CN113156010B - 一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，包括：分别采用薄层色谱法、HPLC特征图谱对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，采用高效液相外标一点法对厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行定量分析。本发明针对目前现有方法的不足，提供厚朴温中汤物质基准质控方法，为经典名方厚朴温中汤复方制剂开发提供可靠的质量属性研究方法和评价体系。

Description

一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法
技术领域
本发明涉及一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法。
背景技术
厚朴温中汤由厚朴(姜制)、橘红、甘草(炙)、草豆蔻仁、茯苓(去皮)、木香、干姜、生姜八味药组成，厚朴温中汤最初出自金代李东垣的《内外伤辨感论》卷中肺之脾胃虚方，原书主治“脾胃虚寒，心腹胀满及秋冬客寒犯胃，时作疼痛”，即寒湿气滞之脘腹胀痛证[1]。作为理气剂的代表方剂，方中厚朴温中下气，燥湿散满，为君药。寒湿之邪，非温不化，辅用干姜、草豆蔻仁温脾暖胃，散寒化湿；橘红、木香辛温行气，疏调气机，使气行则湿自化，佐茯苓渗湿健脾，利湿于下以解中阳之困；生姜温胃降逆，可助散寒化浊之力。甘草和药调中为使。全方以温散中焦寒湿为主，兼而行气滞以散湿满，使寒去湿化，气机调畅则诸症自愈。现代临床常用于治疗急慢性胃炎、急性胃扩张、慢性肠炎、胃溃疡、胃潴留等属脾胃气滞寒湿证者[2-3]。
目前，关于厚朴温中汤的研究多集中于药理、临床观察[4]方面，质量控制方面的定性定量分析研究较少，尚未有确定的厚朴温中汤物质基准的质量标准。
参考文献
[1]李东垣.内外伤辨惑论[M].北京:人民卫生出版社,2007:28.
[2]谢鸣,周然.方剂学[M].北京:人民卫生出版社,2002:249.
[3]刘建群,闫君,舒积成,张锐,杨瑞昆,张升林,曹天佑,杨明.经典名方厚朴温中汤的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(17):209-218.
[4]闫君,邬思芳,刘莉,蒋红霞,齐珂璇,冯秀文,刘建群.基于尿液代谢组学比较厚朴温中汤合煎与单煎对脾胃虚寒大鼠的影响[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(20):117-123.
发明内容
本发明的目的提供厚朴温中汤物质基准的质量控制方法。
厚朴温中汤物质基准由以下制备工艺制成，包括：取姜厚朴、橘红各40重量份，炙甘草、草豆蔻仁、茯苓(去皮)、木香各20重量份、干姜3重量份，分别粉碎成粗粉；取上述七味药材粗粉共约20重量份，加水200重量份，加入生姜9重量份，闭盖，先武火煮沸再文火煎煮，煮至100重量份，过滤，滤液冷冻干燥，得厚朴温中汤物质基准。
具体的，采用300目的滤布进行过滤。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，包括：分别采用薄层色谱法、HPLC特征图谱对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，采用高效液相外标一点法对厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行定量分析；定量分析包括：
步骤(1)、制备供试品溶液：取厚朴温中汤物质基准，加入提取溶剂，超声提取，放冷，补足提取溶剂失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液；其中，所述的厚朴温中汤物质基准和提取溶剂的用量比为0.2g:10ml～20ml，优选为0.2g:10ml；所述的提取溶剂为50％(体积分数)甲醇或50％(体积分数)乙醇，优选为50％乙醇；超声提取的时间为15min～45min，优选为30min；超声提取的功率为250w，频率为100kHZ；
制备对照品溶液：取橙皮苷对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品，加提取溶剂溶解，得到含橙皮苷5.26～507μg/ml、厚朴酚1.07～103.6μg/ml、和厚朴酚1.07～102.9μg/ml的混合对照品溶液；
步骤(2)、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标一点法分别计算双厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量；其中，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱，以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速：0.8～1.0ml/min；柱温：25℃～35℃；检测波长：290nm；进样体积：10μl；
梯度洗脱程序为：
Figure GDA0003861439350000021
优选的，所述的供试品溶液的制备方法为：取0.2g厚朴温中汤物质基准，精密加入10ml50％乙醇，超声处理(功率250w，频率100kHZ)30min，取出放冷，补足失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液。
优选的，所述的C18色谱柱为色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)、CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)、Kromasil 100-5C18(4.6×250mm，5μm)，优选为ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)。
优选的，高效液相色谱的条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速：0.9ml/min；柱温：25℃；检测波长：290nm；进样体积：10μl。
采用HPLC特征图谱对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，包括：
步骤(1)、供试品溶液制备：取厚朴温中汤物质基准，加入50％(体积分数)乙醇，超声提取，冷却至室温，摇匀，滤过，取续滤液后过活化后的SPE小柱，先用一个柱体积的30％甲醇淋洗，再用一个柱体积的甲醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液用0.45μm滤器过滤，即得供试品溶液；其中，厚朴温中汤物质基准和50％乙醇的用量比为0.02:1g/ml或kg/l；
步骤(2)、取10μl供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行定性分析，HPLC色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(流动相A)-乙腈(流动相B)梯度洗脱，流速0.8ml/min；柱温：30℃；检测波长：290nm、250nm；
洗脱梯度程序为：
Figure GDA0003861439350000022
分别记录检测波长290nm、250nm下的HPLC色谱图，对厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、山姜素、小豆蔻明、和厚朴酚、厚朴酚、桤木酮、甘草酸铵、木香烃内酯进行定性分析。
检测波长290nm下的HPLC色谱图，以橙皮苷为参照峰，各特征峰及其相对保留时间如下：
Figure GDA0003861439350000031
检测波长250nm下的HPLC色谱图，以甘草酸铵为参照峰，各特征峰及其相对保留时间如下：
Figure GDA0003861439350000032
所述的SPE小柱的填料为C18，具体可以为SupelcleanTM LC-18Tubes。
SPE小柱的活化方法：一个柱体积的甲醇活化，再加一个柱体积的水平衡。
续滤液的上样量为一柱体积SPE小柱。
采用薄层色谱法对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，包括：
供试品溶液制备：取厚朴温中汤物质基准1g，加入水饱和的正丁醇10ml，超声处理30min，滤过，滤液用正丁醇饱和水洗涤3次，每次10ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加2ml甲醇复溶，即得供试品溶液；
对照品溶液制备：称取厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、6-姜辣素和桤木酮、橙皮苷、甘草苷对照品于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释，得到混合对照品溶液；其中，混合对照品溶液中厚朴酚0.25mg/ml、木香烃内酯0.35mg/ml、去氢木香内酯0.25mg/ml、6-姜辣素0.15mg/ml和桤木酮0.20mg/ml、橙皮苷0.65mg/ml、甘草苷0.8mg/ml；
甘草苷和橙皮苷的薄层色谱鉴别：吸取对照品溶液和供试品溶液各8μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，点样宽度为10mm，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸和水的体积比＝15:1:1:2)为展开剂，展开8cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在波长365nm下检视，供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点，在与橙皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同显色的深色斑点。
厚朴酚、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯和6-姜辣素的薄层色谱鉴别：吸取对照品溶液和供试品溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，点样宽度为10mm，甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇(甲苯、乙酸乙酯、乙酸和甲醇的体积比＝26:2:1:0.5)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，在波长254nm下检视，供试品色谱中，在与厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同的浅蓝色荧光斑点；再喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点。
本发明的有益效果：
本发明针对目前现有研究的不足，建立厚朴温中汤物质基准中姜厚朴、橘红、炙甘草、草豆蔻、木香、干姜和生姜的薄层鉴别方法；建立橙皮苷、厚朴酚与和厚朴酚的含量测定方法，确定多指标成分从药材/饮片-物质基准转移率范围以及出膏率范围；建立物质基准特征图谱方法，15批厚朴温中汤物质基准相似度达到90％以上。本发明为厚朴温中汤后续的药学研究奠定基础，也为类似方剂的开发与工业生产提供新的思路。
附图说明
图1为条件1点样体积考察的供试品薄层色谱；其中，1-点样体积2μl，2-点样体积5μl，3-点样体积8μl，4-点样体积10μl；橙皮苷RF＝0.303，甘草苷RF＝0.500。
图2为条件1点样宽度考察的供试品薄层色谱；其中，1-点样宽度2mm，2-点样宽度4mm，3-点样宽度6mm，4-点样宽度8mm，5-点样宽度10mm；橙皮苷RF＝0.317，甘草苷RF＝0.517。
图3为条件1不同展开距离考察的供试品薄层色谱；图a为展开距离6cm的薄层色谱，图b为展开距离8cm的薄层色谱，图c为展开距离10cm的薄层色谱；S1-混合对照品，1-供试品。
图4条件1下物质基准样品溶液薄层色谱图；S1-对照品溶液，1-8为不同批次的供试品溶液。
图5为条件2点样体积考察的供试品薄层色谱；其中，左图为紫外光灯(254nm)下检视的薄层色谱，右图为香草醛硫酸显色后的日光条件下的薄层色谱；1-点样体积2μl，2-点样体积5μl，3-点样体积8μl，4-点样体积10μl；6-姜辣素RF＝0.241，厚朴酚RF＝0.342，木香烃内酯RF＝0.541，去氢木香内酯RF＝0.613，桤木酮RF＝0.740。
图6为条件2点样宽度考察的供试品薄层色谱；其中，左图为紫外光灯(254nm)下检视的薄层色谱，右图为香草醛硫酸显色后的日光条件下的薄层色谱；1-点样宽度2mm，2-点样宽度4mm，3-点样宽度6mm，4-点样宽度8mm，5-点样宽度10mm；6-姜辣素RF＝0.235，厚朴酚RF＝0.325，木香烃内酯RF＝0.535，去氢木香内酯RF＝0.590，桤木酮RF＝0.741。
图7为条件2展开距离8cm的薄层色谱；其中，左图为紫外光灯(254nm)下检视的薄层色谱，右图为香草醛硫酸显色后的日光条件下的薄层色谱；S1-混合对照品，1-供试品；6-姜辣素RF＝0.219，厚朴酚RF＝0.319，木香烃内酯RF＝0.494，去氢木香内酯RF＝0.556，桤木酮RF＝0.681。
图8为条件2展开距离10cm的薄层色谱；其中，左图为紫外光灯(254nm)下检视的薄层色谱，右图为香草醛硫酸显色后的日光条件下的薄层色谱；S1-混合对照品，1-供试品；6-姜辣素RF＝0.250，厚朴酚RF＝0.345，木香烃内酯RF＝0.560，去氢木香内酯RF＝0.615，桤木酮RF＝0.745。
图9为条件2展开距离12cm的薄层色谱；其中，左图为紫外光灯(254nm)下检视的薄层色谱，右图为香草醛硫酸显色后的日光条件下的薄层色谱；S1-混合对照品，1-供试品；6-姜辣素RF＝0.254，厚朴酚RF＝0.363，木香烃内酯RF＝0.554，去氢木香内酯RF＝0.613，桤木酮RF＝0.746。
图10条件2下物质基准样品溶液薄层色谱图；左图为紫外光灯(254nm)下检视的薄层色谱，右图为香草醛硫酸显色后的日光条件下的薄层色谱；S1-对照品溶液，1-4为不同批次的供试品溶液。
图11为混合标准品(a)和供试品(b)色谱图(290nm)；其中，1-橙皮苷；2-山姜素；3-小豆蔻明；4-和厚朴酚；5-厚朴酚；6-桤木酮。
图12为混合标准品(a)和供试品(c)色谱图(250nm)；其中，7-甘草酸铵；8-木香烃内酯。
图13为15批物质基准样品特征图谱图(290nm)。
图14为15批物质基准样品特征图谱图(250nm)。
图15为专属性考察结果；其中，a-橙皮苷，b-和厚朴酚，c-厚朴酚，d-样品，e-缺橘红样品，f-缺厚朴样品；1-橙皮苷，2-和厚朴酚，3-厚朴酚。
图16为15批厚朴温中汤物质基准样品液相色谱图(自下至上为S1-S15)；其中，1-橙皮苷，2-和厚朴酚，3-厚朴酚。
具体实施方式
根据文献考证结果，认为金代李东垣《内外伤辨惑论》中厚朴温中汤的药用计量单位值为：1两约合今39.00～41.25g，1钱合3.90～4.13g，1分合0.39～0.41g。厚朴温中汤各药味折合现代剂量为：厚朴、橘红各40g，炙甘草、草豆蔻仁、茯苓(去皮)、木香各20g、干姜3g。
厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；橘红为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥外层果皮；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎；木香为菊科植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核；草豆蔻仁为姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata的干燥近成熟种子；干姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎；生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎。
厚朴温中汤物质基准制备工艺如下：姜厚朴、橘红各40g，炙甘草、草豆蔻、茯苓(去皮)、木香各20g、干姜3g，分别粉碎成粗粉。取上述七味药材粗粉共约20g，加水200ml，加入生姜三片(以生姜一片3g计，共为9g)，闭盖，先武火煮沸再文火煎煮，煮至100ml，300目滤布滤过，冷冻干燥得厚朴温中汤物质基准。
发明人通过随机数表法组合各批次饮片制备15批厚朴温中汤物质基准(S1-S15)，采用薄层色谱、特征图谱对物质基准进行定性分析，并采用含量测定对物质基准进行定量分析，拟定厚朴温中汤物质基准的质量控制方法。
1建立厚朴温中汤物质基准薄层鉴别研究
1.1样品溶液制备
供试品溶液制备：取厚朴温中汤物质基准1g，加水饱和的正丁醇(水饱和的正丁醇为水与正丁醇按照体积比1:1萃取时的上层)10ml，超声处理30min，滤过，滤液用正丁醇饱和水(正丁醇饱和水为水与正丁醇按照体积比1:1萃取时的下层)洗涤3次，每次10ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加2ml甲醇复溶，即得样品溶液。按供试品溶液的制备方法，同法分别制备缺姜厚朴、缺橘红、缺木香、缺甘草、缺草豆蔻仁、缺干姜和缺生姜阴性样品溶液。
对照品溶液制备：精密称取厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、6-姜辣素和桤木酮、橙皮苷、甘草苷对照品于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释，得到混合对照品溶液，混合对照品溶液中各对照品浓度分别为厚朴酚0.25mg/ml、木香烃内酯0.35mg/ml、去氢木香内酯0.25mg/ml、6-姜辣素0.15mg/ml和桤木酮0.20mg/ml、橙皮苷0.65mg/ml、甘草苷0.8mg/ml。
1.2薄层条件
1.2.1甘草苷与橙皮苷的薄层条件(条件1)
1.2.1.1色谱条件考察
1.2.1.1.1点样体积考察
取供试品溶液分别点样2μl、5μl、8μl和10μl于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上。点样宽度10mm，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比＝15:1:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。如图1所示，供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点；在与橙皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同显色的深色斑点。随着点样量的增大，薄层色谱条带的亮度和宽度也随之增大，当点样量为10μl时，甘草苷条带过宽，分离效果不如8μl的好，所以选择8μl作为点样体积。
1.2.1.1.2点样宽度考察
取8μl供试品溶液，分别点样于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，点样宽度分别为2mm、4mm、6mm、8mm和10mm。以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比＝15:1:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。如图2所示，供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点；在与橙皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同显色的深色斑点。随着点样宽度的增大，薄层色谱条带也随之变细，当点样宽度为10mm时条带最细且清晰，所以选择10mm为点样宽度。
1.2.1.1.3展开距离考察
取混合对照品溶液和供试品溶液分别点样于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上。点样体积8μl，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比＝15:1:1:2)为展开剂，分别展开6cm、8cm、10cm后取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。如图3所示，供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点；在与橙皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同显色的深色斑点。展开距离为6cm：橙皮苷RF＝0.269、甘草苷RF＝0.462，展开距离为8cm：橙皮苷RF＝0.294、甘草苷RF＝0.500，展开距离为10cm:橙皮苷RF＝0.293、甘草苷RF＝0.493。随着展开距离的增大，两个对照品的色谱条带与它们附近的条带之间的分离效果也随之优化。综合考虑分离效果和时间选择展开距离为8cm。
综合考虑：厚朴温中汤物质基准中甘草苷和橙皮苷的薄层色谱条件为：吸取对照品溶液和供试品溶液各8μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，点样宽度为10mm，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比＝15:1:1:2)为展开剂，展开8cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；图4为不同批次厚朴温中汤物质基准样品溶液薄层色谱，供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点；在与橙皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同显色的深色斑点。
1.2.2厚朴酚、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯和6-姜辣素的薄层条件(条件2)
1.2.2.1点样体积考察
取供试品溶液分别点样2μl、5μl、8μl和10μl于同一硅胶G薄层板上，点样宽度10mm，以甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇(体积比＝26:2:1:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检视，如图5所示，供试品色谱中，在与厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同的浅蓝色荧光斑点；喷以1％香草醛硫酸溶液，供试品色谱中，在与桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点。随着点样量的增大，薄层色谱条带的亮度和宽度也随之增大。当点样量为10μl时，木香烃内酯和去氢木香内酯条带过宽，分离效果不如8μl的好，所以选择8μl作为点样体积。
1.2.2.2点样宽度考察
取供试品溶液8μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，点样宽度分别为2mm、4mm、6mm、8mm和10mm，以甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇(体积比＝26:2:1:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检视，如图6所示，供试品色谱中，在与厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同的浅蓝色荧光斑点；喷以1％香草醛硫酸溶液，供试品色谱中，在与桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点。随着点样宽度的增大，薄层色谱条带也随之变细。当点样宽度为10mm时条带最细且清晰，所以选择10mm为点样宽度。
1.2.2.3展开距离考察
取混合对照品溶液和供试品溶液，同时点样于三块不同的硅胶G薄层板上。点样体积8μl，点样宽度10mm，以甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇(体积比＝26:2:1:0.5)为展开剂，展开8cm、10cm、12cm，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检视，如图7-图9所示，供试品色谱中，在与厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同的浅蓝色荧光斑点；喷以1％香草醛硫酸溶液，供试品色谱中，在与桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点。随着展开距离的增大，五种对照品的色谱条带与它们附近的条带之间的分离效果也随之优化。展开距离8cm时，厚朴酚的条带同它上面的色谱条带刚好分离。而展开距离10cm的色谱图中，五种对照品与它们附近的成分分离完全，在兼顾提高分离效果和控制展开时间的基础上，选择10cm作为展开距离。
综合考虑：厚朴温中汤物质基准中厚朴酚、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯和6-姜辣素的薄层色谱条件为：吸取对照品溶液和供试品溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，点样宽度为10mm，甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇(体积比＝26:2:1:0.5)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检视。图10为不同批次厚朴温中汤物质基准样品溶液薄层色谱，供试品色谱中，在与厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同的浅蓝色荧光斑点；后喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点。
2建立厚朴温中汤物质基准HPLC特征图谱研究
为全面的反映厚朴温中汤物质基准的化学成分信息，整体控制其质量，建立了250nm、290nm条件下厚朴温中汤物质基准的特征图谱。于290nm下选择6个共有峰(1-橙皮苷；2-山姜素；3-小豆蔻明；4-和厚朴酚；5-厚朴酚；6-桤木酮)作为特征峰，以峰1为参照峰(S)计算峰1～峰6的相对保留时间(RRT)和相对峰面积(RA)；250nm下选择2个共有峰(7-甘草酸铵；8-木香烃内酯)作为特征峰，以峰7为参照峰(S)计算峰7～峰8的相对保留时间(RRT)和相对峰面积(RA)。在方法学考察时以相对保留时间和相对峰面积的RSD值来对仪器的精密度、供试品溶液的重复性及稳定性进行评价。
2.1样品溶液制备
供试品溶液制备：精密称定0.2g厚朴温中汤物质基准于锥形瓶中，精密加入10ml50％乙醇，超声30min，冷却至室温，摇匀，滤过，取1ml续滤液上活化后的SPE小柱(SupelcleanTM LC-18 1ml Tubes)，先用1ml 30％甲醇淋洗去除干扰物质，再用1ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，洗脱液用0.45μm滤器过滤，即得供试品溶液。同法制得缺橘红、缺姜厚朴、缺炙甘草、缺木香、缺草豆蔻、缺干姜生姜、缺茯苓阴性样品溶液。
SPE小柱的活化方法：一个柱体积(1ml)的甲醇活化，再加一个柱体积(1ml)的水平衡。
对照品溶液的制备：取橙皮苷、山姜素、小豆蔻明、和厚朴酚、厚朴酚、桤木酮、甘草酸铵和木香烃内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成橙皮苷60μg/ml、山姜素40μg/ml、小豆蔻明40μg/ml、和厚朴酚24μg/ml、厚朴酚40μg/ml、桤木酮80μg/ml、甘草酸铵200μg/ml、木香烃内酯100μg/ml的混合溶液，即得。
2.2色谱条件
色谱柱：色谱柱：Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱梯度见表1；流速0.8ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl；检测波长：290nm、250nm。色谱图见图11、图12。
表1.梯度洗脱程序
Figure GDA0003861439350000071
Figure GDA0003861439350000081
2.3专属性
将混合标准品溶液和供试品溶液按照“2.2”中的色谱条件进样，记录色谱图，结果表明，无阴性干扰，专属性良好。
2.4精密度
按照“2.1”项下样品溶液制备方法制备供试品溶液，并按照“2.2”项下色谱条件进行分析，在一天内连续进样6次，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。实验结果表明，各待测成分相对保留时间RSD＜1、相对峰面积的RSD<3，本方法精密度较好。
2.5重复性
平行称取6份样品粉末，按照“2.1”项下样品溶液制备方法制备供试品溶液，并按照“2.2”项下色谱条件进行分析，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。实验结果表明，各待测成分相对保留时间RSD＜1、相对峰面积的RSD＜4，说明本方法重复性较好。
2.6稳定性
按照“2.1”项下样品溶液制备方法制备供试品溶液，并按照“2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24h各进样1针进行分析，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。实验结果表明，各待测成分相对保留时间RSD＜1、相对峰面积的RSD＜4，说明供试品溶液在24小时内稳定。
2.7厚朴温中汤物质基准HPLC特征图谱的建立
按照“2.1”项下样品溶液制备方法制备厚朴温中汤物质基准供试品溶液S1～S15，并按照“2.2”项下色谱条件进行测定，记录各色谱峰的保留时间和峰面积，采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)，以S5为参照图谱，时间窗宽度为0.1，采用平均数法生成对照指纹图谱，进行峰匹配，计算相似度。15批物质基准特征图谱(图13、图14)与对照图谱R的相似度均＞0.90，说明厚朴温中汤物质基准制备工艺稳定。
290nm波长下选择6个共有峰为特征峰建立特征图谱，特征峰面积占总峰面积90％以上，以峰1为参照峰S，计算峰1～峰6的相对保留时间分别为1.000(峰1)、2.284(峰2)、4.151峰3)、4.394(峰4)、4.930(峰5)和5.729(峰6)。
250nm波长下选择2个共有峰为特征峰建立特征图谱，特征峰面积占总峰面积90％以上，以峰7为参照峰S，计算峰7、峰8的相对保留时间分别为1.000(峰7)、1.720(峰8)。
表2.15批物质基准特征图谱相似度结果-290nm
Figure GDA0003861439350000082
注：R为对照指纹图谱。
表3.物质基准样品测定结果(检测波长290nm，相对保留时间)
Figure GDA0003861439350000091
表4.物质基准样品测定结果(检测波长290nm，相对峰面积)
Figure GDA0003861439350000092
表5.15批物质基准特征图谱相似度结果(检测波长250nm)
Figure GDA0003861439350000093
Figure GDA0003861439350000101
注：R为对照指纹图谱。
表6.物质基准样品测定结果(检测波长250nm，相对保留时间)
Figure GDA0003861439350000102
表7.物质基准样品测定结果(检测波长250nm，相对峰面积)
Figure GDA0003861439350000103
2.8小结
15批物质基准样品中的处方药味生姜及干姜的指标成分6-姜辣素含量较低且不能稳定存在，因此6-姜辣素不作为特征峰。由于茯苓含有丰富的多糖类成分，在紫外条件下无吸收，因而在全方物质基准特征图谱中未检测到茯苓的特征峰。后续实验可尝试对茯苓中三萜类成分进行进一步富集，以求为方中所有药味建立完整的质量标准奠定基础。
3建立厚朴温中汤物质基准定量研究
3.1供试品制备条件的考察
3.1.1标准品溶液的制备
取一定量的橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品加50％乙醇溶解，得到含橙皮苷0.2mg/mL、厚朴酚0.04mg/mL、和厚朴酚0.04mg/mL的混合对照品溶液。供试品中三种待分析成分含量按以下公式计算：
含量(％)＝(rU/rS)×CS×(V/W)×0.1
rU＝供试品溶液中待测成分的峰面积；rS＝对照品溶液中待测成分的峰面积；CS＝对照品溶液中待测成分的浓度(μg/mL)；V＝供试品溶液体积(mL)；W＝厚朴温中汤物质基准重量(mg)。
3.1.2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表8中的梯度洗脱；流速：0.9ml/min；柱温：25℃；检测波长为290nm；进样体积10μl。
表8.梯度洗脱程序
Figure GDA0003861439350000111
3.1.3提取溶剂考察
取0.2g厚朴温中汤物质基准三份，精密称定，分别置于100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入10ml水、10ml50％乙醇和10ml50％甲醇，超声处理(功率250w，频率100kHZ)30min，取出放冷，补足失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液进样，记录峰面积，计算厚朴温中汤物质基准中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量。
表9.提取溶剂考察(n＝3,％)
Figure GDA0003861439350000112
Figure GDA0003861439350000121
结果显示，50％乙醇提取效率最高，因此选择50％乙醇作为提取溶剂。
3.1.4提取体积考察
取0.2g厚朴温中汤物质基准三份，精密称定，分别置于100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入10ml、15ml、20ml50％乙醇，超声处理(功率250w，频率100kHZ)30min，取出放冷，补足失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液进样，记录峰面积，计算厚朴温中汤物质基准中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量。
表10.提取溶剂体积考察(n＝3,％)
Figure GDA0003861439350000122
可以看出，溶剂体积对于样品提取影响不大，为节约溶剂，选择10ml作为提取溶剂体积。
3.1.5提取时间的考察
取0.2g厚朴温中汤物质基准三份，精密称定，分别置于100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入10ml50％乙醇，分别超声处理(功率250w，频率100kHZ)15min、30min、45min，取出放冷，补足失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液进样，记录峰面积，计算厚朴温中汤物质基准中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量。
表11.不同提取时间的考察(n＝3,％)
Figure GDA0003861439350000123
Figure GDA0003861439350000131
实验结果表明，随着提取时间的加长，待测成分含量变化不大。提取30min时，所测的和厚朴酚与厚朴酚含量较15min和45min稍微高一些，综合考虑选择提取时间为30min。
3.1.6小结
综合上述考察结果，供试品制备方法被确定为：精密称定0.2g厚朴温中汤物质基准冻干粉，精密加入10ml50％乙醇，超声处理(功率250w，频率100kHZ)30min，取出放冷，补足失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液。
3.2色谱条件考察
3.2.1检测波长的确定
取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品，采用紫外灯扫描模式(190～400nm)进行扫描。发现在284nm、290nm、292nm处有最大吸收，为兼顾整体测定，确定检测波长为290nm。
3.2.2色谱系统考察
3.2.2.1色谱柱考察
选取三根不同型号的色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm，S.N.：USUXA31568)、CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm，Col.No.：A4AD 22307)、Kromasil 100-5C18(4.6×250mm，5μm，Serial No.：E59028)进行考察。3个化合物在三根色谱柱上均能得到较好的分离，最终以峰形、分离度较好的ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)选作色谱柱。
表12.不同色谱柱考察结果
Figure GDA0003861439350000132
3.2.2.2流动相考察
3.2.2.2.1流动相pH考察
分别考察纯水、0.05％、0.10％甲酸对色谱分离的影响，记录待测成分的色谱参数。结果显示，3个化合物在三种pH条件下均能得到较好的分离，综合考虑，最终以拖尾因子稍好的0.10％甲酸选作流动相。
表13.流动相pH考察结果
Figure GDA0003861439350000133
Figure GDA0003861439350000141
3.2.2.2.2流动相梯度考察
以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，分别考察三个不同的流动相梯度，如表14所示，根据分离度、拖尾因子、理论塔板数和信噪比，可知洗脱程序B效果最佳。
表14.流动相梯度考察
Figure GDA0003861439350000142
表15.流动相梯度考察结果
Figure GDA0003861439350000143
3.2.2.3流速考察
对不同流速0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min的分离效果进行考察，结果表明流速对分离效果有较大的影响，0.9ml/min分离效果最佳。
表16.流速考察结果
Figure GDA0003861439350000144
Figure GDA0003861439350000151
3.2.2.4柱温考察
分别考察不同柱温25℃、30℃、35℃对分离效果的影响。30℃时分离度和保留时间最为合适。
表17.柱温考察结果
Figure GDA0003861439350000152
3.2.2.5进样体积考察
分别考察了不同进样体积5μl、10μl、15μl对待测成分分离的影响，结果表明进样体积对分离效果影响不大。比较各色谱参数，综合考虑，选择10μl为进样体积。
表18.进样体积考察结果
Figure GDA0003861439350000153
3.3方法学考察
3.3.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表8的梯度洗脱；流速：0.9ml/min；柱温：25℃；检测波长为290nm；进样体积10μl。
3.3.2线性和范围
3.3.2.1标准曲线
对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，置于10ml容量瓶中，加50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚分别为0.507、0.1036、0.1029mg/ml的混合对照品溶液，记为对照品溶液Ⅰ。吸取上述对照品溶液Ⅰ3.0ml于5ml容量瓶，加50％乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液Ⅱ。吸取上述对照品溶液Ⅱ3.0ml于5ml容量瓶，加50％乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液Ⅲ。吸取上述对照品溶液Ⅲ3.0ml于5ml容量瓶，加50％乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液Ⅳ。吸取上述对照品溶液Ⅳ1.0ml于5ml容量瓶，加50％乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液Ⅴ。吸取上述对照品溶液Ⅴ3.0ml于5ml容量瓶，加50％乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液Ⅵ。吸取上述对照品溶液Ⅵ2.0ml于5ml容量瓶，加50％乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液Ⅶ。
按照“3.3.1”的色谱条件测定，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并以最小二乘法计算回归方程。表明在各成分在其线性范围内，对照品浓度与峰面积均呈良好线性关系。
表19.线性考察
Figure GDA0003861439350000161
实验结果表明，在该色谱条件下，橙皮苷在5.26μg/mL-507μg/mL范围内时峰面积与浓度呈线性关系，和厚朴酚在1.07μg/mL-102.9μg/mL范围内时峰面积与浓度呈线性关系，厚朴酚在1.07μg/mL-103.6μg/mL范围内时峰面积与浓度呈线性关系。
3.3.2.2检测限和定量限
用50％乙醇稀释对照品溶液，将对照品溶液稀释至约3倍信噪比的浓度(S/N＝3)，即为检测限(LOD)；约10倍信噪比的浓度(S/N＝10)即为定量限(LOQ)，将稀释所得一系列合适浓度的对照品稀释溶液注入液相色谱仪确定检测限(LOD)及定量限(LOQ)，结果见表19。
3.3.3精密度考察
3.3.3.1重复性
取同一批厚朴温中汤物质基准6份，精密称定，置于100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入10ml50％乙醇，超声处理(功率250w，频率100kHZ)30min，取出放冷，补足失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液，按照“3.3.1”的色谱条件进行分析。记录各待测成分色谱峰峰面积，并计算各待测成分的含量。实验结果表明RSD均小于3％，表明该方法重复性好。
表20.重复性考察结果
Figure GDA0003861439350000162
3.3.3.2中间精密度
3.3.3.2.1不同天
每天按照“3.1.6”项下方法制备供试品溶液，按照“3.3.1”的色谱条件，连续进样三天，记录色谱图，测定各色谱峰的峰面积并计算含量。实验结果见表21，表明RSD小于3％，表明该方法在不同天之间的精密度良好。
表21.三种成分中间精密度考察(不同天)
Figure GDA0003861439350000171
3.3.3.2.2不同分析人员
实验室不同分析人员按“3.1.6”项下方法制备样品溶液，按“3.3.1”项下色谱条件测定样品中3个待测成分的含量，每个样品连续进样3次，测定峰面积，计算各化合物的含量。结果见22，显示不同分析人员所测样品RSD小于2％，表明所建方法精密度良好。
表22.三种成分中间精密度考察(不同分析人员)
Figure GDA0003861439350000172
3.3.3.2.2不同仪器
按“3.1.6”项下方法制备样品溶液，平行制备三份供试品溶液，按“3.3.1”项下色谱条件分别在岛津LC-20A、Agilent 1290Infinity和Waters ACQUITY Arc三种不同系列高效液相色谱仪上进行分析。记录色谱峰峰面积，计算各化合物的含量。结果见表23，显示不同仪器所测样品RSD小于2％，说明本方法在不同仪器之间的中间精密度良好。
表23.三种成分中间精密度考察(不同仪器)
Figure GDA0003861439350000181
3.3.4专属性
将标准品溶液和供试样品溶液按照“3.3.1”中的色谱条件进样，记录色谱图，如图15所示，供试品溶液3种待测成分的保留时间与标准品溶液的色谱峰相对应，且无阴性干扰，说明本方法专属性良好。
3.3.5稳定性
将按照“3.1.6”项下方法制备的供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24h进样六次，记录峰面积。实验结果见表24，表明样品溶液色谱峰中在24h内峰面积没有显著变化，表明供试品溶液24h内能够保持稳定。
表24.稳定性考察结果
Figure GDA0003861439350000182
3.3.6准确度
精密称定0.10g厚朴温中汤物质基准9份，分别为低、中、高三个水平，每个水平平行三份，加入橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的量如表所示，按照“3.1.6”制备供试品溶液，按照“3.3.1”中的色谱条件进行分析。
表25.橙皮苷加样回收率(n＝9)
Figure GDA0003861439350000191
表26.和厚朴酚加样回收率(n＝9)
Figure GDA0003861439350000192
表27.厚朴酚加样回收率(n＝9)
Figure GDA0003861439350000193
3.4样品分析
3.4.1指标成分含量测定
按照“3.1.6”项下方法制备供试品溶液，采用“3.3.1”项下色谱条件，以随行对照品溶液作为对照，测定15批物质基准中3个指标成分的含量。
表28.15批厚朴温中汤物质基准中指标成分含量
Figure GDA0003861439350000201
橙皮苷均值为0.8793％，70％～130％的范围为0.6155％～1.1431％；厚朴酚与和厚朴酚总量均值为0.1776％，70％～130％的范围为0.1243％～0.2309％。
测定15批厚朴温中汤物质基准指标成分含量，结果显示橙皮苷均在均值70％～130％的范围内。S1批次中厚朴酚与和厚朴酚总量超出均值70％～130％范围(表格加粗数据)，溯源该批次物质基准中所用姜厚朴的厚朴酚与和厚朴酚总量为15批次中最低。
3.4.2药材/饮片-物质基准转移率及出膏率
计算药材/饮片-物质基准中指标成分含量的转移率，见表29，考察其之间量值传递关系。
有效成分转移率＝(w×m)/(W×M)×100％
w:表示物质基准中有效成分的质量分数；m:物质基准样品量；W:药材/饮片中有效成分的质量分数；M:药材/饮片投料量。
出膏率(％)＝冷冻干燥后干膏重/药材重*100％
表29.药材/饮片、物质基准转移率和出膏率结果
Figure GDA0003861439350000211
由转移率结果可知，橘红中橙皮苷转移率平均值为15.74％；姜厚朴中厚朴酚与和厚朴酚总量转移率平均值为5.75％；数据波动范围较大，有超出均值70％～130％的数据(表格加粗数据)，说明数据有一定离散程度。暂定橙皮苷转移率为11.02％～20.47％；厚朴酚与和厚朴酚总量转移率为4.02％～7.47％。出膏率平均值为13.71％，数值未出现离散数据，暂定出膏率范围为9.60％～17.82％。

Claims (8)

1.一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：包括：分别采用薄层色谱法、HPLC特征图谱对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，采用高效液相外标一点法对厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行定量分析；
采用薄层色谱法对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，包括：
供试品溶液制备：取厚朴温中汤物质基准1g，加入水饱和的正丁醇10ml，超声处理30min，滤过，滤液用正丁醇饱和水洗涤3次，每次10ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加2ml甲醇复溶，即得供试品溶液；
对照品溶液制备：称取厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、6-姜辣素和桤木酮、橙皮苷、甘草苷对照品于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释，得到混合对照品溶液；
甘草苷和橙皮苷的薄层色谱鉴别：吸取对照品溶液和供试品溶液各8μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，点样宽度为10mm，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开8cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在波长365nm下检视，供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点，在与橙皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同显色的深色斑点；
厚朴酚、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯和6-姜辣素的薄层色谱鉴别：吸取对照品溶液和供试品溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，点样宽度为10mm，甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇为展开剂，展开10cm，取出，晾干，在波长254nm下检视，供试品色谱中，在与厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同的浅蓝色荧光斑点；再喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点；
乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水中乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸和水的体积比＝15:1:1:2；甲苯-乙酸乙酯-乙酸-甲醇中甲苯、乙酸乙酯、乙酸和甲醇的体积比＝26:2:1:0.5；
定量分析包括：
步骤(1)、制备供试品溶液：取厚朴温中汤物质基准，加入提取溶剂，超声提取，放冷，补足提取溶剂失重，摇匀，0.45μm滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液；其中，所述的厚朴温中汤物质基准和提取溶剂的用量比为0.2g:10ml～20ml；所述的提取溶剂为50％甲醇或50％乙醇；超声提取的时间为15min～45min；
制备对照品溶液：取橙皮苷对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品，加提取溶剂溶解，得到含橙皮苷5.26～507μg/ml、厚朴酚1.07～103.6μg/ml、和厚朴酚1.07～102.9μg/ml的混合对照品溶液；
步骤(2)、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标一点法分别计算厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量；其中，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱，以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速：0.8～1.0ml/min；柱温：25℃～35℃；检测波长：290nm；进样体积：10μl；
梯度洗脱程序为：
Figure FDA0003861439340000021
2.根据权利要求1所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：所述的厚朴温中汤物质基准和提取溶剂的用量比为0.2g:10ml；所述的提取溶剂为50％乙醇；超声提取的时间为30min。
3.根据权利要求1所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：高效液相色谱的条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6×250mm，5μm；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速：0.9ml/min；柱温：25℃；检测波长：290nm；进样体积：10μl。
4.根据权利要求1所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：采用HPLC特征图谱对厚朴温中汤物质基准进行定性分析，包括：
步骤(1)、供试品溶液制备：取厚朴温中汤物质基准，加入50％乙醇，超声提取，冷却至室温，摇匀，滤过，取续滤液过活化后的SPE小柱，先用一个柱体积的30％甲醇淋洗，再用一个柱体积的甲醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液用0.45μm滤器过滤，即得供试品溶液；
步骤(2)、取10μl供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行定性分析，HPLC色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速0.8ml/min；柱温：30℃；检测波长：290nm、250nm；
洗脱梯度程序为：
Figure FDA0003861439340000031
分别记录检测波长290nm、250nm下的HPLC色谱图，对厚朴温中汤物质基准中的橙皮苷、山姜素、小豆蔻明、和厚朴酚、厚朴酚、桤木酮、甘草酸铵、木香烃内酯进行定性分析。
5.根据权利要求4所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：厚朴温中汤物质基准和50％乙醇的用量比为0.02:1g/ml或kg/l。
6.根据权利要求4所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：所述的SPE小柱的填料为C18。
7.根据权利要求4所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：检测波长290nm下的HPLC色谱图，以橙皮苷为参照峰，各特征峰及其相对保留时间如下：
Figure FDA0003861439340000032
检测波长250nm下的HPLC色谱图，以甘草酸铵为参照峰，各特征峰及其相对保留时间如下：
Figure FDA0003861439340000033
8.根据权利要求1所述的厚朴温中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：混合对照品溶液中厚朴酚0.25mg/ml、木香烃内酯0.35mg/ml、去氢木香内酯0.25mg/ml、6-姜辣素0.15mg/ml和桤木酮0.20mg/ml、橙皮苷0.65mg/ml、甘草苷0.8mg/ml。
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