CN102749407B - 一种中药组合物中知母皂苷bⅱ的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物中知母皂苷BⅡ的含量测定方法。该中药组合物由黄芪、生地黄、鸡血藤、桂枝、当归、川芎、荔枝核、知母、桑枝、徐长卿、延胡索、麻黄、地龙组成，临床用于糖尿病周围神经病变，本发明通过高效液相色谱法测定其中知母皂苷BⅡ的含量，该方法简便快捷，准确可靠，用于该中药组合物的中间体和终产品的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物中知母皂苷BⅡ的含量测定方法。
背景技术
CN1833703A公开了一种治疗糖尿病周围神经病变的药物及制备方法，该中药组合物中含有原料药材知母，知母中富含甾体皂苷、双苯吡酮类、黄酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类及微量元素等成分。而其中,甾体皂苷类为主要成分,其在根茎中的量约为6 % ,且种类繁多。其中知母皂苷BⅡ为该药材中的重要成分，常作为中药组合物中含量检测指标进行质量控制，常见的测定方法为薄层扫描法，高效液相色谱法等，但是，由于中成药成分复杂，往往不同的中药组合物，知母皂苷BⅡ的含量测定方法会有所不同，原因主要是由于中药组合物中不同原料存在干扰，因此，同一成分的测定方法在不同的中药组合物中，很难采用同一种方法测定，每种中药组合物的测定方法都需要严格的方法筛选才能确定。
本发明是在CN1833703A专利的基础上进行的改进发明，在此全文引用该专利文件记载的内容。
发明内容
本发明目的是提供一种中药组合物中知母皂苷BⅡ的含量测定方法，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：
黄芪300-400份、生地黄300-400份、鸡血藤300-400份、桂枝80-120份、当归100-150份、川芎150-200份、荔枝核150-200份、知母80-120份、桑枝80-120份、徐长卿80-120份、延胡索70-120份 、麻黄50-100份、地龙30-60 份；
该方法采用高效液相色谱法，色谱条件和测定法如下：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物制剂内容物或研细的粉末2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
外标两点法即对照品进样质量的自然对数与其相应的峰面积的自然对数这两点做对数方程，将供试品峰面积取自然对数后代人方程从而求得供试品的含量。
优选地，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
黄芪340份、生地黄340份、鸡血藤340份、桂枝113份、当归136份、川芎170份、荔枝核170份、知母113份、桑枝113份、徐长卿102份、延胡索91份、麻黄68份、地龙45份。
或：
黄芪300份、生地黄300份、鸡血藤300份、桂枝80份、当归100份、川芎150份、荔枝核150份、知母80份、桑枝80份、徐长卿80份、延胡索70份、麻黄50份、地龙30份。
或：
黄芪400份、生地黄400份、鸡血藤400份、桂枝120份、当归150份、川芎200份、荔枝核200份、知母120份、桑枝120份、徐长卿120份、延胡索120份、麻黄100份、地龙60份。
或：
黄芪300份、生地黄300份、鸡血藤300份、桂枝120份、当归150份、川芎150份、荔枝核200份、知母120份、桑枝120份、徐长卿120份、延胡索120份、麻黄100份、地龙60份。
更优选地，本发明中药组合物的活性成分由下列成分组成：
1)黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加8-12倍量50-80%乙醇，回流提取1-3次，提取时间分别为1-3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃热测时相对密度1.02-1.06的流浸膏;
2)桂枝、当归、徐长卿，加5-8倍量水，浸泡20-40分钟，水蒸汽蒸馏法提油时间5-8小时，提取的挥发油；
3)桂枝、当归、徐长卿提取完挥发油后经过滤的水煎液;
4)生地黄、荔枝核、知母、地龙与桂枝、当归、徐长卿提取挥发油后的残渣合并，加8-12倍量水，加热煎煮1-3次，时间分别为1-3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃热测时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度50-70%，5-10℃静置18-36小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃热测时相对密度1.02-1.06的流浸膏。
本发明中药组合物中，原料药材的拉丁名及其加工方法来自《中药大辞典》（1977年7月，第一版，上海科学技术出版社）和《中国药典》（2005年版，化学工业出版社）。
本发明中药组合物制剂还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液等。
本发明的应用中，所述中药组合物为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液制剂中的一种，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。
或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成：
原料药重量比例：
黄芪300-400份、生地黄300-400份、鸡血藤300-400份、桂枝80-120份、当归100-150份、川芎150-200份、荔枝核150-200份、知母80-120份、桑枝80-120份、徐长卿80-120份、延胡索70-120份、麻黄50-100份、地龙30-60份；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量；
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加8-12倍量50-80%乙醇，回流提取1-3次，提取时间分别为1-3小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用；
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加5-8倍量水，浸泡20-40分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间5-8小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用；
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加8-12倍量水，加热煎煮1-3次，时间分别为1-3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度50-70%，5-10℃静置18-36小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用；
5)将淀粉,糊精混匀，置喷雾制粒机中，将步骤2）所得醇提流浸膏和步骤4）所得水提醇沉流浸膏混合喷入制粒，整粒，喷入挥发油，密闭半小时，制成所需剂型，即得。
或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成：
原料药比例：
黄芪340份、生地黄340份、鸡血藤340份、桂枝113份、当归136份、川芎170份、荔枝核170份、知母113份、桑枝113份、徐长卿102份、延胡索91份、麻黄68份、地龙45份；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量；
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加10倍量、8倍量60%乙醇，回流提取2次，提取时间分别为2、1.5小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用；
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加7倍量水，浸泡30分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间6小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用；
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加9倍量水，加热煎煮2次，时间分别为2、1.5小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度60%，5-10℃静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用；
5)将淀粉,糊精混匀，置喷雾制粒机中，将醇提流浸膏和水提醇沉流浸膏混合喷入制粒，整粒，喷入挥发油，密闭半小时，制成所需剂型，即得。
为证实本发明中药组合物中知母皂苷BⅡ的含量测定方法的可行性，发明人进行了如下实验：
1仪器与试药
Waters2695-2424型HPLC仪（包括四元泵、在线脱气机、蒸发光检测器、柱温箱、100μl进样阀、化学工作站等）；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）；其余试剂均为分析纯。对照品知母皂苷BⅡ批号(A0338)、供含量测定用，在选定的色谱条件分离后，按面积归一化法计算，其纯度大于98%。本发明中药组合物制剂（实验室按照实施例1的方法自制，批号：100501，100601，100701）。
方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱为AquaSep C18(4.6mm×250mm，5μm，ES公司)；流动相为乙腈：水-24:76；ELSD检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，供试品进样量为15µL，对照品进样量为10µL和30µL。理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000。
溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取知母皂苷BⅡ对照品10.38mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取制剂内容物2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
阴性样品溶液的制备 按制剂工艺制备不含知母的样品，同“供试品溶液的制备”方法，制备阴性样品溶液
2.3专属性试验 精密量取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各15μL，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果见图1-3。
由图1-3可知，阴性样品在供试品和对照品知母皂苷BⅡ色谱峰位置上无干扰，方法专属性良好。
线性范围考察 精密吸取“对照品溶液的制备”项下的母液1.0ml，共5份，加25%乙腈分别稀释2倍、5倍、10倍、12.5倍、25倍，制得系列浓度对照品溶液。
精密吸取上述不同浓度对照品溶液各15μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条测定，记录知母皂苷BⅡ的峰面积A值，并以峰面积A值的自然对数对进样量M的自然对数进行线性回归，得回归方程，lnA=1.7787lnM+12.139，r=0.9997结果表明，知母皂苷BⅡ进样量在0.62～7.79μg范围内，峰面积自然对数与进样量自然对数有良好的线性关系。
精密度试验 精密吸取对照品溶液15μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，按上述色谱条件测定，结果知母皂苷BⅡ峰面积RSD为1.04%；表明仪器精密度良好。
稳定性试验 精密吸取对照品和供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0h,4h,8h,12h,16h,20h，24h测定，计算供试品中知母皂苷BⅡ的含量RSD为0.82%；表明供试品在24小时内稳定。
重复性试验 取同一批号（100501）样品9份，分别为1.5克3份，2.0克3份，2.5克3份,精密称定，按照“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液及供试品溶液按上述色谱条件测定，计算知母皂苷BⅡ含量的RSD为1.63%；表明重复性良好。
加样回收率试验 称取同一批号（100501）样品9份，每份1.0g，精密称定，分3组，每组3份，每组按样品中知母皂苷BⅡ含量的80%、100%、120%分别精密加入对照品，按照“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液及供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算知母皂苷BⅡ的含量，结果见表1。
表1 知母皂苷BⅡ加样回收率试验结果
结果表明，知母皂苷BⅡ的回收率均在95%～105%，方法准确性良好。
样品测定 取3批样品，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液及供试品溶液按上述色谱条件测定，计算知母皂苷BⅡ的含量量，结果见表2。
表2本发明中药组合物制剂中知母皂苷BⅡ含量测定结果
表2 知母皂苷BⅡ含量测定结果
| 批号 | 知母皂苷BⅡ（mg/g） |
| 100501 | 1.45 |
| 100601 | 1.48 |
| 100701 | 1.43 |
3 结论
本发明含量测定方法，用于本发明中药组合物制剂的质量控制，准确，灵敏，稳定可靠，方法简便，符合药物制剂的质量控制方法的要求。
发明人曾对供试样品的处理方法进行了考察，由于制剂中药味较多、成分复杂、含糖量较高等原因，为了降低测定中其他成分对知母皂苷BⅡ的干扰，我们比较了液液萃取，固相萃取小柱，D330阴离子树脂和AB-8大孔吸附树脂等前处理方法，结果AB-8大孔吸附树脂除杂效果最佳，为了保证知母皂苷BⅡ测定的准确性，本文选择了AB-8大孔吸附树脂作为样品除杂方法。参考《中国药典》2010年版一部的比例，柱子由C8换成C18，通过调整流动相比例，供试品中知母皂苷BⅡ达到基线分离，故选择为本实验的流动相系统。
附图说明
图1 知母皂苷BⅡ对照品图。
图2 供试品图谱。
图3 阴性样品图谱。
具体实施方式
实施例1：
原料药重量：黄芪340kg、生地黄340kg、鸡血藤340kg、桂枝113kg、当归136kg、川芎170kg、荔枝核170kg、知母113kg、桑枝113kg、徐长卿102kg、延胡索91kg、麻黄68kg 地龙45kg；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量。
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加10倍量、8倍量60%乙醇，回流提取2次，提取时间分别为2、1.5小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加7倍量水，浸泡30分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间6小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用。
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加9倍量水，加热煎煮2次，时间分别为2、1.5小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度60%，5-10℃静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
5)将淀粉,糊精混匀，置喷雾制粒机中，将醇提流浸膏和水提醇沉流浸膏混合喷入制粒，整粒，喷入挥发油，密闭半小时，装胶囊，即得胶囊剂；
测定方法：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物制剂内容物粉末2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；
评价结果：
评价结果表
| 专属性 | 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 无干扰 | 1.04 | 1.63 | 0.82 |
实施例2：
原料药重量：黄芪300kg、生地黄300kg、鸡血藤300kg、桂枝80kg、当归100kg、川芎150kg、荔枝核150kg、知母80kg、桑枝80kg、徐长卿80kg、延胡索70kg、麻黄50kg、地龙30kg；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量。
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加12倍量、10倍量、8倍量50%乙醇，回流提取3次，提取时间分别为1、2、3小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加7倍量水，浸泡20分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间5小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用。
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加8倍量水，加热煎煮2次，时间分别为2、3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度50%，5-10℃静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
5)将淀粉,糊精混匀，置喷雾制粒机中，将醇提流浸膏和水提醇沉流浸膏混合喷入制粒，整粒，喷入挥发油，密闭半小时，压片，即得片剂；
测定方法：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物制剂研细的粉末2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；
评价结果：
评价结果表
| 专属性 | 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 无干扰 | 1.26 | 1.72 | 1.01 |
实施例3：
原料药重量：黄芪400kg、生地黄400kg、鸡血藤400kg、桂枝120kg、当归150kg、川芎200kg、荔枝核200kg、知母120kg、桑枝120kg、徐长卿120kg、延胡索120kg、麻黄100kg 、地龙60kg；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量。
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加10倍量、12倍量70%乙醇，回流提取2次，提取时间分别为1、3小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加8倍量水，浸泡40分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间8小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用。
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加12倍量水，加热煎煮3次，时间分别为1、2、3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度70%，5-10℃静置18小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
5)将淀粉,糊精混匀，置喷雾制粒机中，将醇提流浸膏和水提醇沉流浸膏混合喷入制粒，整粒，喷入挥发油，密闭半小时，分装，即得颗粒剂；
测定方法：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物制剂研细的粉末2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；
评价结果：
评价结果表
| 专属性 | 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 无干扰 | 1.15 | 1.57 | 0.98 |
实施例4：
原料药重量：黄芪300kg、生地黄300kg、鸡血藤300kg、桂枝120kg、当归150kg、川芎150kg、荔枝核200kg、知母120kg、桑枝120kg、徐长卿120kg、延胡索120kg、麻黄100kg、地龙60kg；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量。
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加10倍量、12倍量70%乙醇，回流提取2次，提取时间分别为1、3小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加8倍量水，浸泡40分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间8小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用。
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加12倍量水，加热煎煮3次，时间分别为1、2、3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度70%，5-10℃静置18小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
5)将醇提流浸膏和水提醇沉流浸膏混合，烘干，泛制为丸，喷入挥发油，密封包装，即得丸剂；
测定方法：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物制剂研细的粉末2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；
评价结果：
评价结果表
| 专属性 | 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 无干扰 | 1.33 | 1.62 | 0.87 |
实施例5：
原料药重量：黄芪300kg、生地黄300kg、鸡血藤300kg、桂枝120kg、当归150kg、川芎150kg、荔枝核200kg、知母120kg、桑枝120kg、徐长卿120kg、延胡索120kg、麻黄100kg、地龙60kg；
制备方法：
1)取方中药材，分别净选，粗碎为约5-10mm颗粒，按比例称量。
2)按比例称取黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加10倍量、12倍量70%乙醇，回流提取2次，提取时间分别为1、3小时。过滤，合并提取液，残渣弃去。回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
3)按比例称取桂枝、当归、徐长卿，加8倍量水，浸泡40分钟，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提时间8小时，挥发油另器收集。水煎液过滤，备用。
4)按比例称取生地黄、荔枝核、知母、地龙，与提油后残渣合并，加12倍量水，加热煎煮2次，时间分别为1、3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度70%，5-10℃静置36小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃测定时相对密度为1.02-1.06的流浸膏，备用。
5)将醇提流浸膏和水提醇沉流浸膏混合，烘干，研细，喷入挥发油，密封包装，即得散剂；
测定方法：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物制剂研细的粉末2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；
评价结果：
评价结果表
| 专属性 | 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 无干扰 | 1.47 | 1.51 | 0.91 |
Claims (6)
1.一种中药组合物中知母皂苷BⅡ的含量测定方法，该中药组合物是由如下重量份的原料药制成的：黄芪300-400份、生地黄300-400份、鸡血藤300-400份、桂枝80-120份、当归100-150份、川芎150-200份、荔枝核150-200份、知母80-120份、桑枝80-120份、徐长卿80-120份、延胡索70-120份、麻黄50-100份、地龙30-60 份，所述中药组合物的活性成分由下列成分组成：
1)、黄芪、麻黄、桑枝、延胡索、鸡血藤、川芎，分别加8-12倍量50-80%乙醇，回流提取1-3次，提取时间分别为1-3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃热测时相对密度1.02-1.06的流浸膏;
2)、桂枝、当归、徐长卿，加5-8倍量水，浸泡20-40分钟，水蒸汽蒸馏法提油，时间为5-8小时，所提取的挥发油；
3)、桂枝、当归、徐长卿提取完挥发油后经过滤的水煎液;
4)、生地黄、荔枝核、知母、地龙与桂枝、当归、徐长卿提取挥发油后的残渣合并，加8-12倍量水，加热煎煮1-3次，时间分别为1-3小时，过滤，合并提取液，残渣弃去，减压浓缩至60℃热测时相对密度为1.20-1.24的清膏，加95%乙醇至醇浓度50-70%，5-10℃静置18-36小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，减压浓缩至60℃热测时相对密度1.02-1.06的流浸膏，其特征在于该方法采用高效液相色谱法，色谱条件和测定法如下：
色谱条件：色谱柱C18，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：水-24:76；蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃，加热级别为66%，载气流速为25psi柱温为30℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数以知母皂苷BⅡ计不少于6000；
供试品溶液的制备：取上述中药组合物内容物或研细的粉末2.0 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入25%乙腈50ml，称重，超声提取30分钟，放冷，用25%乙腈补足减失的重量，取续滤液25ml，回收溶剂至近干，残渣用约50ml水溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，规格为内径1.5cm，长10cm，分别用氨试液50ml、20%乙醇50ml洗脱，弃去；再用80%乙醇洗脱100ml，收集洗脱液，蒸干，残渣用25%乙腈溶解，并转移至10 ml量瓶中，加25%乙腈至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品10mg置10ml量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取1ml母液置10ml量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液15µl、30µl，供试品溶液15µl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
2.根据权利要求1所述的知母皂苷BⅡ的含量测定方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成:
黄芪 340份 生地黄340份 鸡血藤340份 桂枝113份 当归136份 川芎 170份 荔枝核170份 知母113份 桑枝113份 徐长卿102份 延胡索91份 麻黄68份 地龙45 份。
3.根据权利要求1所述的知母皂苷BⅡ的含量测定方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成:
黄芪300份 生地黄300份 鸡血藤300份 桂枝80份 当归100份 川芎150份 荔枝核150份 知母80份 桑枝80份 徐长卿80份 延胡索70份 麻黄50份 地龙30份。
4.根据权利要求1所述的知母皂苷BⅡ的含量测定方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成:
黄芪400份 生地黄400份 鸡血藤400份 桂枝120份 当归150份 川芎200份 荔枝核200份 知母120份 桑枝120份 徐长卿120份 延胡索120份 麻黄100份 地龙60 份。
5.根据权利要求1所述的知母皂苷BⅡ的含量测定方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成:
黄芪300份 生地黄300份 鸡血藤300份 桂枝120份 当归150份 川芎150份 荔枝核200份 知母120份 桑枝120份 徐长卿120份 延胡索120份 麻黄100份 地龙60份。
6.根据权利要求1-5任一所述的知母皂苷BⅡ的含量测定方法，其特征在于所述中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或散剂。
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