KR20140081982A - 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 0.001~90.0중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 활성산소 소거효과, 노화 방지효과, 주름개선효과, 콜라겐 합성 촉진, 피부 보습효과, 미백효과, 피부자극 완화, 여드름 방지효과, 아토피 개선 및 항염증의 효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 기능성 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{A skin-care agent containig Lyophyllum ulmarium fruit body extract or Lyophyllum ulmarium mycelium extract}
본 발명은 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 만가닥버섯 자실체 추출물로부터 수득한 여과액 또는 만가닥버섯 균사체를 발효시켜 수득한 여과액을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am . Acad . Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest . Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am . Acad . Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화 될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고, 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.
그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 MMP(Matrix metallopretease)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 분해효소(MMP)의 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.
한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌이 과잉생산되면 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하기 위한 연구개발이 활발히 진행되고 있다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠, 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하거나 또는 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.
한편, 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 대표적인 질환으로, 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 70%에서 아토피의 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 호발하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하기 때문에 유전적 요인에 의한 질병이나 면역 질환 중의 하나로 이해되고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는, 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약재가 사용되고 있으나 부신피질 호르몬제의 부작용이 문제가 되고 있고, 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세악화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같이 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치가 어려운 상태이기 때문에 부작용이 없는 아토피 피부염의 개선제 또는 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.
최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(Functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341은 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여, 일본특허공개 평9-672662는 히아루로니디아제(Hyaluronidase) 억제 효능을 가지는 해조류 추출물에 관하여, 일본특허공개 평10-85905는 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum) 속 추출물의 항산화 효과에 관하여, 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을, 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물에 관해 개시하고 있다.
또한, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 활발해지면 생성된 과잉 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭 내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5-알파-리덕타아제(5-α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하는 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로 테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론은 여드름, 피지 증가, 탈모 및 전립선 비대증 등의 해당 조직에 관여한다. 특히, 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5-알파-리덕타아제에 의하여 생성되는 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5-알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 탈모방지 및 여드름 방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.
이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물 또는 약용과 식용버섯 추출물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 지금까지 알려진 버섯의 추출물을 이용한 화장료 조성물로서는 눈꽃동충하초(한국특허 제0340185호), 상황버섯, 치마버섯(한국특허 제0681703호, 제0295623호), 잎새버섯(한국특허 제0438009호), 표고버섯 등이 있으며 이들 추출물의 피부 노화방지 효과에 관한 연구가 계속되어 왔다.
약용과 식용으로 사용되고 있는 버섯류들은 그 예와 종류가 무수히 많지만, 화장료 조성물로서 이용되고 연구되고 있는 버섯류들은 아직은 일부분으로 알려져 있다.
한편, 만가닥버섯(Lyophyllum ulmarium)은 담자균류 주름버섯목 송이과의 버섯으로 가을철에 너도밤나무 등의 활엽수 고사목이나 그루터기에 다발로 발생된다. 발생 초기에는 둥근 단추모양이거나 반구형이며 성숙하면 평평해며, 초기의 갓 표면은 짙은 크림색을 나타내고 자라면서 차차 옅어진다. 특히, 건조해지면 갓의 표면이 갈라져 거북이 등 모양의 무늬를 이루는 것이 특징이며, 육질은 두껍지만 부드럽고 잘 부서지며, 식재료로 활용된다. 만가닥버섯은 콜레스테롤의 배출을 촉진시키고 간에서는 콜레스테롤 합성을 억제하며 지방을 줄이는 등의 효능이 있는 다당단백질이 함유되어 있어 다이어트에 효과적이다.
이러한 만가닥버섯에 대하여 아직까지 피부 외용제로서 피부 노화방지 효과, 미백효과, 피부자극 완화효과, 아토피 개선효과, 여드름 개선효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 개선효과 및 염증질환 예방 또는 치료효과를 나타내는지는 규명된 바가 전혀 없다.
대한민국 등록특허 제10-0438009호(잎새버섯 균사체의 추출물을 함유하는 화장료 조성물)에는 항산화 효과와 피부 세포의 증식 및 콜라겐의 생성촉진 효과와 피부 멜라닌생성 억제 효과가 있는 잎새버섯의 균사체 또는 그의 배양액으로부터 얻은 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 대해 기재되었으나, 이에는 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액을 이용하는 점에 대해서는 기재된 바 없다. 대한민국 등록특허 제10-0340185호(눈꽃동충하초 추출물을 함유하는 주름 방지용 화장료 조성물)에는 눈꽃동충하초의 추출물을 함유시킴으로써 주름방지에 우수한 화장료 조성물에 대해 기재되었으나, 이에는 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액을 이용하는 점에 대해서는 기재된 바 없다.
본 발명은 천연추출물을 이용하여 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부자극 완화, 여드름 방지, 아토피 개선 및 항염증의 효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 가지는 피부 외용제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 고등균류인 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양액으로부터 얻은 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부자극 완화, 여드름 방지, 아토피 개선 및 항염증의 효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 복합적으로 가지는 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물을 효율 좋게 수득하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
이하 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 외용제 조성물은 항산화 효과, 노화 방지 효과, 주름 개선효과, 피부 보습효과, 콜라겐 합성촉진효과, 미백효과, 아토피성 피부염 개선·예방 또는 치료 효과, 피부자극 완화효과, 염증질환 예방 또는 치료효과, 여드름 개선·예방 또는 치료효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 개선효과가 우수한 피부 외용제 조성물을 제공하기 위해, 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 만가닥버섯 자실체 추출물은 만가닥버섯 자실체를 추출하여 얻을 수 있는데, 여기서 만가닥버섯 자실체의 종류에는 특정의 종류에 한정되는 것은 아니며 자연채취된 것 또는 인공배양된 것 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 만가닥버섯 자실체 추출물의 추출방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 사용하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 만가닥버섯 자실체를 동결건조하고 분쇄하여 수득한 자실체 분말에 약 2배 내지 20배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급(C1-C4)알코올의 극성용매 또는 이들의 혼합용매로 10℃ 내지 30℃ 추출온도에서 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 초고압 추출 등의 추출방법을 이용할 수 있다.
또한, 바람직하게는 이와 같이 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 동결건조하여 극성용매에 가용할 수 있다. 예를 들면, 수득된 추출액을 여과시킨 후 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하고, 이렇게 얻어진 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 ~ 70.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출물을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 만가닥버섯 자실체 추출물은 이와 같이 얻어진 추출물에 유효성분으로 함유된 다당체 자체를 의미할 수도 있다.
한편, 본 발명의 만가닥버섯 균사체 추출물은 만가닥버섯 균사체를 추출하여 얻은 것으로, 그 추출방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 사용하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 만가닥버섯 균사체를 동결건조하고 분쇄하여 수득한 균사체 분말의 열수추출물, 또는 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 유기용매 추출물일 수 있다.
한편, 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액은 그대로 사용하거나, 건조(또는 동결건조)하여 분말 형태로 사용할 수 있다. 바람직하게는 배양액을 여과하여 사용할 수도 있다. 구체적으로 만가닥버섯 균사체를 액체 배양한 후, 균사체를 원심분리를 통해 제거한 후, 배양 여액을 종이필터로 여과하여 수득된 여과액을 사용할 수 있는 것이다. 이때, 배양은 '발효'를 포함하는 의미이다.
또한, 본 발명의 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액은 상기 열수추출물, 상기 유기용매 추출물 또는 상기 여과액에서 추출된 다당체일 수도 있다.
또한, 본 발명의 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액은 1종 이상의 동물 또는 식물 또는 생약재를 기질로 사용한 만가닥버섯 균사체의 추출물인 것이 바람직하다. 여기서, 상기 동물 또는 식물 또는 생약재는 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 사용되는 동물 또는 식물 또는 생약재를 기질로 사용할 수 있다.
이와 같이 수득된 본 발명의 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액은 항산화 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 미백효과, 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과, 여드름균에 대한 항균효과, 아토피 피부염에 대한 항염증효과, 피부 자극 완화효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 매우 우수하여 다기능성 피부 외용제 조성물에 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 조성물 전체에 대해 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 0.001 ~ 90.0 중량% 함유하는 것이 좋은데, 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과 등이 미미하고, 90.0 중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하기 때문이다.
한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 피부 외용제 조성물로부터 피부질환의 예방 및 억제의 효과를 나타낼 수 있는 정도로, 피부 외용제 조성물에 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션(formulation) 되는 것을 포함하는 의미이다.
한편, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 바람직하게 화장료 조성물인 것이 좋은데, 화장료 조성물의 제형으로는 일예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형; 이 있다.
한편, 화장료 조성물은 가장 바람직하게 피부 미백용, 노화방지용, 피부자극완화용, 피부 보습용, 주름 개선용, 아토피 피부 개선용, 여드름 개선용, 모발손상 방지용 또는 탈모방지용인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 바람직하게 약학 조성물인 것이 좋은데, 약학 조성물의 제형으로는 일예로 경고제(PLASTERS), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화제제가 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약리학적으로 허용되는 기제; 운반제; 부형제; 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하는 결합제; 한천, 전분, 젤라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨을 포함하는 분쇄제; 스테아린산 마그네슘, 활석 및 수첨 식물유를 포함하는 윤활제; 및 착색제 등을 포함할 수 있고, 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등이 있다. 상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.
한편, 많은 환자에게 본 발명인 피부 외용제 조성물에 대한 표준 투여량은 환자의 개별적 특성에 의해 그 양이 변화될 수 있으며, 실질적으로 숙련된 임상 의사는 환자를 위해 본 발명의 피부 외용제 조성물에 대한 이상적인 투여량 및 투여 계획, 예를 들어 특정 필요 및 환자의 전체적인 조건의 관점에서 가장 적절한 치료 전략을 정할 수 있다. 본 발명의 피부 외용제 조성물에 대하여, 적절한 투여량을 결정하는 데는 수많은 참조 문헌을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물의 적절한 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델에서 일반적으로 결정될 수도 있다. 예를 들어 시험관 내에서 표적 세포에 대해 여러 농도의 본 발명 피부 외용제 조성물을 첨가하여 그 적절한 투여량을 결정할 수도 있다.
한편, 약학 조성물은 바람직하게 염증질환 예방 또는 치료용, 아토피 예방 또는 치료용 또는 여드름 예방 또는 치료용인 것이 좋다.
본 발명에 의하면, 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 노화 방지, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부자극 완화, 여드름 방지, 아토피 개선 및 항염증의 효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 복합적으로 발휘하는 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액을 수율 좋게 수득할 수 있고, 이를 이용하여 다기능성 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 만가닥버섯 자실체 추출물의 제조
만가닥버섯(Lyophyllum ulmarium) 자실체를 동결건조하고 분쇄하여 수득한 자실체 분말을 에탄올이 70%(v/v) 함유된 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득된 동결 건조물을 15중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜의 혼합용매에 용해시킴으로써 추출물(이하, '만가닥버섯 자실체 추출물'이라 칭함)을 제조하였다.
실시예 2: 만가닥버섯 균사체 추출물의 제조
실험에 사용된 만가닥버섯(Lyophyllum ulmarium) 균주는 신선한 자실체로부터 직접 분리하였으며, 만가닥버섯 균사체를 효모-맥아즙 한천배지(효모 추출물 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당 10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1 ℓ)가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하고, 이를 포도당 3%, 효모 추출물 1.0%를 함유한 단순 복합 배지로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150 rpm, 통기량 1.5 vvm의 조건으로 10일간 배양하였다.
배양완료 후, 균사체를 원심분리를 통해 회수한 후, 상기 실시예 1에 기재된 방법으로 추출하여 균사체 추출물(이하, '만가닥버섯 균사체 추출물'이라 칭함)을 제조하였다.
실시예 3: 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액의 제조
실험에 사용된 만가닥버섯(Lyophyllum ulmarium) 균주는 신선한 자실체로부터 직접 분리하였으며, 만가닥버섯 균사체를 효모-맥아즙 한천배지(효모 추출물 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당 10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1 ℓ)가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하고, 이를 포도당 3%, 효모 추출물 1.0%를 함유한 단순 복합 배지로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150 rpm, 통기량 1.5 vvm의 조건으로 10일간 배양하였다.
배양완료 후, 균사체를 원심분리를 통해 제거한 배양여액을 종이필터 (watman no.4)로 여과하여 여과액을(이하, '만가닥버섯 균사체 배양액'이라 칭함) 수득하였다.
실험예 1: NBT 을 이용한 항산화 효과 측정
상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교샘플로 사용하였고, 항산화 측정은 NBT법을 이용하였다.
NBT법은 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소와 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)이 반응하여 생성된 청색을 파장 560 nm에서 측정하는 방법으로, 활성산소 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같다.
바이엘병에 0.05 M의 탄산나트륨(Na2CO3) 2.4 ㎖, 3 mM의 크산틴 용액 0.1 ㎖, 3 mM의 EDTA 용액 0.1 ㎖, BSA 용액 0.1 ㎖, 0.72 mM의 NBT 용액 0.1 ㎖를 가하고 여기에 시료용액을 각각 첨가한 후, 25℃에서 10분간 방치하였다. 방치 후, 크산틴옥시다제 용액 0.1 ㎖를 가하여 빠르게 교반한 다음, 25℃에서 20분간 배양 하였고, 여기에 6 mM의 염화구리(CuCl2) 용액 0.1 ㎖를 가하여 반응을 정지시키고 560 nm에서의 흡광도(St)를 측정하였다. 공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것으로, 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bt)를 측정하였다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 크산틴옥시다제 용액 대신 증류수를 사용해 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bo)를 측정하였다.
측정 결과는 하기 수학식 1에 의하여 산출하였다.
[수학식 1]
활성산소 소거율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)] × 100
St : 시료용액의 효소 반응 후의 560 ㎚에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560 ㎚에서의 흡광도
So : 효소 무첨가 시료용액의 효소 반응 전의 560 ㎚에서의 흡광도
Bo : 효소 무첨가 공시험용액의 효소 반응 전의 560 ㎚에서의 흡광도
시료명 활성산소 소거율(항산화 효과;%)
만가닥버섯 자실체 추출물 0.25중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.1중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.05중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.025중량%
BHT 0.1중량%
시료명 활성산소 소거율(항산화 효과;%)
만가닥버섯 균사체 배양액 0.25중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.1중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.05중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.025중량%
BHT 0.1중량%
NBT법을 이용한 항산화 효과를 측정한 결과(표 1, 표 2), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 BHT와 같은 농도에서 보다 우수한 항산화효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명의 유효성분인 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 항산화효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 항산화 효과를 알 수 있었다.
실험예 2: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정
본 실험예 2에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교샘플로 사용하였고, 항산화 측정은 DPPH법을 이용하였다.
DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 방법으로, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560 nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같다.
0.25, 0.1, 0.05, 0.025중량% 농도의 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 준비한 후, 농도에 따른 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 96-웰 프레이트에 넣었다. 여기에 100 uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560 nm에서 흡광도(St)를 측정하였다.
자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.
[수학식 2]
자유라디칼 소거활성(%)={100-(B/A)} × 100
A: 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 배양액을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도
B: 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액을 처리한 실험군 웰의 흡광도
시료명 자유라디칼 소거율(항산화 효과;%)
만가닥버섯 자실체 추출물 0.25중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.1중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.05중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.025중량%
BHT 0.1중량%
시료명 자유라디칼 소거율(항산화 효과;%)
만가닥버섯 균사체 배양액 0.25중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.1중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.05중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.025중량%
BHT 0.1중량%
DPPH법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과(표3, 표 4), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 BHT 보다 낮은 농도에서도 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 항산화 효과를 추론할 수 있었다.
실험예 3: 세포 내 활성산소 소거 효과 측정
본 실험예 3에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소의 소거 효과를 측정하기 위해 EGCG를 비교샘플로 사용하였고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
본 실험예 3에서 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96-웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 104개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 1일간 배양한 후, 0.02, 0.01, 0.005중량% 농도로 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 처리하였다.
시험시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20 μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100 ㎕ 가하고 37℃, 5% CO2 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이후 농도별로 처리된 HCSS를 100 ㎕ 가한 후, 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트리더(Ex;485 nm, Em;530 nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20 mJ/cm2)를 조사하고 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 처리한 후, 형광플레이트 리더(Ex;485 nm, Em;530nm)를 사용하여 형광도를 측정하였다.
시료명 활성산소 소거효과(%)
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
EGCG 0.01중량%
시료명 자유라디칼 소거율(항산화 효과;%)
만가닥버섯 균사체 배양액 0.25중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.1중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.05중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.025중량%
BHT 0.1중량%
활성산소 소거 효과를 측정한 결과(표 5, 표 6), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 EGCG와 동일한 농도에서 EGCG 보다 높은 활성산소 소거율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명의 유효성분인 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 활성산소 소거효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 활성산소 소거 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 4: 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 활성 저해율 측정( in vitro )
본 실험예 4에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 in vitro에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율을 측정하기 위해 녹차추출물을 비교 샘플로 사용하였고, 형광분석법을 이용하였다.
실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-Collagen을 사용하였고, 효소는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 콜라게나제(collagenase)를 사용하였으며, 반응완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl2, 2 mM sodium azide, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100 ㎕에 0.25 ㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ collagen 20 ㎕와 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액(0.02, 0.01, 0.005중량%) 40 ㎕를 각각 첨가하고 0.5 unit으로 희석한 콜라게나제(collagenase) 40 ㎕를 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후, 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm로 형광값을 측정하였다. 대조군은 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가한 후, 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 이용하였다.
시료명 MMP-1 활성 저해율(%)
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
녹차추출물 0.2중량%
시료명 MMP-1 활성 저해율(%)
만가닥버섯 균사체 배양액 0.02중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.01중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.005중량%
녹차추출물 0.2중량%
in vitro에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율을 측정한 결과(표 7, 표 8), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 녹차추출물에 비해 낮은 농도에서 금속단백질분해효소(MMP-1)의 활성을 효과적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소를 효과적으로 저해함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 5: 자외선 조사 후 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 발현억제 정도 측정
본 실험예 5에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정하기 위해 레티놀을 비교샘플로 사용하였다.
UV 조사 및 시료 첨가(만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액, 레티놀) 후, 금속단백질분해효소(MMP-1) 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 수행하였다.
UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3 J/㎠의 에너지로 조사하였고, 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였고, UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후, 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양한 다음, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 일차항체{MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체}를 처리하고 37℃에서 60분 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.
시료명 MMP-1 발현억제율(%)
대조군
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
레티놀
시료명 MMP-1 발현억제율(%)
대조군
만가닥버섯 균사체 배양액 0.02중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.01중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.005중량%
레티놀
자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정한 결과(표 9, 표 10), 시료를 처리하지 않은 대조군에 반해 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 우수한 억제율을 보였는데, 이는 비교샘플로 사용한 레티놀의 억제율에 비해서도 상당히 우수한 결과였다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 추추물의 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 6: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과 측정
본 실험예 6에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 확인하기 위하여 TGF-β를 양성대조군으로 사용하였고, 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같이 수행하였다.
신생아의 표피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×104 cell/cm2농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대 배양된 세포를 실험에 이용하였다.
프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48-웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후, 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 0.02%, 0.01%, 0.005중량% 농도로 각각 가하고, 24시간이 지난 후, 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit, MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.
시료명 프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
TGF-β 0.001중량%
시료명 프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
만가닥버섯 균사체 배양액 0.02중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.01중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.005중량%
TGF-β 0.001중량%
프로콜라겐 생합성 촉진효과를 측정한 결과(표 11, 표 12), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액은 세포신호전달 물질 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 프로콜라겐 생합성 촉진효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명은 피부노화 개선효과가 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
실험예 7: 엘라스타제 활성 억제효과 측정
본 실험예 7에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 엘라스틴 생성 촉진효과를 측정하기 위해, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 처리하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후, 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 1일간 각각 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med ., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J. Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA의 NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.
시료명 엘라스타제 활성 억제율(%)
대조군
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
시료명 엘라스타제 활성 억제율(%)
대조군
만가닥버섯 균사체 배양액 0.02중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.01중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.005중량%
엘라스타제 활성 억제율을 측정한 결과(표 13, 표 14), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 농도의존적으로 엘라스타제의 활성 억제율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 엘라스타제 활성 억제효과를 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 8: 티로시나제 활성 억제효과 측정
본 실험예 8에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였다.
티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소이다.
티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신은 0.05 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1 ㎎/㎖ 용액으로 만들고, 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액은 각각 0.05 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5 ㎖를 시험관에 넣고 여기에 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 시료액 0.5 ㎖를 각각 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후, 200 unit/㎖ 티로시나제 0.5 ㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후, 분광광도계를 파장 475 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 대신 완충용액 0.5 ㎖를 넣은 것을 사용하였다.
상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
티로시나제 활성 저해율(%) = 100 - [(비교군흡광도/대조군흡광도)] × 100
시료명 티로시나제 저해율(%)
대조군
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
알부틴 0.2중량%
시료명 티로시나제 저해율(%)
대조군 0
만가닥버섯 균사체 배양액 0.02중량% 51
만가닥버섯 균사체 배양액 0.01중량% 41
만가닥버섯 균사체 배양액 0.005중량% 35
알부틴 0.2중량% 54
티로시나제의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 15, 표 16), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 알부틴과 유사한 티로시나제 활성 저해율을 나타내었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 티로시나제 활성 저해효과를 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 알 수 있었다.
실험예 9: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정
본 실험예 9에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였고, B16F1 멜라닌 세포를 이용하였다.
본 실험예 9에서 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다.
B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2×106 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R Lotan and D Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ㎖를 첨가하고, 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405 ㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.
B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.
[수학식 4]
멜라닌 합성 저해율(%) = [(A-B)/A] × 100
A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양
B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양
시료명 멜라닌 합성 저해율(%)
대조군
만가닥버섯 자실체 추출물 0.02중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.01중량%
만가닥버섯 자실체 추출물 0.005중량%
알부틴 0.2중량%
시료명 멜라닌 합성 저해율(%)
대조군
만가닥버섯 균사체 배양액 0.02중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.01중량%
만가닥버섯 균사체 배양액 0.005중량%
알부틴 0.2중량%
B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과(표 17, 표 18), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액은 알부틴과 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 알 수 있었다.
실험예 10: 염증유발관련 효소( hyaluronidase ) 활성 억제효과 측정
본 실험예 10에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 항염증 효과를 측정하기 위해 컴프리 추출물, 시소 추출물, 유용성 감초 추출물을 양성대조군으로 사용하였고, 염증유발효소인 히아루로니디아제(hyaluronidase) 활성 억제효과를 측정하였다.
히아루로니디아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발하는 효소이다.
본 실험예에서는 히아루로니디아제(hyaluronidase)의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법(Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammation, 4, 437-438, 1984)을 응용해 항염증 효과를 판정하였다.
시료 100 ㎕와 히아루로니디아제 용액(type Ⅳ-S, Sigma, 400U/㎖) 50 ㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl2ㆍ2H2O, Sigma, 0.1 ㎎/㎖)을 100 ㎕ 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시켰다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4 ㎎/㎖)을 250 ㎕ 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100 ㎕ 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3 ㎖ 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시킨 후 발색시켰다. 585 ㎚에서 흡광도를 측정하여 히아루로니디아제 활성 저해율을 측정하였다.
히아루로니디아제의 활성 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC50 값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.
[수학식 5]
히아루로니디아제의 활성 저해율(%) = [(A-B)/A] × 100
A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소활성
B: 시료를 첨가한 웰의 효소 활성
시료명 히아루로니디아제 활성 저해효과(IC50;%)
컴프리 추출물
시소 추출물
유용성 감초 추출물
만가닥버섯 자실체 추출물
시료명 히아루로니디아제 활성 저해효과(IC50;%)
컴프리 추출물
시소 추출물
유용성 감초 추출물
만가닥버섯 균사체 배양액
히아루로니디아제(hyaluronidase)의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 19, 표 20), 만가닥버섯 자실체 추출물의 IC50값과 만가닥버섯 균사체 배양액의 IC50값은 항염증제로 잘 알려진 컴프리 추출물, 시소 추출물 및 유용성 감초 추출물과 유사하거나 뛰어난 효과를 나타내었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 항염증 효과를 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 항염증 효과를 알 수 있었다.
실험예 11: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과 측정
본 실험예 11에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화효과를 측정하였다.
섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x105개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖를 첨가하였다. 여기에 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕와 MTT용액(2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후, 2시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 그리고 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.
수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하였다.
[수학식 6]
세포생존율(%) = [(St-Bo)/(Bt-Bo)] × 100
Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
[수학식 7]
자외선에 의한 세포독성 완화율(%) = [1-(St-Bo)/(Bt-Bo)] × 100
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율
Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포 생존율
St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포 생존율
시료명 처리농도(중량%) 세포독성 완화율(%)

만가닥버섯 자실체 추출물		 0.02
0.01
0.005
시료명 처리농도(중량%) 세포독성 완화율(%)

만가닥버섯 균사체 배양액		 0.02
0.01
0.005
자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 측정한 결과(표 21, 표 22), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액은 자외선에 의한 세포 독성을 우수하게 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 자외선에 의한 피부자극 완화효과를 알 수 있었다.
실험예 12: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과 측정
본 실험예 12는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 항염증효과를 측정하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 측정하였다.
사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X104개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 8에 의해 계산하였다.
[수학식 8]
염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량
시료명 처리농도(중량%) 염증성 사이토카인 발현 억제율(%)

만가닥버섯 자실체 추출물		 0.02
0.01
0.005
시료명 처리농도(중량%) 염증성 사이토카인 발현 억제율(%)

만가닥버섯 균사체 배양액		 0.02
0.01
0.005
자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 측정한 결과(표 23, 표 24), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액은 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 확인할 수 있었다. 상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 항염증 효과를 알 수 있었다.
실험예 13: 자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과 측정
본 실험예 13에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 프로스타글란딘(prostaglandin E2;이하, PGE2로 칭함) 생합성 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x104개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간 동안 배양한 다음, 상기의 각질형성세포에 최종농도가 50 uM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E2 synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX)의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15 W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250 ㎕를 첨가하였다. 여기에 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE2(prostaglandin E2)를 정량함으로서 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE2의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량화하였다.
시료명 PGE2 억제율(%)
(-)UV B
(+)UV B
(+)UV B + 만가닥버섯 자실체 추출물 0.02 중량%
(+)UV B + 만가닥버섯 자실체 추출물 0.01 중량%
(+)UV B + 만가닥버섯 자실체 추출물 0.005 중량%
시료명 PGE2 억제율(%)
(-)UV B
(+)UV B
(+)UV B + 만가닥버섯 균사체 배양액 0.02 중량%
(+)UV B + 만가닥버섯 균사체 배양액 0.01 중량%
(+)UV B + 만가닥버섯 균사체 배양액 0.005 중량%
자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 측정한 결과(표 25, 표 26), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히 생성되는 PGE2는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 추론할 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 확인할 수 있었다.
실험예 14: 여드름균에 대한 항균력 측정
본 실험예 14에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위해 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다.
먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar1.5%)에 0.1 ㎖씩 도말 한 후, 건조시켰다. 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8 ㎜의 paper disc에 50 ㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체 배지 위에 올려놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 'Paper disc' 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다.
여드름균에 대한 항균력을 측정한 결과, 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 균 성장 저지환의 크기는 16 ㎜인 것으로 나타나, 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 항균력을 확인할 수 있었다.
실험예 15: Compound 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 항염증 효과 측정
BALB/c 마우스(5 wks, male)의 등 쪽 목 부위 피부의 진피 내로 마리당 30 ㎕의 compound 48/80(Sigma, Co.; 1 ㎎/㎖ in saline)을 주사한 후 케이지에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 compound 48/80을 주사하기 5일 전부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 250 ㎕/㎖의 농도로 마리당 100 ㎕씩 각각 마우스의 등 쪽 목 부위에 도포하였다. 도포방법은 5일 동안 하루에 두 번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등 쪽 목 부위에 도포하여 전처리 한 다음 compound 48/80을 주사한 후 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.
시료명 Number of scratching (in 5min)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
만가닥버섯 자실체 추출물
대조군
시료명 Number of scratching (in 5min)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
만가닥버섯 균사체 배양액
대조군
아토피 피부염 유발 후 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 항염증 효과를 측정한 결과(표 27, 표 28), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 compound 48/80에 의한 아토피 피부염(피부 소양증) 유발을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 아토피 예방 효과를 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 아토피 개선, 예방 또는 치료 효과를 알 수 있었다.
실험예 16: 수분 흡습성 측정
본 실험예 16에서는 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 수분 흡습성을 측정하기 위하여, 인간으로부터 직접 채취하거나 또는 상업적으로 구입한 사람의 건조 표피세포에 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액과 증류수에 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조 후의 질량변화를 측정하였다.
각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부 세포 단위 질량당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡습되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.
구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피세포를 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액, 정제수에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 달고, 일부를 채취하여 카이저 수분측정기로 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다. 이후 다시 48시간 감압건조시키고 무게를 달고난 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다(수분 mg/표피세포 질량 g).
시료명 수분함량
초기 건조상태 포화상태 재건조 후
만가닥버섯 자실체 추출물
정제수
시료명 수분함량
초기 건조상태 포화상태 재건조 후
만가닥버섯 균사체 배양액
정제수
수분 흡습성을 측정한 결과(표 29, 표 30), 만가닥버섯 자실체 추출물, 만가닥버섯 균사체 배양액으로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화 흡습 된 표피세포보다 재건조 과정에 있어 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 피부 흡습성을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 보습 효과를 알 수 있었다.
실험예 17: 만가닥버섯 자실체 추출물 및 만가닥버섯 균사체 배양액과 사람 모발 단백질의 결합 효과
사람 모발 케라틴 단백질 50 ㎍에 상기 실시예 1 또는 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 0.5, 0.25, 0.1중량%의 시험 농도로 첨가하고 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 6% 과산화수소와 0.5% 암모니아 1:1 혼합 용액으로 처리하여 30분 동안 반응시켰다. 반응액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동하고, 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색한 후 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합용액에서 탈색시키고 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. 이미지 마스터(Amersham Pharmacia Biotech.) 소프트웨어를 사용하여 50 ㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 단백질 띠를 100%로 하고, 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 결합 효과를 %로 표시하였다.
만가닥버섯 자실체 추출물 대조군 0.5중량% 0.25중량% 0.1중량%
모발단백질 결합효과
만가닥버섯 균사체 배양액 대조군 0.5중량% 0.25중량% 0.1중량%
모발단백질 결합효과
실험결과(표 31, 표 32), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액모두 함량이 증가함에 따라 모발 단백질 케라틴과의 결합 능력도 증가하는 것을 알 수 있었다.
실험예 18: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 케라틴 용출에 대한 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 보호 효과
3 g의 모발을 10 ㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합용액에 넣고 상기 실시예 1 또는 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 0.5, 0.25, 0.1중량%의 시험 농도로 첨가한 후에 상온에서 30분 동안 처리하였다. 반응액 0.5 ㎖를 Rapid-Con protein concentration kit(Elpis Biotech.)를 사용하여 농축시키고 농축액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동한 후 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색하고 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 탈색시켜 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. 이미지 마스터 소프트웨어(Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 50 ㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 밴드를 100%로 하고, 만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 배양액을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 단백질의 결합 효과를 %로 표시하였다.
만가닥버섯 자실체 추출물 대조군 0.5중량% 0.25중량% 0.1중량%
모발 용출 케라틴 단백질
만가닥버섯 균사체 배양액 대조군 0.5중량% 0.25중량% 0.1중량%
모발 용출 케라틴 단백질
실험결과(표 33, 표 34), 만가닥버섯 자실체 추출물, 만가닥버섯 균사체 배양액모두 함량이 증가함에 따라 모발로부터 용출되는 케라틴 단백질 함량이 감소하는 것을 알 수 있었다.
실험예 19: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 모발 인장 강도와 신도에 대한 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 효과
3 g의 모발을 10 ㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합 용액에 넣고 상기 실시예 1 또는 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액을 각각 0.5, 0.25, 0.1중량%의 시험 농도로 첨가하여 상온에서 30분 동안 처리한 후, 물로 씻고 바람에 건조시켜 오토그래프(Autograph) 시험기에서 인장 강도(gf)및 신도(%)를 측정하였다. 다음 표 18은 이와 같이 처리한 모발의 인장 강도 및 신도를 나타낸 것이다.
만가닥버섯 자실체 추출물 정제수 0.5중량% 0.25중량% 0.1중량%
인장 강도(gf)
신도(%)
만가닥버섯 균사체 배양액 정제수 0.5중량% 0.25중량% 0.1중량%
인장 강도(gf)
신도(%)
실험결과(표 35, 표 36), 탈색제(상기 과산화수소와 암모니아 혼합 용액)를 30분간 처리한 경우 만가닥버섯 자실체 추출물, 만가닥버섯 균사체 배양액 모두 첨가량이 증가함에 따라서 모발의 강도 저하가 억제된 것을 볼 수 있다. 이에 따라 탈색제를 처리한 경우 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액에 의한 모발 보호 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다.
실험예 20: 모발성장효과 시험
상기 실시예 1 또는 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액 2중량%을 함유하는 30% 함수 에탄올 용액을 각각 제조하여 모발성장효과 시험에 사용하였다. 모발성장효과 시험은 마우스(ICR), 생후 47~53일 것을 사용하여 등 부위 털을 제거하고, 등 부위가 깨끗한 것을 골라 물질 군 마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 시험물질을 개체당 100 ㎖씩 도포하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 0에서 2까지 부가하여 각각 비교하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다.
모발성장 촉진 효과 정도를 3등급으로 분류하여 평가하였다(0:전혀 자라지 않음, 1:약간자람, 2:많이자람).
시료/경과일수 5 10 15
만가닥버섯 자실체 추출물 2중량%
대조군
시료/경과일수 5 10 15
만가닥버섯 균사체 배양액 2중량%
대조군
실험결과(표 37, 표 38), 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액의 우수한 모발성장 촉진 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 4 및 비교예 1 : 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 화장료 제조
본 실시예 4에서는 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 화장료를 제조하였다.
제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 하기 표 39에 나타낸 바와 같다.
우선 하기 표 39에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비 유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림(실시예 3, 비교예 1)을 제조하였다.
원료 실시예 4(중량%) 비교예 1(중량%)
가 스테아릴 알콜 8 8
스테아린산 2 2
스테아린산 콜레스테롤 2 2
스쿠알란 4 4
2-옥틸도데실알콜 6 6
폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르 3 3
글리세릴모노스테아린산 아스테르 2 2
나 만가닥버섯 자실체 추출물 1 -
프로필렌글리콜 5 5
정제수 100이 될 때까지 100이 될 때까지
실시예 5 및 비교예 2 : 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장료 제조
본 실시예 5에서는 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장료를 제조하였다.
제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 하기 표 40에 나타낸 바와 같다.
우선 하기 표 40에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비 유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림(실시예 4, 비교예 2)을 제조하였다.
원료 실시예 5(중량%) 비교예 2(중량%)
가 스테아릴 알콜 8 8
스테아린산 2 2
스테아린산 콜레스테롤 2 2
스쿠알란 4 4
2-옥틸도데실알콜 6 6
폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르 3 3
글리세릴모노스테아린산 아스테르 2 2
나 만가닥버섯 균사체 배양액 1 -
프로필렌글리콜 5 5
정제수 100이 될 때까지 100이 될 때까지
실험예 21: 화장료의 피부 탄력 개선효과 측정
상기 실시예 4 내지 5 및 비교예 1 내지 2에서 제조된 화장료의 피부 탄력 개선효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 4 또는 실시예 5를 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1 또는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.
피부 탄력 개선효과를 확인하기 위해 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 21에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다(n=20, p<0.05).
실험제품 피부탄력효과(R7)
실시예 4
비교예 1
실험제품 피부탄력효과(R7)
실시예 5
비교예 2
화장료의 피부 탄력 개선효과를 측정한 결과(표 41, 표 42), 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 실시예 4와, 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 실시예 5 를 도포한 실험자의 피부 탄력개선효과가 비교예 1 내지 비교예 2 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 피부 탄력 개선효과를 확인할 수 있었다.
실험예 22: 화장료의 피부 주름 개선효과 측정
상기 실시예 4 내지 5 및 비교예 1 내지 2에서 제조된 화장료의 피부 주름 개선효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 3 또는 실시예 4를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1 또는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.
피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오 미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다.
그 결과를 하기 표 42 및 표 43에서 나타내었으며, 표 42 및 표 43은 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 값이 음수가 나올수록 주름 개선효과가 높다는 것을 의미한다.
실험제품 R1 R2 R3 R4 R5
실시예 4
비교예 1
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값
R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균
R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치
R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값
R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값
실험제품 R1 R2 R3 R4 R5
실시예 5
비교예 2
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값
R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균
R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치
R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값
R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값
화장료의 피부 주름 개선효과를 측정한 결과(표 43, 44), 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유한 실시예 4와 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유한 실시예 5의 피부 주름 개선효과가 비교예 1 내지 비교예 2 보다 우수함을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 주름 개선효과를 확인할 수 있었다.
실험예 23 : 화장료의 미백효과 측정
본 실험예 23에서는 상기 실시예 4 내지 5 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 화장료의 미백효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 4 또는 실시예 5를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1 또는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.
2개월 후, 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 44, 표 45에 나타내었고, 미백효능 정도를 7등급으로 분류하여 평가하였다(-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선).
피부색의 밝기 변화(△L) 숙련자의 객관적 평가 피검자의 주관적 평가
실시예 4 비교예 1 실시예 4 비교예 1 실시예 4 비교예 1
평균값
피부색의 밝기 변화(△L) 숙련자의 객관적 평가 피검자의 주관적 평가
실시예 5 비교예 2 실시예 5 비교예 2 실시예 5 비교예 2
평균값
화장료의 미백효과를 측정한 결과(표 45, 표 46), 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 실시예 4와 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 실시예 5는 비교예 1 내지 2 보다 미백효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.
실험예 24: 화장료의 아토피성 피부염에 대한 개선효과 측정
본 실험예 24에서는 상기 실시예 4 내지 5와 비교예 1 내지 2에서 제조된 화장료의 아토피성 피부염에 대한 개선효과를 비교측정하기 위해 다음과 같이 임상실험을 실시하였다.
5~30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 4 또는 실시예 5를, 오른쪽 손에는 비교예 1 또는 비교예 2를 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 47, 표 48에 나타내었다.
매우 좋다 좋다 그저 그렇다
실시예 4 80% (24명) 20% (6명) 0%
비교예 1 10% (3명) 20% (6명) 70% (21명)
매우 좋다 좋다 그저 그렇다
실시예 5 70% (21명) 30% (9명) 0%
비교예 2 10% (3명) 20% (6명) 70% (21명)
화장료 아토피성 피부염에 대한 개선효과를 측정한 결과(표 47, 표 48), 만가닥버섯 자실체 추출물이 함유된 실시예 3과 만가닥버섯 균사체 배양액이 함유된 실시예 4가 비교예 1 내지 2 보다 아토피성 피부개선효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 아토피성 피부염 개선효과를 확인할 수 있었다.
실험예 25: SLS 에 의한 피부 자극 완화효과 측정
본 실험예 25에서는 상기 실시예 4 내지 5에서 제조된 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.
일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 4 또는 실시예 5의 화장료를 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포한 후, 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.
20~50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 제품을 0.3 mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.
SLS에 의한 피부 자극 완화효과를 측정한 결과, SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 실시예 4와 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 실시예 5는 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.
상기의 결과로부터 만가닥버섯 자실체 추출물과 만가닥버섯 균사체 배양액이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 화장수 제조
95% 에탄올 8 g에 폴리피로리돈 0.05 g, 올레일알콜 0.1 g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2 g, 향료 0.2 g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1 g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물 0.05 g, 글리세린 5 g을 정제수 85.33 g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.
실시예 7: 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장수 제조
95% 에탄올 8 g에 폴리피로리돈 0.05 g, 올레일알콜 0.1 g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2 g, 향료 0.2 g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1 g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액 0.05 g, 글리세린 5 g을 정제수 85.33 g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장수를 제조하였다.
실시예 8: 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 유액 제조
세틸알콜 1.2 g, 스쿠알란 10 g, 바세린 2 g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2 g, 글리세린모노에스테아레이드 1 g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1 g 및 향료 0.1 g을 70℃에서 가열 혼합 용해하고, 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물 0.5 g, 디프로필렌글리콜 5 g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2 g, 트리에탄올아민 0.2 g, 정제수 76.2 g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 유액을 제조하였다.
실시예 9: 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 유액 제조
세틸알콜 1.2 g, 스쿠알란 10 g, 바세린 2 g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2 g, 글리세린모노에스테아레이드 1 g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1 g 및 향료 0.1 g을 70℃에서 가열 혼합 용해하고, 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액 0.5 g, 디프로필렌글리콜 5 g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2 g, 트리에탄올아민 0.2 g, 정제수 76.2 g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 유액을 제조하였다.
실시예 10: 만가닥버섯 자실체 추출물을 함유하는 미용액 제조
95% 에틸알콜 5 g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2 g, 키툴로오즈 0.3 g, 히야론산나트륨 0.2 g, 비타민 E-아세테이트 0.2 g, 감초산 나트륨 0.2 g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1 g, 상기 실시예 1에서 수득된 만가닥버섯 자실체 추출물 1 g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.
실시예 11: 만가닥버섯 균사체 배양액을 함유하는 미용액 제조
95% 에틸알콜 5 g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2 g, 키툴로오즈 0.3 g, 히야론산나트륨 0.2 g, 비타민 E-아세테이트 0.2 g, 감초산 나트륨 0.2 g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1 g, 상기 실시예 3에서 수득된 만가닥버섯 균사체 배양액 1 g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

Claims (18)

  1. 만가닥버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  2. 만가닥버섯 균사체 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  3. 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 피부 외용제 조성물은,
    만가닥버섯 자실체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체 추출물 또는 만가닥버섯 균사체의 배양으로부터 얻은 배양액을 조성물 전체에 대해 0.001 ~ 90.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 피부 외용제 조성물은,
    화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    피부 미백용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    노화 방지용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    주름 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    피부 보습용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    피부자극 완화용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    아토피 피부 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    여드름 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    모발손상 방지용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은,
    탈모방지 및 육모 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 피부 외용제 조성물은,
    약학 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 약학 조성물은,
    염증질환 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 약학 조성물은,
    아토피 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 약학 조성물은,
    여드름 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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