 초과시 미생물에 의한 오염이 발생할 수 있고, 6시간 미만이면 다당체가 충분히 추출되지 않기 때문이다. 열수 추출하여 얻어진 추출액은 여과 기기를 이용하여 여과한 후 감압 농축한다.

상기 열수 추출물에서 다당체만을 분리하기 위해서 한외여과 및 에탄올 침전 반응을 수행한다. 다당체는 10만 달톤(dalton) 이상의 분자량을 갖고 있으며, 이는 유리 단백질의 분자량보다 훨씬 큰 값이다. 이러한 분자량의 차이를 이용하여 한외여과를 수행함으로써 편백다당체의 함량을 증가시킬 수 있다. 또한, 한외여과는 연 속식 공정으로서 저분자량 물질의 분리 및 여과액의 농축을 동시에 진행할 수 있을 뿐만 아니라, 공정이 상온에서 이루어지기 때문에 열변성의 문제가 발생하지 않는다는 장점을 갖는다.

이어서, 상기 한외 여과 농축액에 에탄올을 서서히 가해 에탄올 침전 반응을 진행한다. 이때, 에탄올의 첨가속도는 100~200㎖/min이 바람직하고, 200㎖/min를 초과하면 최종 생성 입자의 크기가 너무 커지거나 뭉칠 수 있다. 에탄올 침전 반응이 완료되면 에탄올을 제거하고, 얻어진 편백다당체를 40~50℃에서 진공 건조하면 파우더 형태의 편백다당체를 얻을 수 있다.

본 발명의 편백다당체는 피부 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 그 함량이 0.001중량% 미만이면 효과가 미미하여 활성성분으로서의 작용을 기대하기 어렵고, 10중량%를 초과하면 제형 안정성에 문제가 생길 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 화장품의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장품은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

본 발명의 편백다당체를 포함하는 피부 외용제는 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은, 로션, 크림, 연고 또는 젤 등으로 제형화될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 경피 투여되는 것이 바람직하다.

상기 약제학적 조성물의 유효성분인 편백다당체의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적으로 투여량은 대략 0.0001mg/kg/일 내지 2000g/kg/일 범위이다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예들에 의해 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 편백다당체의 제조

건조된 편백잎(1kg)에 에탄올(10ℓ)을 첨가하여 상온에서 24시간 동안 교반 한 후, 원심분리를 통해 용매를 제거하였다. 제조된 편백잎 잔사를 30℃에서 7시간 동안 열수 추출하고, 얻어진 열수 추출액은 필터프레스기기를 이용하여 여과(규조토 여과) 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10이 되도록 50℃에서 감압 농축하였다. 이어서, 상기 농축액을 한외여과(분자량 CUT OFF: 1,000달톤)하여 저분자량의 유리 단백질을 제거하고, 최종 한외 여과 농축액의 5배 부피의 에탄올을 100㎖/min의 속도로 서서히 가하여 에탄올 침전반응을 진행하였다. 침전된 편백다당체를 45℃에서 진공 건조하여 파우더 형태의 편백다당체(53g)를 얻었다.

[시험예 1] I형 프로콜라겐 생성 분석(Type I Procollagen assay)

인간 정상 섬유아세포를 10⁵개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 제조예 1에서 얻은 편백다당체를 1ppm, 10ppm, 50ppm의 농도로 포함하는 배지로 교체하였다. 양성 대조군으로 TGF-β(Human Transforming Growth Factor-β1, Roche Co.)를 사용하였다. 배양 3일째 세포를 수확해서(harvest) ELISA 방법으로 생성된 I형 프로콜라겐(type I procollagen)의 양을 정량하였다. 상기 편백다당체를 포함하지 않은 대조군의 프로콜라겐의 양을 0, 양성 대조군은 100으로 설정하고 각 측정값과의 비교치를 산출하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

구분	Ⅰ형 프로콜라겐 생합성(%)
음성 대조군	0
편백다당체 (1ppm)	2
편백다당체 (10ppm)	12
편백다당체 (50ppm)	21
TGF-β (10ng/㎖)	100

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 인간 정상 섬유아세포 단층 배양 시스템(Normal human fibroblast monolayer culture system)에서 편백다당체는 음성 대조군과 비교하여 I형 프로콜라겐 생성을 농도 의존적으로 촉진시켰다. 따라서, 본 발명의 편백다당체는 콜라겐 생성을 촉진함으로써 인체 피부의 노화에 의해 발생하는 콜라겐의 감소 현상을 완화시켜 항노화 효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 2] MMP-1 생합성 억제 분석

인간 정상 섬유아세포를 10⁵개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 자외선 B를 40mJ/cm²로 조사한 후, 제조예 1에서 얻은 편백다당체를 1ppm, 10ppm 및 50ppm으로 포함하는 배지로 교체하였다. 배양 2일째 세포를 수확해서(harvest) ELISA 방법으로 생성된 MMP-1(matrix metalloproteinase I)의 양을 정량하였다. 양성 대조군으로는 레티노익산(Retinoic acid; RA, Sigma. 미국)을 사용하였다. 시험물질을 포함하지 않고 자외선을 조사하지 않은 대조군을 100으로 하여 측정한 값과의 비교치를 산출하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

구분	MMP-1 생합성(%)
UV 조사하지 않음(대조군)	100
UV 조사	152
UV 조사 + 편백다당체 (1ppm)	145
UV 조사 + 편백다당체 (10ppm)	134
UV 조사 + 편백다당체 (50ppm)	105
UV 조사 + RA 10μM	45

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 인간 정상 섬유아세포 단층 배양 시스템에서 편백다당체는 자외선 B에 의해서 유도되는 MMP-1의 생합성을 유의적으로 억제하였다. 또한, 상기 편백다당체를 50ppm의 농도로 처리한 경우에는 UV를 조사하지 않은 대조군과 유사한 수준까지 MMP-1 생합성을 억제하였다.

따라서, 본 발명에 의한 편백다당체는 내적 노화 또는 외적 환경요인에 의하여 발생하는 피부조직 분해효소인 MMP-1의 생합성을 저해함으로써 피부 기질이 파괴되고 얇아지는 피부 노화의 제반 증상을 예방하고 피부 내 콜라겐 감소를 억제하여 피부 주름을 개선함을 알 수 있다.

[시험예 3] 인체피부를 대상으로 한 피부주름 개선 효과

30~50세의 안면주름이 있는 시험 대상자 40명에 대하여 하기 표 3에 기재된 조성의 편백다당체를 함유한 영양크림(실시예 1) 및 편백다당체를 함유하지 않는 영양크림(비교예 1)을 이용하여 피부 주름 개선 효과를 비교 평가하였다.

성 분	실시예 1 (중량%)	비교예 1 (중량%)
편백다당체(제조예 1)	0.1	-
밀납	10	10
폴리솔베이트60	1.5	1.5
피이지 60 경화피마자유	2	2
솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
유동파라핀	10	10
스쿠알란	5	5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 (Estasan: Uniqema(제조사))	5	5
글리세린	5	5
부틸렌글리콜	3	3
프로필렌글리콜	3	3
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	잔량	잔량

실험은 피검자의 안면 좌부에는 실시예 1, 안면 우부에는 비교예 1을 3개월간 도포하도록 하였다. 영양크림 사용전의 안면 양쪽부의 피부 상태를 측정해 놓은 다음, 사용 3개월 후 동일 부위에서의 피부 상태를 재측정하여 피부 주름의 변화를 측정하였다. 보다 구체적으로는 24℃, 상대습도 40%의 항온 항습실에서 눈꼬리 부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서 비시오메타 시스템(Visiometer system; C+K사)으로 피부주름을 측정하였다. 피부 주름의 변화량은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

(상기 수학식 1에서 Tdi는 도포 90일 후의 피부주름 측정값이고, Tdo는 도포 전의 피부주름 측정값이다.)

상기 수학식 1에 따라 피부주름의 변화량을 계산한 결과, 편백다당체를 함유하지 않는 비교예 1을 사용한 부위의 피부주름은 5.3±7%(평균±표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 편백다당체를 함유하는 실시예 1을 사용한 부위의 피부주름은 30±8%의 감소치를 나타내었다.

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 편백추출물을 함유하는 실시예 1은 이를 함유하지 않는 비교예 1보다 약 6배의 피부 주름을 감소시키는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 편백추출물을 함유하는 조성물은 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내었다.

[시험예 4] 인체에서의 피부 탄력 개선 효과 실험

상기 실시예 1 및 비교예 1의 피부 탄력 개선 효과를 측정하였다. 30~50세의 여성 40명을 대상으로 2개조로 나누어, 각 조에 상기 실시예 1 및 비교예 1의 영양크림을 매일 2회씩 12주간 안면에 도포한 후 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다.

상기 비교예 1을 사용한 부위의 피부 탄력 수치는 0.21±0.14(평균±표준편차)를 나타낸 반면, 실시예 1을 사용한 부위의 탄력 수치는 0.30±0.10를 나타내었다.

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 편백다당체를 함유한 실시예 1은 편백다당체를 함유하지 않는 비교예 1보다 약 30% 향상된 피부 탄력 증진 효과를 나타내었다.

[시험예 5] 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과

본 발명의 편백다당체의 멜라닌 생성 억제효과를 알아보기 위하여 쥐의 색소세포를 이용하였다. 먼저, C57BL/6 마우스 유래의 쥐 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoylphorbol)-13-아세테이트 및 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양한 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-공 플레이트에 10⁵ 세포/공(cells/well)의 농도로 세포를 배양한 다음 이틀째부터 3일 연속으로 10ppm, 50ppm 및 100ppm의 편백다당체를 가하여 배양하였다. 이 때, 알부틴(arbutin, Sigma, 미국)을 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도를 이용하여 하기 수학식 2에 따라 멜라닌 생성 억제율(%)을 계산하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다(Dooley의 방법).

구분	멜라닌 생성 억제율(%)
비처리군 (대조군)	0
편백다당체 (10ppm)	5
편백다당체 (50ppm)	20
편백다당체 (100ppm)	53
알부틴 (100ppm)	52

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 편백다당체는 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하고, 100ppm에서는 동일 농도의 알부틴과 유사한 수준의 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 편백다당체는 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 우수한 피부 미백 효과를 나타냄을 알 수 있다.

[시험예 6] 인체 피부에 대한 미백 효과

본 발명의 편백다당체의 인체 피부에 대한 미백 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다. 먼저, 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

상기 자외선 조사 후 시험물질인 편백다당체와 하이드로퀴논을 각각 바르고, 한 곳은 대조군으로 용매만 도포하여 10주 동안 상태변화를 관찰하였다. 피부색은 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 그 다음 상기 각 시험물질의 도포 개시시점과 도포 완료시점(10주 후)에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 3에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

피부 미백 효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하는데, △L* 값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

피부색의 차이(△L*) = 도포 완료시점에서의 L*값 - 도포 개시시점에서의 L*값

시험물질	피부색의 차이(△L*)
편백다당체	1.75 ± 0.17
하이드로 퀴논(양성 대조군)	1.89 ± 0.15
용매(음성 대조군)	0.51 ± 0.13

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 편백다당체는 하이드로 퀴논과 유사한 정도로 피부색을 밝게 해주는 것을 확인하였다. 따라서, 본원발명의 편백다당체는 자외선에 의해 생성된 색소 침착을 개선하고 피부 미백 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

[시험예 7] 인간 각질형성세포의 분화유도

각질형성세포 및 인간피부세포주(HaCaT)의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)의 양을 측정하여 본 발명에 의한 편백다당체의 세포분화 촉진 효과를 알아보았다.

일차 배양한 인간의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, 칼슘과 편백다당체를 농도별로 배양액에 첨가하고, 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이 세포를 수확(cell harvest)하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음, 2% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH7.4) 1㎖를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리한 침전물을 다시 PBS 1㎖에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액 일부를 취하여 단백질 함량을 측정하여, 세포 분화 정도의 평가시 기준으로 삼았다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘농도에서 얻은 시험 결과를 100으로 하고 측정한 값과의 비교치를 계산하여 하기 표 6에 나타내었다.

시험물질		각질형성세포의 분화능 (%)
대조군	저칼슘 처리군 (Ca2+ 0.03mM)	100
	고칼슘 처리군 (Ca2+ 1.2mM)	215
편백다당체	1 ppm	122
	10 ppm	125
	100 ppm	135

상기 표 6의 결과를 통해 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 편백다당체는 각질형성세포 분화를 농도 의존적으로 촉진하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 편백다당체는 각질형성세포의 분화를 촉진시키고 표피의 턴오버 주기를 정상화시켜서 피부 보습을 강화함을 알 수 있다.

[시험예 8] 인간 각질형성세포의 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 발현 효과

인간 각질형성세포를 96공 세포배양 플레이트의 각 공에 5x10⁴개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 부착시킨 피부세포주에 시험물질을 처리한 후, 2일이 지난 다음, 배지를 제거하고, -20℃ 냉장고에 보관하였다. 동결-해동(Freeze-thawing)을 2회 반복하여 물질 처리한 세포를 파괴시킨 후, -20℃에 보관한 아세톤:에탄올(1:1, v/v)을 처리하여 4℃에서 30분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후, 실온에 방치하여 유기용매가 증발되게 하고, 블록킹(1% 소혈청알부민), 트랜스글루타미나아제 항체(primary), HRP 안티-마우스 항체(secondary)를 처리하였으며, 발색은 OPD(σ-phenyldiamine)를 첨가하여 수행하였다. 발현량은 490nm에서 흡광도를 측정하였고, 보정은 630nm에서 백그라운드(background)를 측정하여 수행하였다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 결과를 100으로 하고 측정한 값과의 비교치를 계산하여 하기 표 7에 나타내었다.

시험물질		트랜스글루타미나아제 발현량(%)
대조군	저칼슘 처리군(Ca2+ 0.03 mM)	100
	고칼슘 처리군(Ca2+ 1.2 mM)	138
편백다당체	1 ppm	105
	10 ppm	123
	100 ppm	145

상기 표 7의 결과에서, 본 발명에 의한 편백다당체는 음성 대조군에 비해 트랜스글루타미나아제의 발현을 농도 의존적으로 향상시키고, 편백다당체를 100ppm으로 사용한 처리군은 양성 대조군인 고칼슘처리군보다 우수한 트랜스글루타미나아제의 발현량을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 편백다당체가 각질형성 세포의 트랜스글루타미나아제 발현을 촉진시킴으로써 우수한 피부 보습 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

[시험예 9] 인체에서의 피부 보습력 증가

피부건조증을 나타내는 50~60대의 성인 남녀 50명을 2개조로 나누어, 각 조에 실시예 1 및 비교예 1을 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점 및 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 코니오미터로 피부수분량을 측정하고, 시험결과는 도포 개시 전에 측정한 코니오미터 값을 기준으로 하여 일정기간 처리 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

시험물질	수분 증가율 (%)
	1주 경과	2주 경과	4주 경과	6주 경과
실시예 1	35	45	49	35
비교예 1	31	34	34	15

상기 표 8에서 보여지는 바와 같이, 편백다당체가 함유된 실시예 1을 도포한 군은 모든 측정시점에서 비교예 1을 도포한 군에 비해서 피부 수분량이 더 증가되었다. 또한, 실시예 1의 영양크림의 도포를 중지한 2주 후(총 6주 경과)에 피부수분을 측정한 수치는 도포 1주 경과 후의 수치와 유사하게 나타난 반면, 비교예 1을 도포한 군은 도포를 중지할 경우는 수분 증가율이 급속하게 떨어졌다. 그러므로 본 발명의 편백다당체를 함유하는 조성물은 피부 수분량을 증가시킬 뿐만 아니라, 도포를 중지할 경우에도 일정 기간 동안 피부 수분을 지속적으로 유지시키는 것을 알 수 있었다.

[시험예 10] LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 생합성 억제 효과

인체 섬유아세포를 10⁵ 개의 농도로 12공 평판배양기에 배양한 다음 LPS처리를 한 후, 편백다당체를 1ppm, 10ppm 및 100ppm을 포함한 배지로 교체하였다. 대조군은 편백다당체를 처리하지 않고 배양한 미처리군이다. 배양 2일째 세포를 수확해서(harvest) 웨스턴블랏(Westren blot) 방법을 사용하여 생성된 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)의 양을 정량하였다. 대조군을 100으로 하여 농도계(densitometer)로 측정한 값과의 비교치를 하기 표 9에 나타내었다.

시험물질		COX-2 생합성(%)
편백다당체	100 ppm	31
	10 ppm	52
	1 ppm	80
대조군		100

상기 표 9의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 편백다당체는 염증반응 유발인자인 LPS로 유도된 사이클로옥시게나제-2의 생합성을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 염증반응을 억제하는 것을 알 수 있었다. 그러므로 편백다당체는 피부 염증 반응을 효과적으로 억제하며, 이로써 피부 트러블을 완화시키는 효능 또한 뛰어나다.

[시험예 11] 염증 억제 효능 시험(마우스 모델)

테트라데카노일 포르볼 아세테이트(tetradecanoyl phorbol acetate, TPA) 유발성 마우스 귀 염증 모델은 염증반응의 작용기전과 억제물질의 효능을 시험하기 위해 널리 사용되고 있는 실험방법이다(De Young LM et al., Agents and Actions, 26; 335-341 (1989)).

편백다당체의 염증 억제 효능을 확인하기 위하여, 8주령의 ICR 마우스 수컷(각 군당 8마리)을 준비하고, 시험군은 TPA를 처리하고 80% 에탄올 수용액에 편백다당체가 분산된 용액을 도포하고, 비처리군은 TPA를 처리하지 않고 80% 에탄올 수용액만을 도포한 군으로, 음성 대조군은 TPA를 처리하고 80% 에탄올 수용액만을 도포한 군으로, 양성 대조군은 TPA를 처리하고 편백다당체 대신 인도메타신(indomethacine, Sigma, 미국)을 0.5mg씩 도포한 군으로 설정하였다.

제조예 1에서 얻은 편백다당체를 0.5%의 농도로 80% 에탄올 수용액에 분산시킨 다음, 시험군 마우스에 TPA 도포 전에 2일 동안 하루에 2회 귀 부위에 전처리를 하고, TPA 도포 30분 후에도 재도포하였다.　아세톤에 2.5㎍/㎖ 농도로 녹인 TPA 용액(Sigma, 미국)을 왼쪽 귀에 2.5㎕씩 도포하여 피부 자극을 유도하였다.　비처리군, 음성 대조군 및 양성 대조군의 마우스들도 상기 설정된 바와 같이 처리하였다.　TPA 도포 후 24시간이 경과한 시점에 마우스를 경추 탈골법으로 안락사시키고, 왼쪽 귀를 일정한 넓이로 채취하여 무게를 측정하였다. TPA단독 처리시 염증 발생으로 귀 무게가 증가하지만 시험 물질을 같이 도포하는 경우 귀 무게의 증가가 저하되는데, 이때 저하되는 무게 차이가 저해도이다. 저해도(%)는 하기 수학식 4에 따라 계산하였다. 그 결과는 하기 표 10에 나타내었다.

저해도(%) = (TPA 단독처리군 귀 무게-비처리군 귀 무게)/(TPA 단독처리군 귀 무게-시험 물질 처리 후 귀 무게)×100

구분	귀 무게 (평균 ±표준편차)	저해도(%) (평균)
비처리군	6.64 ± 0.65	-
TPA 단독처리군	13.21 ± 2.49	-
인도메타신(0.5㎎/ear)	7.20 ± 0.57	92
편백다당체(0.5%)	8.63 ± 1.10	70

상기 표 10에서 보는 바와 같이, TPA 단독 처리군과 비교하여 편백다당체를 처리한 시험군은 TPA에 의해 유발된 염증반응에 의한 귀 부종을 유의하게 억제하였다. 따라서, 본 발명의 편백다당체는 피부 도포 시 항염증 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

[시험예 12] 피부자극 억제 효능 시험 (토끼 모델)

레티노익산(retinoic acid)의 경우 피부 각질층의 분화 촉진, 여드름 치료, 주름 개선 효과 등의 여러 가지 탁월한 피부 효능으로 인해 화장품과 의약품에 널리 이용되고 있다(Fisher et al., J. Investig. Dermatol., 3: 61-68(1998)).　그러나, 레티노익산을 피부에 국소적으로 적용할 경우 초기에 자극감을 유발하고 더 나아가 피부 홍반과 부종을 유발하는 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다(Varani et al., Arch. Dermatol. Res., 295: 255-262(2003)). 이에 레티노익산의 이러한 피부자극을 줄이기 위한 시도가 다방면으로 진행되고 있다(Kim et al., Toxicol. Letters., 146: 65-73(2003)).　한편, 뉴질랜드 흰 토끼의 경우 여러 피부자극 물질에 대한 반응성이 우수하고 개체 차이가 적어 피부자극 실험에 널리 사용되고 있다. 따라서 본 시험예에서는 레티노익산으로 뉴질랜드 흰 토끼에서 피부자극을 유발시킨 후 시험 물질에 의한 피부자극 감소 정도를 평가하였다.

시험 하루 전, 웅성 뉴질랜드 흰 토끼(체중 2.0~2.5kg, 4마리) 등쪽의 털을 제거하였다.　제모한 토끼의 등(back)에 마리 당 2개씩 대칭되는 4개의 적용 부위(오른쪽 상부-왼쪽 상부, 오른쪽 하부-왼쪽 하부)를 표시하였다.　또한 레티노익산(0.025%)과 제조예 1에서 얻은 편백다당체(0.5%)를 각각 PEG400과 에탄올의 혼합 용액(부피비: 7/3)에 녹여 시험용액을 제조하였다.

토끼 등의 4개의 적용 부위에 모두 0.025% 레티노익산 용액(Sigma, 미국) 100㎕를 국소로 적용하였다. 적용 30분 후에, 대칭되는 적용 부위의 한쪽에는 편백다당체(100㎕/ 적용부위) 용액을, 다른 쪽에는 상기 혼합 용액(100㎕/ 적용부위)만을 처리하였다. 시험 용액들을 각각 4일간 매일 2회씩 국소 적용하고, 5일째 적용 부위를 육안으로 관찰하여 피부자극 정도를 관찰하고, 각 실험군의 피부자극을 누적자극지수로 나타내었다.

상기 누적자극지수는 홍반을 기준으로 삼았으며, 홍반이 없는 경우(0), 눈으로 식별이 가능한 미약한 홍반(1), 명료한 홍반(2), 붉은색이 진한 홍반(3), 심홍색의 강한 홍반과 가피형성(4)의 5단계로 나누어 점수를 부과하였다.

또한, 레티노익산 용액만 처리한 대조군의 누적자극지수를 기준으로 레티노익산과 산성 다당체 용액을 모두 처리한 실험군의 누적자극지수 감소를 저해도(%)로 계산하여 피부자극 억제 효능의 지표로 삼았다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

시험물질	누적자극지수 (평균±표준편차)	저해도(%)(평균)
레티노익산(대조군)	3.23 ± 0.46	0%
레티노익산 + 편백다당체	2.34 ± 0.35	27.6%

상기 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 편백다당체를 처리한 실험군은 레티노익산만을 처리한 실험군보다 약 27.6%의 누적자극지수가 감소되었다. 따라서, 본 발명의 편백다당체가 피부 자극의 억제 효능이 우수함을 알 수 있다.

[시험예 13] 시험관 내 상처 치유 측정법(in vitro wound healing assay)을 통한 상처 치유 활성

인간의 각질형성 세포인 HaCaT 세포는 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank;Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포를 10% (v/v) FBS, 페니실린 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖를 포함하는 DMEM 배지에 주입하고 37℃, 5% CO₂ 공급조건을 갖춘 동물세포배양기에서 배양하였다. 공(Well) 당 1.5×10⁶ 농도로 준비된 HaCaT 세포를 24 시간 배양하여 세포 단일층을 형성시킨 후, HaCaT 세포 단일층을 p200 피펫 팁으로 "긁힘 손상"을 유도하였다. "긁힘 손상"된 세포층을 제조예 1에서 얻은 편백다당체 10ppm 농도로 처리한 배양 배지에서 24시간 배양하고, 음성 대조군은 상기 편백다당체를 녹이는데 사용한 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 동량 처리하여 긁힘 상처가 회복되는 정도를 마이크로이미지 비디오 카메라(Boyertown, PA)가 장착된 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과에서 확인할 수 있듯이, 음성 대조군으로 처리된 세포의 "긁힘 손상"은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 편백다당체로 처리된 세포에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 "긁힘 손상"이 치유되어 24시간 후 긁힌 면적이 거의 복구되었다. 따라서, 본 발명의 편백다당체가 피부 상처 치유 및 피부 재생 효과가 우수함을 알 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 조성물의 제형예를 설명하고자 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[제형예 1] 유연화장수(스킨로션)

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
편백다당체	0.1
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량

[제형예 2] 영양화장수(밀크로션)

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
편백다당체	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
Montana 202 (제조사:Seppic)	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

[제형예 3] 마사지크림

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
편백다당체	0.1
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
Montana 202 (제조사:Seppic)	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

[제형예 4] 팩

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
편백다당체	0.1
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
핑이지-12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량

도 1은 시험관 내 상처 치유 측정법을 이용하여 편백다당체 도포 전후의 상처 치유 효과를 나타낸 사진이다.

Claims (10)

1. 편백(Chamaecyparis obtusa) 다당체를 유효성분으로 함유하고, 1000 달돈(dalton) 이하의 유리 단백질 및 엽록소를 불포함하며,

   상기 다당체는 10만 달톤(dalton) 이상의 분자량을 갖는 것인 피부 외용제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 편백다당체가 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 항노화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 피부 주름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 피부 탄력 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 피부 미백용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 피부 보습용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 피부 건조 질환의 예방 및 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 항염증용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 피부 재생용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.

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