PL211896B1

PL211896B1 - Sposób wytwarzania timosaponiny BII

Info

Publication number: PL211896B1
Application number: PL381702A
Authority: PL
Inventors: Baiping Ma; Hao Chen; Chengqi Xiong; Liping Kang; Jie Zhang
Original assignee: Inst Radiation Med Amms Pla
Priority date: 2004-04-29
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2012-07-31
Also published as: HK1100865A1; RU2006142102A; EP1752464A1; CA2564889C; EP1752464A4; PL381702A1; KR20070028386A; RU2395518C2; CN1693310A; CN100427500C; JP5208499B2; WO2005105824A1; CA2564889A1; US20090012277A1; JP2007534706A; US8765925B2; EP1752464B1

Description

Tradycyjny chiński lek Rhizome Anemarrhenae jest kłączem Anemarrhena asphodehides Bge. (Liliaceae), szeroko rozprowadzanym w Hebei, Neimenggu, prowincji Shanxi w północno-wschodnich Chinach i na pewnych innych obszarach. Z uwagi na działanie usuwające ciepło i wysoką gorączkę oraz działanie wzmacniające wytwarzanie płynów ustrojowych i zasilających płuca, często był stosowany w tradycyjnej medycynie chińskiej. Głównymi składnikami Anemarrhena asphodeloldes Bge. są steroidowe saponiny, razem z między innymi flawonami, oligosacharydami, polisacharydami i kwasami tłuszczowymi. Badania farmakologiczne wykazują, że mają one działanie przeciw antybiozie, przeciwwirusowe, usuwające gorączkę, przeciwcukrzycowe, uspokajające, hamujące agregację płytek krwi, przeciwrakowe i radioochronne, itp.

Timosaponina BII, także nazywana jako Prototimosaponina AIII, jest głównym składnikiem kłącza Anemarrhena asphodeloldes Bge. Ma budowę (25S)-26-O-e-D-glukopiranozylo-22-hydroksy-5e-furostano-3e, 26-diol-3-O-e-D-glukopiranozylo-(1->2)-e-D-galaktopiranozydu o następującym wzorze:

Timosaponinę BII p raz pierwszy wydzielił Toshio Kawazaki w 1963 roku, ale nie określił jej budowy. W 1991 roku, Seiji Nagumo pierwszy ustalił budowę timosaponiny BII (Seiji Nagumo i in., Yakugaku Zasshi, 1991; 111 (1) : 306-310). Następnie, Noboru Nakashima (Noboru Nakashima i in., Journal of Natural Products, 1993; 56 (3) : 345-350), Bai-ping Ma (Bai-ping Ma i in., Acta. Pharm. Sin. 1996; 31 (4) : 271-277), Masayasu Kimula (Masayasu Kimura i in., Biol. Pharm. Bull, 1996; 19 (7) : 926-931) i Jian-ying Zhang (Jian-ying Zhang i in., Clinica Chimica Acta, 1999; 289: 79-88) opisali wydzielanie i aktywność timosaponiny BII, Badania wykazały, że timosaponina BII ma aktywność przeciwcukrzycową, hamującą agregację płytek krwi, usuwającą wolne rodniki i działa przeciw otępieniu. Według prawie wszystkich odsyłaczy literaturowych stanu techniki, timosaponinę BII wytwarzano metodą ekstrakcji n-butanolem, chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym w fazie normalnej, chromatografii kolumnowej na makroporowatej żywicy oraz HPLC. Ale podczas ekstrakcji n-butanolem łatwo tworzy się emulsja, wielkość próbki jest ograniczona do chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, odtwarzanie żelu krzemionkowego jest trudne, jak również trudne jest odzyskiwanie eluentu chloroform-metanol-woda. Dlatego realizacja wskazanych metod jest zazwyczaj trudna, wydajność jest mała, czystość słaba i nie nadają się one do wytwarzania w skali przemysłowej. Nawet zastosowanie makroporowatej żywicy i chromatografii cieczowej w fazie odwróconej, eluowanie układem metanol-woda prowadzi do C-22 hydroksymetoksylowania timosaponiny BII z wytworzeniem pewnej ilości timosaponiny BI (Seiji Nagumo i in., Yakugaku Zasshi, 1991; 111 (1) : 306-310). Metody te prowadziłyby

PL 211 896 B1 zatem do pewnych strat i można by wytwarzać tylko mieszaninę timosaponiny BII i timosaponina BI, a otrzymanie czystej timosaponiny BII jest zbyt trudne.

Z tych wzglę dów konieczne jest ulepszenie sposobu wytwarzania timosaponiny BII.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ulepszony sposób wytwarzania timosaponiny BII. Według sposobu unika się stosowania n-butanolu i chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym w procesie ekstrakcji i oczyszczania, unika się stosowania metanolu do eluowania, a tym samym zapewnia się otrzymywanie timosaponiny BII o dużej czystości i z dużą wydajnością.

Zgodnie z tym, przedmiotem wynalazku jest ulepszony sposób wytwarzania timosaponiny BII, który obejmuje:

a) dostarczenie kawałków z wyciągu tradycyjnego chińskiego leku Rhizome Anemarrhenae lub świeżego kłącza lub korzenia Anemarrhena asphodeloides Bge. jako surowego materiału i ekstrakcję z zastosowaniem rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmującej wodę , aceton, etanol, propanol i mieszaninę co najmniej dwóch z nich;

b) oddzielenie ekstraktu uzyskanego według punktu a) z zastosowaniem jednej lub więcej metod wybranych z grupy obejmującej adsorpcję na żywicy, chromatografię poliamidową, chromatografię kolumnową w fazie odwróconej i chromatografię na kolumnie Sephadex LH-20, oraz eluowanie z zastosowaniem eluentu wybranego z grupy obejmującej wodę, aceton, acetonitryl, etanol, propanol i mieszaninę co najmniej dwóch z nich;

c) połączenie eluentów uzyskanych według punktu b), suszenie w celu otrzymania timosaponiny BII.

Według wynalazku, rozpuszczalnikiem stosowanym w etapie a) może być dowolny rozpuszczalnik spośród takich jak woda, aceton, etanol i propanol lub mieszanina składająca się z dwóch lub więcej z nich w dowolnej proporcji. Ekstrakcję można przeprowadzać jako ekstrakcję przez zanurzenie lub ekstrakcję ultradźwiękową w ultradźwiękowym ekstraktorze w temperaturze pokojowej, albo ekstrakcję przez zanurzenie lub ekstrakcję w temperaturze refluksu w warunkach ogrzewania, przy czym ekstrakcję można przeprowadzać jeden lub więcej razy. W etapie a) korzystne są następująco metody ekstrakcji:

warzenie z wodą; lub refluks, diakolacja lub ekstrakcja ultradźwiękowa z zastosowaniem 10 do 90% roztworu etanolu w wodzie; albo refluks, diakolacja lub ekstrakcja ultradźwiękowa z zastosowaniem 10 do 80% roztworu acetonu w wodzie.

Według wynalazku, w etapie b), tj. adsorpcji na żywicy, jako żywice można stosować żywice adsorpcyjne typu D-101, żywice adsorpcyjne typu AB-8, żywice adsorpcyjne typu XAD-2, żywice adsorpcyjne typu HP20, żywice adsorpcyjne typu SP825, żywice adsorpcyjne typu SP700, żywice adsorpcyjne typu CHP-20P lub żywice adsorpcyjne typu SP70, albo innego typu makroporowate adsorpcyjne żywice polistyrenowe (PS). Jako eluent można stosować jeden lub więcej takich rozpuszczalników jak woda, aceton, etanol i propanol. Eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

Według specyficznego rozwiązania, odwirowany supernatant lub przesącz ekstraktu jest adsorbowany na makroporowatej żywicy, a zanieczyszczenia można usuwać eluując wodą albo acetonem lub niższym alkoholem (np. etanolem lub propanolem) o małym stężeniu w wodzie, przy czym stężenie może wynosić 5 do 30% i objętość może wynosić 2 do 7 objętości kolumny (2 do 7 BV). Następnie kolumnę eluuje się stosując większe stężenie acetonu lub niższego alkoholu (np. etanolu lub propanolu)

PL 211 896 B1 w wodzie, które może wynosić 20 do 70% i objętość może wynosić 2 do 7 objętości kolumny (2 do 7 BV). Zależnie od wyników badania, cały lub część eluatu zbiera się, rozpuszczalnik odzyskuje się i pozostałość zatęża się z wytworzeniem surowej timosaponiny BII.

Według wynalazku, alternatywnie w etapie b) jako chromatografię poliamidową można stosować chromatografię kolumnową lub statyczną filtrację adsorpcyjną, a jako eluent można stosować jeden lub więcej takich rozpuszczalników jak woda, aceton, acetonitryl, etanol i propanol. Eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

Według specyficznego rozwiązania, wodny roztwór timosaponiny BII wprowadza się na kolumnę z poliamidem i eluuje wodą lub acetonem lub niższym alkoholem (np. etanolem lub propanolem) w małym stężeniu w wodzie, które może wynosić 0 do 15% i objętość może wynosić 2 do 5 objętości kolumny (2 do 5 BV). Zależnie od wyników badania, cały lub część eluatu zbiera się, rozpuszczalnik odzyskuje się i pozostałość zatęża się, uzyskując timosaponinę BII. Alternatywnie, poliamid dodaje się do wodnego roztworu zawierającego timosaponinę BII, miesza się dostatecznie, pozostawia do odstania, przesącza się na lejku Buchnera i eluuje wodą lub acetonem lub niższym alkoholem w małym stężeniu w wodzie. Zależnie od wyników badania, cały lub część eluatu łączy się, rozpuszczalnik odzyskuje się i pozostałość zatęża się, uzyskując timosaponinę BII. Poliamid można regenerować stosując aceton, etanol lub propanol w dużym stężeniu w wodzie albo kwas lub ług.

Alternatywnie, w etapie b) według wynalazku można stosować chromatografię kolumnową w fazie odwróconej pod ciśnieniem normalnym lub zwiększonym. Wypełnienie kolumny w układzie faz odwróconych może stanowić żel krzemionkowy (żel krzemionkowy RP-18) lub (żel krzemionkowy RP-8). Eluentem może być jeden lub więcej rozpuszczalników takich jak acetonitryl-woda, aceton-woda, etanol-woda i propanol-woda. Eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

Według specyficznego rozwiązania, próbkę zawierającą timosaponinę BII rozpuszcza się w eluencie, roztwór poddaje się chromatografii na kolumnie w układzie faz odwróconych i eluuje jednym lub więcej takimi rozpuszczalnikami jak acetonitryl-woda, aceton-woda, etanol-woda i propanol-woda, przy czym stężenie organicznego rozpuszczalnika może wynosić 15 do 60%, oraz zbiera się frakcje eluatu. Zależnie od wyników badania, część eluatu łączy się, rozpuszczalnik odzyskuje się i pozostałość zatęża się, uzyskując timosaponinę BII.

Alternatywnie, w etapie b) według wynalazku można stosować chromatografię na kolumnie Sephadex LH-20 pod ciśnieniem normalnym lub zwiększonym. Eluentem może być jeden lub więcej rozpuszczalników takich jak acetonitryl-woda, aceton-woda, etanol-woda i propanol-woda, a eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

Według specyficznego rozwiązania, próbkę zawierającą timosaponinę BII rozpuszcza się w eluencie, poddaje chromatografii na kolumnie Sephadex LH-20 i eluuje stosując jeden lub więcej takich rozpuszczalników jak acetonitryl-woda, aceton-woda, C2 do C5 alkohol (np. etanol i propanol) - woda, przy czym stężenie organicznego rozpuszczalnika może wynosić 5 do 60%, oraz zbiera się frakcje eluatu. Zależnie od wyników badania, część eluatu łączy się, rozpuszczalnik odzyskuje się i pozostałość zatęża się, uzyskując timosaponinę BII.

Według wynalazku, w etapie c) można stosować metodę suszenia znaną w dziedzinie, np. suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem, liofilizację lub suszenie rozpryskowe.

Wynalazek rozwiązuje problemy występujące w metodach według stanu techniki, a zwłaszcza małej czystości i małej wydajności otrzymywania timosaponiny BII, z uwagi na stosowanie n-butanolu, metanolu i chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Zgodnie ze sposobem według wynalazku, czystość wytworzonej timosaponiny BII przekracza 90%; sposób jest prosty, praktyczny i nadający się do stosowania w skali przemysłowej.

P r z y k ł a d y

Następujące przykłady zilustrują wynalazek szczegółowo lecz nie przedstawiono ich z zamiarem jakiegokolwiek ograniczenia zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie timosaponiny BII

Kawałki z wyciągu tradycyjnego chińskiego leku Rhizome Anemarrhenae (8 kg) zmielono i dodano do nich 48 l 50% etanolu. Lek utrzymywano w zanurzeniu przez jedną godzinę i następnie ekstrahowano w temperaturze refluksu przez jedną godzinę, po czym przesączono. Pozostałość ekstrahowano podobnie w temperaturze refluksu jeszcze dwa razy. Ekstrakty etanolowe połączono, etanol odzyskano i pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 40 l. Wstępnie potraktowaną makroporowatą żywicę absorpcyjną SP825 (Mitsubishi Co., Japan) umieszczono w kolumnie

PL 211 896 B1 (18 l), którą zrównoważono wodą. Zatężony ekstrakt przesączono i przesącz poddano chromatografii na kolumnie i przemyto wodą w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie, kolumnę eluowano kolejno stosując 3 objętości kolumny (3BV) 35% etanolu, 3BV 50% etanolu i 3BV 95% etanolu. Wyniki badań wykazały, że timosaponinę BII zebrano głównie we frakcji 50% etanolu. Tę frakcję zatężono do małej objętości w celu usunięcia etanolu, a następnie etanol dodano do końcowego stężenia 35% do następnego zastosowania. Regenerowaną makroporowatą żywicę SP825 w kolumnie (18 l) zrównoważono stosując 35% etanol. Powyższą próbkę poddano chromatografii na kolumnie i eluowano 6BV 45% etanolu. Zbierano frakcje eluatu po 2000 ml i czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 18 do 30 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia etanolu. Otrzymany roztwór poddano chromatografii na kolumnie ze wstępnie potraktowanym poliamidem (6 l, 30-60 mesh, Linjiang Reagent Chemical Plant) i eluowano stosując 5BV wody. Początkową frakcję zawierającą zabarwioną substancję odrzucono, zbierano frakcje eluatu po 600 ml i oznaczano metodą HPLC. Frakcje 6 do 23 połączono, zatężono i osuszono rozpryskowo, uzyskując timosaponinę BII (56,5 g). Wydajność produktu wynosiła 0,71% surowej substancji leczniczej, a czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 90,8%.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie timosaponiny BII

Kawałki z wyciągu tradycyjnego chińskiego leku Rhizome Anemarrhenae (5 kg) zmielono dodano do nich 30 l 30% acetonu. Lek utrzymywano w zanurzeniu przez dwie godziny i następnie ekstrahowano przez 0,5 godziny z zastosowaniem generatora ultradźwiękowego, po czym przesączono. Pozostałość podobnie ekstrahowano ultradźwiękowo jeszcze dwa razy. Acetonowy ekstrakt połączono, aceton odzyskano i pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 30 l. Wstępnie potraktowaną makroporowatą żywicę AB-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) umieszczono w kolumnie (18 l), którą zrównoważono wodą. Zatężony ekstrakt przesączono i przesącz poddano chromatografii na kolumnie i eluowano wodą w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie, kolumnę eluowano kolejno stosując 3 objętości kolumny (3BV) 20% etanolu, 3BV 50% etanolu i 3BV 95% etanolu. Wyniki badań wykazały, że timosaponinę BII zebrano głównie we frakcji 50% etanolu. Tę frakcję zatężono do małej objętości w celu usunięcia etanolu i następnie osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując próbkę surowej timosaponiny BII (286 g). 80 g surowej próbki rozpuszczono w 1000 ml 25% acetonu i wprowadzono do kolumny z żelem krzemionkowym RP-18 (6,5 l), którą wcześniej zrównoważono stosując 25% aceton. Kolumnę eluowano kolejno 28% acetonem (20000 ml) i 30% acetonem (20000 ml), a nastę pnie regenerowano stosują c 80% aceton (13000 ml). Eluaty 28% acetonu i 30% acetonu zebrano jako frakcje o objętości 600 ml i czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 6 do 21 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia acetonu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (12,9 g). Wydajność produktu wynosiła 0,92% surowej substancji leczniczej, a czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 94,3%.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie timosaponiny BII

Kawałki z wyciągu tradycyjnego chińskiego leku Rhizome Anemarrhenae (5 kg) zmielono i dodano do nich 30 l 30% acetonu. Lek utrzymywano w zanurzeniu przez dwie godziny i następnie ekstrahowano przez 0,5 godziny z zastosowaniem generatora ultradźwiękowego, po czym przesączono. Pozostałość podobnie ekstrahowano ultradźwiękowo jeszcze dwa razy. Acetonowy ekstrakt połączono, aceton odzyskano i pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 30 l. Wstępnie potraktowaną makroporowatą żywicę AB-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) umieszczono w kolumnie (18 l), którą zrównoważono wodą. Zatężony ekstrakt przesączono i przesącz poddano chromatografii na kolumnie i eluowano wodą w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie, kolumnę eluowano kolejno przy użyciu 3BV 20% etanolu, 3BV 50% etanolu i 3BV 95% etanolu. Wyniki badań wykazały, że timosaponinę BII zebrano głównie we frakcji 50% etanolu. Tę frakcję zatężono do małej objętości w celu usunię cia etanolu i nastę pnie osuszono pod zmniejszonym ciś nieniem, uzyskują c próbkę surowej timosaponiny BII (290 g). 80 g surowej próbki rozpuszczono w 1000 ml 25% roztworu acetonu i poddano chromatografii na kolumnie z ż elem krzemionkowym RP-18 (6,5 l), którą wcześ niej zrównoważono 32% metanolem. Kolumnę eluowano kolejno przy użyciu 32% metanolu (20000 ml) i 34% metanolu (20000 ml), a następnie regenerowano stosując 90% metanol (15000 ml). Eluaty 32% metanolu i 34% metanolu zebrano jako frakcje o objętości 600 ml, i czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 8 do 19 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia metanolu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (9,79 g). Czystość oznaczona metodą HPLC

PL 211 896 B1 wynosiła 73,1%. Próbkę rozpuszczono w 30% acetonie, ogrzewano w temperaturze refluksu 95°C przez 5 godzin, po czym zatężono do małej objętości w celu usunięcia acetonu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (9,7 g). Wydajność produktu wynosiła 0,70% surowej substancji leczniczej, a czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 93,9%.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie timosaponiny BII

Świeże kłącza Anemarrhena asphodeloldes Bunge (4 kg) pocięto na kawałki i wygotowano w 10 l wody przez 1 godzinę oraz przesą czono. Do pozostało ś ci dodano 8 l wody i gotowano przez 1 godzinę oraz przesączono. Przesącze połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 10 l, do której dodano etanol do końcowego stężenia 25%, uzyskując ekstrakt do następnego zastosowania. Wstępnie potraktowaną makroporowatą żywicę D101 (Tianjin Agrochemical Plant) umieszczono w kolumnie (6 l), którą zrównoważono stosując 25 etanol. Roztwór ekstraktu przesączono i przesącz poddano chromatografii na kolumnie. Następnie, kolumnę eluowano kolejno przy użyciu 3BV 25% etanolu, 3BV 35% etanolu i 3BV 90% etanolu. Wyniki badań wykazały, że timosaponinę BII zebrano głównie we frakcji 35% etanolu. Tę frakcję zatężono do małej objętości w celu usunięcia etanolu. Zatężony eluat poddano chromatografii na kolumnie ze wstępnie potraktowanym poliamidem (6 l, 30-60 mesh, Linjiang Reagent Chemical Plant) i eluowano stosując 5BV wody. Początkową frakcję zawierającą zabarwioną substancję odrzucono, zbierano frakcje eluatu po 600 ml i oznaczano metodą HPLC. Frakcje 8 do 24 połączono, zatężono i osuszono rozpryskowo z wytworzeniem surowej próbki timosaponiny BII (51 g). Około 40 g surowej próbki rozpuszczono w 200 ml 35% etanolu i poddano chromatografii na kolumnie Sephadex LH-20 (8,5 l), którą wstępnie zrównoważono 35% etanolem. Kolumnę eluowano 35% etanolem (50000 ml), a następnie regenerowano stosując 95% etanol (20000 ml). Eluat 35% etanolu zebrano jako frakcje o objętości 800 ml i czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 16 do 35 połączono, zatężono do małej objętości w celu usunięcia etanolu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (11,2 g). Wydajność produktu wynosiła 0,36% świeżych kłączy (co odpowiada wydajności 1,07% suchej substancji leczniczej), a czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 92,3%.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie timosaponiny BII

Włókniste korzenie Anemarrhena asphodeloldes Bunge (2 kg) pocięto i wygotowano w 16 l wody przez 1 godzinę oraz przesączono. Do pozostałości dodano 12 l wody i gotowano przez 1 godzinę oraz przesączono. Przesącze połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 12 l, do której dodano aceton do końcowego stężenia 15%, w celu późniejszego zastosowania. Wstępnie potraktowaną makroporowatą żywicę SP700 (Mitsubishi Co., Japan) umieszczono w kolumnie (6 l), którą zrównoważono stosując 15% aceton. Ekstrakt przesączono i przesącz poddano chromatografii na kolumnie. Następnie, kolumnę eluowano kolejno przy użyciu 3BV 25% acetonu, 3BV 35% acetonu i 3BV 80% acetonu. Wyniki badań wykazały, że timosaponinę BII zebrano głównie we frakcji 35% acetonu. Tę frakcję zatężono w celu usunięcia acetonu i osuszono rozpryskowo, uzyskując surową próbkę timosaponiny BII (45,0 g). Około 40 g surowej próbki rozpuszczono w 200 ml 10% acetonu i poddano chromatografii na kolumnie Sephadex LH-20 (8,5 l), którą wcześniej zrównoważono 10% acetonem. Kolumnę eluowano 10% acetonem (40000 ml), a następnie regenerowano stosując 80% aceton (20000 ml). Eluat 10% acetonu zebrano jako frakcje o objętości 800 ml i czystość każdej frakcji oznaczono metodą HPLC. Frakcje 20 do 36 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia acetonu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (9,2 g). Wydajność produktu wynosiła 0,52% korzennego materiału, a czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 91,7%.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie timosaponiny BII

Świeże kłącza Anemarrhena asphodeloldes Bunge (4 kg) pocięto na kawałki, do których dodano 8 l 50% etanolu. Lek utrzymywano w zanurzeniu przez 2 godziny i następnie ekstrahowano przez 0,5 godziny z zastosowaniem generatora ultradźwiękowego, po czym przesączono. Pozostałość podobnie ekstrahowano ultradźwiękowo jeszcze dwa razy. Etanolowe ekstrakty połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia etanolu do objętości 10 l. Wstępnie potraktowaną makroporowatą żywicę AB-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) umieszczono w kolumnie (6 l), którą zrównoważono wodą. Zatężony ekstrakt przesączono i przesącz poddano chromatografii na kolumnie i eluowano wodą w celu usunię cia zanieczyszczeń . Nastę pnie, kolumnę eluowano kolejno przy uż yciu 3BV 20% etanolu, 3BV 50% etanolu i 3BV 95% etanolu. Wyniki badań wykazały, że timosaponinę BII

PL 211 896 B1 zebrano głównie we frakcji 50% etanolu. Tę frakcję zatężono do małej objętości w celu usunięcia etanolu i następnie osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując próbkę surowej timosaponiny BII (59,3 g). 50 g surowej próbki rozpuszczono w 200 ml 25% acetonu i poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym RP-18 (6,5 l), którą wcześniej zrównoważono stosując 25% aceton. Kolumnę eluowano kolejno 28% acetonem (20000 ml) i 30% acetonem (20000 ml), a następnie regenerowano stosując 80% aceton (15000 ml). Eluaty 28% acetonu i 30% acetonu zebrano jako frakcje o objętości 600 ml i czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 6 do 25 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia acetonu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (15,6 g). 14,1 g próbki rozpuszczono w 70 ml 25% roztworu acetonu i poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym RP-18 (6,5 l), którą wcześniej zrównoważono stosując 25% aceton. Kolumnę eluowano 28% acetonem (40000 ml), a następnie regenerowano stosując 80% aceton (1200 ml). Eluat zebrano jako frakcje o objętości 600 ml i czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 8 do 19 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia acetonu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (4,5 g). Wydajność produktu wynosiła 0,15% świeżych kłączy (co odpowiada wydajności 0,44% w przeliczeniu na suchą substancję leczniczą), a czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 98,6%.

Produkt był białym bezpostaciowym proszkiem o temperaturze topnienia > 243°C (rozkład) i dawał wynik dodatni zarówno w reakcji Liebermann'a-Burchard'a jak i Molish'a, a także z odczynnikiem Ehrlich'a.

Budowę otrzymanej timosaponiny BII zidentyfikowano za pomocą IR, MS i NMR, następująco: IR (odbicie rozproszone) cm^-1: 3348 (OH), 2930, 2850, 1075, 1044 (wiązanie glikozydowe C-O).

FAB-MS (m/z): 943(M+Na)⁺, 903(M+H-H2O)⁺, 741(M+H-H2O-Glc)⁺, 579(M+H-H2O-Glc*2)⁺, 417(M+H-H2O-Glc*2-Gal)⁺, 399(aglikon+H-H2O*2)⁺, 255, 185, 145.

EI-MS(m/z): 740(M-H2O-GIc)⁺, 578(M-H2O-Glc*2)⁺, 416(aglikon-H2O)⁺, 415(aglikon-H-H2O)⁺, 357, 273, 217, 181, 139.

¹H-NMR(C5D5N) δ: 0,85(3H, S, 18-CH3), 0,96(3H, S, 19-CH3), 1,00(3H, d, J=6,4 Hz, 27-CH3), 1,30(3H, d, J=6,8 Hz, 21-CH3), 4,79(1H, d, J=7,8 Hz, Glc 1-H), 4,90(1H, d, J=7,8 Hz, Gal 1-H), 5,27 (1H, d, J=7,8 Hz, Glc 1-H).

Dane 13_C-NMR pokazano w tabeli 1. Związkiem był (25S)-26-O-e-glukopiranozylo-22-hydroksy-5e-furostano-3e, 26-diol-3-O-e-D-glukopiranozylo-(1->2)-p-D-galaktopiranozyd.

T a b e l a 1

Chemiczne przesunięcia 13C-NMR dla timosaponiny BII (δ w pirydynie-d5)

Pozycja (aglikon)	δc	Pozycja (glikozyl)	δc
1	2	3	4
1	30,9	gal-1	102,5
2	27,0	2	81,8
3	75,0	3	76,9
4	30,9	4	69,8
5	36,9	5	76,5
6	26,7	6	62,1
7	26,7	glc-1	106,1
8	35,4	2	75,5
9	40,2	3	78,0
10	35,2	4	71,4
11	21,1	5	78,4
12	40,4	6	62,7
13	41,2	26qlc-1	105,1
14	56,4	2	75,2
15	32,4	3	78,5

PL 211 896 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
16	81,2	4	71,6
17	64,0	5	78,4
18	16,7	6	62,7
19	24,0
20	40,6
21	16,4
22	110,6
23	37,1
24	28,3
25	34,4
26	75,3
27	17,4

P r z y k ł a d porównawczy 1

Wytwarzanie timosaponiny BII

Kawałki z wyciągu tradycyjnego chińskiego leku Rhizome Anemarrhenae (1 kg) zmielono i dodano do nich 6 l 60% etanolu. Lek utrzymywano w zanurzeniu przez jedną godzinę i następnie ekstrahowano w temperaturze refluksu przez jedną godzinę, po czym przesączono. Pozostałość ekstrahowano podobnie w temperaturze refluksu jeszcze dwa razy. Etanolowe ekstrakty połączono i zatężono w celu usunięcia etanolu pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 4 l. Do zatężonego roztworu dodano 4 l n-butanolu nasyconego wodą. Otrzymany roztwór mieszano homogenicznie przez wytrząsanie i pozostawiono na pewien czas do rozwarstwienia. Następnie, warstwę n-butanolu zebrano, a warstwę wodną podobnie ekstrahowano jeszcze 4 razy, dodając n-butanol nasycony wodą. Pięć ekstraktów n-butanolowych połączono i zatężono do suchej masy, uzyskując tym samym saponiny (33,1 g). Saponiny rozpuszczono w metanolu i mieszano z żelem krzemionkowym (60 g), po czym ogrzewano w celu odparowania rozpuszczalnika do suchej masy. Mieszaną próbkę poddano chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym (3 l) wprowadzonym metodą na sucho, oraz eluowano z zastosowaniem gradientu chloroform-metanol-woda. Eluat chlorofomu-metanolu-wody (60:40:10, niższa faza), zawierający timosaponinę BII, zebrano i zatężono do suchej masy, uzyskując tym samym surowy produkt (2,3 g). Surowy produkt poddano następnie chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym (500 ml) i eluowano układem chloroform-metanol-woda. Eluat chloroform-metanol-woda (65:35:10, niższa faza) zebrano jako frakcje o objętości 50 ml. Frakcje 15 do 23 zatężono do suchej masy, uzyskując tym samym produkt (0,67 g). Produkt rozpuszczono w 32% metanolu i poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym RP-18 (600 ml). Kolumnę eluowano kolejno przy użyciu 32% metanolu (1800 ml) i 34% metanolu (1800 ml), a następnie regenerowano stosując 90% metanol (1200 ml). Eluaty 32% metanolu i 34% metanolu zebrano jako frakcje o objętości 50 ml, a czystość każdej frakcji oznaczano metodą HPLC. Frakcje 13 do 21 połączono i zatężono do małej objętości w celu usunięcia metanolu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (0,34 g). Czystość oznaczona metodą HPLC wynosiła 75,5%. Produkt rozpuszczono w 30% acetonie, ogrzewano w temperaturze refluksu 95°C w łaźni wodnej przez 5 godzin oraz zatężono w celu usunięcia acetonu i następnie liofilizowano, uzyskując timosaponinę BII (0,33 g). Wydajność produktu wynosiła 0,033% surowej substancji leczniczej, a czystość wynosiła 93,4%.

Claims

1. Ulepszony sposób otrzymywania timosaponiny BII, znamienny tym, że

a) dostarcza się kawałki z wyciągu tradycyjnego chińskiego leku Rhizome Anemarrhenae lub świeżego kłącza lub korzenia Anemarrhena asphodeloides Bunge jako surowego materiału i ekstrahuje się z zastosowaniem rozpuszczalnika wybranego z grupy obejmującej wodę, aceton, etanol, propanol i mieszaninę co najmniej dwóch z nich;

PL 211 896 B1

b) oddziela się ekstrakt uzyskany według punktu a) z zastosowaniem jednej lub wię cej metod wybranych z grupy obejmującej adsorpcję na żywicy, chromatografię poliamidową, chromatografię kolumnową w fazie odwróconej i chromatografię na kolumnie Sephadex LH-20, oraz eluuje się z zastosowaniem eluentu wybranego z grupy obejmującej wodę, aceton, acetonitryl, etanol, propanol i mieszaninę co najmniej dwóch z nich;

c) łączy się eluenty uzyskane wedł ug punktu b) i suszy się otrzymują c timosaponinę BII.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję według punktu a) stanowi ekstrakcja w temperaturze pokojowej lub z ogrzewaniem, lub ekstrakcją ultradźwiękową, przy czym ekstrakcję można przeprowadzać jeden lub więcej razy,

3. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że ekstrakcję rozpuszczalnikową według punktu a) stanowi ekstrakcja przeprowadzona metodą wybraną z grupy obejmującej:

ekstrakcję w temperaturze refluksu, diakolacji lub ekstrakcji ultradź wię kowej z zastosowaniem 10 do 95% etanolu w wodzie; oraz ekstrakcję w temperaturze refluksu, diakolacji lub ekstrakcji ultradźwiękowej z zastosowaniem 10 do 80% aceton w wodzie, ekstrakcję po warzeniu surowego materiału w wodzie.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako żywicę absorpcyjną według punktu b), stosuje się makroporowatą żywicę typu polistyrenu, jako eluent stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmują cej wodę , aceton, etanol i propanol, oraz eluowanie moż na przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, ż e jako żywicę według punktu b) stosuje się żywicę adsorpcyjną typu D-101, żywicę adsorpcyjną typu AB-8, żywicę adsorpcyjną typu XAD-2, żywicę adsorpcyjną typu HP20, żywicę adsorpcyjną typu SP825, żywicę adsorpcyjną typu SP700, żywicę adsorpcyjną typu CHP-20P lub żywicę adsorpcyjną typu SP70.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że proces adsorpcji na żywicy obejmuje adsorpcję odwirowanego supernatantu lub przesączu ekstraktu rozpuszczalnikowego na makroporowatej żywicy, usuwanie zanieczyszczeń przez eluowanie wodą lub 5 do 20% acetonem, etanolem lub propanolem w wodzie w ilości 2 do 7 objętości kolumny, a następnie eluowanie 20 do 70% acetonem, etanolem lub propanolem w wodzie w ilości 2 do 7 objętości kolumny.

7. Sposób wytwarzania timosaponiny BII według zastrz. 1, znamienny tym, że chromatografię poliamidową według punktu b) przeprowadza się metodą chromatografii kolumnowej lub statycznej filtracji adsorpcyjnej, jako eluent stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej wodę, aceton, acetonitryl, etanol i propanol, oraz eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że chromatografię poliamidową według punktu b) przeprowadza się przez wprowadzenie wodnego roztworu timosaponiny BII do kolumny z poliamidem, a nastę pnie eluje się wodą lub 0 do 15% roztworem acetonu, etanolu lub propanolu w wodzie w iloś ci 2 do 7 obję toś ci kolumny.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że chromatografię kolumnową w fazie odwróconej przeprowadza się jako chromatografię kolumnową w fazie odwróconej pod ciśnieniem normalnym lub zwiększonym, jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy RP-18 (ODS) lub RP-8, stosuje się eluent wybrany z grupy obejmującej acetonitryl-wodę, aceton-wodę, etanol-wodę i propanol-wodę, oraz eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.

10. Sposób wytwarzania timosaponiny BII według zastrz. 1, znamienny tym, że chromatografię na kolumnie Sephadex LH-20 przeprowadza się jako chromatografię kolumnową pod ciśnieniem normalnym lub zwiększonym, stosuje się eluent wybrany z grupy obejmującej acetonitryl-wodę, acetonwodę, etanol-wodę i propanol-wodę, oraz eluowanie można przeprowadzać izokratycznie lub gradientowo.