CN113109495B - 一种基于薄层色谱的枣仁安神胶囊质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于薄层色谱的枣仁安神胶囊质量检测方法，所述检测方法对枣仁安神胶囊中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、丹参酮II_A、丹酚酸B、五味子甲素、五味子醇甲等七个主要活性成分进行定性检测，具体包括制备供试品溶液、制备对照品溶液、制备对照药材溶液和薄层色谱检索步骤。通过优化枣仁安神胶囊薄层用供试品制备方法以及展开条件等，在一块薄层板上实现了复方全药味的同时检测，简化了鉴别步骤，提高了鉴别效率，促进了枣仁安神胶囊的整体质量控制。

Description

一种基于薄层色谱的枣仁安神胶囊质量检测方法

技术领域

本发明属于检验分析技术领域，具体涉及一种基于薄层色谱的枣仁安神胶囊质量检测方法。

技术背景

枣仁安神成方制剂(简称枣仁安神制剂)是由炒酸枣仁、丹参、醋五味子制得的中药复方制品，具有养血安神的功效，临床用于治疗心血不足引起的失眠、健忘、心烦、头晕及神经衰弱症见上述证候者。枣仁安神制剂主要包括胶囊、颗粒和口服液3种剂型。胶囊剂为药材经75％乙醇、60％乙醇、水依次回流提取，浓缩后加淀粉制成颗粒装入胶囊所得；颗粒剂为药材经水煎煮，浓缩后加糊精制成颗粒；口服液为药材经水提取，浓缩后加辅料和水煮沸，过滤而得。

目前国外主流国家和地区的药典，包括《欧洲药典》、《美国药典》、《日本药典》、《英国药典》等，均未收载枣仁安神制剂。我国药典和部分中药成方制剂标准中收载有枣仁安神胶囊、颗粒及口服液的质量标准，如《中国药典》一部2020年版和《新药转正标准》第72册中收载了枣仁安神胶囊质量标准，《中国药典》一部2020年版和《卫生部药品标准中药成方制剂》第11册中收载有枣仁安神颗粒(冲剂)质量标准，《卫生部药品标准中药成方制剂》第18册中收载有枣仁安神液质量标准。

枣仁安神制剂在我国不同标准中的收载项目及规定有所不同，以《中国药典》2020年版收载各项指标最为全面，涵盖了性状、薄层色谱(TLC)鉴别、HPLC特征图谱和HPLC含量测定的检测内容。相同制剂的相同检测项在不同标准中的规定有所不同，如枣仁安神胶囊TLC鉴别项下，《中国药典》2020年版以酸枣仁提取物或酸枣仁皂苷A，B为对照，《新药转正标准》则以酸枣仁皂苷A、原儿茶醛及五味子甲素为对照。各标准中以《中国药典》2020年版最为完善，虽然通过综合采用TLC鉴别、HPLC特征图谱以及含量测定基本实现了对枣仁安神胶囊的全药味主成分控制，但是该质量标准仍有待完善和进一步提高。

薄层色谱法(TLC)常以特征成分、对照提取物或对照药材为对照，通过检测中药材及其制剂中的主要成分或特征成分，以较低成本对其进行快速定性分析及鉴别，如《中国药典》2020年版、《新药转正标准》及《中药成方制剂》中即收载了枣仁安神制剂的TLC鉴别方法。薄层色谱扫描法(TLCS)则可以对主要成分或特征成分进行定量分析。对于枣仁安神制剂的TLC研究较多，主要以对照品、对照提取物或对照药材作为对照对其进行定性分析，但所涉及的对照化学成分较少，酸枣仁成分为酸枣仁皂苷A和B，五味子成分为五味子甲素，丹参成分为原儿茶醛，且原儿茶醛不是丹参的典型特征成分。所用展开剂根据目标成分不同会有所不同，但多含有甲酸、冰醋酸等酸性溶剂；另外在原儿茶醛的分析中经常使用三氯甲烷等毒性溶剂。显色剂常根据所鉴别成分进行选择，如酸枣仁皂苷A，B常用香草醛硫酸溶液进行鉴别，原儿茶醛多用三氯化铁溶液鉴别，五味子成分则选用硅胶GF₂₅₄薄层板展开，在紫外光灯(254nm)下检视。另外值得注意的是，由于枣仁安神制剂的化学成分复杂，目前的TLC多是针对某一味药的个别成分分别进行检测，操作繁琐，鉴别效率低，尚未有在一块薄层板上实现复方全药味或多药味同时检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种枣仁安神胶囊的薄层色谱检测方法，优化了枣仁安神胶囊薄层用供试品制备方法以及展开条件，在一块薄层板上实现了复方全药味的同时检测，简化了鉴别步骤，提高了鉴别效率，促进了枣仁安神胶囊的整体质量控制。

为实现上述目的，本发明提供了一种枣仁安神胶囊的薄层色谱检测方法，所述检测方法对枣仁安神胶囊中七个主要活性成分进行定性检测，所述七个主要活性成分具体为：斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、丹参酮II_A、丹酚酸B、五味子甲素、五味子醇甲。

优选地，所述检测方法包括以下步骤：

取薄层层析硅胶板，吸取供试品溶液、对照药材溶液或/和对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，使成条状，加入第一展开剂进行一次展开，取出，晾干，再加入第二展开剂二次展开，取出，晾干后进行检视。

优选地，所述第一展开剂以溶剂体积比计为乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水12-20：1-7：0.1：1-3；所述一次展开的长度为总展开长度的50-70％。

优选地，所述一次展开的长度为展至4.5-5.5cm。

优选地，所述第二展开剂以溶剂体积比计为60-90℃石油醚-乙酸乙酯2-6：1；所述二次展开的长度为总展开长度的100％。

优选地，所述二次展开的长度为展至8.5cm。

优选地，所述供试品溶液的制备方法为：

取待测枣仁安神胶囊内容物，加甲醇加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。

优选地，胶囊内容物与甲醇的物料比(g:mL)为1:10；加热回流时间为30min。

优选地，所述对照药材溶液或/和对照品溶液的制备方法为：

1)制备对照品溶液：取斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品、丹参酮II_A对照品、丹酚酸B对照品、五味子甲素对照品、五味子醇甲对照品，加甲醇制成对照品溶液；

2)取酸枣仁对照提取物，加水饱和的正丁醇，超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解；取丹参对照药材，加甲醇，超声提取，滤过，取滤液；取五味子对照药材，加甲醇，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，分别作为对照药材溶液。

优选地，所述检视具体为：

1)一次检视：在紫外光灯254nm下直接检视斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素和丹参酮II_A成分，

2)二次检视：在一次检视后喷显色剂5％香草醛硫酸溶液在日光灯下检视酸枣仁皂苷A、B成分，

3)三次检视：在二次检视后再加热5分钟后在日光灯下检视丹酚酸B成分；

优选地，三次检视时105℃加热。

上述三次检视均采用薄层色谱数码成像仪进行检视，经此三次检视后，可清楚地辨识对照品及供试品条带中全部七种成分斑点。

优选地，所述薄层层析硅胶板为GF₂₅₄薄层层析硅胶板。

优选地，所述供试品溶液的点样量为3-4μL。

一个优选的具体实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：

取待测枣仁安神胶囊内容物1g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用10mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；

(2)制备对照品溶液：

另取斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品、丹参酮II_A对照品、丹酚酸B对照品、五味子甲素对照品、五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1mL含以上对照品0.5mg、1mg、1mg、0.2mg、0.6mg、0.4mg和0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)制备对照药材溶液：

取酸枣仁对照提取物0.1g，加水饱和的正丁醇10mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解；取丹参对照药材0.4g，加甲醇2mL，超声提取15分钟，滤过，取滤液；取五味子对照药材0.4g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，分别作为对照药材溶液；

(4)薄层色谱检测：

照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μL、对照药材溶液5μL或/和对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，使成8mm条状，以溶剂体积比计乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水16：4：0.1：2为第一展开剂，一次展开，展至约5cm，取出，晾干，再以溶剂体积比计60～90℃石油醚-乙酸乙酯4：1为第二展开剂，二次展开，展至约8.5cm，取出，晾干，在紫外光灯254nm下检视，再喷以5％香草醛硫酸溶液，置日光灯下检视，然后于105℃加热5分钟，再置日光灯下检视。

本发明的有益效果：

本发明优化了枣仁安神胶囊薄层用供试品制备方法以及展开条件，在一块薄层板上实现了复方全药味的同时检测，简化了鉴别步骤，提高了鉴别效率，促进了枣仁安神胶囊的整体质量控制。

附图说明

图1：不同展开剂系统的薄层色谱图：a：水饱和的正丁醇，b：三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸6:4:8:1:4(展至4cm)，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯4:1(展至8cm)，c：石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸15:5:1上层溶液，d：乙酸乙酯-甲醇-水4:1:0.5，1：酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素的混合对照品，2：酸枣仁药材，3：丹参酮II_A，4：丹酚酸B，5：五味子醇甲，6五味子甲素，7：五味子药材，8：枣仁安神胶囊供试品溶液。

图2：展开剂系统的确定：a：紫外光灯254nm，b：5％香草醛硫酸溶液，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁药材，3：丹参酮II_A(Ⅶ)，4：丹酚酸B(Ⅳ)，5：丹参药材，6：五味子醇甲(Ⅴ)，7：五味子甲素(Ⅵ)，8：五味子药材，9：枣仁安神胶囊供试品溶液。

图3：不同供试品制备方法的薄层色谱图：a：紫外光灯254nm，b：5％香草醛硫酸溶液，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁药材，3：丹参酮II_A(Ⅶ)，4：丹酚酸B(Ⅳ)，5：丹参药材，6：五味子醇甲(Ⅴ)，7：五味子甲素(Ⅵ)，8：五味子药材，9：方法一供试品，10：方法二供试品，11：方法三供试品，12：方法四供试品，13：方法五供试品。

图4：不同显色方式的薄层色谱图：a：紫外光灯254nm，b：紫外光灯366nm，c：5％香草醛硫酸溶液，未加热，日光，d：5％香草醛硫酸溶液，加热，日光，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁对照提取物，3：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，4：丹参对照药材，5：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，6：五味子对照药材，7：供试品Z1，8：供试品Z2，9：供试品Z3。

图5：不同展开距离的薄层色谱图：a：第一次展开4.5cm，b：第一次展开5cm，c：第一次展开5.5cm，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁对照提取物，3：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，4：丹参对照药材，5：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，6：五味子对照药材，7：供试品Z1，8：供试品Z2，9：供试品Z3。

图6：不同点样量的薄层色谱图：a：紫外光灯254nm，b：5％香草醛硫酸溶液，未加热，日光，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁对照提取物，3：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，4：丹参对照药材，5：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，6：五味子对照药材，7：供试品1μL，8：供试品2μL，9：供试品3μL，10：供试品4μL，11：供试品5μL。

图7：专属性考察：a：紫外光灯254nm，b：5％香草醛硫酸溶液，未加热，日光，c：5％香草醛硫酸溶液，加热，日光，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁对照提取物，3：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，4：丹参对照药材，5：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，6：五味子对照药材，7：五味子阴性样品，8：丹参阴性样品，9：酸枣仁阴性样品，10：供试品Z1，11：供试品Z2，12：供试品Z3。

图8：不同薄层板的薄层色谱图：a：德国Merck公司硅胶GF₂₅₄薄层板，b：青岛海洋化工厂分厂硅胶GF₂₅₄薄层板，c：烟台市化学工业研究所硅胶HSGF₂₅₄薄层板，d：德国Merck公司硅胶G薄层板，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：酸枣仁对照提取物，3：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，4：丹参对照药材，5：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，6：五味子对照药材，7：供试品Z1，8：供试品Z2，9：供试品Z3。

图9：不同温度下的薄层色谱图：a：低温(T＝3.5℃，RH＝25％)，b：常温(T＝23.7℃，RH＝23％)，c：高温(T＝40.0℃，RH＝13％)，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，3：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，4：供试品Z1，5：供试品Z2，6：供试品Z3。

图10：不同湿度下的薄层色谱图：a：低湿(T＝23.7℃，RH＝23％)，b：高湿(T＝19.6℃，RH＝65％)，1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)和斯皮诺素(Ⅲ)的混合对照品，2：丹酚酸B(Ⅳ)和丹参酮II_A(Ⅶ)的混合对照品，3：五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)的混合对照品，4：供试品Z1，5：供试品Z2，6：供试品Z3。

图11：枣仁安神胶囊薄层色谱图：1：酸枣仁皂苷A(Ⅰ)、酸枣仁皂苷B(Ⅱ)、斯皮诺素(Ⅲ)、丹酚酸B(Ⅳ)、五味子醇甲(Ⅴ)和五味子甲素(Ⅵ)和丹参酮IIA(Ⅶ)的混合对照品，2：Z1，3：Z2，4：Z3，5：Z4，6：Z5，7：Z6，8：Z7，9：Z8，10：Z9，11：Z10，12：Z11，13：Z12，14：Z13，15：Z14，16：Z15。

具体实施方式

下面通过具体实例对本申请做进一步详细说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：枣仁安神胶囊的薄层色谱检测方法条件考察

1、仪器与试药

1.1仪器

薄层色谱自动点样系统AUTOMATIC TLC SAMPLER 4(CAMAG,Muttenz,Switzerland)，薄层色谱自动展开系统ADC2(CAMAG,Muttenz,Switzerland)，薄层色谱数码成像仪TLC VISUALIZER(CAMAG,Muttenz,Switzerland)，电热套(98-1-B型，天津市泰斯特仪器有限公司)，旋转蒸发仪(N-1100型，东京理化)，冷却水循环装置(CA-111型，东京理化)，水浴锅(SB-2000，东京理化)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SQP十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2材料和试剂

Merck薄层层析硅胶板(GF₂₅₄板，10×20cm,批号：HX079229，默克化工技术有限公司)，Merck薄层层析硅胶板(G板，10×20cm，批号：HC30863956，默克化工技术有限公司)，薄层层析硅胶板(GF₂₅₄板，10×20cm，批号：20121012，青岛海洋化工厂分厂)，薄层色谱硅胶预制板(HSGF₂₅₄板，10×20cm，批号：20190719，烟台市化学工业研究所)，一次性使用无菌注射器(2mL，上海治宇医疗器械有限公司)，微孔滤膜(0.22μm，津腾尼龙66型)。甲醇、甲酸、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚(60～90℃)等均为分析纯试剂，由北京市通广精细化工公司生产，水为Water Purification System(RODI-220A1,锐思捷水纯化技术有限公司)制备所得。

1.3药材与样品

所用枣仁安神胶囊样品及其原药材均由国药集团同济堂(贵州)制药有限公司提供，共收集到成品枣仁安神胶囊15批次，原料药材炒酸枣仁、丹参、醋五味子各2批次，中间体枣仁安神胶囊药粉(已加淀粉)1批次。酸枣仁对照提取物(批号：610009-201501)，丹参对照药材(批号：120923-201615)，五味子对照药材(批号：120922-201610)均购买于中国食品药品检定研究院。

表1.枣仁安神胶囊及相关样品信息

1.4对照品

酸枣仁皂苷A(批号：110734-201713)，酸枣仁皂苷B(批号：110814-201809)，丹酚酸B(批号：111562-201917)，丹参酮II_A(批号：0766-200010)，五味子醇甲(批号：110857-201815)，五味子甲素(批号：110764-200408)均购买于中国食品药品检定研究院；斯皮诺素(批号：DSTDS006001)购买于成都德思特生物技术有限公司。薄层色谱用对照品结构如下所示：

2、条件考察

2.1样品制备和薄层色谱操作方法

取本品内容物1g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用10mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品、丹参酮II_A对照品、丹酚酸B对照品、五味子甲素对照品、五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1mL含以上对照品0.5mg、1mg、1mg、0.2mg、0.6mg、0.4mg和0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液。另取酸枣仁对照提取物0.1g，加水饱和的正丁醇10mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解；取丹参对照药材0.4g，加甲醇2mL，超声提取15分钟，滤过，取滤液；取五味子对照药材0.4g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，分别作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μL、对照药材溶液5μL或/和对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，使成条状(8mm)，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(16：4：0.1：2)为展开剂，展开，展至约5cm，取出，晾干，再以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，展至约8.5cm，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检视，再喷以5％香草醛硫酸溶液，置日光灯下检视，然后于105℃加热5分钟，再置日光灯下检视。

2.2对照品的选择

《中国药典》2020年版中，枣仁安神胶囊和枣仁安神颗粒的薄层色谱鉴别项，均选取酸枣仁对照提取物或酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品作为对照。此方法鉴别成分单一，仅包括酸枣仁皂苷类化合物，缺乏了对其他类型成分及其他药味成分的鉴别。《中国药典》2020年版中酸枣仁薄层色谱鉴别则选取了酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B及斯皮诺素三种对照品；丹参薄层色谱鉴别选取了丹参酮II_A和丹酚酸B两种对照品；五味子薄层色谱鉴别选取了五味子甲素对照品。为更好地鉴别枣仁安神胶囊的特征性成分，本实验选取了《中国药典》2020年版中各药味薄层色谱鉴别所用对照品，包括酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、丹参酮II_A、丹酚酸B和五味子甲素，涵盖了酸枣仁皂苷、黄酮、丹参酮、丹酚酸、五味子木脂素等各药味主成分类型。此外，实验还选取了五味子中含量较高的主要成分五味子醇甲^[1-2]，为进一步鉴别枣仁安神胶囊中五味子成分提供保障。

2.3展开剂的考察

《中国药典》2020年版中，枣仁安神胶囊以及酸枣仁药材的薄层色谱鉴别项中所采用的展开剂系统均为水饱和的正丁醇，实验时发现在此展开剂系统下各对照品斑点分离度不好。实验中结合药典及文献报道，考察了不同的展开剂系统，最后选择了二次展开的展开方式，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(16：4：0.1：2)为第一次展开剂，展至约5cm，再以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4：1)为第二次展开剂，展至约8.5cm，可以达到最佳分离效果(附图1和2)。

实验中分别考察了《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊及酸枣仁薄层展开条件(图1a)、丹参薄层展开条件(图1b)、五味子薄层展开条件(图1c)及本实验室所优化的酸枣仁薄层展开条件(图1d)。结果表明，水饱和的正丁醇及乙酸乙酯-甲醇-水4:1:0.5展开剂对酸枣仁对照成分分离效果较好，但丹参酮II_A、五味子醇甲、五味子甲素等成分的比移值接近，分离效果差，不能从供试品条带中辨认，且在此条件下丹酚酸B斑点拖尾严重，分析其原因可能是由于丹酚酸B显酸性，在中性展开剂中会部分结构发生电离而导致拖尾，故考虑在展开剂中加酸来改善；三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸6:4:8:1:4和石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯4:1二次展开以及石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸15:5:1上层溶液展开剂对所选的丹参及五味子的四个对照品成分分离效果较好，但这两种展开剂系统均不能展开所选取的酸枣仁成分。

依据以上展开剂系统对于所选取对照成分的展开情况，对展开剂进行优化，先以极性较高的展开剂(乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水16:4:0.1:2)展开至约一半距离，保证酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素以及丹酚酸B成分的分离，同时将低极性成分推向展开剂前沿，再以极性较低的展开剂(石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯4:1)分离极性较小的丹参酮II_A、五味子醇甲、五味子甲素等成分(图2)。

优化后的展开剂为乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水16:4:0.1:2展至5cm，再以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯4:1展至8.5cm。二次展开后，所选7个对照品均能在一张薄层板上展开，且斑点清晰，比移值适中，分离效果良好，在供试品条带中均能找到其相应的斑点，丹酚酸B的拖尾问题也得到了一定程度改善。所以最后确定展开剂为：乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水16:4:0.1:2以及石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯4:1。

2.4供试品制备方法的考察

方法一，即《中国药典》2020年版枣仁安神胶囊薄层色谱鉴别中检测酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B所用供试品制备方法，具体为：取本品内容物4g，加乙醚50mL，加热回流30分钟,滤过，滤渣挥干溶剂，加甲醇50mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10mL，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

方法一经过加热回流提取、乙醚除杂、多次萃取富集、碱水洗涤等操作，均以保留酸枣仁皂苷类成分，除去其他成分为目的，操作繁琐。本实验所选取的对照品种类多样，极性跨度较大。为兼顾各成分的提取效果，简化实验操作，节省药品试剂，本实验考察了以下供试品制备方法：

方法二：取本品内容物1g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用25mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

方法三：取本品内容物1g，加甲醇10mL，加热回流20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用25mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

方法四：取本品内容物1g，加甲醇10mL，加热回流10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用25mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

方法五：取本品内容物1g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用10mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

实验结果表明(图3)，在方法一、方法五供试品条带上均可以找到所选7个对照品成分的斑点，但方法一供试品条带高极性部分颜色较深，不利于酸枣仁成分及丹酚酸B的辨识，应该是胶囊内容物称取量较多，样品较浓，杂质较多所致；且方法一供试品条带低极性部分斑点较稀疏，应是制备过程中除去乙醚回流成分所致。而方法二、方法三、方法四供试品条带上的酸枣仁皂苷B以及丹酚酸B的斑点均比较模糊，效果不如方法一和方法五；尤其方法四供试品条带斑点更不易辨认，应是回流时间较短，成分提取量较少所致。方法五供试品条带上各对照品成分斑点清晰，利于辨认，且制备方法简便，药品、试剂用量较少，所以，最终选择方法五作为枣仁安神胶囊薄层色谱供试品制备方法。

2.5显色方式的考察

《中国药典》2020年版枣仁安神胶囊薄层色谱鉴别中检测酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B，采用了喷5％香草醛硫酸溶液并加热的显色方式。鉴于喷显色剂后，五味子对照品斑点不易辨认，实验考察了直接在紫外光灯254nm及366nm下检视、喷以5％香草醛硫酸溶液后直接检视以及喷以5％香草醛硫酸溶液并在105℃加热后检视这几种检视方式，结果见图4。

实验结果表明(图4)，用GF₂₅₄薄层板二次展开后，在紫外光灯254nm下可以清晰地看到除酸枣仁皂苷A、B外所有的对照品斑点，而在紫外光灯366nm下仅可以看到斯皮诺素、丹酚酸B和丹参酮II_A的斑点，所以不采用紫外光灯366nm的检视方式；喷显色剂5％香草醛硫酸溶液后在日光灯下直接检视，可以在酸枣仁对照品色谱及供试品色谱相应位置看到酸枣仁皂苷A、B的蓝色斑点以及斯皮诺素的黄色斑点，在丹参对照品色谱及供试品色谱相应位置看到丹酚酸B较浅的粉红色斑点；加热后酸枣仁皂苷A、B以及丹酚酸B的斑点颜色变深，利于对丹酚酸B粉色斑点的确认，但供试品中杂质颜色也变深，对其中酸枣仁皂苷B斑点的辨认影响较大。因此，考虑选择二次展开后在紫外光灯254nm下直接检视(辨认斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素和丹参酮II_A成分)，之后喷显色剂5％香草醛硫酸溶液在日光灯下检视(辨认酸枣仁皂苷A、B成分)，再加热5分钟后在日光灯下检视(确认丹酚酸B成分)的显色方式。经此三次检视后，可清楚地辨识对照品及供试品条带中全部七种成分斑点。

2.6展开距离的考察

由于实验中所选取的薄层鉴别用对照品数量较多，为使其各成分充分分离，采用了二次展开的展开方式，且第二次展开距离选取了卡玛(CAMAG)半自动展开仪所能展开的最大距离8.5cm。本实验仅考察了第一次展开的展开距离，分别展开4.5cm、5cm、5.5cm，最终选择了第一次展开5cm，第二次展开8.5cm的展开方式。二次展开色谱图见图5。

实验结果表明(图5)，第一次展开4.5cm时，供试品色谱中丹酚酸B与五味子醇甲的斑点受邻近的斑点干扰较大，不易辨识；第一次展开5cm与5.5cm的展开结果相差不大，所有鉴别斑点分离效果均较好；考虑到第一次展开5cm相对节省时间，所以最后选用第一次展开5cm的展开条件。

2.7供试品点样量的考察

《中国药典》2020年版枣仁安神胶囊薄层色谱鉴别中检测酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B，采用了10μL的供试品点样量。但实际操作过程中发现点样量较大，结果中供试品条带颜色深，不利于辨识目标斑点。实验对供试品点样量进行了优化，分别考察了点样1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，选取了3μL为供试品点样量。色谱图见图6。

结果表明，供试品点样1μL或2μL时，条带颜色较浅，显色后酸枣仁皂苷A、B斑点不明显，不易辨识；供试品点样5μL时，条带中丹酚酸B斑点受邻近斑点干扰较大；供试品点样3μL或4μL，结果基本一致，所以选择3μL作为供试品的点样量。

2.8专属性考察

枣仁安神胶囊为炒酸枣仁、丹参和醋五味子制得的中成药，所含成分丰富。为检验此薄层色谱法对于所选对照品成分的专属性，本实验按《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊制法分别制备了酸枣仁阴性样品、丹参阴性样品和五味子阴性样品，并按实验所确定的薄层色谱鉴别方法分别制成阴性样品溶液，点样，展开，显色，检视(图7)。

《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊制法如下：本品由炒酸枣仁1425g，丹参285g，醋五味子285g，加75％乙醇回流提取2小时，滤过，滤液备用；药渣加60％乙醇回流1小时，滤过，与上述滤液合并，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.30(60℃)的稠膏，备用；药渣再加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.30(60℃)的稠膏，加入上述稠膏，浓缩至相对密度为1.40(60℃)的稠膏，加淀粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。

实验结果表明，酸枣仁对照品斑点显示清晰，分离度好，且能在酸枣仁对照提取物及供试品条带上相应位置找到对应斑点，在酸枣仁阴性样品条带上对应位置没有斑点；五味子对照品斑点显示清晰，分离度好，且能在五味子对照药材及供试品条带上相应位置找到对应斑点，在五味子阴性样品条带上对应位置没有斑点；丹参对照品丹参酮II_A斑点显示清晰，分离度好，且能在丹参对照药材及供试品条带上相应位置找到对应斑点，在丹参阴性样品条带上对应位置没有斑点；丹酚酸B斑点显示清晰，分离度好，能在丹参对照药材及供试品条带上相应位置找到对应斑点，但在丹参阴性样品条带上对应位置也有斑点，经对比分析，发现丹参阴性样品条带上此斑点成分来自于酸枣仁；经显色加热后，丹酚酸B对照品斑点呈粉红色，丹参对照药材及供试品条带上相应位置的斑点也呈粉红色，而酸枣仁对照提取物及丹参阴性样品条带上相应位置的斑点呈棕黑色，可依此来鉴别枣仁安神胶囊中的丹酚酸B成分。

综上所述，该薄层色谱鉴别方法专属性良好。

2.9薄层板考察

实验考察了青岛海洋化工厂分厂、烟台市化学工业研究所和德国Merck公司三个厂家的包含G、GF₂₅₄共4种薄层色谱硅胶板，色谱图见图8。

实验结果表明，三个厂家的GF₂₅₄薄层板均可以将所选7个成分分开，此方法的薄层板耐用性良好。德国Merck公司所制薄层板硅胶质量更为均一，所展开的色谱图条带更为均匀、美观；青岛海洋薄层板(图8b)的6号条带宽窄不均匀，烟台薄层板(图8c)的7、8号条带有些许弯曲，可能是由于薄层板部分位置硅胶填充不均所致。硅胶G薄层板在254nm下及显色后均不能看到五味子的对照成分，且254nm下各显色斑点均没有GF₂₅₄薄层板直观。实验最终选择了硅胶GF₂₅₄薄层板进行枣仁安神胶囊的薄层色谱鉴别，且选择图谱效果最好的德国Merck公司GF₂₅₄薄层板进行各薄层色谱条件的考察。

2.10温湿度考察

为进一步检验此薄层色谱法的耐用性，实验对薄层展开过程中的温度、相对湿度分别进行考察，具体如下：

温度考察：按2.1所述方法，分别将展开缸置于3.5℃冷库、实验室室温、40℃烘箱，展开，色谱图见图9。

实验结果表明，展开温度为3.5℃时，供试品条带丹酚酸B和五味子甲素斑点较模糊，与邻近成分不易分离，可能是低温减慢了展开剂扩散，影响了其分离效果。常温与40℃下的展开结果基本一致，各成分斑点显示清晰，分离度好。

相对湿度考察：按2.1所述方法，分别将展开缸置于干燥器(相对湿度23％)和实验室环境(相对湿度65％，高湿)，展开，色谱图见图10。

实验结果表明，在较干燥环境中，各对照品成分斑点分离度好，显示清晰；相对湿度较大时，供试品条带丹酚酸B斑点与邻近斑点不易分离，其余成分斑点分离度与低湿时一致。

综上所述，该薄层色谱鉴别方法不适宜在低温或相对湿度太高的环境中进行。

2.11枣仁安神胶囊薄层鉴别方法的确定

取本品内容物1g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用10mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品、丹参酮II_A对照品、丹酚酸B对照品、五味子甲素对照品、五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1mL含以上对照品0.5mg、1mg、1mg、0.2mg、0.6mg、0.4mg和0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液；取酸枣仁对照提取物0.1g，加水饱和的正丁醇10mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解；取丹参对照药材0.4g，加甲醇2mL，超声提取15分钟，滤过，取滤液；取五味子对照药材0.4g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，分别作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μL、对照药材溶液5μL或/和对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，使成条状(8mm)，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(16：4：0.1：2)为展开剂，展开，展至约5cm，取出，晾干，再以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，展至约8.5cm，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱或斯皮诺素、丹参酮II_A、丹酚酸B、五味子甲素、五味子醇甲对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再喷以5％香草醛硫酸溶液，置日光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱或酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再加热5分钟，置日光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱或斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、丹参酮II_A、丹酚酸B对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.12薄层色谱结果与分析

采用优化后的薄层色谱鉴别方法，对所收集到的各批枣仁安神胶囊进行薄层色谱鉴别分析(图11)。

结果显示，此方法可以鉴别各批枣仁安神胶囊中七种成分的存在，紫外光灯(254nm)下，枣仁安神胶囊供试品及其对照品条带上均存在清晰的斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素和丹参酮II_A斑点，喷以5％香草醛硫酸溶液后，对照品及供试品条带上均存在酸枣仁皂苷A、B蓝色斑点以及丹酚酸B粉色斑点；各批次枣仁安神胶囊之间薄层色谱图差异很小，该企业的生产工艺稳定。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (6)

1.一种基于薄层色谱的枣仁安神胶囊质量检测方法，其特征在于，所述检测方法对枣仁安神胶囊中七个主要活性成分进行定性检测，所述七个主要活性成分具体为：斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、丹参酮II_A、丹酚酸B、五味子甲素、五味子醇甲；所述检测方法包括以下步骤：

取薄层层析硅胶板，吸取供试品溶液，以及对照药材溶液或/和对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，使成条状，加入第一展开剂进行一次展开，取出，晾干，再加入第二展开剂二次展开，取出，晾干后进行检视；

其中，所述第一展开剂以溶剂体积比计为乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水12-20：1-7：0.1：1-3；所述一次展开的长度为总展开长度的50-70％；

所述第二展开剂以溶剂体积比计为60-90℃石油醚-乙酸乙酯2-6：1；所述二次展开的长度为总展开长度的100％；

所述供试品溶液的制备方法为：

取待测枣仁安神胶囊内容物，加甲醇加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照药材溶液或/和对照品溶液的制备方法为：

1)制备对照品溶液：取斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品、丹参酮II_A对照品、丹酚酸B对照品、五味子甲素对照品、五味子醇甲对照品，加甲醇制成对照品溶液；

2)取酸枣仁对照提取物，加水饱和的正丁醇，超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解；取丹参对照药材，加甲醇，超声提取，滤过，取滤液；取五味子对照药材，加甲醇，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，分别作为对照药材溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检视具体为：

1)一次检视：在紫外光灯254nm下直接检视斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素和丹参酮II_A成分，

2)二次检视：在一次检视后喷显色剂5％香草醛硫酸溶液在日光灯下检视酸枣仁皂苷A、B成分，

3)三次检视：在二次检视后再加热5分钟后在日光灯下检视丹酚酸B成分；

上述三次检视均采用薄层色谱数码成像仪进行检视，经此三次检视后，可清楚地辨识对照品及供试品条带中全部七种成分斑点。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述薄层层析硅胶板为GF₂₅₄薄层层析硅胶板。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的点样量为3-4μL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：

取待测枣仁安神胶囊内容物1g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，用10mL水饱和的正丁醇振摇提取1次，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；

(2)制备对照品溶液：

取斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品、丹参酮II_A对照品、丹酚酸B对照品、五味子甲素对照品、五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1mL含以上对照品0.5mg、1mg、1mg、0.2mg、0.6mg、0.4mg和0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)制备对照药材溶液：

取酸枣仁对照提取物0.1g，加水饱和的正丁醇10mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解；取丹参对照药材0.4g，加甲醇2mL，超声提取15分钟，滤过，取滤液；取五味子对照药材0.4g，加甲醇10mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，分别作为对照药材溶液；

(4)薄层色谱检测：

照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μL，以及对照药材溶液5μL或/和对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，使成8mm条状，以溶剂体积比计乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水16：4：0.1：2为第一展开剂，一次展开，展至约5cm，取出，晾干，再以溶剂体积比计60～90℃石油醚-乙酸乙酯4：1为第二展开剂，二次展开，展至约8.5cm，取出，晾干，在紫外光灯254nm下检视，再喷以5％香草醛硫酸溶液，置日光灯下检视，然后于105℃加热5分钟，再置日光灯下检视。

Images