CN110274963B - 一种消渴清指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种消渴清药物指纹图谱检测方法，所述方法，包括以下步骤：步骤a：黄酮类成分芒果苷的检测方法，步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的检测方法；以及消渴清指纹图谱的建立方法，所述方法，包括以下步骤：步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所得多批次合格产品的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物标准对照指纹图谱。

Description

一种消渴清指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种药物的有效成分测定方法，特别涉及一种中药制剂消渴清颗粒的定量指纹图谱检测方法。

背景技术

消渴清颗粒为一种已经上市的中成药，由知母、苍术、黄连、蒲黄及地锦草5味药制备而成，具有滋阴清热，活血化瘀功能。配合抗糖尿病化学药品用于Ⅱ型糖尿病属阴虚热盛挟血瘀证的治疗；可改善该证所见口渴欲饮、多食易饥、怕热心烦、溲赤或尿多、大便干结、或胸中闷痛、或肢体麻木、刺痛，以及盗汗等症。由于疗效确切、不良反应少且价格低廉，临床应用广泛，故对其进行质量检测以保证药物的安全性、有效性，具有重要意义。

从传统的中医药观点来看,指标成分的控制难以真正控制中药的功效,尤其是复方制剂,检测任何一种指标成分均不能反映其所体现的整体疗效。近年来,指纹图谱技术被认为是中药质量控制研究的有效手段。王露黔等.消渴清颗粒UPLC-PDA-ELSD指纹图谱的建立及5个主要成分的测定[J].中草药,2013,(24):3482-3488.公开了公开消渴清颗粒的UPLC-PDA-ELSD指纹图谱建立方法，并对新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、巴马汀和小檗碱进行定量测定，但未能检测产品中的没食子酸及苍术素，没食子酸对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，具备降糖功效，而苍术素具有降血糖、利尿、促进胃排空、抗炎、等药理活性。因此对没食子酸及苍术素的检测就显得尤为重要，黄酮类成分与挥发性也是消渴清重要的有效成分，以往均未同时控制，此外如何对生产过程中的成品的质量进行全面控制，仍没有找到好的解决办法。

本发明通过系统定量指纹图谱方法，主要以该产品中黄酮类成分与挥发性成分等2大类有效部位群的整体特征为产品的内在质量属性，通过检测2张指纹图谱、1个指标性成分定量表现这种产品的内在特异的质量属性，将多张中药指纹图谱与指标成分定量分析相结合,既体现了中医药整体治疗的特色,又突出了指标性成分的作用，点面结合，使得消渴清质量检测更加准确、更能真实反映中药的质量状况，以保证药物的安全性、有效性。

发明内容

本发明提供了一种消渴清药物的定量指纹图谱检测方法，采用超高效液相色谱法测定消渴清颗粒中的黄酮类成分如芒果苷含量，同时用气相色谱法测定消渴清颗粒中的挥发性成分及非极性成分如苍术素的含量，从而得到不同种类有效成分之间的比例关系，为生产过程中的中间产物或产成品的质量控制方法提供了新的依据。

为此，本发明提供一种消渴清成分的检测方法，所述方法，包括以下步骤：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤a1对照品溶液的制备

步骤a2供试品溶液的制备

步骤a3测定：分别吸取步骤a1所得的对照品溶液及步骤a2供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算芒果苷的含量；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤b1对照品溶液的制备

步骤b2供试品溶液的制备

步骤b3测定：分别吸取步骤b1所得的苍术素对照品溶液与步骤b2所得的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算苍术素的含量。

优选的，本发明消渴清成分的检测方法，所述方法，包括以下步骤：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤a1对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％-70％甲醇溶液制成每1ml含芒果苷15μg-25μg的对照品溶液；

步骤a2供试品溶液的制备：取消渴清药物0.15g-0.50g，加入50％-70％甲醇10ml，超声处理10-40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液0.8-1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程60℃～90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液18-22ml，水浴蒸至近干，转移至量瓶中，加50％-70％(v/v)的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a3分别吸取步骤芒果苷对照品溶液及供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤b1对照品溶液的制备

取苍术素对照品适量，精密称定，至棕色容量瓶中，加甲醇制成溶液，摇匀，即得苍术素对制成每1ml含0.03mg-0.05mg的溶液，

步骤b2供试品溶液的制备

取消渴清药物0.7-1.3g，加入40-60％甲醇10ml，超声10-35min，使完全溶解，再精密加入沸程60～90℃的石油醚5-15ml,密塞，精密称定，超声萃取15-35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b3测定法

吸取苍术素对照品溶液与供试品溶液，注入气相色谱仪，测定，即得。

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％-0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，按表1或表2中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm。流动相B优选以0.1％三氟乙酸溶液，流速优选1.0ml/min，柱温优选为35℃。

表1梯度洗脱程序

或

表2梯度洗脱程序

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表3或表4中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表3升温程序

或

表4升温程序

用本发明的上述方法可以得到相应的对照品和供试品色谱图，根据色谱图可以计算消渴清中的芒果苷或其类似物的含量，以及苍术素或其类似物的含量，进而计算两种不同种类的有效成分的比例。

本发明进一步提供一种快速测定消渴清中的芒果苷或其类似物的含量，以及苍术素或其类似物的含量的方法，以及计算两种不同种类的有效成分的比例的方法，即本发明所述指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤a1多批次合格消渴清药物供试品溶液的制备

步骤a2测定：吸取步骤a1制备的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到多批次合格消渴清药物超高效液相色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1多批次合格消渴清药物供试品溶液的制备

步骤b2测定：分别吸取步骤b1所得的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到多批次合格消渴清药物气相色谱图；

上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，得到消渴清药物超高效液相标准对照指纹图谱，和气相色谱标准对照指纹图谱。

优选的，本发明所述指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤a1供试品溶液的制备：取消渴清药物0.15g-0.50g，置具塞离心管中，加入50％-70％甲醇10ml，超声处理10-40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液0.8-1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程60℃～90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容(优选用25ml量瓶定容)，摇匀，取定容后的甲醇溶液18-22ml，水浴蒸至近干，转移至量瓶(优选4-6ml容量的量瓶)中，加50％-70％的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a2吸取步骤a1制备的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1供试品溶液的制备

取消渴清药物0.7-1.3g，加入40-60％甲醇10ml，超声10-35min，使完全溶解，再精密加入沸程60～90℃的石油醚5-15ml,密塞，精密称定，超声萃取15-35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b2测定：分别吸取步骤b1所得的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％-0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，按表5或表6中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm。

流动相B优选以0.1％三氟乙酸溶液，流速优选1.0ml/min，柱温优选为35℃；

表5梯度洗脱程序

或

表6梯度洗脱程序

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表7或表8中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表7升温程序

或

表8升温程序

上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种消渴清药物标准对照指纹图谱。

本发明进一步提供一种消渴清药物的指纹图谱检测方法，所述方法，步骤如下：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的检测方法，所述方法步骤如下：

供试品溶液的制备；吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的检测方法，所述方法步骤如下：

供试品溶液的制备；吸取供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

将所得的消渴清药物超高效液相色图谱，和气相色谱图与消渴清药物超高效液相标准对照指纹图谱，和气相色谱标准对照指纹图谱进行对照，符合一致为合格产品。

采用上述标准对照指纹图谱和实际生产过程中的用本发明方法检测的供试品的色谱图进行对比，符合一致者为合格产品，符合一致要求在90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，最优选在99％以上。

其中，所述经过计算机模型为中药色谱指纹相似度评价系统。

本发明所述消渴清颗粒，消渴清药物均属于现有技术，其中消渴清颗粒是用知母、苍术、黄连、蒲黄及地锦草5味中药材经过提取得到提取物，以该提取物为消渴清药物活性成分和药物可接受的载体混合制备而成的颗粒制剂，可于市场购得，其他消渴清药物也可按中国专利200310107286.5、200410048002.4等相关专利制备而得。

本发明所述消渴清药物包括以消渴清药物活性成分为主药，和药物可接受的载体混合制备而成任何一种药物制剂形式，如片剂，胶囊，口服液，颗粒剂等，本发明优选消渴清颗粒。

在本发明的消渴清药物活性成分中，其主要活性成分为黄酮类成分例如没食子酸和挥发性成分例如苍术素及非极性成分,本发明以其中的核心活性成分黄酮类成分芒果苷和挥发性成分及非极性成分苍术素为标的物，对它们的含量及其配比进行了检测并制定了标准对照指纹图谱。

本发明中除另有明确外，溶质为固体的百分含量均为重量体积百分比，单位分别为g/ml％，kg/L％，溶质为液体的百分含量均为体积百分比(v/v)，单位分别为ml/ml％,L/L％。本发明所述的多批次，应为10个批次及以上，例如20-30批次。

本发明采用两种不同方法测定消渴清药物不同种类的有效成分的指纹图谱的好处是，产品合格判断更加准确，减少不同产地，不同来源原料中类似非活性成分的物质的干扰，保障产品质量，有利于患者大众的健康。

本发明是通过大量实验筛选得到的，以下通过实验数据证明本发明的有益效果：

1.黄酮类成分定量指纹图谱及芒果苷含量检测实验的筛选

2.色谱系统及色谱条件优化

采用乙腈-0.1％三氟乙酸系统，通过改变有机相比例的方法优化色谱洗脱程序，对消渴清颗粒50％甲醇提取液，共对色谱洗脱程序进行了10余次不同比例的尝试及优化，最终确定了最优的梯度洗脱程序，见表9，典型的色谱图见图-1所示。

表9最佳洗脱程序

3.供试品溶液制备方法的考察

3.1不同提取溶剂考察

根据消渴清颗粒处方中药材的化学成分性质并结合制剂工艺的特点，以芒果苷为定量指标，对不同比例、不同酸碱性的甲醇溶液的提取效果进行考察，结果表明：第一部分为目标成分黄酮类成分区，第二部分为生物碱类成分区，第三部分为低极性成分区。加酸或碱后，目标成分区的色谱峰有所增多或减少，表明目标成分不适合稀酸、稀碱作为提取溶剂；初步确定了不同浓度的甲醇溶液为提取溶剂；对不同浓度的甲醇进一步考察，结果显示50％甲醇与70％甲醇的提取率相当，考虑到后续固相萃取过程的吸附性能，最终确定50％甲醇为提取溶剂，见图-2～3。

3.2不同固液比的考察

为探究溶质与溶剂以哪种比例混合对其成分提取较为完全，实验设计了0.15g：10ml、0.25g：10ml、0.5g：10ml、0.7g：10ml四种不同固液比进行比较考察，结果表明：peak1、peak2的提取效果在0.15g：10ml、0.25g：10ml时相当，随固液比的增加提取效果随之降低；peak3的提取效果在0.25g：10ml、0.5g：10ml时的固液比提取效果相当。因此，综合考虑最终选用0.25g溶质：10ml溶液的固液比。如图-4～5。

3.3提取时间考察

为探究超声时间对样品成分提取率的影响，以最大化的提取目标成分，实验共考察了10分钟、20分钟、30分钟、40分钟4个不同的超声提取时间，最终选择超声20分钟为最佳提取时间，见图-6。

3.4供试品溶液富集纯化考察

黄酮类成分富集纯化方法主要包括液液萃取，固相萃取(大孔树脂、聚酰胺)等方法，本研究拟采用固相萃取的方法开展相关研究，主要考察不同填料(D101、AB-8、D152、AL-2大孔树脂，聚酰胺)、填料用量、洗脱曲线等方面进行系统考察。

3.4.1固相萃取填料考察

实验共考察了5种固相萃取填料对样品中目标成分的富集能力，结果表明：AB-8、D101、AL-2、D152型4种大孔树脂型固相萃取填料对消渴清颗粒中目标成分的吸附及解吸附能力均不适宜；聚酰胺填料可有效去除样品中的非目标成分，对黄酮类目标成分吸附及解吸附能力适中，故选择聚酰胺填料作为样品中目标成分的富集填料。见图-7～11。

3.4.2洗脱溶剂及其用量的考察

实验考察了不同体积的甲醇、甲醇：盐酸(100:1)的2种溶剂体系对目标成分的洗过效果，结果表明：强洗脱能力的甲醇：盐酸(100:1)的混合溶剂体系25ml可最大程度的去除非目标成分，保留黄酮类成分，故确定洗脱溶剂为甲醇：盐酸(100:1)混合液，洗脱用量为25ml，见图-12。

3.4.3聚酰胺填料用量考察

为确保目标组分被最大程度的保留，非目标成分最大程度的去除，同时满足定量指标及指纹图谱的测试要求，实验对聚酰胺填料的用量进行了考察，分别考察了用量为0.7g、1.0g、1.3g时的富集纯化效果。结果表明：填料用量为1.0g，满足测试要求。见图-13

4.色谱峰定性

采用已有对照品与药材对指纹图谱色谱峰进行定性研究，并对比其光谱图。其中2号峰为没食子酸、S为芒果苷。消渴清颗粒黄酮类成分典型色谱图见图-14。对照品及样品中没食子酸、芒果苷的光谱图见图-15。

挥发性成分及非极性成分指纹图谱分析检测实验的筛选

2.1不同色谱柱的考察

实验共考察了Agilent HP-5、DB-624、cyclosil-B 3种不同气相色谱柱，表明Agilent HP-5型气相色谱柱对消渴清颗粒供试品溶液的分离，出峰时间适宜，峰型、分离度均较为理想。见图16-17

2.2升温程序的考察

实验共考察了18种梯度升温程序，以图谱中峰数、主要色谱峰的峰型、分离度、对称性、分析时长等多因素综合特性为评价指标，最终确定了最优的梯度升温程序，如表10所示，典型色谱图如图-18。

表10最优梯度升温程序

3.苍术素对照品溶液制备方法的考察

鉴于苍术素对照品的光敏性特点，为保证对照品溶液满足测定方法对标准品溶液的性能要求，经查阅苍术素标准品相关理化性质研究、苍术素标准品溶液稳定性研究等相关文献，结合预试验结果，结论如下：①甲醇为苍术素标准品的溶媒，可实现苍术素标准品完全溶解；②溶液的配制及测试过程须保持避光操作，色谱图见图-19

4.供试品溶液处理方法的考察

实验共进行了(乙酸乙酯-甲醇系统)、(水-正己烷-乙酸乙酯系统)、(水-石油醚-乙酸乙酯系统)、(水-乙酸乙酯-甲醇系统)、(50％甲醇-石油醚-乙酸乙酯系统)、(50％甲醇-正己烷-乙酸乙酯系统)6种个供试品提取及分离溶剂系统的6个供试品制备方法，最终确定了(50％甲醇-石油醚-乙酸乙酯系统)为溶剂系统，方法⑤作为初步的供试品制备方法。如图-20。

4.1正交实验优选最佳供试品制备方法

通过正交实验设计，对上述初步确定的供试品制备方法中的3个关键参数进行优化，即固液比A、石油醚用量B、超声萃取时间C，基于初步试验数据，采用三因素三水平正交试验表L9(34)设计实验，优选最佳供试品制备方法，对数据进行直观分析及方差分析，得出来最佳因素水平组合，最终确定了最佳的供试品制备方法，并且对最佳制备方法进行了验证。因素水平见表11，实验安排及结果见表12，直观分析结果方差分析见表13。

表11实验因素水平表

表12正交实验安排及结果

4.1.1直观分析

极差(Rj)分析，Rj愈大，对应的因素越重要，由此可定出各因素的主次排列顺序；由各因素各水平对应指标结果的平均值大小可确定各因素取什么水平较好，确定的原则为：①如果要求指标越小越好，则取最小平均值对应的水平；②如果要求指标越大越好，则取最大平均值对应的水平；③如果要求指标适中，则取适中的平均值所对应的水平。依据上述原则，确定的最佳因素水平组合为A3B2C2，即固液比0.13g/ml、石油醚用量10ml、超声时间25分钟。正交实验数据直观分析结果见图-21。

4.1.2方差分析

方差分析是用来区分所考察因子是由于水平不同对应的实验结果的差异是由于水平的改变所引起还是由于实验误差所引起，以便在直观分析的基础上进一步检验哪些因子对结果有影响，哪些没有，并区分哪些是影响结果的主要因素，哪些是次要因素。依据上述原则对正交实验数据进行方差分析，对常用的P＝0.01、P＝0.05、P＝0.1三个显著性水平进行进行检验，结果表明，F比值均小于3个显著性水平的F临界值，表明从3个不同的显著性水平来判断，实验结果的波动均是由于实验误差造成，而非因子水平的变化引起。方差分析结果见表13。

表13方差分析结果

备注：显著性水平

①“***”：表明该因子水平的改变，对实验结果有高度显著性影响；②“**”：表明该因子

水平的改变，对实验结果有显著性影响；③“*”：表明该因子水平的改变，对实验结果

有一定的影响；

4.1.3最佳供试品制备方法验证

按照最佳供试品制备参数：固液比0.13，石油醚用量为10ml,超声时间为25分钟，平行制备消渴清颗粒供试品3份，按照实施例1色谱条件项下条件测试。以色谱中5个主要色谱峰峰面积总和的平均值为评价指标，结果表明：5号峰为苍术素色谱峰，3次平行实验的RSD％值为6.5％，偏差偏大，原因为苍术素为光敏物质，在供试品制备及测定过程中受光照影响较显著，提示试验过程应避光操作；除5号峰外，1、2、3、4号色谱峰各次实验平行2针结果的RAD％值均＜2.0，3次平行实验结果的RSD％值均＜3.5；表明所优选的最佳供试品制备参数合理、稳定，可作为最佳供试品制备参数。结果见表14。

表14最佳供试品制备工艺参数验证结果

采用本发明的技术方案取得了很好的技术效果，针对本发明建立的消渴清颗粒黄酮类成分指纹图谱，为保证其方法的准确性和合理性，按照方法验证要求，对其方法进行学验证。方法学验证内容如下：

1.专属性

根据处方比例称取知母，地锦草、蒲黄、茅苍术各，黄连，其他操作同“实施例1”项供试品溶液制备方法，即得。空白溶液为去除供试品，其他操作同“实施例1”项供试品溶液制备方法及色谱条件测试，即得。

结果表明：空白溶液在消渴清颗粒相应色谱峰处无干扰，表明聚酰胺填料对供试品溶液测定无影响；色谱峰归属详见表15，图-22。

表15消渴清颗粒黄酮特征指纹图谱色谱峰归属表

2.仪器精密度

取消渴清颗粒按“实施例1”项下供试品溶液制备方法及色谱条件，连续进6针分析，计算各色谱峰的保留时间与峰面积的RSD值。消渴清颗粒供试品溶液中芒果苷保留时间和峰面积的RSD％分别为0.06％～0.42％、0.36％～1.80％，说明仪器精密度良好。结果详见表16，表17。

表16仪器精密度—保留时间

表17仪器精密度—峰面积

3.稳定性试验

取批号为140702的消渴清颗粒，按“实施例1”项下制备供试品溶液及色谱条件，分别于0h、3h、5h、12h、18h、20h、22h进样分析，以芒果苷峰为参照峰，考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积的变化情况，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于0.55％；相对峰面积的RSD％在0.45％～2.83％，表明供试品溶液中10个色谱峰在22h内相对稳定。结果详见表18，表19。

表18稳定性--相对保留时间

表19稳定性--相对峰面积

4.重复性试验

取批号为140702的消渴清颗粒，“实施例1”项下制备供试品溶液及色谱条件，测定，平行制备6份。以芒果苷峰为参照峰,考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积。各共有峰相对保留时间的RSD小于0.30％；各峰相对峰面积的RSD％在0.48％～5.77％，说明本方法的重复性相对良好。结果详见表20，表21。

表20重复性—相对保留时间

表21重复性—相对峰面积

5.中间精密度试验

为考察随机变动因素对精密度的影响，设计开展中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。不同分析人员于不同日期，取批号为140702的消渴清颗粒，按“实施例1”项下制备供试品溶液及色谱条件，于不同仪器(①Waters HPLC 2695-2996；②Waters HPLC 2695-2487)上分析，以芒果苷峰为参照峰，考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积的变化情况，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD，除peak1为2.23，其他均小于0.074％，peak1出峰较早流动相波动对其影响相对较大；除peak8、9的相对峰面积13.14％、14.43％，其余各峰相对峰面积的RSD％均小于5.0％，可能是由于其峰面积较小且分离度未基线分离的原因造成的。从整体考虑本方法的精密度相对良好。结果见表22，表23。

表22中间精密度—相对保留时间统计表

表23中间精密度—相对峰面积统计表

6.耐用性

取批号为140702的消渴清颗粒，按实施例1”项下制备供试品溶液及色谱条件，除改用色谱柱(Amethyst C18，4.6×150mm，5μm)进行耐用性测试，结果表明：peak1、peak2在不同色谱柱的相对保留时间RAD％分别为4.52％、2.44％，其他色谱峰的相对保留时间均小于2.0％；peak1、8、9的相对峰面积RSD％为14.72％、14.91％、19.25％，其他色谱峰的相对保留时间小于3.60％。表明不同色谱柱之间的耐用性较好。结果见表24，表25。

表24耐用性—相对保留时间统计表

表25耐用性—相对峰面积统计表

针对本发明建立的消渴清颗粒挥发性成分及非极性成分气相指纹图谱，为保证其方法的准确性和合理性，按照方法验证要求，对其方法进行学验证。方法学验证内容如下：

1.中间精密度试验

取同一批号(批号：140702)样品，取1份，精密称取1.0g，按下表-1安排测试实验，按”实施例1”项下规定的供试品溶液处理方法制备方法及色谱条件测定，计算供试品溶液共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD。以4号峰为参比峰，其余4个共有峰的相对保留时间RSD均＜3.0％，相对峰面积RSD均＜5.0％，结果见表26，表27，表28。

表26中间精密度实验安排

表27供试品溶液共有峰相对保留时间比值-中间精密度试验

表28供试品溶液共有峰相对峰面积-中间精密度试验

2.重复性试验

取取同一批号(批号：140702)样品，取6份，精密称取1.0g，按”实施例1”项下中规定的供试品溶液处理方法制备方法及色谱条件测定，测试供试品溶液共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD值。以3号峰为参比峰，各色谱峰相对保留时间RSD均＜3.0％，相对峰面积RSD均＜5.5％，结果见表29，表30。

表29供试品溶液共有峰相对保留时间比值的重复性试验

表30供试品溶液共有峰相对峰面积比值的重复性试验

3.稳定性试验

3.1供试品溶液稳定性测试

取同一批号(批号：140702)样品1份，精密称定，按”实施例1”项下中规定的供试品溶液制备方法及色谱条件测定，分别在0时及下述规定的时间点测试，测定不同时间点共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD％。结果表明：以7号峰(苍术素)为参比峰，其余6个共有峰的相对保留时间RSD均＜3.0％，相对峰面积RSD均＜2.0％。表明供试品溶液24小时内，上述7个色谱峰稳定性良好，满足测试要求。结果见表31，表32。

表31供试品溶液共有峰相对保留时间比值的稳定性试验

表32供试品溶液共有峰相对峰面积比值的稳定性试验

3.2对照品溶液稳定性测试

取苍术素对照品适量，置棕色容量瓶中，精密称定，加甲醇配制成适宜浓度的溶液，分别于配制0时及配制后规定时间点，”实施例1”项下色谱条件进行测试。结果表明，各测试时间点与0时RAD％均＜2.0，所有时间点测试结果RSD％＜2.0％，表明苍术素对照品溶液14h内稳定性满足测试要求，结果见表33。

表33对照品溶液稳定性试验

芒果苷含量测定方法学验证

1.专属性

对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每ml含芒果苷20μg的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品(批号：140702)约0.25g，按”实施例1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。

知母的阴性供试品溶液的制备：取缺知母的消渴清颗粒(处方中去除知母并按其制法制备)约0.25g，按”实施例1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。

空白溶剂：去除消渴清颗粒供试品，其他均按”实施例1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。

测定法：色谱条件同已确定的方法，分别取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪分析，测定，记录色谱图。结果表明，空白溶液色谱图中在芒果苷色谱峰处无对应色谱峰出现；缺知母阴性供试品溶液色谱图中在芒果苷色谱峰处有一小色谱峰出现，峰面积约占样品峰面积的4％小于5％，故该方法专属性好，可对芒果苷进行定量测定，见图-23。

2.分离度

参照“实施例1”项下对照品溶液与供试品溶液制备方法制备测试溶液，按”实施例1”项下规定的色谱条件进行分析测定，记录色谱图。试验结果表明，供试品溶液色谱图中芒果苷色谱峰与其相邻的色谱峰分离度均大于1.5，达到基线分离。

3.稳定性测试

3.1对照品溶液的稳定性测试

取芒果苷对照品溶液(20.1μg/ml)分别于0h、3h、10h、17h、23h进样分析，计算各时间点峰面积与0时峰面积的RAD及各时间点峰面积的相对平均偏差RSD。芒果苷对照品溶液各时间点，峰面积与0时峰面积的RAD均小于2.0％，各时间点峰面积间的相对平均偏差RSD均小于2.0％。说明芒果苷对照品溶液在室温下23h内稳定。对照品溶液稳定性结果见表34。

表34芒果苷对照品溶液稳定性试验

3.2供试品溶液的稳定性测试

按“实施例1”项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0h、3h、5h、12h、18h、20h、22h进样分析，计算芒果苷各时间点峰面积与0时峰面积的RAD及各时间点峰面积的相对平均偏差RSD。供试品溶液各时间点，芒果苷与0时峰面积的均小于2.0％，各时间点峰面积间的相对平均偏差RSD小于2.0％。说明消渴清颗粒供试品溶液在室温下22h内稳定。消渴清颗粒供试品溶液稳定性结果见表35。

表35供试品溶液稳定性试验结果

4.线性与范围

对照品溶液制备过程：取芒果苷对照品适量，加1ml DMSO与适量50％甲醇制成相应母液，然后逐级稀释。分别精密吸取上述对照品溶液20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见测定结果表4、图-24，计算线性范围。试验结果表明，芒果苷标准曲线方程为y＝38600x+8120.6，r＝1.000，芒果苷浓度在1.768μg/ml～353.6μg/ml浓度范围内线性良好，结果见表36，图-24。

表36芒果苷对照品系列浓度与对应峰面积

5.仪器精密度

取消渴清颗粒(批号140702)按”实施例1”项制备供试品溶液，连续进6针分析，计算芒果苷保留时间与峰面积的RSD值。消渴清颗粒供试品溶液中芒果苷保留时间和峰面积的RSD％分别为0.12％、044％，说明仪器精密度良好。结果详见表37。

表37仪器精密度

6.精密度

6.1重复性

取消渴清颗粒(批号140702)按实施例1项制备供试品溶液，平行制备6份，然后进行分析。芒果苷的平均含量2852.768μg/g，RSD％＝1.10％，说明本方法的重复性良好，结果详见表38。

表38重复性试验

6.2中间精密度

为考察随机变动因素对精密度的影响，设计开展中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。不同分析人员于不同日期，取消渴清颗粒(批号140702)按“实施例1”项制备供试品溶液，平行制备6份，然后按照已确定色谱条件于不同仪器(①Waters HPLC 2695-2996；②Waters HPLC 2695-2487)上分析，测定，并计算含量。不同日期、不同分析人员、不同设备试验中芒果苷平均含量为2816.149μg/g，RSD为1.13％，符合要求，结果见表39。

表39芒果苷中间精密度试验结果表

7.准确度测试

取批号为140702的消渴清颗粒，精密称取0.125g，共6份，置具塞50ml离心管中，向上述已知含量的样品中加入芒果苷对照品溶液10ml，按“实施例1”项下供试品制备方法及色谱条件，测定，计算回收率。芒果苷的平均回收率为102.21％，RSD为2.34％，说明该方法准确度良好，结果详见表40。

表40芒果苷准确度试验结果统计表

8.耐用性测试

取批号为140702的消渴清颗粒，按”实施例1”项下制备方法及色谱条件，平行制备三份，采用Sepax Technologies Amethyst C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)进行耐用性测试，试验结果证明本方法耐用性良好，结果详见下表41。

表41耐用性考察试验

附图说明

图-1消渴清颗粒供试品溶液在最优色谱条件下的色谱图

图-2不同提取溶剂考察色谱图

图-3不同提取溶剂考察结果柱状图

图-4供试品溶液方法考察涉及的色谱图

图-5不同提取溶剂考察结果柱状图

图-6不同提取时间考察结果柱状图

图-7消渴清颗粒经AB-8大孔树脂处理后的色谱图

图-8消渴清颗粒经D101大孔树脂处理后的色谱图

图-9消渴清颗粒经D152大孔树脂处理后的色谱图

图-10消渴清颗粒经D152大孔树脂处理后的色谱图

图-11消渴清颗粒经聚酰胺处理后的色谱图

图-12聚酰胺固相萃取柱洗脱色谱图

图-13不同聚酰胺用量考察色谱图

图-14消渴清颗粒黄酮类成分典型色谱图，分别为

对照品：没食子酸芒果苷样品：没食子酸芒果苷

图-15没食子酸、芒果苷对照品及样品的光谱图

图-16不同时色谱柱考察结果色谱图

图-17HP-5型色谱柱的分离效果局部放大图

图-18消渴清颗粒供试品最优升温程序色谱图

图-19苍术素对照品色谱图

图-20消渴清颗粒6种供试品制备方法色谱图比对

图-21正交试验数据直观分析效应曲线图

图-22消渴清颗粒指纹图谱专属性及色谱峰归属

图-23专属性试验色谱图

图-24芒果苷标准曲线

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

消渴清药物的检测方法，

黄酮类成分的检测方法，包括黄酮类成分指纹图谱及芒果苷含量测定对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每ml含芒果苷20μg的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取消渴清药物约0.25g，精密称定，置具塞离心管中，精密加入50％甲醇10ml，密封，超声处理(功率120W，频率40kHz)20分钟，取出，放冷，离心(转速每分钟3000转)3分钟，精密吸取上清液1ml，加在聚酰胺柱(100～200目，预先用95％乙醇浸泡去杂质，挥干溶剂备用，1g；柱内径10mm，干法装柱)上，先用石油醚(60℃～90℃)20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液于25ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，精密量取甲醇液20ml，水浴蒸至近干，转移至5ml量瓶中，用适量50％甲醇洗涤并全部转移至量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取芒果苷对照品溶液及供试品溶液10μl，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×150mm，3.5μm或5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B，流速1.0ml/min，按表42中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；检测波长为254nm。

表42梯度洗脱程序

挥发性成分及非极性成分的检测方法

对照品溶液的制备

取苍术素对照品适量，精密称定，至棕色容量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，摇匀，即得苍术素对照品溶液。

供试品溶液的制备

取消渴清药物1.0g置50ml棕色离心管中,精密称定，精密加入50％甲醇10ml，超声10ml,使完全溶解，再精密加入色谱级石油醚(沸程60～90℃)10ml,密塞，精密称定，超声萃取25min,补足减失重量，离心(3000rad/min)5分钟,取上清液，0.22μm滤过，即得。

测定法

精密吸取苍术素对照品溶液与供试品溶液各3μl，注入气相色谱仪，测定，即得。

色谱条件

用Agilent HP-5(柱长30m，内径为0.320mm，膜厚0.25μm)色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；按下表43中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表43升温程序

实施例2

消渴清颗粒的检测方法，包括以下步骤：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤a1对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1ml含芒果苷15μg-的对照品溶液；

步骤a2供试品溶液的制备：取消渴清颗粒0.15g，置具塞离心管中，加入50％甲醇10ml，超声处理10分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液0.8ml，上聚酰胺柱，先用沸程60℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液18ml，水浴蒸至近干，转移至4ml量瓶中，加50％(v/v)的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a3分别吸取步骤芒果苷对照品溶液及供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤b1对照品溶液的制备

取苍术素对照品适量，精密称定，至棕色容量瓶中，加甲醇制成溶液，摇匀，即得苍术素对制成每1ml含0.03mg的溶液，

步骤b2供试品溶液的制备

取消渴清颗粒0.7g，加入40％甲醇10ml，超声10-min，使完全溶解，再精密加入沸程60℃的石油醚5ml,密塞，精密称定，超声萃取15min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b3测定法

吸取苍术素对照品溶液与供试品溶液，注入气相色谱仪，测定，即得。

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为0.8ml/min，按表44中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为254nm。

表44梯度洗脱程序

或

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用Agilent HP-5色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表45的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表45升温程序

实施例3

消渴清药物指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤a1供试品溶液的制备：取消渴清药物0.15g，置具塞离心管中，加入50％甲醇10ml，超声处理10分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液0.8ml，上聚酰胺柱，先用沸程60℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液18ml，水浴蒸至近干，转移至4ml量瓶中，加50％的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a2吸取步骤a1制备的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1供试品溶液的制备

取消渴清药物0.7g，加入40％甲醇10ml，超声10min，使完全溶解，再精密加入沸程60℃的石油醚5ml,密塞，精密称定，超声萃取15min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b2测定：分别吸取步骤b1所得的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为0.8ml/min，按表46中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm。

表46梯度洗脱程序

或

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用Agilent HP-5色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表47中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表47升温程序

实施例4

消渴清药物的检测方法，所述方法，包括以下步骤：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤a1对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇溶液制成每1ml含芒果苷25μg的对照品溶液；

步骤a2供试品溶液的制备：取消渴清药物0.50g，置具塞离心管中，加入70％甲醇10ml，超声处理40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液122ml，水浴蒸至近干，转移至6ml量瓶中，加70％(v/v)的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a3分别吸取步骤芒果苷对照品溶液及供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤b1对照品溶液的制备

取苍术素对照品适量，精密称定，至棕色容量瓶中，加甲醇制成溶液，摇匀，即得苍术素对制成每1ml含0.05mg的溶液，

步骤b2供试品溶液的制备

取消渴清药物1.3g，加入60％甲醇10ml，超声35min，使完全溶解，再精密加入沸程90℃的石油醚15ml,密塞，精密称定，超声萃取35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b3测定法

吸取苍术素对照品溶液与供试品溶液，注入气相色谱仪，测定，即得。

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为1.2ml/min，按表48中的规定进行梯度洗脱；柱温40℃；检测波长为254nm。

表48梯度洗脱程序

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用Agilent HP-5色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表49中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表49升温程序

实施例5

消渴清药物指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤a1供试品溶液的制备：取消渴清药物0.50g，置具塞离心管中，加入70％甲醇10ml，超声处理40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液22ml，水浴蒸至近干，转移至6ml量瓶中，加70％的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a2吸取步骤a1制备的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1供试品溶液的制备

取消渴清药物1.3g，加入60％甲醇10ml，超声35min，使完全溶解，再精密加入沸程90℃的石油醚15ml,密塞，精密称定，超声萃取35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b2测定：分别吸取步骤b1所得的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为1.2ml/min，按表50中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm。

表50梯度洗脱程序

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用Agilent HP-5色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表51中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表51升温程序

实施例6

消渴清药物的指纹图谱检测方法

步骤a1供试品溶液的制备：取消渴清药物0.50g，置具塞离心管中，加入70％甲醇10ml，超声处理40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液22ml，水浴蒸至近干，转移至6ml量瓶中，加70％的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a2吸取步骤a1制备的消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1供试品溶液的制备

取消渴清药物1.3g，加入60％甲醇10ml，超声35min，使完全溶解，再精密加入沸程90℃的石油醚15ml,密塞，精密称定，超声萃取35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b2测定：吸取步骤b1所得消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为1.2ml/min，按表52中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm。

表52梯度洗脱程序

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用Agilent HP-5色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；，按下表53中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml。

表53升温程序

将所得的消渴清药物超高效液相色图谱，和气相色谱图和消渴清药物超高效液相标准对照指纹图谱，和气相色谱标准对照指纹图谱进行对照，符合一致为合格产品。

Claims (4)

1.一种消渴清药物的检测方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤a1对照品溶液的制备；

步骤a2供试品溶液的制备；

步骤a3测定：分别吸取步骤a1所得的对照品溶液及步骤a2供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算芒果苷的含量；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤b1对照品溶液的制备；

步骤b2供试品溶液的制备；

步骤b3测定：分别吸取步骤b1所得的苍术素对照品溶液与步骤b2所得的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图计算苍术素的含量，

其中，步骤a：黄酮类成分芒果苷的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤a1对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1ml含芒果苷15μg-25μg的对照品溶液；

步骤a2供试品溶液的制备：取消渴清药物0.25g，加入50％甲醇10ml，超声处理20分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液0.8-1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程60℃～90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液18-22ml，水浴蒸至近干，转移至量瓶中，加50％v/v的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a3分别吸取步骤芒果苷对照品溶液及供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定；

其中，色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％-0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm

梯度洗脱程序

序号 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 1 0～3 4.0 96.0 2 3～10 4.0～10.0 96.0～90.0 3 10～12 10.0 90.0 4 12～20 10.0～15.0 90.0～85.0 5 20～35 15.0～30.0 85.0～70.0 6 35～37 30.0～80.0 70.0～20.0 7 37～38 80.0～4.0 20.0～96.0 8 38～40 4 96.0

或

梯度洗脱程序

序号 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 1 0～3 4.0 96.0 2 3～10 4.0～10.0 96.0～90.0 3 10～12 10.0 90.0 4 12～20 10.0～15.0 90.0～85.0 5 20～35 15.0～30.0 85.0～70.0 6 35～36 30.0～4.0 70.0～96.0 7 36～45 4.0 96.0

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的含量测定方法，所述方法步骤如下：

步骤b1对照品溶液的制备

取苍术素对照品适量，精密称定，至棕色容量瓶中，加甲醇制成溶液，摇匀，即得苍术素对制成每1ml含0.03mg-0.05mg的溶液，

步骤b2供试品溶液的制备

取消渴清药物0.7-1.3g，加入40-60％甲醇10ml，超声10-35min，使完全溶解，再精密加入沸程60～90℃的石油醚5-15ml,密塞，精密称定，超声萃取15-35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b3测定法

吸取苍术素对照品溶液与供试品溶液，注入气相色谱仪，测定，即得，

其中，色谱条件为

用5％-苯基-甲基聚硅氧烷色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃；进行升温程序；流速为每分钟1.0ml，

升温程序

Rate(℃/分钟) Value(℃) Hold Time(分钟) Run Time(分钟) 0 105 3 3 2.5 155 10 33 4 250 6 62.75

或

升温程序

Rate(℃/分钟) Value(℃) Hold Time(分钟) Run Time(分钟) 0 110 5 5 2 150 10 35 4 250 7 67，

其中，聚酰胺填料用量为1.0g。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中流动相B为0.1％三氟乙酸溶液，流速为1.0ml/min，柱温为35℃。

3.一种消渴清药物指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤a1多批次合格消渴清药物供试品溶液的制备；

步骤a2测定：吸取步骤a1制备的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到多批次合格消渴清药物的色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1多批次合格消渴清药物供试品溶液的制备

步骤b2测定：分别吸取步骤b1所得的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得多批次合格消渴清药物到色谱图；

上述方法所得多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，得到消渴清药物超高效液相标准对照指纹图谱，和气相色谱标准对照指纹图谱，

其中

步骤a：消渴清黄酮类成分指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤a1供试品溶液的制备：取消渴清成药或中间体消渴清药物活性成分0.15g-0.50g，加入50％-70％甲醇10ml，超声处理10-40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液0.8-1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程60℃～90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液18-22ml，水浴蒸至近干，转移至量瓶中，加50％-70％v/v的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a2吸取步骤a1制备的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1供试品溶液的制备

取消渴清药物0.7-1.3g，加入40-60％甲醇10ml，超声10-35min，使完全溶解，再精密加入沸程60～90℃的石油醚5-15ml,密塞，精密称定，超声萃取15-35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b2测定：分别吸取步骤b1所得的多批次合格消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图，

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％-0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm；

梯度洗脱程序

或

梯度洗脱程序

序号 时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 1 0～3 4.0 96.0 2 3～10 4.0～10.0 96.0～90.0 3 10～12 10.0 90.0 4 12～20 10.0～15.0 90.0～85.0 5 20～35 15.0～30.0 85.0～70.0 6 35～36 30.0～4.0 70.0～96.0 7 36～45 4.0 96.0，

其中，流动相B为0.1％三氟乙酸溶液，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用5％-苯基-甲基聚硅氧烷色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃，进行升温程序；流速为每分钟1.0ml；

升温程序

Rate(℃/分钟) Value(℃) Hold Time(分钟) Run Time(分钟) 0 105 3 3 2.5 155 10 33 4 250 6 62.75

或

升温程序

4.一种消渴清药物的指纹图谱检测方法，所述方法，步骤如下：

步骤a：黄酮类成分芒果苷的检测方法，所述方法步骤如下：

供试品溶液的制备；吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：挥发性成分及非极性成分苍术素的检测方法，所述方法步骤如下：

供试品溶液的制备；吸取供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

其中

步骤a1供试品溶液的制备：取消渴清药物0.50g，置具塞离心管中，加入70％甲醇10ml，超声处理40分钟，取出，放冷，离心，吸取上清液1.2ml，上聚酰胺柱，先用沸程90℃的石油醚20ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容，摇匀，取定容后的甲醇溶液22ml，水浴蒸至近干，转移至6ml量瓶中，加70％的甲醇定容，摇匀，滤过，得到滤液；

步骤a2吸取步骤a1制备的消渴清药物的供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤b：消渴清挥发性成分及非极性成分的指纹图谱的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤b1供试品溶液的制备

取消渴清药物1.3g，加入60％甲醇10ml，超声35min，使完全溶解，再精密加入沸程90℃的石油醚15ml,密塞，精密称定，超声萃取35min,补足减失重量，离心,取上清液，滤过，即得；

步骤b2测定：吸取步骤b1所得消渴清药物的供试品溶液，注入气相色谱仪测定，得到色谱图；

其中，步骤a：黄酮类成分及芒果苷的含量测定方法的色谱条件为

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，流速为1.2ml/min，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃-40℃；检测波长为254nm，

梯度洗脱程序

其中，步骤b：挥发性成分及非极性成分的含量测定方法的色谱条件为

用Agilent HP-5色谱柱，以氮气为载气，进样口温度250℃；分流比1:1；检测器温度250℃，按下表中的规定进行升温程序；流速为每分钟1.0ml，

升温程序

Rate(℃/分钟) Value(℃) Hold Time(分钟) Run Time(分钟) 0 110 5 5 2 150 10 35 4 250 7 67

将所得的消渴清药物超高效液相色图谱，和气相色谱图和消渴清药物超高效液相标准对照指纹图谱，和气相色谱标准对照指纹图谱进行对照，符合一致为合格产品。

Images