CN105440098B - 一种制备知母皂苷n的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备知母皂苷N的方法，包括如下步骤：(1)以知母药材为原料，加入溶剂进行溶剂提取得到提取液；(2)将步骤(1)中得到的提取液预处理后，采用树脂吸附法、聚酰胺层析法、反相ODS柱层析法和Sephadex LH‑20柱层析法中的任意一种或至少两种进行组合的方式洗脱分离；(3)合并步骤(2)中的洗脱液，并进行干燥得到知母皂苷N。该发明中知母皂苷N的制备方法相对简单，所得知母皂苷N的得率与现有技术相比具有显著的提高，向工业化生产更迈进了一步。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物的制备方法，具体涉及一种从中药知母中提取分离的单体成分知母皂苷N的方法。
背景技术
知母皂苷N是中药材知母中的有效成分，其化合物分子式为C45H76O30，分子量为936，化学名为(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。结构为：
现有技术中，对于知母皂苷N的提取分离方法已有如下报道：马百平报道了知母皂苷N的分离过程(知母中的两种新呋甾皂苷，药学学报，2006，41(6)：527-532)，该方法先以溶剂提取，正丁醇萃取，再以两次大孔吸附树脂柱层析，所得的混合物需要用C18柱色谱反复分离、纯化，得知母皂苷N，该提取过程中3kg知母药材仅获得42mg知母皂苷N，得率仅为0.0014％。Yokosuka等只是在其文章(Steroidal glycosides from the undergroundparts of Yucca glauca and their cytotoxic activities.Phytochemistry.2014(101):109-115)中提到从植物丝兰中分离得到知母皂苷N，分离过程先以甲醇进行提取，再用大孔吸附树脂、硅胶柱层析、再用ODS、制备HPLC进行制备得到知母皂苷N，该提取过程中2kg知母药材仅获得19mg知母皂苷N，得率仅为0.00095％。
以上两种分离知母皂苷N方法过程繁琐，且所得产率极低，不能满足于工业上的应用。因此需要设计一种方法简单且得率稿的知母皂苷N提取方法。
发明内容
本发明的目的在于一种制备知母皂苷N的方法。该方法采用化学途径从中药知母中分离出单体成分-知母皂苷N。本发明制备方法相对简单，所得知母皂苷N的得率较高。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备知母皂苷N的方法，包括如下步骤：
(1)以知母药材为原料，加入溶剂进行溶剂提取得到提取液，所述的溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮和丙醇中的任意一种或至少两种的混合液；
(2)将步骤(1)中得到的提取液预处理后，采用树脂吸附法、聚酰胺层析法、反相ODS柱层析法和Sephadex LH-20柱层析法中的任意一种或至少两种进行组合的方式洗脱分离，洗脱分离过程中选用水、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇和丙醇中的任意一种或至少两种的混合液作为洗脱剂；
(3)合并步骤(2)中的洗脱液，并进行干燥得到知母皂苷N。
步骤(1)中所述的溶剂优选为水、丙酮水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液、甲醇水溶液或丙醇水溶液；进一步优选为水、丙酮水溶液或乙醇水溶液；所述溶剂提取的方式为回流、渗滤或超声提取。更进一步优选的，所述乙醇水溶液的体积百分含量为10％～95％，所述丙酮水溶液的体积百分含量为10％～95％。最优选的，所述乙醇水溶液的体积百分含量为70％～95％，所述丙酮水溶液的体积百分含量为50％～90％。
步骤(2)中采用树脂吸附法与聚酰胺层析法、反相ODS柱层析法和Sephadex LH-20柱层析法中的任意一种进行组合的方式洗脱分离；优选的，采用树脂吸附法与反相ODS柱层析法进行组合的方式洗脱分离。
所述树脂吸附法采用的树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂，洗脱剂为水、丙酮水溶液、乙醇水溶液和丙醇水溶液中的至少一种，所述洗脱的方式为等浓度洗脱或梯度洗脱。所述的聚苯乙烯型大孔吸附树脂优选为HPD-100型吸附树脂、AB-8型吸附树脂、D101型吸附树脂、XDA-5型吸附树脂、YWD01G3型吸附树脂、HPD300型吸附树脂、HPD722型吸附树脂、HP20型吸附树脂、SP850型吸附树脂、LX-6型吸附树脂或SP825型吸附树脂。
步骤(2)中所述预处理的方式为将提取液调整浓度后离心取上清液或过滤，所述的树脂吸附法为将提取液的离心上清液或过滤液通过大孔树脂吸附后加洗脱剂进行洗脱分离，所述洗脱分离的过程为：先用水洗脱除杂，再用5％～30％(v/v)的丙酮水溶液、乙醇水溶液或丙醇水溶液洗脱除杂，最后再用20％～95％(v/v)的丙酮水溶液、乙醇水溶液或丙醇水溶液洗脱。
优选的，所述洗脱分离的过程为：先用2～8BV的水洗脱除杂，再用2～8BV 10％～30％(v/v)的丙酮水溶液、乙醇水溶液或丙醇水溶液洗脱除杂，最后再用2～8BV 35％～95％(v/v)的丙酮水溶液、乙醇水溶液或丙醇水溶液洗脱。
进一步优选的，所述洗脱分离的过程为：依次用2～8BV的水、2～8BV的20％～30％乙醇洗脱除杂，再用2～8BV的40％～60％乙醇洗脱。更进一步优选为：依次用6BV的水、6BV的30％乙醇水溶液洗脱除杂，再用6BV的50％乙醇水溶液洗脱。
所述反相ODS柱层析法、聚酰胺层析法和Sephadex LH-20柱层析法的洗脱剂为含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇和含水甲醇中的至少一种，洗脱方式为等浓度洗脱或梯度洗脱。优选的，所述的洗脱剂为体积百分含量为20％～90％的含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇或含水甲醇。进一步优选，所述反相ODS柱层析法的洗脱剂为体积百分含量为30％～70％的含水丙酮或含水甲醇，其洗脱方式为等浓度洗脱。更进一步优选，洗脱剂为体积百分含量为50％的含水甲醇或40％的含水丙酮。洗脱剂用量一般为2～8倍柱体积。
所述预处理的最优选过程为将提取液的浓度调整为0.1g生药/mL，然后离心留上清或过滤。
本领域技术人员公知的，所述的聚酰胺层析法为常压或加压聚酰胺柱层析，所用的柱填料为十八烷基健合相或八烷基健合相。所述的Sephadex LH-20柱层析法为常压或加压柱层析，所用的柱填料为十八烷基健合相或八烷基健合相，所述反相ODS柱层析法为常压或加压反相柱层析，所用柱填料为十八烷基健合相或八烷基健合相。
本发明的有益效果：
该发明中知母皂苷N的制备方法相对简单，所得知母皂苷N的得率与现有技术相比具有显著的提高，向工业化生产更迈进了一步。
附图说明
图1为知母皂苷N的质谱图
图2为知母皂苷N的氢谱数据
图3为知母皂苷N的碳谱数据
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例1：知母皂苷N的提取分离方法I与鉴别
取知母药材2.0千克，以20升90％(v/v)乙醇回流提取三次，每次回流2小时，过滤，合并滤液。回收乙醇，减压浓缩至5L，再加水15L稀释浓缩液，至体积浓度为0.1g生药/mL，溶液进行过滤，滤液待上样。
将预先处理好的大孔吸附树脂HP20(北京绿百草科技发展有限公司)装柱(5L)，放置平衡后，滤液上样。
上样之后依次用6倍柱体积(6BV)的水洗脱除杂，用6BV的30％(v/v)乙醇洗脱除杂、用6BV的50％(v/v)乙醇洗脱，最后用3BV的95％(v/v)乙醇洗脱下柱，经检测知母皂苷N主要集中于50％(v/v)乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷N粗样品146g。
取粗样品其中140g溶解于200m1水溶液，通入50％(v/v)甲醇平衡好的ODS柱(5L)，用50％甲醇(20000m1)洗脱，收集洗脱液，每份1000mL,HPLC检测各份纯度，将8-15份合并，回收甲醇，浓缩至小体积，干燥得知母皂苷N 5.8g。产品收率为知母药材的0.29％，HPLC检测纯度为95％。
实施例2：知母皂苷N的提取分离方法II
取知母药材2.0千克，以20升70％(v/v)丙酮回流提取三次，每次回流2小时，过滤，合并滤液。回收乙醇，减压浓缩至5L，再加水15L稀释浓缩液，至体积浓度为0.1g生药/mL，溶液进行过滤，滤液待上样。
将预先处理好的大孔吸附树脂SP850(北京绿百草科技发展有限公司)装柱(5L)，放置平衡后，滤液上样。
上样之后依次用6倍柱体积(6BV)的水洗脱除杂，用6BV的30％(v/v)乙醇洗脱除杂、用6BV的50％(v/v)乙醇和3BV的95％(v/v)乙醇洗脱下柱，经检测知母皂苷N主要集中于50％乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷N粗样品142g。
取粗样品其中140g溶解于200m1水溶液，通入40％(v/v)丙酮平衡好的ODS柱(5L)，用40％丙酮(20000m1)洗脱，收集洗脱液，每份1000mL,HPLC检测各份纯度，将10-25份合并，回收丙酮，浓缩至小体积，干燥得知母皂苷N 5.2g。产品收率为知母药材的0.26％，HPLC检测纯度为96％。
实施例3：知母皂苷N的鉴别
知母皂苷N样品为白色无定形粉末，mp>250℃(dec)。Liebermann-Burchard反应和Molish反应呈阳性，对Ehrlich试剂亦呈阳性反应。
知母皂苷N的结构鉴定：利用质谱和核磁等手段进行了结构鉴定，结果如下：HR-ESI-MS(negative mode)m/z:935.4959[M-H]-(calcd.935.4852),1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ5.27(1H,d,J＝7.7Hz,Glc 1H),4.94(1H,d,J＝7.6Hz,gal 1-H),4.80(1H,d,J＝7.7Hz,Glc1-H),1.02(3H,d,J＝5.9Hz,27-CH3),0.95(3H,s,19-CH3),0.85(3H,s,).其中δ5.27(d,J＝7.7Hz,1H),4.94(d,J＝7.6Hz,1H),4.80(d,J＝7.7Hz,1H)为3个六碳糖端基质子的信号。13C-NMR中δ105.9，104.9，103.0，分别为3个六碳糖的端基碳的信号。δ110.4，是连有羟基的C-22的特征信号。以上数据与文献中知母皂苷N【知母中的两种新呋甾皂苷，药学学报，2006，41(6)：527-532】基本一致，碳谱数据见下表1。
表1 知母皂苷N的碳谱化学位移
| Position | 知母皂苷N | Position | 知母皂苷N |
| 1 | 40.1 | Gal’-1 | 103.0 |
| 2 | 67.0 | 2 | 81.4 |
| 3 | 81.6 | 3 | 75.0 |
| 4 | 31.5 | 4 | 69.5 |
| 5 | 36.3 | 5 | 76.7 |
| 6 | 26.0 | 6 | 61.8 |
| 7 | 26.5 | Glc”-1 | 105.9 |
| 8 | 35.3 | 2 | 76.7 |
| 9 | 40.4 | 3 | 77.8 |
| 10 | 36.9 | 4 | 71.4 |
| 11 | 21.0 | 5 | 78.3 |
| 12 | 40.3 | 6 | 62.5 |
| 13 | 40.9 | Glc”’-1 | 104.9 |
| 14 | 56.0 | 2 | 75.0 |
| 15 | 32.1 | 3 | 78.4 |
| 16 | 81.0 | 4 | 71.4 |
| 17 | 63.7 | 5 | 78.3 |
| 18 | 16.5 | 6 | 62.5 |
| 19 | 23.6 | ||
| 20 | 41.2 | ||
| 21 | 16.3 | ||
| 22 | 110.4 | ||
| 23 | 37.0 | ||
| 24 | 28.1 | ||
| 25 | 34.2 | ||
| 26 | 75.2 | ||
| 27 | 17.2 |
Claims (9)
1.一种制备知母皂苷N的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以知母药材为原料，加入溶剂进行溶剂提取得到提取液，所述的溶剂为丙酮水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液、甲醇水溶液或丙醇水溶液；
(2)将步骤(1)中得到的提取液预处理后，采用树脂吸附法与反相ODS柱层析法进行组合的方式洗脱分离，洗脱分离过程中，所述树脂吸附法的洗脱剂为水、丙酮水溶液、乙醇水溶液和丙醇水溶液中的至少一种；所述反相ODS柱层析法的洗脱剂为含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇和含水甲醇中的至少一种；
所述树脂吸附法采用的树脂为大孔吸附树脂HP20或大孔吸附树脂SP850；
所述预处理的方式为将提取液调整浓度后离心取上清液或过滤；
(3)合并步骤(2)中的洗脱液，并进行干燥得到知母皂苷N。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1) 中所述的溶剂为丙酮水溶液或乙醇水溶液；所述溶剂提取的方式为回流、渗滤或超声提取。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述乙醇水溶液的体积百分含量为10%~95%，所述丙酮水溶液的体积百分含量为10%~95%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述树脂吸附法的洗脱方式为等浓度洗脱或梯度洗脱。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的树脂吸附法为将提取液的离心上清液或过滤液通过大孔树脂吸附后加洗脱剂进行洗脱分离，所述洗脱分离的过程为：先用水洗脱除杂，再用5%~30%的丙酮水溶液、乙醇水溶液或丙醇水溶液洗脱除杂，最后再用20%~95%的丙酮水溶液、乙醇水溶液或丙醇水溶液洗脱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述洗脱分离的过程为：依次用2~8BV的水、2~8BV的30%乙醇水溶液洗脱除杂，再用2~8BV的50%乙醇水溶液洗脱。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反相ODS柱层析法的洗脱方式为等浓度洗脱或梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的洗脱剂为体积百分含量为20%~90%的含水乙腈、含水丙酮、含水乙醇或含水甲醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反相ODS柱层析法的洗脱剂为体积百分含量为30%~70%的含水丙酮或含水甲醇，其洗脱方式为等浓度洗脱。
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| CN1212966A (zh) * | 1997-09-26 | 1999-04-07 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 甾体皂甙防治老年性痴呆的用途及新的甾体皂甙 |
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Non-Patent Citations (2)
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| "Steroidal glycosides from the underground parts of Yucca glauca and their cytotoxic activities";Akihito Yokosuka，et al.;《Phytochemistry》;20140305;第101卷;109-115 * |
| "知母中的两种新呋甾皂苷";康利平等;《药学学报》;20061231;第41卷(第6期);527-532 * |
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