CN115508491A - 一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立及含量测定方法 - Google Patents
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立及含量测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药分析领域，特别涉及一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱及含量测定方法的建立。特征图谱建立方法步骤包括供试品溶液的制备、将供试品溶液注入高效液相色谱、记录色谱图、方法学考察。另建立了厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷和山姜素4个指标成分的含量测定方法，并进行了精密度、重复性、稳定性、专属性、线性关系、加样回收率和耐用性考察，得出该方法的方法学考察结果较好，耐受性较高，适用于厚朴温中汤指标成分的含量测定。通过建立指标成分含量测定方法和特征图谱含量测定方法为厚朴温中汤汤剂基准样品的质量控制提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂的质量控制方法，特别是涉及一种用高效液相色谱法对厚朴温中汤汤剂及基准样品制剂特征图谱的构建方法及含量测定方法。
背景技术
基准样品是是经典名方开发过程中的关键物质，开展基准样品的质量研究，需要从多方面进行整体质量评价，如质量控制成分的含量、特征图谱、得膏率等。质量控制成分的选取在控制复方制剂的质量上极为重要。
厚朴温中汤中厚朴为“君药”，其药理作用与厚朴温中汤整方的药理作用类似，厚朴酚与和厚朴酚为《中国药典》(2020年版)中的质量控制成分，并且这两个成分的药理活性在本方治疗胃肠疾病中发挥着重要作用；草豆蔻为本方的“臣药”，其成分山姜素具有保护胃黏膜的药理作用；陈皮中的橙皮苷成分在复方中的含量较高，并且也具有抗胃溃疡的药理作用。
专利CN 113156010 A中提供了厚朴温中汤物质基准的橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚三种成分的定量分析测定方法；橙皮苷、山姜素、小豆蔻明、和厚朴酚、厚朴酚、桤木酮、甘草酸铵、木香烃内酯8种成分的定性分析方法；一种薄层色谱鉴别方法。
按前期考证结果及综合复方的“君臣佐使”和Q-maker预测分析，确定厚朴温中汤适宜的质量控制成分为厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷和山姜素。并确定和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷、甘草苷、甘草酸、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、木香烃内酯、去氢木香内酯、6-姜辣素的特征图谱建立方法。通过建立指标成分含量测定方法和特征图谱含量测定方法为基准样品的质量控制提供依据，通过考察煎煮、浓缩工艺确定基准样品的制备方法，为基准样品的制备提供参考。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法及含量测定方法，用于评价和控制厚朴温中汤汤剂的质量，以确保厚朴温中汤汤剂的质量稳定性、一致性和可控性，为控制该制剂质量提供了新的技术方法，旨在解决目前对厚朴温中汤汤剂的质量控制技术不足的问题。
按前期考证结果，厚朴温中汤汤剂及基准样品制备工艺为：取姜厚朴和橘红各37.30g，炒甘草，草豆蔻，茯苓块和木香各18.65g，干姜片2.61g，混合后粉碎成粗粉，称取10.0g，加生姜3.0g，加水400mL，1200W煎煮15min后转200W煎煮至体积为200mL，趁热过滤，得到的滤液趁热离心(4000r.min-1)10min，即得厚朴温中汤汤剂及基准样品。
本发明提供一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法及含量测定方法，其中特征图谱的具体步骤包括：
(a)供试品的制备：取固相萃取小柱，活化后，取厚朴温中汤汤剂及基准样品上样后用不同浓度的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液；
(b)对照品的制备：精密称取厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、甘草苷、甘草酸铵、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素适量，分别加甲醇制成一定浓度的对照品溶液；
(c)色谱条件：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，其中梯度洗脱程序为：0～65min，流动相A为11％～57％，流动相B为89％～43％；65～72min，流动相A为57％～66％，流动相B为43％～34％；72～75min，流动相A为62％～85％，流动相B为38％～15％；75～82min，流动相A为85％～90％，流动相B为15％～10％，流速0.8～1.2mL·min-1，检测波长210～290nm，柱温20～40℃；
(d)分别取混合对照品和供试品溶液10～20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
本发明前述厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法，优选地，步骤a中所用的固相萃取小柱为C18-U固相萃取小柱，用甲醇5mL活化，水5mL平衡，平衡后，精密量取厚朴温中汤汤剂及基准样品离心上清液5mL上样，加10％甲醇5mL淋洗，再加纯甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法，优选地，步骤b中混合对照品的制备方法如下：精密称取毛厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、甘草苷、甘草酸铵、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素适量，分别加甲醇制成8～55mg·L-1的混合对照品溶液。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法，优选地，步骤c中的色谱条件：色谱柱规格为Diamonsil C18，4.6mm*150mm，5μm；流速1.0mL·min-1；检测波长210nm；柱温25℃。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法，优选地，步骤d中的混合对照品溶液和供试品溶液的的进样量均为10μL。
所述厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法，其中，通过混标和厚朴温中汤全方的图谱，见图1，共指认12个色谱峰，其中第8、11号峰分别为和厚朴酚与厚朴酚；第2号峰为橙皮苷；第1、4号峰分别为甘草苷和甘草酸；第3、6、7、12号峰分别为山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮；第9、10号峰分别为木香烃内酯与去氢木香内酯；第5号峰为6-姜辣素。并且该特征图谱分离效果良好，方法学考察结果显示最终确定的液相条件较好，耐受性较高，适用于厚朴温中汤的特征成分分析。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，包括以下步骤：
(a)供试品溶液的制备：取固相萃取小柱，用甲醇5mL活化，水5mL平衡，平衡后，精密量取厚朴温中汤滤液趁热离心后的上清液5mL上样，加10％甲醇5mL淋洗，再加纯甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液；
(b)混合对照品溶液的制备：分别精密称定和厚朴酚、山姜素、厚朴酚、橙皮苷适量，加甲醇制成一定浓度的对照品溶液；
(c)色谱条件：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，其中梯度洗脱程序为：0～20min，流动相A为20％～25％，流动相B为80％～75％；20～25min，流动相A为25％～40％，流动相B为75％～60％；25～36min，流动相A为40％，流动相B为60％；36～37min，流动相A为40％～50％，流动相B为60％～50％；37～55min，流动相A为50％～60％，流动相B为50％～40％；55～60min，流动相A为60％～65％，流动相B为40％～35％；60～65min，流动相A为65％～100％，流动相B为35％～0％，流速0.8～1.2mL·min-1，检测波长210～290nm，柱温20～40℃；
(d)分别取混合对照品和供试品溶液注入高效液相色谱仪5～20μL，记录色谱图。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，优选地，步骤(a)中使用的是C18-U固相萃取小柱。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，优选地，步骤(b)中混合对照品溶液中和厚朴酚、山姜素、厚朴酚、橙皮苷的浓度分别为41.867μg/mL、42.333μg/mL、20.93μg/mL、0.40mg/mL。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，优选地，步骤(c)中的色谱条件：Diamonsil C18色谱柱，柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，优选地，步骤(d)中分别取混合对照品和供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，在该色谱条件下，4个成分的R均大于1.5，达到基线分离，理论塔板数均不低于5000。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过建立指标成分含量测定方法和特征图谱含量测定方法为基准样品的质量控制提供依据，通过考察煎煮、浓缩工艺确定基准样品的制备方法，为基准样品的制备提供参考。
2、本发明提供的一种厚朴温中汤的液相特征图谱建立方法，经过系统性优化，特征图谱的谱图中能全面的反映出色谱峰以及有更好的分离效果，并考察了其检测波长、柱温、流动相系统和色谱柱对方法的影响，方法学考察结果显示最终确定的液相条件较好，耐受性较高，适用于厚朴温中汤的特征成分分析。
3、本发明综合复方的“君臣佐使”和Q-maker预测分析，确定厚朴温中汤适宜的质量控制成分为厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷和山姜素，并对建立的4个指标成分的含量测定方法做了精密度、重复性、稳定性、专属性、线性关系、加样回收率和耐用性考察，得出该方法的方法学考察结果较好，耐受性较高，适用于厚朴温中汤指标成分的含量测定。
附图说明
图1为厚朴温中汤特征图谱中共有峰指认色谱图
图2为厚朴温中汤缺单味方煎液样品特征图谱
图3为各单味药材样品的特征图谱-全方(a)；厚朴(b)；陈皮(c)；甘草(d)；草豆蔻(e)；木香(f)；茯苓(g)；干姜(g)
图4为厚朴温中汤含量测定方法专属性色谱图
图5为厚朴温中汤含量测定方法中不同流动相系统下的色谱图
图6为厚朴温中汤含量测定方法中不同柱温下的色谱图
图7为厚朴温中汤含量测定方法中不同色谱柱下的色谱图
具体实施方式
除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域公知的或常用的。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立及含量测定方法，步骤如下：
1、仪器和试药
1.1仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；赛多利斯BT型万分之一电子天平；BT25S型十万分之一电子天平，德国Sartorius公司；DE-100g万能高速粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；XY系列精密电子天平，常州市幸运电子设备有限公司；TD5多管架自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；C18-U固相萃取小柱，北京迪马科技有限公司；H22-X3型电陶炉，九阳股份有限公司。
1.2试药与试剂：所用对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，购自安徽天地高纯溶剂有限公司，其余所用试剂为分纯，水为超纯水，试验所用对照品信息表见1，饮片信息见表2。
表1试验所用对照品信息表
表2各饮片信息表
2厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法与结果
2.1对照品溶液的制备
分别精密称定各对照品适量，用甲醇溶解制备对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，置于25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、甘草苷、甘草酸铵、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素质量浓度分别为13.33、8.01、41.66、10.02、51.83、25.08、16.66、16.66、26.66、42.66、50.83和49.86mg·L-1的混合对照品溶液。
2.2供试品溶液制备
取姜厚朴和橘红各37.30g，炒甘草，草豆蔻，茯苓块和木香各18.65g，干姜片2.61g，混合后粉碎成粗粉，称取10.0g，加生姜3.0g，加水400mL，1200W煎煮15min后转200W煎煮至体积为200mL，趁热过滤，得到的滤液趁热离心(4000r.min-1)10min，取上清液备用。
取固相萃取小柱，用甲醇5mL活化，水5mL平衡，平衡后，精密量取离心后的厚朴温中汤汤剂及基准样品上清液5mL上样，加10％甲醇5mL淋洗，再加纯甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液。
2.3厚朴温中汤单味药供试品溶液及阴性对照液的制备
同“2.2项下”制备单味药及缺姜厚朴、橘红、草豆蔻药材的阴性水煎液，同法制备单味药供试品溶液及阴性对照液。
2.4色谱条件
采用Diamonsil C18色谱柱，4.6mm×150mm，5μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，其中梯度洗脱程序为：0～65min，流动相A为11％～57％，流动相B为89％～43％；65～72min，流动相A为57％～66％，流动相B为43％～34％；72～75min，流动相A为62％～85％，流动相B为38％～15％；75～82min，流动相A为85％～90％，流动相B为15％～10％，流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温25℃。
2.5共有峰指认及归属
2.5.1共有峰指认
通过混标和厚朴温中汤全方的图谱，见图1，共指认12个色谱峰，其中第8、11号峰分别为和厚朴酚与厚朴酚；第2号峰为橙皮苷；第1、4号峰分别为甘草苷和甘草酸；第3、6、7、12号峰分别为山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮；第9、10号峰分别为木香烃内酯与去氢木香内酯；第5号峰为6-姜辣素。
2.5.2共有峰归属
取厚朴温中汤汤剂以及缺单味方供试品溶液，以及各单味药材供试品溶液，照“2.4项下”色谱条件测定，记录色谱图，见图2、3。
以各峰保留时间、DAD紫外光谱图为鉴定标准，对标定的28个共有峰进行色谱峰的指认：第1、23、26、28号峰为厚朴中成分，第2、3、6、7、9、12号峰为陈皮中成分，第4、5、8、11、15号峰为甘草中成分，第13、16、18、21、27号峰为草豆蔻中成分，第24、25号峰为木香中成分，第20号峰为干姜中成分，第19号峰为厚朴与草豆蔻中共有成分，第17号峰为草豆蔻与干姜中共有成分，第10、22号峰为七味药材中共有成分。
2.6结果
2.6.1精密度试验
取混合对照品溶液，照“2.4项下”色谱条件连续进样6次，计算6组对照品各信号峰相对保留时间的RSD值为0％～0.10％，相对峰面积的RSD值为0％～1.25％，见表3，表明仪器精密度良好。
2.6.2重复性试验
取厚朴温中汤煎液适量，照“2.1.2项下”方法平行制备6份供试品溶液，照“2.4项下”色谱条件测定，以第5号峰，6-姜辣素为参照进行计算，各共有峰相对保留时间的RSD值为0％～0.28％，相对峰面积的RSD值为0％～4.0％，见表3，表明方法重复性较好。
2.6.3稳定性试验
取供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24和36h照“2.4项下”色谱条件测定，以第5号峰(6-姜辣素)为参照进行计算，各共有峰相对保留时间的RSD值为0％～0.24％，相对峰面积的RSD值为0％～4.0％，见表3，表明供试品溶液在36h内稳定。
2.7耐用性考察
2.7.1检测波长的选择
本色谱条件为保证各个特征成分均有响应，利用仪器的DAD检测器进行全波长扫描，同时对比了210nm、220nm、254nm、280nm等不同波长下各色谱峰峰数、峰形、分离度、基线平稳程度等情况，发现在波长为210nm条件下色谱峰的基线平稳、峰数更多、峰形较好，故选择210nm作为检测波长。
表3特征图谱方法学考察
2.7.2不同流动相考察
由于检测波长选择为210nm，故首先选择乙腈作为流动相，考察了乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水溶液、乙腈-0.05％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相系统，以峰数、峰形、分离度、基线平稳程度等因素为评价指标，发现乙腈-水为流动相系统得到的色谱图峰形、分离度、基线平稳程度较差，乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相的峰数较少，相比于乙腈-0.05％磷酸水溶液，乙腈-0.1％磷酸水溶液系统得到的色谱图峰形、分离度均相对较好，最终选定乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相系统。
2.7.3柱温的考察
采用安捷伦1260高效液相色谱仪，Diamonsil C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，分别考察20℃、25℃、30℃不同柱温的影响。结果显示20℃时色谱图中成分出峰时间相对延后，部分色谱峰会出现拖尾，25℃和30℃时得到的各色谱峰的峰形较好、分离度较高。选择25℃作为特征图谱方法的柱温。
2.7.4不同色谱柱的考察
采用安捷伦1260高效液相色谱仪，考察该特征图谱方法在迪马-Diamonsil C18色谱柱，4.6×250mm，5μm、岛津-Shim-pac VP-ODS色谱柱4.6×250mm，5μm、安捷伦-HC-C18(2)，4.6×250mm，5μm这3根不同色谱柱上的耐受性。结果显示，指认的12个色谱峰在3根不同色谱柱上均有良好的分离效果，分离度R＞1.5，且3根不同色谱柱得到的色谱图相似度为0.95，表明该方法在本次试验所使用的3根色谱柱上耐受性较好。
2.8在本节中建立了厚朴温中汤的液相特征图谱方法，在此基础上，为了在色谱图中尽可能多反映出色谱峰以及有更好的分离效果，对液相特征图谱进行了系统性优化，考察了其检测波长、柱温、流动相系统和色谱柱对方法的影响，方法学考察结果显示最终确定的液相条件较好，耐受性较高，适用于厚朴温中汤的特征成分分析。
3、厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法与结果
3.1混合对照品溶液的制备
分别精密称定和厚朴酚、山姜素、厚朴酚、橙皮苷各对照品适量，用甲醇溶解制备对照品单一储备液。精密吸取各储备液适量，置于25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得和厚朴酚、山姜素、厚朴酚质量浓度分别为41.867μg/mL、42.333μg/mL、20.93μg/mL、0.40mg/mL的混合对照品溶液。
3.2供试品溶液的制备
按本课题组前期考证结果，取厚朴(姜制)和橘红各37.30g，炒甘草，草豆蔻仁，茯苓(去皮)和木香各18.65g，干姜2.61g，混合后粉碎成粗粉，精密称取10.0g，加生姜3.0g，加水400mL，煎煮至体积约200mL，趁热过滤，放冷至室温后取滤液定容至200mL，即得厚朴温中汤煎液。
精密量取煎液5mL低速离心(3500r.min-1)5min，取离心上清液过固相萃取小柱(取固相萃取小柱，用甲醇5mL活化，水5mL平衡，上清液上样，纯水5mL淋洗，纯甲醇5mL洗脱)，收集甲醇洗脱液；取离心沉淀加入甲醇5mL超声10min后，低速离心(3500r.min-1)5min，取甲醇上清液；取甲醇洗脱液和甲醇上清液定容至10mL即得供试品溶液。
3.3厚朴温中汤阴性对照液的制备
同“2.3项下”，制备不含姜厚朴、橘红、草豆蔻3味药材的阴性对照液。
3.4色谱条件
采用Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，其中梯度洗脱程序为：0～20min，流动相A为20％～25％，流动相B为80％～75％；20～25min，流动相A为25％～40％，流动相B为75％～60％；25～36min，流动相A为40％，流动相B为60％；36～37min，流动相A为40％～50％，流动相B为60％～50％；37～55min，流动相A为50％～60％，流动相B为50％～40％；55～60min，流动相A为60％～65％，流动相B为40％～35％；60～65min，流动相A为65％～100％，流动相B为35％～0％，柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm，进样量20μL。在该色谱条件下，4个成分的R均大于1.5，达到基线分离，理论塔板数均不低于5000。
3.5结果
3.5.1精密度试验
取混合对照品溶液，照“3.4项下”条件连续进样6次，结果各对照品保留时间与峰面积的RSD值均小于0.63％，表明仪器精密度良好，结果见表4。
3.5.2重复性试验
取厚朴温中汤煎液照“3.2项下”方法平行制备6份供试品溶液，照“3.4项下”条件测定，结果6份样品中4个指标成分保留时间与峰面积的RSD均小于等于3.00％，表明该方法重复性良好，结果见表4。
3.5.3稳定性试验
取同一厚朴温中汤供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24h照“3.4项下”条件测定，结果6份样品中4个指标成分保留时间与峰面积的RSD均小于3.00％，表明供试品溶液中这4个成分在24h内稳定，结果见表4。
3.5.4专属性试验
取混合对照品、厚朴温中汤供试品和阴性溶液各20μL，照“3.4”项下条件测定。结果供试品与混合对照品溶液在相同保留时间处有色谱峰，阴性溶液无干扰峰，说明方法专属性好，色谱图见图4。
3.5.5线性关系考察
精密吸取“3.1”项下山姜素、和厚朴酚、厚朴酚各对照品储备液适量，分别用甲醇稀释成6个梯度浓度的混合对照品溶液；精密吸取橙皮苷对照品溶液，用甲醇稀释成6个梯度浓度的橙皮苷对照品溶液，照“3.4”项下色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，以进样浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，绘制标准曲线并计算回归方程，见表5。结果4个指标成分在相应线性范围内线性关系良好。
表4厚朴温中汤中4个成分的精密度、重复性、稳定性实验结果
3.5.6加样回收率试验
精密量取厚朴温中汤同批样品6份，各精密吸取5ml，根据重复性实验测定的含量，分别依次精密加入一定量的对照品，照“3.2”项下制备加样回收供试品溶液，照“3.4”项下条件进样测定，分别计算4个成分的回收率及其回收率的均值和RSD，结果见表6。照《中国药典》(2020年版)“通则9101项下”规定，待测成分含量在0.01～0.1之间时，回收率限度(％)为85％～110％，待测成分含量在0.1～1之间时，回收率限度(％)为90％～108％，结果4个成分的回收率均在98.0％～106.0％之间，符合加样回收率规定，4个成分回收率的RSD值均小于3.00％，表明该方法的加样回收率良好。
表5厚朴温中汤中4个成分的线性关系结果
表6厚朴温中汤中4个成分的加样回收率实验结果
3.6耐用性考察
3.6.1检测波长的选择
本色谱条件同时检测了和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷和山姜素4个质量控制指标，为保证各个指标成分的响应，以及能准确定量，利用仪器的DAD检测器进行全波长扫描，发现在210和280nm左右均具有较大吸收峰值，但210nm处存在末端吸收，有较多干扰峰存在，故选择280nm作为检测波长。
3.6.2不同流动相考察
2020年版《中国药典》中姜厚朴、橘红、草豆蔻的含量测定多采用甲醇-水为流动相系统，故本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％磷酸水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％磷酸水和乙腈-0.1％甲酸水溶液等流动相系统，结果见图5。结果表明，甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、甲醇-0.1％甲酸水溶液为流动相系统时，橙皮苷与山姜素的分离效果较差，分离度均小于1.5，对称因子均小于0.7；乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水为流动相系统时，基线平稳，分离效果均较好，综合各方面效益，最后选择乙腈-水为流动相系统。
3.6.3柱温的考察
采用安捷伦1260高效液相色谱仪，Diamonsil C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，考察在20℃、25℃、30℃不同柱温对含量测定结果的影响，结果见图6。结果显示，相比于25℃，在20℃时成分出峰时间相对延后，30℃时出峰时间相对提前。三个不同柱温检测得到的色谱图中各指标成分峰面积的RSD值小于3.0％(n＝6)，表明不同柱温对4个被测成分无显著性影响。
3.6.4不同色谱柱的考察
采用安捷伦1260高效液相色谱仪，迪马-Diamonsil C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，、岛津-Shim-pac VP-ODS色谱柱，4.6×250mm，5μm，、安捷伦-HC-C18(2)，4.6×250mm，5μm这3根不同色谱柱对4个被测成分含量的影响，结果见图7。结果显示，4个被测成分在3根不同色谱柱上均有良好的分离效果，分离度大于1.5，且不同色谱柱对4个被测成分含量无显著影响，RSD＜4.0％。
3.7供试品的处理
以橙皮苷、山姜素、和厚朴酚、厚朴酚的含量为考察指标，通过单因素和正交试验对供试品的前处理方法进行考察。采用AHP法得到对正交试验结果进行综合评分，每个成分的权重系数相等，综合评分＝(X1/Xmax+X2/Xmax+X3/Xmax+X4/Xmax)/4进行评价。
2.7.1单因素考察供试品处理方法
1)水：精密量取厚朴温中汤的煎液10ml，低速离心(3500r.min-1)5min，取上清液过0.22μm滤膜即得。
2)甲醇：精密量取厚朴温中汤的煎液10ml，置60℃水浴蒸干，再精密加入纯甲醇5ml溶解，低速离心(3500r·min-1)5min，取上清液过0.22μm滤膜即得。
3)固相萃取小柱：取厚朴温中汤煎液10ml，低速离心(3500r·min-1)5min，取上清液。取固相萃取小柱，用甲醇5mL活化，水5mL平衡，平衡后，精密量取上述两种离心上清液各5mL上样，加纯水5mL淋洗，再加纯甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，即得。
4)液-液萃取：取厚朴温中汤煎液10ml，分别用正丁醇、乙酸乙酯各20ml萃取，取上清液蒸干后，加少量甲醇溶解，定容至2ml。
5)固相萃取小柱合并沉淀超声：取厚朴温中汤煎液5ml，低速离心(3500r.min-1)5min，取离心上清液，照“3)”项下进行固相萃取，得到5ml甲醇洗脱液；去离心沉淀，加入甲醇5ml超声10min后，离心取上清甲醇；取5ml甲醇洗脱液与5ml上清甲醇定容至10ml，即得。
将上述供试品溶液照“2.4项下”进样，测定4个质控成分的含量，结果见表7。
表7单因素考察4个被测成分含量结果
结果显示，选择过固相萃取小柱合并沉淀加甲醇超声的方式，进行前处理得到的结果中4个质控成分的综合评分相对较高；向汤液中加入不同量甲醇，能够很好的将待测成分溶出，但加入甲醇后又相当于将煎液进行了稀释，导致色谱峰面积太小，不利于定量测定；使用液液萃取方式能将厚朴酚与和厚朴酚很好的萃取出来，但橙皮苷和山姜素的萃取率极低，导致含量测定不准确；单独使用固相萃取能够起到富集的作用，但过固相萃取小柱的煎液因离心而沉降下来的成分没有计入到含量中，导致含量计算不准确；将煎汤60℃下蒸干后用甲醇溶解进样效果最差。故综合考虑最后选择固相萃取小柱合并沉淀加甲醇超声的方式，将煎液离心，离心上清液进行固相萃取，离心沉淀加入甲醇超声，不仅能对水煎液起到富集的作用，也尽量不让含量损失，该方法重复性及加样回收率均较好，故选择该方法作为供试品处理方法。
3.7.2正交试验考察最佳处理方式
经上述单因素试验得到固相萃取合并超声提取的效果最佳，为了考察甲醇的加入量是否能够将成分完全洗脱或者提取出来，以及超声的时间是否对结果有影响，故将固相萃取甲醇洗脱量(A)、超声提取甲醇加入量(B)、超声时间(C)作为考察因素，将橙皮苷、山姜素、和厚朴酚、厚朴酚的含量作为考察指标设计L9(34)正交试验，因素与水平见表8。采用SPSS 22.0软件对正交试验结果进行分析，正交试验结果见表9，方差分析见表10。
结果显示，各组数据均符合正态分布，各因素对煎汤影响的主次为：B＞C＞A，但均无显著影响(P＜0.05)，表明甲醇的加入量以及超声时间对4个被测成分的含量均无显著影响。结合各因素水平的综合结果，推测最佳试验条件为A3B3C2，即精密量取煎汤5mL，低速离心(3500r.min-1)3min，取离心上清过固相萃取小柱，用5ml甲醇洗脱；取离心沉淀加甲醇5mL超声10min，离心取上清甲醇；取二者定容至10ml。并选择A3B3C2作为最佳前处理方式进行验证。
3.7.3验证试验
取同批次汤剂各3份，按A3B3C2工艺进行样品前处理，测定4个质控成分的峰面积，计算含量，结果见表11，平行样之间RSD值小于2.9％，表明该方法处理得到的含量结果较稳定、该前处理方法合适。
表8因素与水平
表9正交试验设计和结果
表10正交试验方差分析结果
表11验证试验结果
3.8小结
为了使被测成分含量尽可能反映煎液的含量，本节采用单因素试验和正交试验对厚朴温中汤煎液供试品的前处理方法进行了考察，得出最佳前处理方法为：精密量取煎液5mL，低速离心(3500r.min-1)3min，取离心上清过固相萃取小柱，用5ml甲醇洗脱；取离心沉淀加甲醇5mL超声10min，离心取上清甲醇；取二者定容至10ml，即得。为了使待测成分在色谱图中达到更好的分离效果，本节对建立的4个指标成分的含量测定方法做了精密度、重复性、稳定性、专属性、线性关系、加样回收率和耐用性考察，得出该方法的方法学考察结果较好，耐受性较高，适用于厚朴温中汤指标成分的含量测定。
应当说明的是，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)供试品的制备：取固相萃取小柱，活化后，取厚朴温中汤汤剂及基准样品上样后用甲醇溶液淋洗和洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液；
(b)对照品的制备：精密称取厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、甘草苷、甘草酸铵、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素，分别加甲醇制成对照品溶液；
(c)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，其中梯度洗脱程序为：0～65min，流动相A为11％～57％，流动相B为89％～43％；65～72min，流动相A为57％～66％，流动相B为43％～34％；72～75min，流动相A为62％～85％，流动相B为38％～15％；75～82min，流动相A为85％～90％，流动相B为15％～10％，流速0.8～1.2mL·min-1，检测波长210～290nm，柱温20～40℃；
(d)分别取混合对照品和供试品溶液5～20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
2.根据权利要求书1所述的特征图谱的建立方法，其特征在于，取厚朴温中汤汤剂及基准样品提取液，趁热过滤，得到的滤液趁热离心10min，取上清液备用；取C18-U固相萃取小柱，用甲醇5mL活化，水5mL平衡，平衡后，精密量取离心上清液5mL上样，加10％甲醇5mL淋洗，再加纯甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的特征图谱的建立方法，其特征在于，混合对照品的制备方法如下：精密称取毛厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、甘草苷、甘草酸铵、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、去氢木香内酯、木香烃内酯、6-姜辣素适量，分别加甲醇制成8～55mg·L-1的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的特征图谱的建立方法，其特征在于，厚朴温中汤汤剂及基准样品特征图谱测定的色谱条件为：采用Diamonsil C18色谱柱，4.6mm×150mm，5μm。
5.根据权利要求1所述的特征图谱的建立方法，其特征在于，测定方法具体操作过程为：分别精密吸取对照品和供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图的时间为82min。
6.根据权利要求1所述的特征图谱的建立方法，其特征在于，通过混标和厚朴温中汤全方的图谱，共指认12个色谱峰，其中第8、11号峰分别为和厚朴酚与厚朴酚；第2号峰为橙皮苷；第1、4号峰分别为甘草苷和甘草酸；第3、6、7、12号峰分别为山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮；第9、10号峰分别为木香烃内酯与去氢木香内酯；第5号峰为6-姜辣素。
7.一种厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)供试品溶液的制备：取固相萃取小柱，用甲醇活化后用水平衡，平衡后，取厚朴温中汤汤剂及基准样品上样后用甲醇溶液淋洗和洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液；
(b)混合对照品溶液的制备：分别精密称定和厚朴酚、山姜素、厚朴酚、橙皮苷，加甲醇制成对照品溶液；
(c)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，其中梯度洗脱程序为：0～20min，流动相A为20％～25％，流动相B为80％～75％；20～25min，流动相A为25％～40％，流动相B为75％～60％；25～36min，流动相A为40％，流动相B为60％；36～37min，流动相A为40％～50％，流动相B为60％～50％；37～55min，流动相A为50％～60％，流动相B为50％～40％；55～60min，流动相A为60％～65％，流动相B为40％～35％；60～65min，流动相A为65％～100％，流动相B为35％～0％，流速0.8～1.2mL·min-1，检测波长210～290nm，柱温20～40℃；
(d)分别取混合对照品和供试品溶液5～20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，在该色谱条件下，4个成分的R均大于1.5，达到基线分离，理论塔板数均不低于5000。
8.根据权利要求7所述的厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，其特征在于，步骤(a)中使用的是C18-U固相萃取小柱，采用5mL上清液上样，加10％甲醇5mL淋洗，再加纯甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，得厚朴温中汤供试品溶液。
9.根据权利要求7所述的厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，其特征在于，步骤(b)中混合对照品中得和厚朴酚、山姜素、厚朴酚、橙皮苷的浓度分别为41.867μg/mL、42.333μg/mL、20.93μg/mL、0.40mg/mL的混合对照品溶液。
10.根据权利要求7所述的厚朴温中汤汤剂及基准样品含量测定方法，其特征在于，步骤(c)中的色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为水；Diamonsil C18色谱柱，柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20221223 |
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