FR3090275A1 - Substance biologiquement active, son procede de fabrication et son utilisation comme agent protecteur d’un tissu biologique - Google Patents
Substance biologiquement active, son procede de fabrication et son utilisation comme agent protecteur d’un tissu biologique Download PDFInfo
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Abstract
SUBSTANCE BIOLOGIQUEMENT ACTIVE, SON PROCEDE DE FABRICATION ET SON UTILISATION COMME AGENT PROTECTEUR D’UN TISSU BIOLOGIQUE La substance biologiquement active est obtenue ou susceptible d’être obtenue par extraction alcaline, par une solution aqueuse d’au moins une base en présence d’au moins un agent réducteur, d’au moins un champignon comestible macroscopique réduit en poudre, pour obtenir un mélange ayant une partie liquide contenant les matières extraites solubles et une partie solide formée de particules solides insolubles ; filtration du mélange obtenu pour en retirer la partie solide et clarification éventuelle de la partie liquide ; neutralisation de la partie liquide à l’aide d’au moins une résine échangeuse de cations et filtration/clarification éventuelle de la partie liquide ainsi neutralisée pour obtenir la substance biologiquement active en phase aqueuse ; et traitement de la phase aqueuse obtenue choisi parmi une dilution dans l’eau, une concentration, une déshydratation et une lyophilisation pour obtenir une substance biologiquement active respectivement davantage diluée dans l’eau, en solution aqueuse davantage concentrée, déshydratée sous forme de poudre ou lyophilisée.
Description
Description
Titre de l’invention : SUBSTANCE BIOLOGIQUEMENT ACTIVE, SON PROCEDE DE FABRICATION ET SON UTILISATION COMME AGENT PROTECTEUR D’UN TISSU BIOLOGIQUE
[0001] La présente invention porte sur une substance biologiquement active obtenue à partir d’au moins un champignon comestible macroscopique, sur son procédé de fabrication et sur son utilisation comme agent protecteur d’un tissu biologique.
[0002] On entend par tissu biologique une enveloppe d’un organisme, laquelle constitue une interface directe entre ledit organisme et l’environnement extérieur et doit donc être protégée de toute agression par tout agent exogène.
[0003] Comme tissu biologique, on peut donc mentionner aussi bien les tissus végétaux, tels que les parties aériennes des plantes, la vigne, le blé, les fruits, les tomates, les pommes de terre, etc., que la peau humaine ou animale.
[0004] Les tissus végétaux sont susceptibles d’être attaqués par des agents pathogènes, tels que les virus, les bactéries, les champignons ou les insectes et peuvent alors répondre à ces attaques par le développement, en particulier sous l’action de composés dits éliciteurs/réparateurs, de réponses physiologiques ou métaboliques de défense naturelle qui consistent en :
[0005] - le renforcement des barrières cellulaires préexistantes par la stimulation de la lignification des parois des cellules végétales ;
[0006] - la synthèse par la plante de composés à activité antibiotique, tels que les phytoalexines ;
[0007] - la synthèse de protéines enzymatiques pouvant s’attaquer à la paroi des pathogènes, telles que les chitinases ou les glucanases.
[0008] La peau humaine ou animale constitue l’interface directe entre l’homme et son environnement. Elle doit donc le protéger contre les agressions extérieures mais elle subit également des dommages liés à cet environnement. Ces dommages peuvent être importants tels que des plaies ou des brûlures, mais aussi plus lents et « mineurs » tels que les rides.
[0009] Le mécanisme d’apparition des rides fait intervenir à la fois des facteurs intrinsèques et extrinsèques. Parmi les facteurs intrinsèques induisant la formation des rides, on retrouve plusieurs mécanismes : diminution de l’hydratation ; diminution de la production de collagène III et prédominance du collagène de type I plus rigide ; diminution de 50% du renouvellement cellulaire ; raréfaction des kératinocytes en raison de la diminution de la capacité de migration vers la surface de l’épiderme.
[0010] De plus, l’organisme a son propre système de défense pour neutraliser les dommages liés aux radicaux libres, mais, avec l’âge, l’efficacité de ce système décline et notre besoin en anti-oxydants augmente.
[0011] A ce vieillissement génétiquement programmé s’ajoutent des facteurs environnementaux qui vont accélérer ce processus : les agressions climatiques, pathologiques.. . Les comportements peuvent également largement influer sur l’aspect de la peau : tabac, alcool, etc. Les dermatologues estiment que 90% du vieillissement cutané est dû à ces facteurs exogènes.
[0012] De façon générale, le processus de réparation de la peau doit faire intervenir plusieurs facteurs, tels que la prolifération des cellules du derme et de l’épiderme ; la synthèse et/ou le remodelage de la matrice extracellulaire ; la protection contre les radicaux libres.
[0013] Les présents inventeurs ont recherché une substance biologiquement active avantageusement d’origine naturelle et facile à fabriquer qui puisse protéger efficacement tout tissu biologique, jouant notamment le rôle d’éliciteurs/réparateurs dans le cas du tissu végétal, et le rôle d’ingrédient cosmétique protecteur dans le cas de la peau.
[0014] Cette recherche leur a permis de découvrir une substance biologique issue d’un champignon comestible macroscopique dont ils ont démontré les propriétés protectrices pour tous ces tissus biologiques.
[0015] L’invention a donc d’abord pour objet une substance biologiquement active obtenue ou susceptible d’être obtenue par :
[0016] - extraction alcaline, par une solution aqueuse d’au moins une base en présence d’au moins un agent réducteur, d’au moins un champignon comestible macroscopique réduit en poudre, pour obtenir un mélange ayant une partie liquide contenant les matières extraites solubles et une partie solide formée de particules solides insolubles ;
- filtration du mélange obtenu pour en retirer la partie solide et clarification éventuelle de la partie liquide ;
- neutralisation de la partie liquide à l’aide d’au moins une résine échangeuse de cations et filtration/clarification éventuelle de la partie liquide ainsi neutralisée pour obtenir la substance biologiquement active en phase aqueuse ; et - traitement de la phase aqueuse obtenue choisi parmi une dilution dans l’eau, une concentration, une déshydratation et une lyophilisation pour obtenir une substance biologiquement active respectivement davantage diluée dans l’eau, en solution aqueuse davantage concentrée, déshydratée sous forme de poudre ou lyophilisée.
[0017] Le ou les champignons soumis à l’extraction peuvent être choisis dans le groupe formé par les pleurotes, les coulemelles et les champignons de Paris.
[0018] La base peut être choisie parmi les bases hydroxylées, telles que l’hydroxyde de sodium et l’hydroxyde de potassium ; le ou les agents réducteurs peuvent être choisis parmi les borohydrures alcalins, tels que le borohydrure de sodium ou de potassium ; et la résine échangeuse de cations peut être choisie parmi les résines à groupements sulfoniques, phosphore, carboxyméthyle, carboxyliques.
[0019] La substance biologiquement active peut comporter, pour 100 parties en poids de matière sèche :
[0020] - 30 à 75 parties en poids de sucres totaux, dont :
- 9 à 25 parties en poids de β-glucanes ; et
- 0,8 à 2,4 parties en poids de glucosamine et/ou de glucosamine acétylée ;
- 7 à 36 parties en poids de peptides totaux/protéines totales ;
- le complément étant constitué par des matières minérales,
[0021] 80 à 100 % des composés organiques ayant notamment une masse en fonction de la taille moléculaire moyenne comprise entre 20 et 45 kDa.
[0022] L’invention porte également sur un procédé de fabrication d’une substance biologiquement active, caractérisé par le fait qu’il comporte les étapes successives suivantes consistant à :
[0023] a. conduire une extraction alcaline, par une solution aqueuse d’au moins une base en présence d’au moins un agent réducteur, d’au moins un champignon comestible macroscopique réduit en poudre, pour obtenir un mélange ayant une partie liquide contenant les matières extraites solubles et une partie solide formée de particules solides insolubles ;
b. filtrer le mélange obtenu pour en retirer la partie solide en faisant éventuellement suivre par une clarification ;
c. neutraliser la partie liquide à l’aide d’au moins une résine échangeuse de cations en faisant éventuellement suivre par une filtration/clarification de la partie liquide ainsi neutralisée pour obtenir la substance biologiquement active en phase aqueuse ; et
d. facultativement, conduire un traitement ultérieur de la phase aqueuse obtenue, choisi parmi une dilution dans l’eau, une concentration, une déshydratation et une lyophilisation pour obtenir une substance biologiquement active respectivement davantage diluée dans l’eau, en solution aqueuse davantage concentrée, déshydratée sous forme de poudre ou lyophilisée.
[0024] La ou les opérations de l’étape (b) peuvent conduire à éliminer les particules solides de taille supérieure à 1 μιη.
[0025] La filtration/clarification éventuelle de l’étape (c) vise à éliminer les particules de résine échangeuse de cations qui pourraient subsister dans la phase aqueuse.
[0026] On peut utiliser un champignon choisi dans le groupe formé par les pleurotes, les coulemelles et les champignons de Paris, la poudre de champignon représentant notamment 5 à 15 % en poids de la solution aqueuse d’au moins une base.
[0027] Pour l’extraction alcaline, on peut utiliser de l’hydroxyde de sodium ou de l’hydroxyde de potassium comme base, et un borohydrure alcalin, tel que le borohydrure de sodium ou de potassium, comme agent réducteur, le ou les agents réducteurs étant utilisés notamment à raison de 0,05 à 1 g/100 mL de la solution aqueuse d’au moins une base ; et que, pour la neutralisation, on utilise au moins une résine échangeuse d’ions choisie parmi les résines à groupements sulfoniques, phosphore, carboxyméthyle, carboxyliques.
[0028] On peut conduire l’extraction alcaline en chauffant la solution aqueuse d’au moins une base, en présence d’au moins un agent réducteur, à une température de 25 à 100°C pendant au moins 2 heures sous agitation.
[0029] L’invention porte également sur une utilisation d’une substance biologiquement active telle que définie ci-dessus ou préparée par le procédé tel que défini ci-dessus, comme agent protecteur d’un tissu biologique à l’encontre d’une agression par au moins un agent exogène.
[0030] Le tissu biologique peut être un tissu végétal, le ou les agents exogènes peuvent être des champignons pathogènes, des bactéries, des virus, des insectes et/ou un agent agresseur physique tel que la pluie, le gel, la température et les stress environnementaux, et l’agent protecteur peut être un agent éliciteur/réparateur dudit tissu végétal, en particulier des plantes agronomiquement utiles ou ornementales, notamment pour un traitement préventif contre les maladies cryptogamiques et les maladies bactériennes, notamment celles choisies dans le groupe formé par les maladies de conservation des fruits, les maladies de la vigne, des arbres fruitiers, des cultures légumières et des céréales. A titre d’exemples de ces maladies cryptogamiques et bactériennes, on peut mentionner :
[0031] · le mildiou (Plasmopara vilicola) ;
• l’oïdium (Erysiphe necalor) ;
• les maladies causées par Xanthomonas sp., par Pseudomonas syringae ;
• le feu bactérien (Erwinia amylovora) ;
• la pourriture grise (Botrytis cinerea) ;
• le mildiou (Phytophthora infestons) de la pomme de terre ;
• la rouille jaune (Septoria sp., Stagonospora nodorum) ;
• la fusariose des épis (Fusarium graminearum) du blé et la tavelure du pommier (Venturia inaequalis) ;
• les maladies de conservation des pommes (Pénicillium expansum) ;
• la moniliose (Monilia frucligena) ;
• les Gloésporioses (Neofabrea sp., Glomerella sp., Nectria sp.).
[0032] L’invention porte également sur une composition de traitement protecteur d’un tissu végétal, caractérisée par le fait qu’elle consiste en la substance biologiquement active telle que définie ci-dessus ou préparée par le procédé tel que défini ci-dessus, obtenu en milieu aqueux notamment à une concentration de 8 à 140 g/L, le cas échéant diluée, le cas échéant concentrée ou déshydratée ou lyophilisée,
[0033] le cas échéant en combinaison avec au moins l’un parmi les agents de formulation compatibles, les agents anti-phytopathogènes, notamment choisis dans le groupe formé par les agents fongicides, les agents antibactériens, les agents antiviraux, les agents pesticides et les agents de biocontrôle, les éléments nutritifs pour les plantes, et les agents d’enrobage de fruits/légumes pour former une cire d’enrobage.
[0034] L’invention porte également sur un procédé de traitement protecteur d’un tissu végétal, caractérisé par le fait qu’il consiste à appliquer la composition telle que définie ci-dessus, lorsqu’elle est en phase aqueuse notamment avec la substance biologiquement active après dilution 50 à 400 fois par pulvérisation sur les parties aériennes des plantes, aux stades végétatifs précoces et/ou aux stades végétatifs adultes et reproducteurs, en une fois ou en plusieurs fois, par exemple jusqu’à 40 fois, à des intervalles de temps répétés, notamment tous les deux à trente jours, ou encore par trempage des produits récoltés, tels que fruits et légumes cueillis, dans ladite composition en phase aqueuse, ou encore par arrosage de racines, ou lorsqu’elle est sous forme d’une cire d’enrobage, par enrobage de fruits/légumes.
[0035] L’invention porte également sur une utilisation caractérisée par le fait que le tissu biologique est la peau humaine ou animale, le ou les agents exogènes étant des agents oxydants, des produits chimiques et/ou des agresseurs physiques et l’agent protecteur est un agent de traitement cosmétique de la peau, notamment d’une peau âgée comportant des rides à réduire ou d’une peau jeune ayant une souplesse et une élasticité à améliorer.
[0036] L’invention porte également sur une composition de traitement protecteur de la peau humaine ou animale, caractérisée par le fait qu’elle consiste en la substance biologiquement active telle que définie ci-dessus ou préparée par le procédé tel que défini ci-dessus, en milieu aqueux ou à l’état de poudre, en combinaison avec au moins un adjuvant cosmétique pour faciliter sa répartition sur la peau.
[0037] L’invention porte également sur un procédé de traitement protecteur de la peau humaine ou animale, caractérisé par le fait qu’il consiste à répartir par étalement ou pulvérisation la composition telle que définie ci-dessus, notamment sous forme de crème ou de solution sur la zone de peau à traiter pour obtenir sur la peau un effet protecteur à chaque application, notamment à raison de 0,005 à 100 g de substance biologiquement active pour 100 g de composition.
[0038] La substance biologique de l’invention dynamise le métabolisme dermique en augmentant la prolifération des fibroblastes et en favorisant la synthèse des constituants matriciels. Cette activité sur la matrice extracellulaire favorise l’élasticité de la peau et la production de collagène. Cette action contribue au lissage du microrelief de la peau et à estomper les rides.
[0039] Cette diminution du microrelief, cumulée avec l’activité de stimulation de synthèse de la matrice extracellulaire, contribue à l’obtention de l’effet tenseur observable avec la substance biologique de l’invention.
[0040] De plus, la substance biologique de l’invention a une activité protectrice grâce à son activité anti-oxydante. Elle permet de restaurer une partie du capital anti-oxydant et ainsi de limiter les dommages causés par les radicaux libres.
[0041] Du fait de ses propriétés sur la prolifération cellulaire, la synthèse de matrice extracellulaire et la protection contre les radicaux libres, la substance biologique de l’invention contribue donc à accélérer ce processus de réparation tissulaire.
[0042] Les Exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. Dans ces exemples, les pourcentages sont en poids sauf indication contraire.
[0043] Exemple 1 : Préparation d’un extrait de Pleurotus ostreatus sous forme lyophilisée [0044] La matière première est constituée de champignons Pleurotus Ostreatus entiers récoltés en mars. 200 g de Pleurotes séchés et broyés (<10mm) sont dispersés dans 2L de soude à 2 %, en présence de borohydrure de sodium à 0,5 % (m/v). L'extraction est réalisée à 50°C pendant 8 heures, sous agitation mécanique.
[0045] Par filtration à 200pm, on élimine la fraction insoluble dans NaOH/NaBH4. Le filtrat obtenu est ensuite clarifié par filtrations en profondeur successives jusqu’à Ipm.
[0046] L’extrait clarifié ainsi obtenu est neutralisé par mise en contact avec une résine échangeuse de cations (Purolite C150H).
[0047] L'extrait neutralisé est clarifié par filtration à Ipm.
[0048] On obtient ainsi un extrait liquide clarifié, qui après lyophilisation permet de récupérer 53 g d'une poudre de couleur beige constituant l'extrait.
[0049] La composition de l’extrait obtenu est rapportée dans le Tableau 1 ci-après
[0050]
[Tableaux 1]
| Composés majoritaires dans l’extrait | Pourcentages (% m/m) |
| Sucres totaux (7) | 45,0 |
| dont oses neutres (1) | 29,2 |
| dont β-glucanes (2) | 13,6 |
| dont glucosamine (3) | 2,1 |
| Protéines totales (4) | 30,1 |
| dont protéines > 3000 Da (5) | 7,8 |
| Matière minérale (6) | 24,9 |
| Mn (kDa) (8) | 25kDa«35kDa pour >95% des composés organiques de l’extrait |
[0051] (1) La quantité d’oses neutres est obtenue par dosage par la méthode phénol acide sulfurique, selon Dubois et al. (Dubois, Gille, Hamilton, Rebers, Smith, Colorimetric method for determination of sugars and relative substances, Analytical Chemistry 28, 350-356 (1956)).
[0052] (2) Les β-glucanes sont dosés par un kit d’analyse (K-YBGL 09/14, Megazyme).
[0053] (3) La quantification de la glucosamine est effectuée par dosage par le MBTH selon
Smith et al. (Smith & Gilkerson : Quantitation of glycosaminoglycan hexosamine using 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone hydrochloride, Analytical Biochemistry 98, 478-480 (1979)).
[0054] (4) La quantité de protéines totales est évaluée avec un dosage d’azote par Kjeldahl dont la valeur obtenue est multipliée par 6,25.
[0055] (5) Les protéines > 3000 Da sont dosées par la méthode Bradford (Bradford, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry 72, 248-254 (1976)).
[0056] (6) La matière minérale est quantifiée à la suite d’une calcination à 650°C.
[0057] (7) La quantité de sucres totaux est calculée par différence avec la matière minérale et les protéines totales.
[0058] (8) Les tailles moléculaires moyennes sont déterminées par analyse en chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière et la viscosimétrie.
[0059] Exemple 2 : Préparation d’un extrait de Pleurotus ostreatus en phase aqueuse
[0060] La matière première est constituée de champignons Pleurotus Ostreatus entiers récoltés en mai. 200 g de Pleurotes séchés et broyés (<10mm) sont dispersés dans 2L de soude à 2 %, en présence de borohydrure de sodium à 0,5 % (m/v). L'extraction est réalisée à 50°C pendant 8 heures, sous agitation mécanique.
[0061] Par filtration à 200pm, on élimine la fraction insoluble dans NaOH/NaBH4. Le filtrat obtenu est ensuite clarifié par filtrations en profondeur successives jusqu’à Ipm.
[0062] L’extrait clarifié ainsi obtenu est neutralisé par mise en contact avec une résine échangeuse de cations (Purolite C150H). L'extrait neutralisé est clarifié par filtration à Ipm. On obtient ainsi un extrait liquide clarifié contenant 34,7 g/L de matière sèche constituant l'extrait.
[0063] La composition de l’extrait obtenu est rapportée dans le Tableau 2 ci-après. Les résultats de composition sont la moyenne issue de 2 réplicas réalisés avec la même matière première.
[0064] [Tableaux2]
| Composés | Pourcentages |
| Sucres totaux (7) | 51,8 + 2,7 |
| dont oses neutres (1) | 27,6 + 1,3 |
| dont β-glucanes (2) | 15,8 + 2,8 |
| dont glucosamine (3) | 1,6 + 0,1 |
| Protéines totales (4) | 22,7 + 3,6 |
| dont protéines > 3000 Da (5) | 7,1+0,9 |
| Matière minérale (6) | 25,5+ 0,9 |
| Mn (kDa) (8) | 25kDa«35kDa pour >95% des composés organiques de l’extrait |
[0065] Exemple 3 : Stimulation des défenses naturelles des tomates avec l’extrait de l’Exemple 1
[0066] L’extrait de pleurote selon l’Exemple 1 a été testé sur des plantes pour évaluer l’induction des défenses de la plante dans le contexte de l’attaque par un pathogène après un traitement préventif par l’extrait de pleurote.
[0067] Le modèle utilisé est un modèle de plants de tomates cultivées sous serre à partir de semis réalisés dans du terreau horticole. Les plants sont âgés d’un mois au moment du traitement.
[0068] Ils subissent d’abord un pré-traitement consistant en 3 applications sous forme de pulvérisations foliaires du produit à tester. Ces applications sont réalisées à 2 jours d’intervalle et jusqu’à ruissellement. Puis 7 jours après la première application, le pathogène est inoculé sous forme d’une infiltration au niveau d’une feuille d’une suspension de spores de Botrytis cinerea, à raison de 100 000 conidies par mL d’une solution de Tween 80 à 0,05 %. Il s’agit d’une souche de Botrytis cinerea (référence UBOCC-A-101100) fournie par l’Université de Bretagne Occidentale.
[0069] A nouveau 7 jours plus tard, les plants sont récoltés, congelés dans l’azote liquide et conservés à -20 °C avant d’être analysés.
[0070] L’activité peroxydase a été évaluée selon le protocole décrit par J.S. Shindler, R. E. Childs, et W. G. Bardsley. Peroxidase from Human Cervical Mucus: The Isolation and Characterization. Eur. J. Biochem.65, 325-331 (1976). Cette enzyme intervient dans la régulation du stress oxydatif et est classée parmi les PR protéines (Pathogenesis Related proteins).
[0071] Deux produits ont été appliqués sur les plants, à savoir :
[0072] - BF : le blanc de formulation correspondant à une solution connue par l’homme du métier par exemple une composition constituée d’un tensio-actif associé à un conservateur, celui-ci est préparé dans l’eau distillée ;
- Extrait de pleurote obtenu selon l’Exemple 1 (35 g matière sèche /L) dilué dans du BF.
[0073] Le Tableau 3 ci-après indique les activités peroxydase quantifiées chez des plants de tomate ayant subi un pré-traitement :
[0074] - soit par le blanc de formulation ;
[0075] - soit par l’extrait de pleurote (Exemple 1).
[0076] Les activités sont exprimées en % de l’activité mesurée pour le témoin (blanc de formulation BF). Les étoiles correspondent à des résultats significativement différents au seuil de 1 % (Test de Kruskal Wallis, moyenne, n=27). Les résultats sont la moyenne de 3 expériences indépendantes.
[0077] [Tableaux3]
| Activité de stimulation des défenses naturelles sur tomate | Peroxydase (% d’activité) |
| Blanc de formulation | 100 |
| Extrait de pleurote formulé | 161,9** |
[0078] Les résultats montrés sur le Tableau 3, attestent, d’un effet de l’extrait de pleurote sur le marqueur peroxydase d’une amplitude de + 61,9 % par rapport au témoin.
[0079] Ainsi, les plants ayant subi un pré-traitement par l’extrait de pleurote ont des défenses stimulées leur permettant de mieux résister aux attaques par les pathogènes. [0080] Exemple 4 : Efficacité de l'extrait de pleurote de l’Exemple 2 sur la réduction des symptômes liés au mildiou ( Plasmouara viticola 1 sur la vigne au cours d'un essai plein champ
[0081] Un essai plein champ a été conduit sur la vigne (Vitis vinifera), cépage Merlot, au cours de l'année 2018 dans le Sud-Ouest de la France, en vue de déterminer l'efficacité de l'extrait de pleurote de l’Exemple 2 en protection vis-à-vis du mildiou (Plasmopara viticola), seul ou en programme avec la bouillie bordelaise BBRSR Dispers NC (UPL EUROPE LTD ; 750 g Cu/ha). Sur la parcelle expérimentale, 4 micro-parcelles par condition de traitement ont été réparties statistiquement.
[0082] Les traitements ont été réalisés entre le 26/04/18 et le 14/06/18 avec un volume de pulvérisation allant de 200 à 300 L/ha en fonction de l’augmentation de la surface foliaire. Le témoin non traité reçoit des pulvérisations d’eau ; le traitement par la bouillie bordelaise consiste à appliquer à partir de la floraison la dose équivalente à 750 g Cu/ha (Tableau 4 ci-après). L'extrait de pleurote obtenu selon l’Exemple 2 est appliqué sous forme de solution aqueuse formulée avec un tensio-actif et un conservateur, l’extrait est utilisé à une dose de 35 g/ha, soit seul, soit en programme avec de la bouillie bordelaise. Un témoin partiel de bouillie bordelaise seule est également testé afin de voir l’apport de l’extrait de pleurote dans un tel programme.
[0083] Le Tableau 4 ci-après montre le calendrier de traitement pour les différentes modalités.
[0084]
[Tableaux4]
| Traitement No. | Traitement | A Dose kg ou L /ha | B Dose kg ou L /ha | c Dose kg ou L /ha | D Dose kg ou L /ha | E Dose kg ou L /ha | F Dose kg ou L /ha | G Dose kg ou L /ha | H Dose kg ou L /ha |
| Stade application | BBC H 14 | BBC H 53 | BBC H 55 | BBC H 57 | BBC H 57 | BBC H 57 | BBC H 65 | BBC H71 | |
| Volume de pulvéri-sati on | 200 L/ha | 250 L/ha | 250 L/ha | 300 L/ha | 300 L/ha | 300 L/ha | 300 L/ha | 300 L/ha | |
| 1 | Non traité (eau) | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 2 | Pie | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 3 | BBRSR DISPERSS | 3,75 | 3,75 | 3,75 | |||||
| 4 | Pie | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| BBRSR DISPERSS | 3,75 | 3,75 | 3,75 |
[0085] BBRSR : bouillie bordelaise ;
[0086] Pie : extrait de pleurote ;
[0087] - : traitement à l’eau.
[0088] [fig-1] du dessin annexé montre l’intensité de maladie (%) sur des grappes de vignes attaquées par du mildiou après traitement (ou non) par l'extrait de pleurote, ainsi qu'en programme avec de la bouillie bordelaise (extrait pleurote/BBRSR). Les notations présentées sur la Ligure 1 ont été réalisées le 13 juin au stade BBCH 71. L’intensité des attaques est estimée par la surface des grappes attaquées par la maladie.
[0089] L'extrait de pleurote (Pie) seul permet donc une réduction des symptômes d'attaque par le mildiou de l’ordre de 78% par rapport au témoin traité à l’eau. En programme avec la bouillie bordelaise l’apport d’efficacité de l’extrait de pleurote est de 68% par rapport au témoin partiel de bouillie bordelaise seule. Ce programme Ple/BBRSR permet d’obtenir une efficacité de 78% sur la réduction des symptômes provoqués par le mildiou de la vigne.
[0090] Exemple 5 : Efficacité de l'extrait de pleurote de l’Exemple 2 sur la réduction des symptômes liés au mildiou ( Plasmooara viticola ) sur la vigne au cours d'un essai plein champ
[0091] Un essai plein champ a été conduit sur la vigne (Vitis vinifera), cépage Melon, au cours de l'année 2018 dans le Nord-Ouest de la France, en vue de déterminer l'efficacité de l'extrait de pleurote de l’Exemple 2 en protection vis-à-vis du mildiou ( Plasmopara viticola), seul ou en programme avec une couverture chimique (Tableau 5 de traitements ci-après). Sur la parcelle expérimentale, 4 micro-parcelles par condition de traitement ont été réparties statistiquement.
[0092] Les traitements ont été réalisés entre le 26/04/18 et le 27/07/18 avec un volume de pulvérisation allant de 130 à 200 L/ha en fonction de l’augmentation de la surface foliaire. Le témoin non traité ne reçoit aucune pulvérisation ; le traitement par la couverture chimique consiste à appliquer 3 types de produits conventionnels à partir du stade BBCH 14 (Tableau 5 ci-après). L'extrait de pleurote obtenu selon l’exemple 2 est appliqué sous forme de solution aqueuse formulée avec un tensio-actif et un conservateur, l’extrait est utilisé à une dose de 35 g/ha, soit seul, soit en programme avec des produits conventionnels et en comparaison avec un programme conventionnel complet.
[0093] Le Tableau 5 montre le calendrier de traitement pour les différentes modalités.
[0094]
[Tableaux5]
| Traiteme nt No. | Traite ment | A Do se kg ou L / ha | B Do se kg ou L / ha | C Do se kg ou L / ha | D Do se kg ou L / ha | E Do se kg ou L / ha | F Do se kg ou L / ha | G Do se kg ou L / ha | H Do se kg ou L / ha | I Do se kg ou L / ha | J Do se kg ou L / ha | K Do se kg ou L / ha | L Do se kg ou L / ha | M Do se kg ou L / ha | N Do se kg ou L / ha |
| Stade application | BB CH 14 | BB CH 53 | BB CH 53 | BB CH 55 | BB CH 57 | BB CH 61 | BB CH 65 | BB CH 71 | BB CH 73 | BB CH 77 | BB CH 79 | BB CH 79 | BB CH 79 | BB CH 79 | |
| Volume de pulvérisation | 130 L/h a | 130 L/h a | 130 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | 200 L/h a | |
| 1 | Témoin Non traité | ||||||||||||||
| 2 | Pie | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| 3 | LBG 01F34 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |||||||||
| POLY RAM DF | 2 | 2 | |||||||||||||
| MIKA L FLASH | 4 | 4 | |||||||||||||
| DITHA NE NEOT EC | 2 | 2 | 2 |
| 4 | Pie | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||||||||
| LBG 01F34 | 3 | ||||||||||||||
| MIKA L FLASH | 4 | 4 | |||||||||||||
| DITHA NE NEOT EC | 2 |
[0095] Pie : extrait de pleurote (35 g/L) ;
[0096] LBG01F34 : Phosphonates de potassium (730 g/L) ;
[0097] Polyram DF : Metiram (700 g/kg) ;
[0098] Mikal Flash : Fosetyl / Folpet (500/250 g/kg) ;
[0099] Dithane Neotec : Mancozeb (750 g/kg).
[0100] [fig.2] du dessin annexé montre l’intensité de maladie (%) sur des grappes de vignes attaquées par du mildiou, après traitement (ou non) par l'extrait de pleurote, ainsi qu'en programme avec une couverture conventionnelle (extrait pleurote/Conv). Les notations présentées sur la Figure 2 ont été réalisées le 24 juillet 2018 au stade BBCH 79.
L’intensité des attaques est estimée par la surface des grappes attaquées par la maladie. [0101] L'extrait de pleurote (Pie) seul permet donc une réduction des symptômes d'attaque par le mildiou de l’ordre de 48% par rapport au témoin non traité. Le remplacement de 2 applications de 2 produits chimiques (LBG 01F34 et Polyram DF) par 3 applications d’extrait de pleurote formulé avant la floraison permet d’obtenir des niveaux de protection statistiquement équivalents à la couverture conventionnelle totale (Conventionnel). Ce programme Ple/Conv permet d’obtenir une efficacité de 84% sur la réduction des symptômes provoqués par le mildiou de la vigne.
[0102] Exemple 6 : Efficacité de l'extrait de pleurote de l’Exemple 2 sur la réduction des symptômes liés à la septoriose ( Septoria tritici 1 du blé au cours d'un essai plein champ
[0103] Un essai plein champ a été conduit sur du blé tendre (Triticum aestivum), variété Advisor au cours de l'année 2018 dans le Nord-Ouest de la France, en vue de déterminer l'efficacité de l'extrait de pleurote de l’Exemple 2 en protection vis-à-vis de la septoriose du blé tendre (Septoria tritici), seul ou en programme avec une couverture chimique (Cf Tableau 6 de traitements). Sur la parcelle expérimentale, 5 micro15 parcelles par condition de traitement ont été réparties statistiquement.
[0104] Les traitements ont été réalisés entre le 22/03/18 et le 03/05/18 avec un volume de pulvérisation de 200 L/ha. Le témoin non traité reçoit des pulvérisations avec de l’eau ; le traitement par la couverture chimique consiste à appliquer 2 types de produits conventionnels à partir du stade BBCH 29 (Tableau 6). L'extrait de pleurote obtenu selon l’Exemple 2 est appliqué sous forme de solution aqueuse formulée avec un tensio-actif et un conservateur, l’extrait est utilisé à une dose de 35 g/ha, soit seul, soit en programme avec des produits conventionnels et en comparaison avec un programme conventionnel complet.
[0105] Le Tableau 6 ci-après montre le calendrier de traitement pour les différentes modalités.
[0106] [Tableaux6]
| Trt No. | Traitement | T0 Dose kg ou L /ha | Tl Dose kg ou L /ha | T2 Dose kg ou L /ha |
| Stade application | 29 | 32 | 39 | |
| Volume de pulvérisation | 200 L/ha | 200 L/ha | 200 L/ha | |
| 1 | Non traité (eau) | - | - | - |
| 2 | CHEROKEE | 2 | ||
| ADEXAR | 2 | |||
| 3 | COV17-01 | 1 | 1 | 1 |
| 4 | COV17-01 | 1 | 1 | |
| ADEXAR | 2 |
[0107] Pie : extrait de pleurote (35 g/L) formulé ;
[0108] CHEROKEE : Propiconazole / Cyproconazole / Chlorothalonil (62,5/50/375 g/L) ;
[0109] ADEXAR : Epoxiconazole / Eluxapyroxad (62,5/62,5 g/L) ;
[0110] - : traitement à l’eau.
[0111] [fig.3] du dessin annexé montre l’intensité de maladie (%) sur la feuille El de blé tendre attaquée par la septoriose après traitement (ou non) par l'extrait de pleurote, ainsi qu'en programme avec une couverture conventionnelle (Ple/Conv). Les notations présentées sur la Ligure 3 ont été réalisées le 18 juin 2018 au stade BBCH 75.
L’intensité des attaques est estimée par la surface des feuilles attaquées par la maladie.
[0112] L'extrait de pleurote (Pie) seul permet donc une réduction des symptômes d'attaque par la septoriose de l’ordre de 50% par rapport au témoin traité à l’eau. Le remplacement d’une application de produit chimique (Cherokee) par 2 applications d’extrait de pleurote formulé permet d’obtenir des niveaux de protection statistiquement équivalents à la couverture conventionnelle totale (Conventionnel). Ce programme Ple/Conv permet d’obtenir une efficacité de 95,5% sur la réduction des symptômes provoqués par la septoriose du blé.
[0113] Exemple 7 : Activité anti-oxydante des extraits des Exemples 1 et 2
[0114] Principe :
[0115] L’évaluation de l’activité anti-oxydante a été réalisée par la méthode ORAC (Oxygen Radical Antioxidant Capacity). Elle consiste à mesurer la protection exercée par une molécule donnée contre l’oxydation de la fluorescéine (CAS 518-47-8) par un radical libre stable, ΓΑΑΡΗ dichlorhydrate de (2,2'-azobis (2-amidino-propane)) (CAS 2997-92-4).
[0116] Les résultats, rapportés dans le Tableau 7 ci-après, sont exprimés par rapport à la protection exercée par un anti-oxydant de référence, le Trolox (CAS 53188-07-1).
[0117] Gamme étalon : Solution-mère de Trolox à 0,002M (25 mg dans 50 ml de tampon phosphate).
[0118] Dilution des échantillons : réalisées dans le tampon phosphate à pH 7,4.
[0119] [Tableaux7]
| Espèce | Activité en pmol équivalent Trolox/g |
| Extrait selon l’exemple 1 | 179 + 9 |
| Extrait selon l’exemple 2 | 144 + 7 |
[0120] On constate que la réalisation de l’extrait selon l’invention permet d’obtenir une activité anti-oxydante. Cette activité varie légèrement en fonction de la date de récolte du pleurote.
[0121] Exemple 8 : Evaluation de l’impact de l’extrait de l’Exemple 1 sur la prolifération fibroblastique
[0122] L’objectif est d’évaluer l’impact de l’extrait de pleurote obtenu selon l’Exemple 1 sur la réparation tissulaire au niveau de la peau. Cette évaluation se fait en comparaison avec un témoin non traité.
[0123] L’extrait de pleurote sec, obtenu selon l’Exemple 1, est dilué dans le milieu de culture DMEM Glutamax afin d’obtenir une solution-mère de traitement à 1 mg/mL qui est ensuite filtrée à 0,2 pm pour éliminer toute contamination par des microorganismes.
[0124] Le protocole opératoire est le suivant :
[0125] Les cultures primaires de fibroblastes de peau humaine de 44 ans (PAL 08052) sont ensemencées dans des microplaques à 48 puits à raison de 10 000 cellules par puits avec un volume de milieu de culture (DMEM glutamax) de 500 pL. Les cellules adhèrent au fond des puits pendant 24 heures. Le milieu de culture est ensuite remplacé par l’extrait obtenu selon l’Exemple 1 dilué dans du milieu de culture puis filtré, et un témoin sans traitement sera réalisé (DMEM glutamax). Plusieurs concentrations seront testées à raison de 500 pL par puits et incubées 48 heures à 37°C dans une atmosphère contenant 5% en volume de CO2. Les cellules sont ensuite décollées à la trypsine, puis comptées sur lame de Malassez. Les analyses sont réalisées sur 6 réplicats.
[0126] Les résultats, indiqués dans le Tableau 8 ci-après, sont exprimés en pourcentages de prolifération par rapport au témoin non traité. Une analyse statistique par test de Wilcoxon-Mann-Withney est réalisée sur les résultats afin de déterminer la significativité des valeurs. Les étoiles de significativité indiquent le degré de significativité soit * p<0,05 ; *** p <0,001.
[0127] [Tableaux8]
| Concentration extrait | Pourcentage de prolifération | |
| Témoin non traité | 100,0 | |
| 50 pg/mL | 133,5 | *** |
| 200 pg/mL | 127,5 | * |
| 250 pg/mL | 161,9 | *** |
| 450 pg/mL | 125,0 | * |
| 650 pg/mL | 133,3 | * |
| 750 pg/mL | 133,3 | * |
| 900 pg/mL | 137,5 | * |
[0128] On constate que l’extrait obtenu selon l’Exemple 1 favorise la prolifération des fibroblastes de façon significative par rapport au témoin non traité, et donc la réparation tissulaire avec une meilleure activité à 250 pg/mL.
[0129] Exemple 9 : Evaluation de l’impact de l’extrait de l’Exemple 1 sur la prolifération kératinocytaire
[0130] L’objectif est d’évaluer l’impact de l’extrait de pleurote obtenu selon l’Exemple 1 sur la réparation de l’épiderme. Cette évaluation se fait en comparaison avec un témoin non traité.
[0131] L’extrait de pleurote selon l’Exemple 1 est dilué dans le milieu de culture KGM Gold afin d’obtenir une solution-mère de traitement à 1 mg/mL qui est ensuite filtrée à 0,2 pm pour éliminer toute contamination par des micro-organismes.
[0132] Le protocole opératoire est le suivant :
[0133] Les cultures primaires de kératinocytes de peau humaine de 43 ans (NHEK 33228) sont ensemencées dans des microplaques à 48 puits à raison de 10 000 cellules par puits avec un volume de milieu de culture KGM Gold de 500 pL. Les cellules adhèrent au fond des puits pendant 48 heures. Le milieu de culture est ensuite remplacé par l’extrait obtenu selon l’Exemple 1 dilué dans du milieu de culture et filtré ; de plus, un témoin sans traitement (uniquement milieu de culture) sera réalisé. Plusieurs concentrations seront testées à raison de 500 pL par puits et incubées 48 heures à 37°C dans une atmosphère enrichie par 5% en volume de CO2. Les tests sont réalisés en triplicats. Les cellules sont ensuite décollées à la Trypsine-EDTA puis comptées sur lame de Malassez.
[0134] Les résultats, indiqués dans le Tableau 9 ci-après, sont exprimés en pourcentages par rapport au témoin non traité. Une analyse statistique par test de WilcoxonMann-Withney est réalisée sur les résultats afin de déterminer la significativité des valeurs. Les étoiles de significativité indiquent le degré de significativité soit * p<0,05 ; ** p <0,01.
[0135] [Tableaux9]
| Concentration extrait | Pourcentage de prolifération | |
| Témoin non traité | 100,0 | |
| 50 pg/mL | 90,0 | |
| 100 pg/mL | 140,0 | * |
| 300 pg/mL | 150,0 | ** |
| 750 pg/mL | 160,0 | * |
[0136] On constate que l’extrait selon l’Exemple 1 favorise la prolifération des kératinocytes de façon significative par rapport au témoin non traité à partir de 100 pg/mL avec une plus forte activité à 750 pg/mL.
Claims (1)
-
Revendications [Revendication 1] Substance biologiquement active obtenue par : - extraction alcaline, par une solution aqueuse d’au moins une base en présence d’au moins un agent réducteur, d’au moins un champignon comestible macroscopique réduit en poudre, pour obtenir un mélange ayant une partie liquide contenant les matières extraites solubles et une partie solide formée de particules solides insolubles ; - filtration du mélange obtenu pour en retirer la partie solide et clarification éventuelle de la partie liquide ; - neutralisation de la partie liquide à l’aide d’au moins une résine échangeuse de cations et filtration/clarification éventuelle de la partie liquide ainsi neutralisée pour obtenir la substance biologiquement active en phase aqueuse ; et - traitement de la phase aqueuse obtenue choisi parmi une dilution dans l’eau, une concentration, une déshydratation et une lyophilisation pour obtenir une substance biologiquement active respectivement davantage diluée dans l’eau, en solution aqueuse davantage concentrée, déshydratée sous forme de poudre ou lyophilisée. [Revendication 2] Substance biologiquement active selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le ou les champignons soumis à l’extraction sont choisis dans le groupe formé par les pleurotes, les coulemelles et les champignons de Paris. [Revendication 3] Substance biologiquement active selon l’une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que la base est choisie parmi les bases hydroxylées, telles que l’hydroxyde de sodium et l’hydroxyde de potassium ; le ou les agents réducteurs sont choisis parmi les borohydrures alcalins, tels que le borohydrure de sodium ou de potassium ; et la résine échangeuse de cations est choisie parmi les résines à groupements sulfoniques, phosphore, carboxyméthyle, carboxyliques. [Revendication 4] Substance biologiquement active selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait qu’elle comporte, pour 100 parties en poids de matière sèche : - 30 à 75 parties en poids de sucres totaux, dont : - 9 à 25 parties en poids de β-glucanes ; et - 0,8 à 2,4 parties en poids de glucosamine et/ou de glucosamine acétylée ; - 7 à 36 parties en poids de peptides totaux/protéines totales ; - le complément étant constitué par des matières minérales, 80 à 100 % des composés organiques ayant notamment une masse en fonction de la taille moléculaire moyenne comprise entre 20 et 45 kDa. [Revendication 5] Procédé de fabrication d’une substance biologiquement active, caractérisé par le fait qu’il comporte les étapes successives suivantes consistant à : (a) conduire une extraction alcaline, par une solution aqueuse d’au moins une base en présence d’au moins un agent réducteur, d’au moins un champignon comestible macroscopique réduit en poudre, pour obtenir un mélange ayant une partie liquide contenant les matières extraites solubles et une partie solide formée de particules solides insolubles ; (b) filtrer le mélange obtenu pour en retirer la partie solide en faisant éventuellement suivre par une clarification ; (c) neutraliser la partie liquide à l’aide d’au moins un résine échangeuse de cations en faisant éventuellement suivre par une filtration/clarification de la partie liquide ainsi neutralisée pour obtenir la substance biologiquement active en phase aqueuse ; et (d) facultativement, conduire un traitement ultérieur de la phase aqueuse obtenue, choisi parmi une dilution dans l’eau, une concentration, une déshydratation et une lyophilisation pour obtenir une substance biologiquement active respectivement davantage diluée dans l’eau, en solution aqueuse davantage concentrée, déshydratée sous forme de poudre ou lyophilisée. [Revendication 6] Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l’on utilise un champignon choisi dans le groupe formé par les pleurotes, les coulemelles et les champignons de Paris, la poudre de champignon représentant notamment 5 à 15 % en poids de la solution aqueuse d’au moins une base. [Revendication 7] Procédé selon l’une des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que, pour l’extraction alcaline, on utilise de l’hydroxyde de sodium ou de l’hydroxyde de potassium comme base, et un borohydrure alcalin, tel que le borohydrure de sodium ou de potassium, comme agent réducteur, le ou les agents réducteurs étant utilisés notamment à raison de 0,05 à 1 g/100 mL de la solution aqueuse d’au moins une base ; et que, pour la neutralisation, on utilise au moins une résine échangeuse d’ions choisie parmi les résines à groupements sulfoniques, phosphore, carboxyméthyle, carboxyliques. [Revendication 8] Procédé selon l’une des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que l’on conduit l’extraction alcaline en chauffant la solution aqueuse d’au moins une base, en présence d’au moins un agent réducteur, à une température de 25 à 100°C pendant au moins 2 heures sous agitation. [Revendication 9] Utilisation d’une substance biologiquement active telle que définie à l’une des revendications 1 à 4 ou préparée par le procédé tel que défini à l’une des revendications 5 à 8, comme agent protecteur d’un tissu biologique à l’encontre d’une agression par au moins un agent exogène. [Revendication 10] Utilisation selon la revendication 9, caractérisée par le fait que le tissu biologique est un tissu végétal, le ou les agents exogènes sont des champignons pathogènes, des bactéries, des virus, des insectes et/ou un agent agresseur physique, tel que la pluie, le gel, la température et les stress environnementaux, et l’agent protecteur est un agent éliciteur/ réparateur dudit tissu végétal, en particulier des plantes agronomiquement utiles ou ornementales, notamment pour un traitement préventif contre les maladies cryptogamiques et les maladies bactériennes, notamment celles choisies dans le groupe formé par les maladies de conservation des fruits, les maladies de la vigne, des arbres fruitiers, des cultures légumières et des céréales, et notamment contre le mildiou (Plasmopara vilicola), l’oïdium (Erysiphe necalor), les maladies causées par Xanthomonas sp., par Pseudomonas syringae, le feu bactérien (Erwinia amylovora), la pourriture grise (Botrytis cinerea), le mildiou (Phytophthora infestons) de la pomme de terre, la rouille jaune (Septoria sp., Stagonospora nodorum), la fusariose des épis ( Fusarium graminearum) du blé et la tavelure du pommier (Venturia inaequalis), les maladies de conservation des pommes (Pénicillium expansum), la moniliose (Monilia fructigena), les Gloésporioses ( Neofabrea sp., Glome relia sp., Nectria sp.). [Revendication 11] Composition de traitement protecteur d’un tissu végétal, caractérisée par le fait qu’elle consiste en la substance biologiquement active telle que définie à l’une des revendications 1 à 4 ou préparée par le procédé tel que défini à l’une des revendications 5 à 8, obtenu en milieu aqueux notamment à une concentration de 8 à 140 g/L, le cas échéant diluée, le cas échéant concentrée ou déshydratée ou lyophilisée, le cas échéant en combinaison avec au moins l’un parmi les agents de formulation compatibles, les agents anti-phytopathogènes, notamment choisis dans le groupe formé par les agents fongicides, les agents antibactériens, les agents antiviraux, les agents pesticides et les agents de biocontrôle, les éléments nutritifs pour les plantes, et les agents d’enrobage de fruits/légumes pour former une cire d’enrobage. [Revendication 12] Procédé de traitement protecteur d’un tissu végétal, caractérisé par le fait qu’il consiste à appliquer la composition telle que définie à la revendication 11, lorsqu’elle est en phase aqueuse notamment avec la substance biologiquement active après dilution 50 à 400 fois par pulvérisation sur les parties aériennes des plantes, aux stades végétatifs précoces et/ou aux stades végétatifs adultes et reproducteurs, en une fois ou en plusieurs fois, par exemple jusqu’à 40 fois, à des intervalles de temps répétés, notamment tous les deux à trente jours, ou encore par trempage des produits récoltés, tels que fruits et légumes cueillis, dans ladite composition en phase aqueuse, ou encore par arrosage de racines, ou lorsqu’elle est sous forme d’une cire d’enrobage, par enrobage de fruits/légumes. [Revendication 13] Utilisation selon la revendication 9, caractérisée par le fait que le tissu biologique est la peau humaine ou animale, le ou les agents exogènes étant des agents oxydants, des produits chimiques et/ou des agresseurs physiques et l’agent protecteur est un agent de traitement cosmétique de la peau, notamment d’une peau âgée comportant des rides à réduire ou d’une peau jeune ayant une souplesse et une élasticité à améliorer. [Revendication 14] Composition de traitement protecteur de la peau humaine ou animale, caractérisée par le fait qu’elle consiste en la substance biologiquement active telle que définie à l’une des revendications 1 à 4 ou préparée par le procédé tel que défini à l’une des revendications 5 à 8, en milieu aqueux ou à l’état de poudre, en combinaison avec au moins un adjuvant cosmétique pour faciliter sa répartition sur la peau. [Revendication 15] Procédé de traitement protecteur de la peau humaine ou animale, caractérisé par le fait qu’il consiste à répartir par étalement ou pulvérisation la composition telle que définie à la revendication 14, notamment sous forme de crème ou de solution, sur la zone de peau à traiter pour obtenir sur la peau un effet protecteur à chaque application, notamment à raison de 0,005 à 100 g de substance biologiquement active pour 100 g de composition. 1/3
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