CN1693310A

CN1693310A - 知母皂苷bⅱ的制备方法

Info

Publication number: CN1693310A
Application number: CNA2005100594674A
Authority: CN
Inventors: 马百平; 陈浩; 熊呈琦; 康利平; 张洁
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Emission and Radiation Medical Research Institute
Priority date: 2004-04-29
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2005-11-09
Anticipated expiration: 2025-03-25
Also published as: HK1100865A1; RU2006142102A; EP1752464A1; CA2564889C; EP1752464A4; PL381702A1; KR20070028386A; RU2395518C2; PL211896B1; CN100427500C; JP5208499B2; WO2005105824A1; CA2564889A1; US20090012277A1; JP2007534706A; US8765925B2; EP1752464B1

Abstract

本发明涉及一种知母皂苷BII的分离制备方法。该方法以中药知母或者新鲜采集的知母Anemarrhena asphodeloides Bge.根茎或须根为原料，采用溶剂提取法、树脂吸附法、聚酰胺层析、反相柱层析法、Sephadex LH－20柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法分离制备知母皂苷BII。本方法制备的知母皂苷BII的纯度高于90％，而且工艺简单实用，适宜于产业化生产。

Description

知母皂苷BII的制备方法

技术领域

本发明涉及知母皂苷BII的分离制备方法。

背景技术

中药知母为百合科(Liliaceae)知母属多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的根茎，主产于河北、内蒙古、山西及东北等地，中医用作苦寒清热药，有清热泻火，滋阴润燥的功效，主要治疗外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴和肠燥便秘等。知母的主要成分是甾体皂苷(steroidal saponin)，其次还有黄酮、寡糖、多糖及脂肪酸等。药理研究表明知母主要有抗菌抗病毒、退热、降血糖、镇静、抑制血小板聚集、抗肿瘤以及辐射防护等作用。

知母皂苷BII(Timosaponin BII)，又名原知母皂苷AIII(Prototimosaponin AIII)等，是知母中的主要成分，结构为(25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羟基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷[(25S)-26-0-β-D-glucopyranosyl-22-hydroxy-5β-furostane-3β，26-diol-3-0-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-galactopyranoside]。结构如下：

1963年川崎敏男等首次分出知母皂苷BII，但并未阐明其结构。1991年南云清二等首次阐明了知母皂苷BII的化学结构(Seiji NAGUMO etal，药学杂志(日)，1991；111(1)：306-310)。以后Noboru Nakashima(NOBORU NAKASHIMA et al，Journal of Natural Products，1993；56(3)：345-350)、马百平(马百平等，药学学报，1996；31(4)：271-277)、Masayasu Kimula(Masayasu KIMURA et al，Biol.Pharm.Bull，1996；19(7)：926-931)和Jianying Zhang (Jianying ZHANG et al，ClinicaChimica Acta，1999；289：79-88)等先后报道了知母皂苷BII的分离及活性。研究表明，知母皂苷B II具有降血糖、抑制血小板聚集、清除自由基、以及抗痴呆的活性。在知母皂苷B II的分离制备上，已有文献基本均应用正丁醇萃取、正相硅胶柱层析，同时结合大孔吸附树脂或高效液相色谱制备获得。正丁醇萃取皂苷乳化严重；硅胶柱层析上样量有限，硅胶填料不易再生利用，洗脱溶剂应用氯仿-甲醇-水混合溶剂系统，回收利用较难。所以现有文献报道的知母皂苷B II的制备方法往往过程复杂，制备量小，纯度不高，不适于工业化制备。即使使用大孔吸附树脂及反相液相色谱，也往往使用甲醇-水洗脱剂，知母皂苷B II的C-22羟基在含甲醇的溶剂中可以甲氧基化，生成一定比例的甲氧基化物(知母皂苷BI)(Seiji NAGUMO et al，药学杂志(日)，1991；111(1)：306-310)，这样在制备中就会损失一部分样品，同时回收溶剂得到的也是知母皂苷B II和知母皂苷B I的混合物，很难得到知母皂苷B II的单体化合物。

因此，改进知母皂苷B II的制备方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种改进的知母皂苷BII的制备方法，该方法避免在提取纯化中使用正丁醇、应用硅胶柱层析，以及避免在洗脱中使用甲醇，从而保证了知母皂苷BII的纯度和收率。

因此，本发明涉及一种改进的知母皂苷BII的制备方法，其包括：

a)将市售的中药知母饮片或者新鲜采集的知母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)根茎或须根为原料，用选自水、丙酮、乙醇、丙醇或它们的至少两种混合物溶剂提取，

b)将a)中提取物通过选自树脂吸附、聚酰胺层析、反相柱层析法或Sephadex LH-20柱层析法的一种或者多种方式分离，用水、丙酮、乙腈、乙醇、丙醇或它们的至少两种混合物作洗脱剂洗脱，

c)合并b)中洗脱液，然后干燥得知母皂苷BII。

根据本发明，在步骤a)中，可选用水、丙酮、乙醇、丙醇中的一种溶剂，也可选用其中的任意两种或多种溶剂以任意比例所组成的混合溶剂，在室温下浸润提取或者超声波振荡仪超声振荡提取，或者在加热状态下浸润提取或回流提取，提取次数可以是一次，也可以是多次。其中，优选：

水煎煮；或10-95％的乙醇水溶液回流、渗漉或超声提取；或10-80％的丙酮水溶液回流、渗漉或超声提取。

根据本发明，在步骤b)中，针对树脂吸附法，树脂可选用D-101型吸附树脂、AB-8型吸附树脂、XAD-2型吸附树脂、HP20型吸附树脂、SP825型吸附树脂、SP700型吸附树脂、CHP-20P型吸附树脂或者SP70型吸附树脂以及其他型号的聚苯乙烯型大孔吸附树脂，洗脱溶剂用水、丙酮、乙醇、丙醇中的一种或多种，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

进一步讲，提取液的离心上清液或过滤液通过大孔树脂吸附，用水或低浓度的丙酮或低级醇的水溶液淋洗除去杂质，低级醇为乙醇或丙醇，其浓度为5-30％，用量为柱体积的2-7倍(2-7BV)；再用较高浓度的丙酮或低级醇的水溶液洗脱，低级醇为乙醇、丙醇，其浓度为20-70％，用量为柱体积的2-7倍(2-7BV)，根据检测情况，收集此部分洗脱液或其中部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，得到粗知母皂苷BII。

在本发明步骤b)选用的聚酰胺层析法中，可选柱层析法或静态吸附过滤法，洗脱剂用水、丙酮、乙腈、乙醇、丙醇中的一种或多种，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

进一步讲，含知母皂苷BII的水溶液通过聚酰胺柱，用水或低浓度的丙酮或低级醇的水溶液洗脱，低级醇为乙醇或丙醇，其浓度为0-15％，用量为柱体积的2-5倍(2-5BV)，根据检测情况，收集此部分洗脱液或其中部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，得到知母皂苷BII。或含知母皂苷BII的水溶液中加入聚酰胺，充分搅拌、放置，布氏漏斗过滤，用水或低浓度的丙酮或低级醇的水溶液进一步洗脱，根据检测情况，收集此部分洗脱液或其中部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，得到知母皂苷BII。再用高浓度的丙酮、乙醇或丙醇的水溶液，或酸、碱再生。

在本发明b)中选用的反相柱层析中，可选用常压或加压反相柱层析，所用柱填料可选十八烷基键合相(ODS)或八烷基键合相，洗脱剂用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、丙醇中的一种或多种，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

进一步讲，用洗脱剂溶解含知母皂苷BII的样品，样品溶液通入反相层析柱，用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、丙醇中的一种或多种洗脱，有机溶剂浓度为15-60％，分步收集，根据检测情况，合并其中部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，得到知母皂苷BII。

在本发明b)中选用的Sephadex LH-20柱层析中，可选用常压或加压柱层析，洗脱剂用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、含水丙醇中的一种或多种，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

进一步讲，用洗脱剂溶解含知母皂苷BII的样品，样品溶液通入Sephadex LH-20层析柱，用含水乙腈、含水丙酮或者含水乙醇、含水丙醇等C2-C5醇类中的一种或多种洗脱，有机溶剂浓度为5-60％，分步收集，根据检测情况，合并其中部分洗脱液，回收溶剂，浓缩，得到知母皂苷BII。

根据本发明，步骤c)中所述干燥为本领域中已知的干燥方法，举例讲，如减压干燥，冷冻干燥或喷雾干燥。

本发明主要解决了已有工艺中方法复杂的问题，特别是解决了由于工艺中使用正丁醇、硅胶柱层析及甲醇，致使知母皂苷BII纯度不高，收率损失的问题，本发明方法制备的知母皂苷BII的纯度高于90％，而且工艺简单实用，适宜于产业化生产。

具体实施方式

下面的实施例用于进一步说明本发明，但其不意味着对本发明的任何限制。

实施例1

知母皂苷BII的制备

中药知母饮片8Kg，适当粉碎，加50％乙醇48L，浸泡1小时，回流提取1小时，过滤；药渣再同样回流提取2次。合并醇提液，回收乙醇，减压浓缩至40L。将预先处理好的大孔吸附树脂SP825(日本三菱公司)装柱(18L)，水平衡。提取浓缩液过滤，滤液上样，用水洗除去杂质。之后依次用3倍柱体积(3BV)的35％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，经检测知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，加乙醇至35％备用。再生后的大孔吸附树脂SP825柱(18L)用35％乙醇平衡，通入上述备用样品，用45％乙醇6BV洗脱，分步收集，每份2000mL，HPLC检测各份纯度。将18-30份合并，回收乙醇，浓缩至小体积备用。此样品通入处理好的聚酰胺柱中(6L，30-60目，临江试剂化工厂)，水洗脱5BV，色带部分舍去，分步收集，每份600mL，HPLC检测，合并第6-23份，浓缩，喷雾干燥，得知母皂苷BII 56.5g，产品收率为药材的0.71％，HPLC检测纯度为90.8％。

实施例2

知母皂苷BII的制备

中药知母饮片5Kg，适当粉碎，加30％丙酮30L，浸泡2小时，用超声波振荡器超声提取0.5小时，过滤；药渣再同样超声提取2次。合并提取液，回收丙酮，减压浓缩至30L。将预先处理好的大孔吸附树脂AB-8(天津南开化工厂)装柱(18L)，水平衡。提取浓缩液过滤，滤液上样，用水洗杂质。之后依次用3倍柱体积(3BV)的20％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，经检测知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷BII粗样品286g。将粗样品80g溶解于1000ml 25％丙酮溶液，通入25％丙酮平衡好的C18柱(6.5L)。依次用28％丙酮(20000ml)、30％丙酮(20000ml)洗脱，80％丙酮(13000ml)再生柱子。28％和30％丙酮部分分步收集，每份600mL，HPLC检测各份纯度。将6-21份合并，回收丙酮，浓缩至小体积，冰干，得知母皂苷BII12.9g，产品收率为药材的0.92％，HPLC检测纯度为94.3％。

实施例3

知母皂苷BII的制备

中药知母饮片5Kg，适当粉碎，加30％丙酮30L，浸泡2小时，用超声波振荡器超声提取0.5小时，过滤；药渣再同样超声提取2次。合并提取液，回收丙酮，减压浓缩至30L。将预先处理好的大孔吸附树脂AB-8(天津南开化工厂)装柱(18L)，水平衡。提取浓缩液过滤，滤液上样，用水洗除去杂质。之后依次用3倍柱体积(3BV)的20％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，经检测知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷BII粗样品290g。将粗样品80g溶解于1000ml 25％丙酮溶液，通入32％甲醇平衡好的C18柱(6.5L)。依次用32％甲醇(20000ml)、34％甲醇(20000ml)洗脱，90％甲醇(15000ml)再生柱子。32％和34％甲醇部分分步收集，每份600mL，HPLC检测各份纯度。将8-19份合并，回收甲醇，浓缩至小体积，冰干，得知母皂苷BII样品9.7g，HPLC检测纯度为73.1％；此样品溶解于30％丙酮中，95℃回流5小时，回收丙酮，浓缩至小体积，冰干，得知母皂苷BII 9.7g，产品收率为药材的0.70％，HPLC检测纯度为93.9％。

实施例4

知母皂苷BII的制备

知母新鲜根茎4Kg，切薄片，加入10L水，煎煮1小时，过滤；药渣再加入8L水，煎煮1小时，过滤。合并滤液，减压浓缩至10L，加乙醇至25％，静置备用。将预先处理好的大孔吸附树脂D101(天津农药厂)装柱(6L)，25％乙醇平衡。上述备用提取液过滤，滤液上样，依次用3倍柱体积(3BV)的25％乙醇、3BV的35％乙醇和3BV的90％乙醇洗脱，经检测知母皂苷BII主要集中于35％乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积备用。此样品通入处理好的聚酰胺柱中(6L，30-60目，临江试剂化工厂)，5BV水洗脱，舍去有色部分，分步收集，每份600ml，HPLC检测，合并第8-24份，浓缩，喷雾干燥，得知母皂苷BII脱色粗样品51g。取其中粗样品约40g样品溶解于200ml35％乙醇溶液，通入35％乙醇平衡好的Sephadex LH-20柱(8.5L)，用35％乙醇(50000ml)洗脱，95％乙醇(20000ml)再生柱子。35％乙醇部分分步收集，每份800mL，HPLC检测各份纯度。将16-35份合并，回收乙醇，浓缩至小体积，冰干，得知母皂苷BII 11.2g，产品收率为新鲜根茎的0.36％(相当干药材的1.07％)，HPLC检测纯度为92.3％。

实施例5

知母皂苷BII的制备

知母须根2Kg，切咀，加入16L水，煎煮1小时，过滤；药渣再加入12L水，煎煮1小时，过滤。合并滤液，减压浓缩至12L，加丙酮至15％，静置备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(6L)，15％丙酮平衡。上述备用提取液过滤，滤液上样，依次用3倍柱体积(3BV)的25％丙酮、3BV的35％丙酮和3BV的80％丙酮洗脱，经检测知母皂苷BII主要集中于35％丙酮部分，此部分洗脱液回收丙酮，浓缩，喷雾干燥，得知母皂苷BII粗样品45.0g。取其中粗样品约40g样品溶解于200ml 10％丙酮溶液，通入10％丙酮平衡好的Sephadex LH-20柱(8.5L)，用10％丙酮(40000ml)洗脱，80％丙酮(20000ml)再生柱子。10％丙酮部分分步收集，每份800mL，HPLC检测各份纯度。将20-36份合并，回收丙酮，浓缩至小体积，冰干，得知母皂苷BII 9.2g，产品收率为须根原料的0.52％，HPLC检测纯度为91.7％。

实施例6

知母皂苷BII的制备

知母新鲜根茎4Kg，切薄片，加入50％乙醇8L，浸泡2小时，用超声波振荡器超声提取0.5小时，过滤；药渣再同样超声提取2次。合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至10L。将预先处理好的大孔吸附树脂AB-8(天津南开化工厂)装柱(6L)，水平衡。提取浓缩液过滤，滤液上样，水洗除去杂质。之后依次用3倍柱体积(3BV)的20％乙醇、3BV的50％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，经检测知母皂苷BII主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷BII粗样品59.3g。取粗样品其中50g溶解于200ml 25％丙酮溶液，通入25％丙酮平衡好的C18柱(6.5L)。依次用28％丙酮(20000ml)、30％丙酮(20000ml)洗脱，80％丙酮(15000ml)再生柱子。28％和30％丙酮部分分步收集，每份600mL，HPLC检测各份纯度。将6-25份合并，回收丙酮，浓缩至小体积，冰干得知母皂苷BII15.6g。取其中14.1g样品再溶解于70ml 25％的丙酮中，通入25％丙酮平衡好的C18柱(6.5L)。用28％丙酮(40000ml)洗脱，80％丙酮(1200ml)再生柱子。分步收集，每份600mL，HPLC检测各份纯度。将8-19份合并，回收丙酮，浓缩至小体积，冰干得知母皂苷BII 4.5g，产品收率为新鲜根茎的0.15％(相当干药材的0.44％)，HPLC检测纯度为98.6％。

样品为白色无定形粉末，mp＞243℃(dec)。Liebermann-Burchard反应和Molish反应呈阳性，对Ehrlich试剂亦呈阳性反应。

知母皂苷BII的结构鉴定：利用红外、质谱和核磁等手段进行了结构鉴定，结果如下。

IR(漫反射)cm^-1：3348(OH)，2930，2850，1075，1044(苷键C-O)。

FAB-MS m/z 943(M+Na)⁺，903(M+H-H₂O)⁺，741(M+H-H₂O-Glc)⁺，579(M+H-H₂O-Glc×2)⁺，417(M+H-H₂O-Glc×2-Gal)⁺，399(苷元+H-H₂O×2)⁺，255，185，145。

EI-MS m/z 740(M-H₂O-Glc)⁺，578(M-H₂O-Glc×2)⁺，416(苷元-H₂O)⁺，415(苷元-H-H₂O)⁺，357，273，217，181，139。

¹H-NMR(C₅D₅N)δ：0.85(3H，S，18-CH₃)，0.96(3H，S，19-CH₃)，1.00(3H，d，J＝6.4Hz，27-CH₃)，1.30(3H，d，J＝6.8Hz，21-CH₃)，4.79(1H，d，J＝7.8Hz，Glc 1-H)，4.90(1H，d，J＝7.8Hz，Gal 1-H)，5.27(1H，d，J＝7.8Hz，Glc 1-H)。

¹³C-NMR谱数据见表1。此化合物为(25S)-26-0-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羟基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-0-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷。

表1.知母皂苷BII的¹³C-NMR化学位移(C₅D₅N)

碳	化学位移	碳	化学位移
碳	化学位移	碳	化学位移	苷元123456789101112	30.927.075.030.936.926.726.735.440.235.221.140.4	糖gal-123456glc-123456	102.581.876.969.876.562.1106.175.578.071.478.462.7

131415161718192021222324252627

41.256.432.481.264.016.724.040.616.4110.637.128.334.475.317.4

26glc-123456

105.175.278.571.678.462.7

对比实施例1

知母皂苷BII的制备

中药知母饮片1Kg，适当粉碎，加60％乙醇6L浸泡1小时，加热回流提取1小时，过滤；药渣再同样回流提取2次。合并乙醇提取液，回收乙醇，减压浓缩至4L。浓缩液中加入4L水饱和正丁醇振摇混匀后静置分层，取上层正丁醇液；下层水液再加入水饱和正丁醇同样萃取4次，合并5次萃取的正丁醇液浓缩至干，得到总皂苷33.1g。总皂苷用甲醇溶解，拌入硅胶60g，加热挥干溶剂。将拌好的样品上样到干法装好的硅胶层析柱(3L)中，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，收集氯仿-甲醇-水(60∶40∶10下相)洗脱含知母皂苷BII的部分浓缩至干，得粗品2.3g；再经硅胶柱层析(500mL)，氯仿-甲醇-水洗脱，收集氯仿-甲醇-水(65∶35∶10下相)洗脱部分，每份50ml，第15-23份浓缩干得样品0.67g。此样品用32％甲醇溶解，进行C18反相柱层析(600ml)，依次用32％甲醇(1800ml)、34％甲醇(1800ml)洗脱，90％甲醇(1200ml)再生柱子。32％和34％甲醇部分分步收集，每份50mL。HPLC检测各份纯度，第13-21份合并，回收甲醇，浓缩至小体积，冰干，得知母皂苷BII样品0.34g，HPLC检测纯度为75.5％；此样品溶解于30％的丙酮中，95℃水浴回流加热5小时，回收丙酮，浓缩，冰干得知母皂苷BII 0.33g，产品收率为药材的0.033％，纯度为93.4％。

Claims

1.一种改进的知母皂苷BII的制备方法，其包括：

c)合并b)中洗脱液，然后干燥得到知母皂苷BII。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于a)中提取是在室温或加热状态下提取、超声波振荡仪超声振荡提取，提取次数可以是一次，也可以是多次。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于a)中所述溶剂提取是在水煎煮原料后，用下述方法之一提取：

10-95％的乙醇水溶液回流、渗漉或超声提取；

10-80％的丙酮水溶液回流、渗漉或超声提取。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于b)中所述树脂吸附法中所用的树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂，洗脱溶剂选自：由水、丙酮、乙醇和丙醇组成的溶剂，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于b)中所述树脂为D-101型吸附树脂、AB-8型吸附树脂、XAD-2型吸附树脂、HP20型吸附树脂、SP825型吸附树脂、SP700型吸附树脂、CHP-20P型吸附树脂或者SP70型吸附树脂。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于所述树脂吸附法为：使溶剂提取液的离心上清液或过滤液通过大孔树脂吸附，用水或5-30％的丙酮、乙醇或丙醇的水溶液淋洗除去杂质，用量为柱体积的2-7倍，再用20-70％的丙酮或乙醇或丙醇的水溶液洗脱，用量为柱体积的2-7倍。

7.如权利要求1所述知母皂苷BII的分离制备方法，其特征在于b)所述聚酰胺层析为柱层析法或静态吸附过滤法，洗脱剂选自由水、丙酮、乙腈、乙醇或丙醇组成的溶剂，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于b)中所述聚酰胺层析为：使含知母皂苷BII的水溶液通过聚酰胺柱，用水或0-15％的丙酮、乙醇或丙醇的水溶液洗脱，用量为柱体积的2-5倍。

9.如权利要求1所述方法，其特征在于所述反相柱层析法为常压或加压反相柱层析，所用柱填料为十八烷基键合相(ODS)或八烷基键合相，洗脱剂选自由含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇和含水丙醇组成的洗脱剂，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。

10.如权利要求1所述知母皂苷B II的分离制备方法，其特征在于所述Sephadex LH-20柱层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂选自由含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇和含水丙醇组成的洗脱剂，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱。