KR100829728B1

KR100829728B1 - 봉미초 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR100829728B1
Application number: KR1020070008759A
Authority: KR
Inventors: 심관섭; 이동환; 김진화; 나영; 이근수; 장영학; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2007-01-29
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2008-05-15

Abstract

본 발명은 봉미초 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 고란초목 고사리과에 속하는 봉미초의 전초(全草) 추출물을 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 자극완화효과, 여드름방지효과, 탈모 방지 및 육모 효과가 우수한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 봉미초 추출물은 활성산소 소거효과뿐만 아니라, 사람 섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 나타낸다.

봉미초 추출물, 항노화용 화장료, 주름 개선효과, 탈모, 육모, 여드름, 피부자극, 피부 외용제

Description

봉미초 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{A skin-care agent containing Pteris multifida extract}

본 발명은 유효성분으로 봉미초 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 고란초목 고사리과에 속하는 봉미초(Pteris multifida)의 전초(全草) 천연물로부터 제조된 추출물을 활성성분으로 0.001 - 30.0 중량%, 바람직하게는 0.01 - 5중량%를 함유하며 활성산소 소거효과, 주름 개선효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological)와 광노화(photoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751- 760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고 피부의 탄력에 지장을 주게 되며 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생하여 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloprotease; "MMP")라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질 의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 미역으로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다; 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다.

또한, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 상승되면 생성된 과잉의 피지가 모낭벽의 지나친 각화로 인하여 모낭 내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5 알파-리덕타아제(5α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하며 남성 호르몬들 중 하나인 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성 외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)은 여드름, 피지 증가, 탈모 및 전립선 비대증 등의 해당 조직에 관여한다(Diane et al. J.I.D. 1995). 특히, 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5 알파-리덕타아제에 의하여 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 탈모방지 및 여드름 방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물에 있어서 화장품으로서의 응용 가능성을 연구한 결과, 고란초목 고사리과에 속하는 전초(全草)인 봉미초를 선정하고 이로부터 추출물을 제조하여, 피부 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 개선효과, 피부자극완화 효과, 여드름방지효과 및 탈모방지 및 육모 효과를 측정한 결과 매우 우수함이 입증되어 화장료로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

봉미초(Pteris multifida )는 고란초목 고사리과의 상록 다년초로 관엽식물이다. 키는 30~70cm 정도로 뿌리가 강하고 크며, 잎은 피침형으로 흑갈색이다. 반그늘, 햇볕이 적당히 드는 암석지대나 바위그늘 등에 분포하며, 맛은 약간 쓴 편이고 성질은 차나 독이 없다. 대장·신장·심장·간에 작용하는 약재로서 몸의 열을 낮추고 피를 서늘하게 하며 지혈효과가 있고, 황달형 간염과 장염·토혈·코피·혈변·혈뇨·편도선염 등에 효과가 있다고 알려져 있다.

본 발명은 여러 천연물 중 고사리과 봉미초 추출물을 이용하여, 피부 외용제의 원료로서의 효능을 확인하고 그 사용 방법을 개발하고 이 원료를 사용함으로써 우수한 기능성을 갖는 피부 외용제를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용시 자외선 조사 등 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 우수한 탈모 방지효과 및 여드름 방지효과를 갖는 5 알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 봉미초 추출물을 이용하여 화장료를 제조하는 방법 및 그 화장료를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉미초 천연물을 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 식물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 봉미초 천연물의 함량이 피부외용제 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물을 제공한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 봉미초 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

봉미초 추출물은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화 제제 등의 약학 조성물로 제제화할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 젤라틴가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다. 상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피 흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

본 발명에서 제공되는 봉미초 추출물은 필요에 따라서 산 부가염으로 할 수 있다. 산 부가염으로서는 예를 들면 염산, 브롬화 수소산, 황산, 인산 등의 무기산과의 염, 초산, 프로피온산, 시트르산, 락트산, 옥살산, 말레인산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 메탄설폰산 등의 유기산과의 염을 들 수 있다. 이러한 염은 통상의 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 봉미초 추출물은 우수한 발모촉진효과, 육모 효과를 갖는다. 따라서, 이것을 두피에 도포하면 탈모의 치료, 개선, 탈모의 예방을 꾀할 수 있다.

본 발명의 봉미초 추출물은 남성형 탈모증과 남성 호르몬성 탈모라고도 불리 는 머리카락이 적어지거나, 탈모 이외에 원형탈모증, 비강성(粃糠性) 탈모증, 지루성 탈모증 등의 병적 탈모증에 적용할 수 있다. 본 발명의 봉미초 추출물 사용량으로서는 성별, 연령, 탈모와 줄어드는 머리카락 등의 증상의 정도 등에 따라서 적절히 결정되는 것으로서, 통상 0.01～20㎎/㎠를 성인 1인당 하루 1회 또는 수회로 나누어 두피에 도포한다.

또, 본 발명의 봉미초 추출물을 발모촉진, 육모 촉진, 탈모예방 등 양모효과를 목적으로 한 의약품, 의약부외품 또는 화장품에 이용하는 경우, 그 제형은 본 발명의 효과를 발휘할 수 있는 제형이면 특별한 제한 없이 임의로 선택할 수 있으며, 예컨대 토닉, 로션, 유액(乳液), 크림, 연고, 젤, 스프레이, 무스 등을 들 수 있다.

그리고, 이러한 제제 중에는 본 발명에 관련된 봉미초 추출물 이외에 의약품, 의약부외품, 화장품의 분야에서 통상 양모제에 배합가능한 성분을 배합할 수 있다. 예를 들면 혈행촉진작용을 갖는 비타민 E 및 그 유도체 등의 약제, 항남성 호르몬작용을 갖는 에스트라디올, 에스트론과 같은 호르몬제 등을 들 수 있다.

또, 알콕시카르보닐피리딘 N-옥시드, 아세틸콜린 유도체 등의 혈관확장제; 세파란틴 등의 피부기능항진제; 헥사클로로펜, 운데실렌산, 트리클로로카르바니드, 비티오놀 등의 항균제; 아연 및 그 유도체; 락트산 또는 그 알킬에스테르; 시트르산 등의 유기산류; 트라네키사무산 등의 프로테아제 저해제 등을 배합할 수 있다.

또, 에탄올, 이소프로필알콜 등의 알콜류; 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 등의 다가알콜류; 고급 지방산, 고급 알콜, 탄화수소유, 천연유지, 에스테르유, 실리콘유 등의 유분; 계면활성제; 향료; 킬레이트제; 1,3-부틸렌글리콜, 히알루론산 및 그 유도체, 말티톨, 아테로콜라겐, 락트산나트륨 등의 보습제; 카복시비닐폴리머 등의 증점제; 산화방지제; 자외선 흡수제; 색소; 물; 안정화제 등 통상 양모제에 배합되는 성분을 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 배합할 수 있다.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 봉미초 추출물 제조

세절하여 음건한 봉미초를 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜, 감압농축물 및 동결건조물이 0.001~30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 봉미초 추출물을 제조하였다.

실시예 2: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서 0.05M Na₂CO₃(2.4ml), 3mM 크산틴 용액(0.1ml), 3mM EDTA 용액( 0.1ml), BSA 용액(0.1ml), 0.72mM NBT 용액(0.1ml)를 가하고 여기에 시료용액 0.1 ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다. 크산틴 옥시다제 용액(0.1ml)가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다. 그 후 6mM CuCl₂ 용액(0.1ml)을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

표 1에서 확인할 수 있듯이 봉미초 추출물은 BHT보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

시료명	항산화효과(%)
봉미초 추출물 0.1중량%	95%
봉미초 추출물 0.01중량%	82%
봉미초 추출물 0.001중량%	58%
BHT 0.1중량%	89%

실시예 3: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다. DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 0.1%, 0.01%, 0.001% 농도의 봉미초 추출물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A: 본 발명의 봉미초 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 봉미초 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 2에서 확인할 수 있듯이 봉미초 추출물은 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT보다 우수한 항산화 효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.

시료명	항산화효과(%)
봉미초 추출물 0.1중량%	91%
봉미초 추출물 0.01중량%	79%
봉미초 추출물 0.001중량%	68%
BHT 0.1중량%	81%

실시예 4: 세포내 활성산소 소거효과

실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물의 자외선에 의해 세포내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교샘플로 EGCG하고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양 받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 0.01%, 0.001%, 0.0001% 농도로 봉미초 추출물을 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20 μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이 후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광 플레이트 판독기(Ex;485nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 봉미초 추출물 처리 후 형광도를 형광 플레이트 판독기(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

표 3에서 확인할 수 있듯이 봉미초 추출물은 활성산소 소거효과에 비교 시료로 많이 이용되고 있는 EGCG보다 우수한 활성산소 소거 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	활성산소 소거효과(%)
봉미초 추출물 0.01중량%	65
봉미초 추출물 0.005중량%	48
봉미초 추출물 0.001중량%	29
EGCG 0.01중량%	49

실시예 5: in vitro MMP -1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-Collagen, 효소(collagenase)는 몰큘라 프로브사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응 완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl₂, 2 mM 소듐 아자이드, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응 완충액 100 ㎕에 0.25 ㎎/㎖로 반응 완충액에 용해한 DQ 콜라겐 20㎕와 봉미초 추출물(0.01 내지 0.1중량%) 40㎕을 첨가하고 0.5unit로 희석한 콜라게나아제 40㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495nm, 방출파장 515nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 4에 나타냈으며 봉미초 추출물 0.1% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성을 83% 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 것으로 나타났다.

시료명	저해율(%)
봉미초 추출물 0.1중량%	85
봉미초 추출물 0.05중량%	62
봉미초 추출물 0.01중량%	45
녹차추출물 0.2중량%	70

실시예 6: 자외선 조사 후 봉미초 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다. UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 봉미초 추출물은 72% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과를 나타내었다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-
봉미초 추출물 0.05중량%	75
봉미초 추출물 0.01중량%	51
레티놀	38

실시예 7: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물 첨가 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1× 10⁴cell/cm²농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 봉미초 추출물을 0.01%, 0.05%, 0.001% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

봉미초 추출물 0.01% 처리시 프로콜라겐의 생합성을 38% 촉진하였으며 이는 세포신호전달 물질인 TGF-β와 유사한 정도였다(표 6).

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
봉미초 추출물 0.01중량%	38%
봉미초 추출물 0.05중량%	24%
봉미초 추출물 0.001중량%	19%
TGF-β 0.001중량%	35%

실시예 8: 자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물의 프로스타글란딘 생합성 억제 효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간 동안 배양한 다음, 상기 각질형성세포에 최종농도가 50uM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 "COX")의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 봉미초 추출물을 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로서 봉미초 추출물의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량화하였으며 실험결과 봉미초 추출물은 자외선에 의한 프로스타글란딘 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 봉미초 추출물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 알 수 있다(표 7).

시료명	PGE₂ 억제율(%)
(-) UV B	대조군
(+) UV B	-
(+) UV B + 봉미초 추출물 0.05중량%	75%
(+) UV B + 봉미초 추출물 0.01중량%	41%

실시예 9: 여드름균에 대한 항균력 시험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화하기 위하여 BHI 액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%; agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 봉미초 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 19㎜인 것으로 나타났다.

실시예 10: 봉미초 추출물의 5알파 - 리덕타아제 활성 억제력 평가실험

5 알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5 알파-리덕타아제는 포피 유래의 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

섬유아세포를 마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 10000개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양한다. 각 홀마다 ³H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하므로 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정한다. 봉미초 추출물이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼는다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이크로헥산(cyclohexane)(1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻는다. 이 얻어진 스테로이드를 박막 크로마토그래피판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))으로 전개시켰다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 3에 의해 5알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.

저해능(%)=[A-B]/[A] × 100

A=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 미첨가시)

B=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 첨가시)

실험결과 봉미초 추출물은 5알파-리덕타아제 저해효과가 있음을 알 수 있다(표 8).

봉미초 추출물 농도(%)	1	0.1	0.05	0.01	0.005	0.001	0.0001
저해율(%)	100.0	98.0	92.0	86.0	65.4	47.9	35.8

실시예 11: 모발성장 효과 시험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물 건조 엑기스 2%를 함유하는 30% 함수 에탄올(ethanol) 용액을 제조하여 시험에 사용하였다. 모발성장 효과 시험은 마우스(ICR), 생후 47~53일 것을 사용하여 등 부위 털을 제거하고, 등 부위가 깨끗한 것을 골라 물질군마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 실시예의 시험물질을 개체당 100㎖씩 도포하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 0에서 2까지 부가하여 각각 비교하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다.

실험결과, 봉미초 추출물이 우수한 모발성장 촉진 효과가 있음을 알 수 있다(표 9).

경과일수/시료	5	10	15
봉미초 추출물	0.23	0.91	1.89±0.39
대조군	0.08	0.27	0.99±0.84

실시예 12 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 12, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표11에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 11에서 나타난 바와 같이 봉미초 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 12	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰 부가) 알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	봉미초 추출물	1	-
	프로필렌 글리콜	5	5
	기타	적량	적량

실험제품	피부탄력효과(△R7)	비고
실시예 12	0.28
비교예 1	0.12

n=20, p＜0.05

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오 미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 12에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter)값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 12에서 나타나듯 봉미초 추출물을 함유한 실시예12의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 12	-0.25	-0.19	-0.10	-0.09	-0.07
비교예 1	-0.10	-0.07	-0.04	-0.03	-0.03
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 13 내지 15에서 제조하였다. 이들 봉미초 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 탈모방지 및 육모 효과, 여드름방지효과, 피부자극 완화효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 13: 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해하였다. 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 14: 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 15: 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 봉미초 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 봉미초 추출물은 활성산소 소거효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 피부 잔주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 봉미초 추출물은 우수한 탈모방지 효과와 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 봉미초 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 탈모 방지, 여드름방지, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 나타냄을 알 수 있다.

Claims

봉미초(Pteris multifida) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 여드름 예방·치료용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 봉미초 추출물은 조성물 전체에 대해서 0.001 - 30.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 봉미초 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 또는 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는, 봉미초 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추출물은 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 상기 액상물의 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는, 봉미초 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형, 샴푸, 린스, 헤어컨디셔너 및 비누 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 봉미초 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물.