CN113295817A - 一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法，该制备方法通过合理控制料液比、温度、及时间，并选择适合的提取液，能快速有效提取凤尾草中的抑菌成分，提高后续研究的效率和可靠性。采用薄层色谱法，通过筛选出适合的展开剂，能将由凤尾草制成的抑菌液中的各成分在薄层板上展开形成斑点而获得薄层色谱图谱，容易借助显色剂或紫外光观察到分离出的斑点，并确定该抑菌液中抑菌成分含量高低，为建立抑菌成分与抑菌效果关联性的快速鉴别方法提供基础。通过抑菌圈实验及薄层色谱法建立薄层色谱图谱，可以快速鉴别凤尾草中的活性抑菌成分含量高低，从而筛选出优质的凤尾草。

Description

一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法
技术领域
本发明涉及凤尾草加工领域，特别是涉及一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法。
背景技术
凤尾草是凤尾蕨科凤尾蕨属植物，主要以其叶形和生态环境来命名，如金鸡尾、鸡脚草、井栏边草等，喜生长在荫蔽、湿润、温暖处，也耐旱，在南方冬季，石缝中生长的植株即使经—二月的干旱，也不会完全枯死；凤尾草以全草入药，性凉，味微苦，归肝、肾、大肠经，具有清热利湿、凉血止血、消肿解毒等功效，用于治疗痢疾、肠炎、黄疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病症，具有明显的抑菌效果。
虽然大多数不同来源的凤尾草的成分类别基本相同，但是因为产地、采摘季节等因素的差异，其抑菌成分的含量也不同，所以不同来源的凤尾草的质量不同，临床疗效也有差异。
现有的凤尾草抗菌活性研究中，还没有一种关于抑菌成分与抑菌效果关联性的快速鉴别方法，不能快速的筛查出优质凤尾草。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供了一种凤尾草抑菌成分的制备、分离及鉴定方法，通过研究不同来源凤尾草的薄层色谱图谱和抑菌圈试验，初步建立一种能够快速鉴定优质凤尾草的薄层色谱图谱，为日后合理开发凤尾草资源提供科学依据。
为实现上述目的，本发明提供了一种凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取8～12g凤尾草粉末并与体积浓度为70％以上的乙醇按料液比为1：5～6g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30～40min，再在45～55℃下加热回流提取0.5～1.5h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20～30mL水溶散后，加入20～30mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1～1.5mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在3～6℃条件下冷藏保存。
作为本发明的进一步改进，凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取10g凤尾草粉末并与体积浓度为70％的乙醇按料液比为1∶5g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30min，再在50℃下加热回流提取1h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20mL水溶散后，加入20mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在4℃条件下冷藏保存。
上述凤尾草抑菌成分的分离方法，包括以下步骤：
(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为100±1℃，烘烤时间为1小时，用微量定量点样器取1±0.1μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于薄层板上并吹干，将点样后的薄层板放入装有展开剂溶液的层析缸中，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；
(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为100～120℃，烘烤时间为3～6min，即可获得显色的斑点。
作为本发明的进一步改进，所述展开剂为由体积比为5:1:1的正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统，由体积比为13:3:1的乙酸乙酯、甲酸、及水制成的展开系统，由体积比为5:5:2的乙酸乙酯、乙醇、及水制成的展开系统，或由体积比为13:6:2的三氯甲烷、乙醇、及水制成的展开系统。
作为本发明的进一步改进，所述展开剂为由体积比为正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统。
作为本发明的进一步改进，所述显色剂为碘化铋钾溶液、浓度为0.05g.mL-1的香草醛硫酸溶液、或浓度为0.1g.mL-1的磷钼酸乙醇溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中烘烤温度为100℃，烘烤时间为5min。
作为本发明的进一步改进，所述紫外光灯中紫外光的波长为365nm。
上述凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-78～-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，于35～37℃摇床上放置6～6.5h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液99～101μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂布在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取29～31μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，，静置0.5h以上，然后置于35～37℃恒温培养16～16.5h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
作为本发明的进一步改进，所述凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，放置于37℃摇床6h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液100μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒涂开，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取30μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，静置0.5h，然后置于37℃恒温培养16h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
与现有技术相比，本发明提供的凤尾草抑菌成分的制备方法有益效果在于：该制备方法通过合理控制料液比、温度、及时间，并选择适合的提取液，能快速有效提取凤尾草中的抑菌成分，提高后续研究的效率和可靠性。
本发明的凤尾草抑菌成分的分离方法的有益效果在于：采用薄层色谱法，通过筛选出适合的展开剂，能将由凤尾草制成的抑菌液中的各成分在薄层板上展开形成斑点而获得薄层色谱图谱，容易借助显色剂或紫外光观察到分离出的斑点，并确定该抑菌液中的主要成分，为建立抑菌成分与抑菌效果关联性的快速鉴别方法提供基础。
本发明的凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，通过抑菌圈实验并结合薄层色谱图谱及显色实验，可以快速鉴别凤尾草中的活性抑菌成分，从而筛选出优质的凤尾草。
综上所述，采用薄层色谱法，按照本发明的凤尾草制备方法制备抑菌液，选用本发明的展开剂可以将凤尾草抑菌液中的抑菌成分分离，在紫外光下可观察到在薄层板上形成有清晰可辨的斑点；再对薄层板喷洒不同的显色剂，展开成分在不同显色剂中呈现不同颜色，结合抑菌圈实验结果，可以快速的鉴定优质凤尾草及其活性抑菌成分。本发明的上述研究不仅为提高凤尾草的质量控制水平，建立和完善相关质量标准打下基础，也为日后合理开发凤尾草资源提供科学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中在紫外灯下观察到的凤尾草抑菌成分在薄层板上展开形成的斑点。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例1提供了一种凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，按1g凤尾草粉末加入体积浓度为70％以上的乙醇5～6mL的料液比进行配置，具体的，在本发明实施例1中，称取10g凤尾草粉末并与体积浓度为70％的乙醇按料液比为1：5g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30min，再在50℃下加热回流提取1h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20mL水溶散后，加入20mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在4℃条件下冷藏保存。
本发明实施例1通过合理控制料液比、温度、及时间，并选择适合的提取液，能快速有效提取凤尾草中的抑菌成分，提高后续研究的效率和可靠性。
具体的，在本发明实施例中，采用了三种不同来源的凤尾草，分别为11月份野生凤尾草即本发明实施例的A组、12月份野生凤尾草即本发明实施例的B组、及人工种植凤尾草即本发明实施例的C组。将上述三组不同来源的凤尾草制成的抑菌液进行分离、及鉴定。
本发明实施例1的凤尾草抑菌成分的分离方法，包括以下步骤：
(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱硅胶G薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为100℃，烘烤时间为1小时，用微量定量点样器取1μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于干燥后的薄层板上，将点样后的薄层板用吹风机快速吹干后，放入装有展开剂溶液的层析缸中，其中，所述展开剂溶液为由体积比为5:1:1的正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光的波长为365nm的紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；
(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，其中，所述显示剂为碘化铋钾溶液，该碘化铋钾溶液的制备方法为：取碘化铋钾试剂0.1g，加冰醋酸1mL溶解后，再加2.5mL水稀释获得碘化铋钾试液，然后取碘化铋钾试液1mL，加0.6mol.L-1盐酸溶液2mL，加水定容至10mL，即得本发明实施例1的碘化铋钾溶液；然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为110℃，烘烤时间为5min，即可获得显色的斑点。
薄层色谱的主要的工作原理是：被分离成分在展开剂、及薄层板上的吸附剂这两相中的亲和力有差异，因此，在同一条件下，不同成分在薄层板迁移率Rf值也不同，依此原理可以实现成分的分离，在本发明实施例1中，以硅胶G薄层板对凤尾草抑菌液进行成分展开分离，分离出的斑点在紫外光灯下清晰可辨。
具体的，如图1所示，是在紫外光灯下观察到的由三组不同来源的凤尾草制成的抑菌液展开后形成的薄层色谱图谱，在此需要说明的是，在紫外光灯下获得的彩色图片调整成黑白图片会与实际图片有差异，但是这些差异不会对本发明实施例有实质性影响。
通过A、B、C三组不同来源的凤尾草的薄层色谱对比可以看出：A、B、C三组均包括斑点1、斑点2、斑点3、斑点4、及斑点5；采用薄层色谱分离出的凤尾草抑菌成分中，处在同一位置的斑点，即Rf值相同，表明对应条带的迁移速率，在相同实验条件下可以判断其为同一个物质；与人工种植凤尾草分离出的斑点相比较，采摘的野生凤尾草提取物分离出的斑点有显著不同，野生凤尾草在斑点1、斑点2、斑点3的大小及清晰度明显高于人工种植凤尾草，而野生凤尾草在斑点4、斑点5与人工种植凤尾草相应部位的斑点差异不明显；对上述斑点1、斑点2、及斑点3进行测量并计算它们的Rf值，结果见表1所示：
表1 各斑点的Rf值
Figure BDA0003140130780000071
通过喷洒显示剂可以不需要紫外光灯能直接观察到斑点，结果显示，在高温情况下，碘化铋钾能够使展开成分显橘红色。
本发明实施例1的凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，于37℃摇床上放置6h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液100μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂布在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取30μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入A、B、C三组不同来源的凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，静置0.5h，然后置于37℃恒温培养16h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
上述A、B、C三组经抑菌效果鉴定后获得的抑菌圈的直径大小，结果见表2。
表2 抑菌圈的直径大小
Figure BDA0003140130780000072
Figure BDA0003140130780000081
由表2可知，11月份、12月份的野生凤尾草提取的抑菌液培养的菌液产生的平均抑菌圈直径分别为29mm、21mm；人工种植凤尾草提取的抑菌液培养的菌液产生的抑菌圈较小，该抑菌圈的平均直径为为16mm；而乙醇空白对照组没有抑菌圈。
由上述野生凤尾草与人工种植凤尾草的薄层色谱图谱中斑点的区别，以及野生凤尾草与人工种植凤尾草提取的抑菌液培养的菌液产生的抑菌圈的大小，可以快速鉴别凤尾草抑菌活性部位为斑点1、斑点2、斑点3，其对应的Rf值分别为0.338、0.394、0.451，从而筛选出优质的凤尾草。
实施例2
实施例2与实施例1的主要区别在于:
一种凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，按1g凤尾草粉末加入体积浓度为70％以上的乙醇5～6mL的料液比进行配置，具体的，在本发明实施例2中，称取8g凤尾草粉末并与体积浓度为80％的乙醇按料液比为1∶6g.mL-1的比例混合均匀后浸泡35min，再在45℃下加热回流提取1.5h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加25mL水溶散后，加入25mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1.3mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在3℃条件下冷藏保存。
上述凤尾草抑菌成分的分离方法，包括以下步骤：
(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱硅胶G薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为99℃，烘烤时间为1.5，用微量定量点样器取0.9μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于干燥后薄层板上，将点样后的薄层板在通风处自然晾干后，放入装有展开剂溶液的层析缸中，其中，所述展开剂为由质量比为13:3:1的乙酸乙酯、甲酸、及水制成的展开系统，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光波长为365nm的紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；
(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，其中，所述显示剂是浓度为0.05g.mL-1的香草醛硫酸溶液，该香草醛硫酸溶液是在0.5g香草醛中加入10％硫酸乙醇溶液定容到10mL制备而成；然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为100℃，烘烤时间为6min，即可获得显色的斑点，结果显示，在高温情况下，香草醛硫酸溶液能够使展开成分显浅绿色。
上述凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-78℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，于35℃摇床上放置6.5h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液99μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂布在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取29μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入A、B、C三组不同来源的凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，，静置1h，然后置于35℃恒温培养16.5h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
本发明实施例2中由凤尾草制备的抑菌液，在不同制备条件下、不同的展开系统下，其获得的薄层色谱图谱中的斑点Rf与实施例1有一定的差异，但是由上述野生凤尾草与人工种植凤尾草的薄层色谱图谱中斑点的区别，以及野生凤尾草与人工种植凤尾草提取的抑菌液培养的菌液产生的抑菌圈的大小，可以快速鉴别凤尾草中的主要活性抑菌成分，从而筛选出优质的凤尾草。
实施例3
实施例3与实施例2的主要区别在于：
一种凤尾草抑菌成分的制备方法，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，按1g凤尾草粉末加入体积浓度为70％以上的乙醇5～6mL的料液比进行配置，具体的，在本发明实施例3中，称取12g凤尾草粉末并与无水乙醇按料液比为1：5g.mL-1的比例混合均匀后浸泡40min，再在55℃下加热回流提取0.5h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加30mL水溶散后，加入30mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1.5mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在6℃条件下冷藏保存。
上述凤尾草抑菌成分的分离方法，包括以下步骤：
(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱硅胶G薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为101℃，烘烤时间为1.5小时，用微量定量点样器取1.1μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于干燥后的薄层板上，将点样后的薄层板用吹风机快速吹干后，放入装有展开剂溶液的层析缸中，其中，所述展开剂为由体积比为5:5:2的乙酸乙酯、乙醇、及水制成的展开系统，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光波长为365nm的紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；
(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，其中所述显示剂是浓度为0.1g.mL-1的磷钼酸乙醇溶液，该磷钼酸乙醇溶液的制备方法是在10g磷钼酸中加无水乙醇定容到100mL制备而成；然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为120℃，烘烤时间为3min，即可获得显色的斑点，结果显示，在高温情况下，磷钼酸乙醇溶液能够使展开成分显蓝色。
上述凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-79℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，于36℃摇床上放置6.3h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液101μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂布在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取31μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入A、B、C三组不同来源的凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，静置1.5h，置于36℃恒温培养16.3h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
本发明实施例3中由凤尾草制备的抑菌液，在不同制备条件下、不同的展开系统下，其获得的薄层色谱图谱中的斑点Rf与实施例2有一定的差异，但是由上述野生凤尾草与人工种植凤尾草的薄层色谱图谱中斑点的区别，以及野生凤尾草与人工种植凤尾草提取的抑菌液培养的菌液产生的抑菌圈的大小，可以快速鉴别凤尾草中的主要活性抑菌成分，从而筛选出优质的凤尾草。
实施例4实施例4与上述实施例1～3任一的主要区别在于，所述展开剂溶液为由体积比为13:6:2的三氯甲烷、乙醇、及水制成的展开系统。
本发明实施例4中由凤尾草制备的抑菌液，在不同的展开系统下，其获得的薄层色谱图谱中的斑点Rf与实施例1、实施例2、或实施例3有一定的差异，但是由上述野生凤尾草与人工种植凤尾草的薄层色谱图谱中斑点的区别，以及野生凤尾草与人工种植凤尾草提取的抑菌液培养的菌液产生的抑菌圈的大小，可以快速鉴别凤尾草中的主要活性抑菌成分，从而筛选出优质的凤尾草。
经过对不同展开系统薄层色谱分离效果的比较，结果表明采用由体积比为5:1:1的正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统，分离效果最好，可直接采用365nm的紫外光，简便直观的观察斑点，斑点清晰可辨。
通过喷洒显示剂可以不需要紫外光灯能直接观察到斑点，结果显示，在高温情况下，香草醛硫酸溶液能够使展开成分显浅绿色，磷钼酸乙醇溶液能够使展开成分显蓝色，碘化铋钾能够使展开成分显橘红色，通过对比可以看出，以0.1g.mL-1的磷钼酸乙醇溶液作为显示剂，获得的斑点最清晰。
综上所述，采用薄层色谱法，按照本发明实施例的凤尾草制备方法制备抑菌液，选用本发明实施例的展开剂可以将凤尾草抑菌液中的抑菌成分分离，在紫外光下可观察到在薄层板上形成有清晰可辨的斑点；再对薄层板喷洒不同的显色剂，展开成分在不同显色剂中呈现不同颜色，结合抑菌圈实验结果，可以快速的鉴定优质凤尾草及其活性抑菌成分，为日后合理开发凤尾草资源提供科学依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种凤尾草抑菌成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取8～12g凤尾草粉末并与体积浓度为70％以上的乙醇按料液比为1：5～6g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30～40min，再在45～55℃下加热回流提取0.5～1.5h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20～30mL水溶散后，加入20～30mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1～1.5mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在3～6℃条件下冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的凤尾草抑菌成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.凤尾草混合提取液的制备：将凤尾草去除杂质并清洗干净后，干燥粉碎，制成凤尾草粉末，称取10g凤尾草粉末并与体积浓度为70％的乙醇按料液比为1：5g.mL-1的比例混合均匀后浸泡30min，再在50℃下加热回流提取1h，冷却后获得凤尾草混合提取液；
S2.抑菌液的制备：将步骤S1中的凤尾草混合提取液过滤得滤液，将滤液蒸干后取残渣，向残渣中加20mL水溶散后，加入20mL乙酸乙酯振摇后用分液漏斗进行分离，取上清液，然后在水浴中蒸干获得料渣，将料渣用1mL无水乙醇溶解，即获得含有凤尾草抑菌成分的抑菌液，将该抑菌液在4℃条件下冷藏保存。
3.权利要求1或2所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抑菌成分的分离：取薄层色谱薄层板，于干燥箱中在下述条件下烘烤干燥：烘烤温度为100±1℃，烘烤时间为1小时以上，用微量定量点样器取1±0.1μL由凤尾草制成的抑菌液并点样于薄层板上并吹干，放入装有展开剂溶液的层析缸中，然后盖上盖子密封，开始对抑菌液进行展开分离，展开分离完毕后，取出薄层板，画出展开剂在薄层板上展开后的前沿位置并晾干，最后将晾干的薄层板置于紫外光灯下检视分离后形成的斑点，测量并计算各斑点的Rf值；
(2)显色实验：向步骤(1)晾干的薄层板喷洒显色剂，然后在干燥箱中按下述条件进行烘烤干燥：烘烤温度为100～120℃，烘烤时间为3～6min，即可获得显色的斑点。
4.根据权利要求3所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，所述展开剂为由体积比为5:1:1的正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统，由体积比为13:3:1的乙酸乙酯、甲酸、及水制成的展开系统，由体积比为5:5:2的乙酸乙酯、乙醇、及水制成的展开系统，或由体积比为13:6:2的三氯甲烷、乙醇、及水制成的展开系统。
5.根据权利要求4所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，所述展开剂为由体积比为5:1:1的正己烷、乙酸乙酯、及甲酸制成的展开系统。
6.根据权利要求3所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，所述显色剂为碘化铋钾溶液、浓度为0.05g.mL-1的香草醛硫酸溶液、或浓度为0.1g.mL-1的磷钼酸乙醇溶液。
7.根据权利要求3所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中烘烤温度为100℃，烘烤时间为5min。
8.根据权利要求3所述的凤尾草抑菌成分的分离方法，其特征在于，所述紫外光灯中紫外光的波长为365nm。
9.权利要求1所述的凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-78～-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，于35～37℃摇床上放置6～6.5h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液99～101μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取29～31μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，静置0.5h以上，然后置于35～37℃恒温培养16～16.5h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
10.根据利要求9所述的凤尾草抑菌成分的抑菌效果鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.菌液的制备：取-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液体培养基中培养，放置于37℃摇床6h进行快速复壮，用分光光度计测定细菌数量，备用；
b.抑菌效果鉴定：吸取步骤a中复壮好的菌液100μL于麦康凯琼脂培养基上，用三角涂布棒将菌液均匀涂在琼脂培养基上，采用琼脂打孔法打孔，然后吸取30μL的麦康凯琼脂培养基封底，往培养基的孔中分别加入凤尾草制成的抑菌液作为实验组，加入乙醇作为对照组，静置0.5h，然后置于37℃恒温培养16h，观察并测量抑菌圈的的直径大小。
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