CN114621224B - 一种玛咖生物碱及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玛咖生物碱及其制备方法与应用，所述的生物碱是具有“1,3‑二氮杂二环[3.3.1]壬烷”骨架的新生物碱，是以十字花科独行菜属资源植物玛咖（植物拉丁名：Lepidium meyenii Walp.）的根为基本原料，经蒸煮炮制后，再经提取分离纯化等制备路线得到。其分子式为C14H16N2O4，分子量为276，该化合物的中文名为玛咖脲素A，英文名为macaniaosu A，其化学结构式为：。玛咖脲素A对两株人源肿瘤细胞株显示出弱的抑制作用。本发明所述的生物碱来源于天然药食两用植物，其结构未见文献报道，且具有潜在的抗肿瘤活性，可作为保健品及功能食品开发的先导化合物，有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药用植物中活性化学成分提取分离和结构鉴定的技术领域，具体涉及一种玛咖生物碱及其制备方法与应用。
背景技术
玛咖(其拉丁名为Lepidium meyeniiWalp) (Brassicaceae)，隶属于十字花科独行菜属1~2年生草本植物，原产于南美洲安第斯山区（海拔大于3500米），为当地常用的特色资源植物以及食用材料，有“秘鲁人参”和“南美人参”的美誉，普遍认为其具有抗疲劳以及提高两性生育能力的作用。由于玛咖营养成分丰富，富含蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、纤维素、维生素和矿物质，因而被联合国世界粮农组织推荐为可食用的安全食品，我国也于2011年5月将玛咖列入食品新资源目录中。现代药理活性研究表明，玛咖具有多种对人体健康有益的活性，如抗氧化、增强免疫力、抗癌、改善记忆力、调控荷尔蒙释放、以及降低血糖和血脂的功效，进一步研究表明，玛咖的一些生物活性与其脂溶性化学成分有直接关系，如玛咖烯、玛咖酰胺、咪唑生物碱、芥子油苷、甾醇和类固醇。早期的研究者从玛卡中发现其含有两类特殊的天然活性成份：玛卡酰胺（macamides）和玛卡烯（macaenes）。Wu H等人运用合成的方法对部分玛咖酰胺类生物碱的抗脂肪酰胺水解酶（FAAH）活性进行了初步探讨，除特征成分玛卡酰胺和玛卡烯外，研究人员还从玛咖中得到了一系列的新颖的生物碱类化合物，并完成了多个分子的全合成研究。Zheng等人从秘鲁产的玛咖中分离得到一类新颖的咪唑类生物碱lepidilines A和B，该类化合物的结构由X-单晶衍射法确定，该类化合物表现出一定的抗肿瘤活性，鉴于该类化合物具有新颖的结构和潜在的药理活性，Wolkenberg S. E.等人以2,3-二羰基丁烷和乙醛作为反应起始原料，用醋酸和醋酸胺催化，经微波反应5分钟后得到高产量的2,4,5-三取代咪唑，通过进一步与苄基氯微波反应5分钟，完成了lepidiline B的全合成，总产率达43%。目前云南的玛咖产量占中国的90%以上，占世界的70%，大多分布在中国云南丽江及香格里拉地区（海拔大于3500至2800米），该植物誉为“秘鲁人参”，并被广泛种植，年产量超过3万吨，与此同时，在云南会泽、昭通、玉溪等地区，玛咖亦被广泛种植。然而，同一特色资源植物在不同的产地，其成分存在较大的差异，中国引种的玛咖其药理活性研究基本停留在提取物的活性评价阶段，并未开展系统的物质基础和药效成分研究，其安全性和有效性都亟待阐明。本方法是针对玛咖空白领域开展的相关研究，首次从中发现了一个新颖的且具有潜在应用价值的生物碱类化合物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种玛咖生物碱；第二目的在于提供所述的生物碱的制备方法；第三目的在于提供所述的生物碱的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的生物碱是具有1,3-二氮杂二环[3.3.1]壬烷骨架的氧化度较高的生物碱，是以十字花科独行菜属特色资源植物玛咖（拉丁名：Lepidium meyeniiWalp.）的根为基本原料，经蒸煮炮制后，再经提取分离纯化等制备路线得到。其分子式为C14H16N2O4，分子量为276，该化合物的中文名为玛咖脲素A，英文名为macaniaosu A，该化合物的系统命名为：3-benzyl-2,4-dioxo-1,3-diazabicyclo[3.3.1]nonane1,3-dioxide，其化学结构式为：
。
本发明的第二目的是这样实现的，是以十字花科独行菜属特色资源植物玛咖（拉丁名：Lepidium meyeniiWalp.）的根为基本原料，经蒸制、提取、萃取、MCI脱色素处理、正相柱色谱法划段、色谱富集、色谱纯化和高效液相制备半制备等步骤制备得到，具体包括：
A、蒸制：将十字花科独行菜属特色资源植物玛咖（拉丁名：Lepidium meyeniiWalp.）的根（干燥或新鲜）高温100~150摄氏度湿法蒸制，后样品自然晾干，然后样品粉碎后过10~100目筛，得到物料a。
B、提取：物料a重量3~8倍的有机溶剂冷浸并超声提取2~5次，每次1~3h，提取液经抽滤得到滤液，蒸馏浓缩得到玛咖浸膏b；
C、萃取；向浸膏b中加入浸膏b重量1~3倍的水，搅拌得到悬浊液，用与水等体积且与水不混溶的有机溶剂萃取2~5次，合并有机溶剂的萃取相，减压浓缩得到浸膏c；
D、MCI脱色素处理：将浸膏c用其重量2~5倍的甲醇-水混合溶剂溶解，使用MCI柱层析纯化，用体积百分浓度为80%~90%的甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到浸膏d；
E、正相柱色谱法划段：将浸膏d用浸膏d重量2~3倍的甲醇或丙酮溶解，用浸膏d重量1~3倍的80~100目或者200~300目的硅胶拌样，使用正相柱色谱法进行纯化，用浸膏d重量5~10倍量的100~200目硅胶装柱，用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集洗脱液并浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到含有玛咖脲素A的混合物e；
F、制备和半制备高效液相色谱富集：混合物e经过制备高效液相色谱，以体积百分浓度40%~90%甲醇溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈溶液洗脱得到玛咖脲素A粗品，再经半制备高效液相色谱分离纯化得到玛咖脲素A纯品（纯度90%以上）。
附图说明
图1为化合物玛咖脲素A的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图2为化合物玛咖脲素A的核磁共振DEPT谱（DEPT）。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的生物碱是具有1,3-二氮杂二环[3.3.1]壬烷骨架的新生物碱，是以十字花科独行菜属特色资源植物玛咖（拉丁名：Lepidium meyeniiWalp.）的蒸制根为基本原料制备得到，其分子式为C14H16N2O4，该化合物的中文名为玛咖脲素A，英文名为macaniaosu A，分子量为276，该化合物的系统命名为：3-benzyl-2,4-dioxo-1,3-diazabicyclo[3.3.1]nonane1,3-dioxide，其化学结构式为：
。
本发明所述的生物碱的制备方法，是以十字花科独行菜属特色资源植物玛咖（拉丁名：Lepidium meyeniiWalp.）的根为基本原料，经蒸制、提取、萃取、MCI脱色素处理、正相柱色谱法划段、色谱富集、色谱纯化步骤制备得到，具体包括：
A、蒸制：将十字花科独行菜属特色资源植物玛咖（拉丁名：Lepidium meyeniiWalp.）的根（干燥或新鲜）高温100~150摄氏度湿法蒸制，后样品自然晾干，然后样品粉碎后过10~100目筛，得到物料a。
B、提取：物料a重量3~8倍的有机溶剂冷浸并超声提取2~5次，每次1~3h，所得提取溶剂用抽滤瓶减压抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压蒸馏，浓缩提取液，得到玛咖浸膏b；
C、萃取；向浸膏b中加入浸膏b重量1~3倍的水，充分搅拌得到悬浊液，用与水等体积且与水不混溶的有机溶剂萃取2~5次，合并有机溶剂的萃取相，减压浓缩得到浸膏c；
D、MCI脱色素处理：将浸膏c用其重量2~5倍的甲醇-水混合溶剂溶解，使用MCI柱层析纯化，用体积百分浓度为80%~90%的甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到浸膏d；
E、正相柱色谱法划段：将浸膏d用浸膏d重量2~3倍的甲醇或丙酮溶解，用浸膏d重量1~3倍的80~100目或者200~300目的硅胶拌样，使用正相柱色谱法进行纯化，用浸膏d重量5~10倍量的100~200目硅胶装柱，用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集洗脱液并浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到低纯度含有玛咖脲素A的混合物e；
F、制备和半制备高效液相色谱富集：混合物e经过制备高效液相色谱，以体积百分浓度40%~90%甲醇溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈溶液洗脱得到玛咖脲素A粗品，纯度为40%~60%，再经半制备高效液相色谱分离纯化得到玛咖脲素A纯品（纯度90%以上）。
优选的，B步骤中所述的有机溶剂为50%~100%的丙酮、80%~100%的乙醇、80%~100%的乙酸乙酯或80%~100%的甲醇。
优选的，C步骤中所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、环己烷或石油醚。
优选的，D步骤中所述的甲醇-水混合溶剂的体积百分浓度为80%。
优选的，E步骤中所述的混合有机溶剂为氯仿-丙酮，其体积配比为10:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
优选的，F步骤中所述的制备高效液相色谱富集是以体积百分浓度40%~90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈水溶液为流动相，流速为10~14mL/min，以ZorbaxPrepHT GF（5μm，21.2×250mm）反相制备柱为固定相，紫外检测器的检测波长为203nm和306nm，每次进样量为10~1000μL，收集10~25min范围内的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A粗品。所述的半制备高效液相色谱纯化是以体积百分浓度40%~90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈水溶液为流动相，流速为1~4mL/min，以 Zorbax SB-C18（10μm，9.4×250mm）反相半制备柱为固定相，DAD检测器的检测波长为203nm、220nm、254nm、265nm和306nm，每次进样量为1~100μL，收集10~25min范围内的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A纯品。
本发明所述的十字花科独行菜属特色资源植物玛咖 (Lepidium meyeniiWalp.)，不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
取自然风干的产自云南丽江的独行菜属植物玛咖 (Lepidium meyeniiWalp.) 的根50kg，纱布包裹后再高压锅中加水120摄氏度蒸制2小时，样品自然晾干后得到物料(a)，粗粉碎至50目，用70%的丙酮水溶液冷浸并超声提取3次，每次60min，提取液减压抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至无丙酮的混悬液；静置，滤除沉淀物，浓缩成10kg浸膏(b)；向浸膏(b)中加入20kg水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩，得到500g浸膏(c)；将浸膏(c)用MCI装柱，向浸膏(c)中加入1000g的80%甲醇和水的混合溶剂溶解，拌样后上柱，用90%的甲醇水溶液8~10L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到400g浸膏(d)；向浸膏(d)中加入900g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶600g拌样，拌样后上柱，用200目硅胶4000g装柱，用体积比分别为10:1，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，梯度洗脱液、收集并浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到6个部分，其中，第二部分（由体积比为9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液所得）得样品35g，再重复正相柱色谱法，用体积比分别为10:1，8:1，5:1，2:1，0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，梯度洗脱液、收集并浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到五个部分，其中第四部分，即2:1部分约为24g，即为玛咖脲素A的混合物(e)，混合物(e)再以50%的甲醇为流动相，流速为12mL/min，以Zorbax PrepHT GF（5μm，21.2×250mm）反相制备柱为固定相，紫外检测器的检测波长为203nm和306nm，每次进样量为100μL，收集10~20min范围内的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A粗品500mg。玛咖脲素A粗品再经半制备高效液相色谱分离纯化，以85%的甲醇水溶液为流动相，流速为3mL/min，以Zorbax SB-C18（10μm，9.4×250mm）反相半制备柱为固定相，DAD检测器的检测波长为203nm、220nm、254nm、265nm和306nm，每次进样量为35μL，收集12.5min的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A纯品155mg，纯度为95%。
实施例2
取新鲜的产自云南玉溪的独行菜属植物玛咖 (Lepidium meyeniiWalp.) 的根茎20kg，纱布包裹后再高压锅中加水120摄氏度蒸制2小时，样品自然晾干后得到物料(a)，粗粉碎至20目，用80%的甲醇超声提取5次，每次80min，提取液减压抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至滤液体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩，得到1kg浸膏(b)；向浸膏(b中加入2kg水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩，得到50g浸膏(c)；将浸膏(c)用MCI装柱，向浸膏(c)中加入100g的80%甲醇和水的混合溶剂溶解，然后上柱，用80%的甲醇水3~5L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到40g浸膏(d)；向浸膏(d)中加入100g的丙酮，溶解，然后加入80目硅胶60g拌样，拌样后上柱，用200目硅胶400g装柱，然后用体积比分别为10:1，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，梯度洗脱液、收集和浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到6个部分，其中，第二部分（由体积比为9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液所得）得样品7g，再重复正相柱色谱法，用体积比分别为10:1，8:1，5:1，2:1，0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，梯度洗脱液、收集和浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到五个部分，其中第四部分，即2:1部分约为2g，即为玛咖脲素A的混合物(e)，再以40%的甲醇为流动相，流速为12mL/min，以Zorbax PrepHT GF（5μm，21.2×250mm）反相制备柱为固定相，紫外检测器的检测波长为203nm和306nm，每次进样量为80μL，收集10~20min范围内的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A粗品60mg；将玛咖脲素A粗品再经半制备高效液相色谱分离纯化，以80%的甲醇水溶液为流动相，流速为3mL/min，以ZorbaxSB-C18（10μm，9.4× 250mm）反相半制备柱为固定相，DAD检测器的检测波长为203nm、220nm、254nm、265nm和306nm，每次进样量为35μL，收集18min的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A纯品30mg，纯度为95%。
实施例3
取实施例1和2制备的玛咖脲素A，为无色油状化合物，用核磁共振，结合紫外光谱、红外光谱、常规及高分辨质谱等鉴定技术鉴定其结构，具体数据为：
（1）紫外光谱（溶剂为甲醇）λ max(logε）：202 (0.56)和255 (0.28)。
（2）红外光谱（溴化钾压片）νmax：3430，2945，1710，1456，1333，1120，998 cm-1。
（3）HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 299 [M+Na]+；HRESIMS (正离子模式) m/z 299.1010 [M+Na]+(计算值299.1002，C14H16N2O4Na+) ；1H和13C NMR谱（图1和图2）给出其分子式为C14H16N2O4。
（4）1H NMR（CDCl3，400MHz）和13C NMR（CDCl3，100MHz）数据：1H NMR (CDCl3，100MHz)：δ H7.38−7.24 (m，5H，H-3a−7a)，4.99 (s，2H，H2-1a)，3.86−3.12 (m，2H，H2-7)，3.56−3.04 (m，2H，H2-9)，2.73(s，1H，H-4)，2.13−1.98(m，2H，H2-5)，1.74−1.59(m，2H，H2-6)；13C NMR（CDCl3，100MHz）：δ C161.0 (s，C-1)，174.3 (s，C-3)，38.5 (d，C-4)，25.8(t，C-5)，21.5 (t，C-6)，52.4(t，C-7)，48.7(t，C-9)，43.6(t，C-1a)，137.4(s，C-2a)，128.4 (d，C-3a)，128.5(d，C-4a)，127.4(d，C-5a)，128.5(d，C-6a)，128.4 (d，C-7a)。
结构解析过程：玛咖脲素A的DEPT NMR谱(图2)和1H NMR谱(图1)显示了14个碳信号和16个氢信号。这些信号中有一个典型的苄基（benzyl）的单取代基信号，是由一个亚甲基δ H4.99 (s，2H，H2-1a) 以及一个单取代苯环δ H7.38−7.24 (m，5H，H-3a−7a) 构成。其它7个碳原子属于骨架上的信号，包括了四个典型的亚甲基信号δ C25.8(t，C-5)，21.5(t，C-6)，52.4(t，C-7)，48.7(t，C-9)，一个次甲基碳信号δ C38.5 (d，C-4)，两个酯基信号δ C174.3 (s，C-3)和161.0 (s，C-1)，其相应的氢谱数据分别为：3.86−3.12 (m，2H，H2-7)，3.56−3.04(m，2H，H2-9)，2.73(s，1H，H-4)，2.13−1.98(m，2H，H2-5)和1.74−1.59(m，2H，H2-6)。结合二维核磁共振，确定这7个碳原子与杂原子构成两个杂环，其中C-1，N-2，C-3，C-4，C-9和N-8构成一个hexahydropyrimidine片段，而C-4，C-5，C-6，C-7，C-9和N-8则构成piperidine片段，这两个片段构成一个罕见的1,3-二氮杂二环[3.3.1]壬烷母核，其中，C-1和C-3羰基化。目前只报道了两个类似骨架的化合物，最后母核1,3-diazabicyclo[3.3.1]nonane与benzyl的取代基的连接顺序通过关键的H2-1a 与C-1/C-3的HMBC相关确定，以上平面结构结合分子式C14H16N2O4可以推测出还有两个氧只能分别连接在N-2和N-8上。因此，该生物碱的平面结构得以确定，该结构未见文献报道，为一个新的天然产物，中文命名为玛咖脲素A，英文名为macaniaosu A，分子量为276，该化合物的系统命名为：3-benzyl-2,4-dioxo-1,3-diazabicyclo[3.3.1]nonane1,3-dioxide。
实施例4
取实施例1或者2制备的玛咖生物碱玛咖脲素A，分别按实施例3中的方法进行结构测定，对所得的玛咖脲素A进行体外抗肿瘤活性测试，试验情况如下：
五株细胞株分别为早幼细胞(HL-60)株、肺癌细胞(A549)株、人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)株、前列腺癌细胞(PC3)株和乳腺癌细胞(MCF7)株，均由中国科学院上海药物研究所提供。
以上细胞与不同浓度化合物温育72小时，每株细胞的实验均重复一次，用两次实验的结果进行数据处理，采用改良MTT法评价化合物对细胞增殖的抑制程度，计算抑制率，根据抑制率采用Logit方法计算IC50，比较化合物的体外抗肿瘤活性。
细胞的增殖抑制率=(空白对照OD值-加药孔的OD值)/空白对照OD值×100%。
方法为改良MTT法，具体方法为：
取对数生长期的悬浮细胞，将细胞浓度调整为4×104mol/mL，加入96孔培养板，90µL/孔。阳性对照为顺铂，用生理盐水溶解。每孔分别加入10μL不同浓度的样品(1号试液~5号试液)。加样组及对照组均设4个复孔，加样组、阳性对照组的高浓度组还设有培养基的加药平行孔，每块板均设有4个空白对照孔 (仅加培养基)。样品的终浓度分别为10-2、10-1、1、10及102µg/mL，相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。当样品在终浓度102µg/mL时，用0.1%DMSO作为溶剂对照，其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10-1、1、10µg/mL。细胞在37℃，5% CO2培养箱中分别孵育48小时后，加入MTT (5 mg/ml，Sigma)，10 µL/孔。继续培养4小时后，加入三联液 [10% SDS-5%异丁醇-0.012mol/L HCL (w/v/v)]，100 µL/孔，放置过夜后用酶标仪在570 nm、630 nm双波长下测定各孔的OD值。
实验结果表明：经对早幼HL-60细胞株、肺腺癌A549细胞株、人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人乳腺癌MCF7细胞株的细胞毒活性实验，其对早幼HL-60细胞株和肺腺癌A549细胞株具有一定的细胞毒活性，IC50值分别为20.62和31.55μM。对人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人乳腺癌MCF7细胞株的抑制活性较弱，均大于40μM。
Claims (4)
1.一种玛咖生物碱，其特征在于所述生物碱是具有1,3-二氮杂二环[3.3.1]壬烷骨架的生物碱，是以十字花科独行菜属植物玛咖的根为基本原料，经蒸煮炮制后，再经提取分离纯化得到；其分子式为C14H16N2O4，分子量为276，命名为玛咖脲素A，其化学结构式为：
。
2.一种根据权利要求1所述的玛咖生物碱的制备方法，其特征在于是以十字花科独行菜属植物玛咖的根为基本原料，经样品蒸制、提取、萃取、MCI脱色素处理、正相柱色谱法划段、制备和半制备高效液相色谱富集的步骤制备得到，具体包括：
A、蒸制：将十字花科独行菜属植物玛咖干燥或新鲜的根经高温100~150摄氏度湿法蒸制，后样品自然晾干，然后样品粉碎后过10~100目筛，得到物料a；
B、提取：物料a重量3~8倍的有机溶剂冷浸并超声提取2~5次，每次1~3h，提取液经抽滤得到滤液，蒸馏浓缩得到玛咖浸膏b；所述的有机溶剂为50%~100%的丙酮、80%~100%的乙醇、80%~100%的乙酸乙酯或80%~100%的甲醇；
C、萃取；向浸膏b中加入浸膏b重量1~3倍的水，搅拌得到悬浊液，用与水等体积且与水不混溶的有机溶剂萃取2~5次，合并有机溶剂的萃取相，减压浓缩得到浸膏c；所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、环己烷或石油醚；
D、MCI脱色素处理：将浸膏c用其重量2~5倍的甲醇-水混合溶剂溶解，使用MCI柱层析纯化，用体积百分浓度为80%~90%的甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到浸膏d；
E、正相柱色谱法划段：将浸膏d用浸膏d重量2~3倍的甲醇或丙酮溶解，用浸膏d重量1~3倍的80~100目或者200~300目的硅胶拌样，使用正相柱色谱法进行纯化，用浸膏d重量5~10倍量的100~200目硅胶装柱，用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集洗脱液并浓缩，经硅胶薄层层析检测，合并显色和分离系数相同的点，得到含有玛咖脲素A的混合物e；所述的混合有机溶剂为氯仿-丙酮，其体积配比为10:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5；
F、制备和半制备高效液相色谱富集：混合物e经过制备高效液相色谱，以体积百分浓度40%~90%甲醇溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈溶液洗脱得到玛咖脲素A粗品，再经半制备高效液相色谱分离纯化得到玛咖脲素A纯品；所述的半制备高效液相色谱纯化是以体积百分浓度40%~90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈水溶液为流动相，流速为1~4mL/min，以10μm，9.4×250mm的 Zorbax SB-C18反相半制备柱为固定相，DAD检测器的检测波长为203nm、220nm、254nm、265nm和306nm，每次进样量为1~100μL，收集10~25min范围内的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A纯品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的甲醇-水混合溶剂的体积百分浓度为80%。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于F步骤中所述的制备高效液相色谱富集是以体积百分浓度40%~90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30%~80%的乙腈水溶液为流动相，流速为10~14mL/min，以5μm，21.2×250mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器的检测波长为203nm和306nm，每次进样量为10~1000μL，收集10~25min范围内的色谱峰，以相同步骤多次累加后，用旋转蒸发仪蒸干，即得所述的玛咖脲素A粗品。
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