CN101205249B - 从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元(laxogenin)的方法。对黑刺菝葜利用溶剂提取，提取物溶于水，依次用弱极性和中极性有机溶剂及与水不互溶的C_4～10低碳醇溶剂萃取得萃取物。两种途径获得纯品皂苷元：一是取弱极性或中极性溶剂萃取物经非极性或弱极性大孔树脂分离，分离物经SephadexLH-20纯化，干燥得拉肖皂苷元；另一种方法是取低碳醇萃取物，经弱极性或极性大孔树脂制备总皂苷，总皂苷中加入稀酸水解，再用弱极性溶剂萃取，干燥得拉肖皂苷元。本法制备拉肖皂苷元，工艺简单，技术易掌握，能耗小，提取率高，纯度好，生产成本低，为开发治疗心血管和抗肿瘤药物、植物激素产品及化学合成提供原料。

Description

从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法

技术领域

本发明涉及一种从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元(laxogenin)的方法，属于天然产物领域。

背景技术

黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis C.H.Wright)又名短梗菝葜，是菝葜科菝葜属植物，生于低山灌丛或山谷河岸，主产于陕西、甘肃各省，广泛分布于北方地区，资源十分丰富。其根茎在我国北方代替威灵仙入药，商品上称为“铁丝威灵仙”、“金刚刺”、“金刚藤”等。具除风湿、活血解毒、镇惊息风和抗癌等功效，临床上用于治疗风湿性腰腿病、小儿惊风肠炎、瘰疬，疮疖、癌肿等病症。在对黑刺菝葜进行系统的化学成分分离研究中发现，黑刺菝葜主要的化学成分为含拉肖皂苷元的甾体皂苷，是制备拉肖皂苷元极好的植物资源。

拉肖皂苷元[(25R)-3β-Hydroxy-5α-spirostan-6-one]，英文名为Laxogenin，是一种非常重要的具有多种用途的甾体皂苷元。

(1)拉肖皂苷元具有显著的药理活性，是一种治疗心血管疾病和抗肿瘤药物的生理活性物质：①强烈的抑制二磷酸腺苷及血小板活化因子诱导的血小板聚集活性(何祥久等，药学学报，2003，38(6)：433-437)。②显著的抑制cAMP磷酸二脂酶的活性(Mimaki Y等，phytochemistry，1993，34：799)。③在体外及肺癌体内二阶段癌发实验中，对癌发促进剂显示了强烈的抑制活性(松田匡由等，日木生药学会第41回年会讲演要旨集，2A-5(1994，日本扎幌)。

(2)拉肖皂苷元是一种天然茶甾酮型油菜素内酯类植物激素。在极低浓度下，具有强烈促进植物生长和种子萌发的作用(Martín A等.J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，2001，261-266；K.Wada等，Agric.Biol.Chem.，1984，48，719.)

(3)拉肖皂苷元还是一种合成薤白皂苷1和合成油菜素甾醇类植物激素类似物的重要原料(Biao Yu等，J.Org.Chem.，2002，67(25)，9099-9102；Martín A等.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2001，261-266)。

然而拉肖皂苷元是一种稀有甾体皂苷元，仅在几个植物中发现含拉肖皂苷元的甾体皂苷，只从华东菝葜(Smilax sieboldi)和薤(Allium chinensis)中分离出单体游离拉肖皂苷元，拉肖皂苷元多以糖苷的形式存在。由于资源和含量限制，目前较多量的拉肖皂苷元一般是通过薯蓣皂苷元经过多步化学反应合成获取(Martín A等，J.Braz.Chem.Soc.，2005.16(3A)：381-385)。化学合成拉肖皂苷元技术复杂，产率低，生长成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法，其特征在于，按下列步骤进行：

对干燥粉碎处理黑刺菝葜植物材料利用溶剂提取，所述的溶剂为乙醇、甲醇、丙酮和水以不同比例组成，材料与提取溶剂的重量比为1∶5～20，提取温度为10℃～100℃，每次提取时间为0.5～5h，提取2～5次，提取液浓缩后得浓缩液或浸膏；

将浓缩液或浸膏溶于水，用弱极性或中等极性的有机溶剂作为萃取剂萃取，所述的弱极性和中等极性的有机溶剂萃取剂为石油醚、环己烷、正己烷、氯仿或乙酸乙酯；萃取后的水相再用与水不互溶C_4～10的低碳醇类溶剂作为萃取剂进行萃取，所述的与水不互溶C_4～10的低碳醇类萃取剂为正丁醇、1-戊醇、环戊醇、环己醇或异辛醇，分别浓缩回收溶剂，得萃取浸膏；

拉肖皂苷元通过以下两个途径获取：

第一种途径是：取弱极性或中等极性有机萃取剂的萃取物，选择非极性或弱极性大孔树脂进行纯化，用醇水体系洗脱剂洗脱，洗脱液浓缩后，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化，氯仿-甲醇溶剂系统洗脱剂洗脱得拉肖皂苷元；

第二种途径是：取与水不互溶C_4～10的低碳醇类萃取剂的萃取浸膏，选择弱极性或极性大孔树脂分离纯化，用醇水体系洗脱剂洗脱，洗脱液浓缩后制备得含拉肖皂苷元的总甾体皂苷，在总甾体皂苷中加入含有助溶剂的稀酸溶液水解，其加入量为总甾体皂苷量的0.5～15倍，水解温度为20℃～100℃，水解时间为0.5～6h，浓缩除去反应液中有机溶剂，再用与水不相混溶的弱极性有机溶剂萃取皂苷元，回收溶剂，干燥得到拉肖皂苷元。

本发明具体包括下列步骤：

1.原料选择

以黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis C.H.Wright)植物的地下部分的块根、须根和根茎及地上部分的茎、卷须和叶子等为提取材料。

2.原料处理

去除原料中杂物，通风处阴干，或100℃以下低温烘干，粉碎成粗粉，干燥保存待用。

3.拉肖皂苷元的提取

取粉碎干燥的黑刺菝葜原料，加入乙醇、甲醇、丙酮和水以不同比例组成的溶剂浸提或回流提取，材料与提取溶剂的重量比为1∶5～20，提取温度为10℃～100℃，每次提取时间为0.5～5h，提取2～5次，合并提取液。提取液浓缩后得浓缩液或浸膏，将浓缩液或浸膏溶于水，用弱极性或中等极性的有机萃取剂如石油醚、环己烷、正己烷、氯仿或乙酸乙酯等萃取，萃取后的水相再用与水不互溶C_4～10的低碳醇类萃取剂如正丁醇、1-戊醇、环戊醇、环己醇或异辛醇等萃取，分别浓缩回收溶剂，得萃取浸膏。

4.拉肖皂苷元的分离和纯化

纯品拉肖皂苷元可通过以下两个途径获取：

(1)纯化弱极性或中等极性的有机溶剂萃取物，分离得拉肖皂苷元

取上述弱极性或中等极性的有机溶剂如氯仿或乙酸乙酯萃取物，选择非极性或弱极性大孔树脂如HP-20、D-101、XDA-1、AB-8型等树脂纯化，先用水洗柱，再用醇水体系洗脱剂洗脱，洗脱液浓缩后，经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20柱纯化，氯仿-甲醇溶剂系统洗脱剂洗脱得拉肖皂苷元。

(2)纯化醇萃取物得含拉肖皂苷元的总皂苷，水解总皂苷制备拉肖皂苷元

取与水不互溶C_4～10的低碳醇类萃取剂的萃取浸膏，如正丁醇萃取浸膏，选择弱极性或极性大孔树脂如D101、AB-8、NKA-9型等大孔树脂分离纯化，先用水洗柱，再用醇水体系洗脱剂洗脱，洗脱液浓缩后制备得含拉肖皂苷元的总皂苷。

总皂苷中加入0.5～15倍量(g/mL)的浓度在0.5～8mol/L硫酸、盐酸、甲酸或醋酸等酸水溶液，酸水溶液中可加入甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等助溶剂，20～100℃水浴回流水解0.5～6h，反应液冷却后，减压浓缩除去溶剂，再用与水不相混溶的弱极性有机溶剂，如环己烷、苯、二氯乙烷或氯仿等从水解液中萃取皂苷元，回收溶剂，干燥得拉肖皂苷元。

本发明提供的方法与化学合成拉肖皂苷元技术相比，制备工艺简单，制作方便，技术易掌握，能耗小，主要以醇-水体系为溶剂，无环境污染，萃取剂和洗脱剂都可回收，循环使用，提取率高，生产成本低。生产的拉肖皂苷元可用于开发治疗心血管和抗肿瘤等药物及植物激素产品，也可作为化学合成的原料。

具体实施例1

取黑刺菝葜地下根茎1kg，干燥，研磨成粗粉，加入4L 70％乙醇(V/V)溶液室温浸提4次，每次4h，合并提取液，将滤液浓缩成浸膏，将其悬浮于水，依次用等体积的石油醚、正丁醇分别萃取5次，分别减压回收溶剂得萃取物。正丁醇萃取物用去离子水溶解，按照样品与填料1∶7比例在D-101型大孔树脂上纯化，先用去离子水洗脱除杂，直至α-萘酚反应检测洗脱液成阴性为止，然后用30％乙醇洗脱，收集该乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥得含拉索皂苷元的总皂苷2.4g。将总皂苷溶解在12mL，浓度为2mol/LHCI(MeOH∶H₂O＝1∶1)溶液中，90℃热水浴回流水解2h，反应液冷却后，减压浓缩除去甲醇，再用氯仿萃取，回收溶剂，N₂干燥得拉肖皂苷元1.2g，纯度97％。

具体实施例2

取粉碎干燥的黑刺菝葜块根1kg，加入5L甲醇溶剂，60℃水浴回流提取3次，每次3h，提取3次，合并提取液，将浸膏用去离子水溶解，在DIAIONHP-20大孔树脂上进行纯化，按照样品与填料1∶6比例上样，装柱，70％甲醇(V/V)溶液洗脱除杂后，收集80％甲醇洗脱液，干燥得2.8g总皂苷。将总皂苷溶解在15mL，浓度为1mol/L H₂SO₄(MeOH∶H₂O＝1∶1)溶液中，80℃热水浴回流水解1h，反应液冷却后，减压浓缩除去甲醇，再用环己烷萃取，回收溶剂，N₂干燥得拉肖皂苷元1.4g，纯度96.6％。

具体实施例3

取粉碎干燥的黑刺菝葜茎1kg，加入4L丙酮，65℃水浴加热回流提取3次，每次2h，共提取3次，合并提取液，减压回收丙酮，浓缩成浸膏，将浸膏用纯净水溶解，依次用等体积的石油醚、氯仿、正丁醇萃取4次，分别减压回收溶剂得萃取物。氯仿萃取物经DIAION HP-20大孔树脂纯化，先用水洗柱，收集90％甲醇溶液洗脱液，洗脱液浓缩干燥后，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱纯化，按氯仿∶甲醇＝1∶1配置的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，干燥得拉肖皂苷元0.5g，纯度96％。

可通过物理化学性质及质谱或波谱数据鉴定拉肖皂苷元。

性状：白色晶体(CHCl₃-MeOH)，可溶于氯仿、丙酮，不溶于石油醚，365nm紫外灯下显淡兰色荧光。Liebermann-burchard反应阳性，A试剂反应显黄色，对E试剂不显色。

质谱：，EI-MS显示m/z(rel.int.)：430[M]⁺(8)，358(23)，316(45)，301(25)，287(55)，139(100)，122(8)，115(41)，相对分子质量为430。谱图中出现来自螺甾烷侧链产生的很强的139的基峰，中等强度的115的碎片离子峰和甾核及甾核加E环产生的碎片离子离子峰358、316、301、287、122。

氢谱：¹H-NMR高场区有山峰型4个甲基尖峰信号及C-26位两个相似氢的化学位移(δ3.50和δ3.46)等特征信号。波谱数据为：0.77(3H，s，H-18)，0.77(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J 6.3，H-27)，0.97(3H，d，J 6.7，H-21)，2.20(1H，dd，J 3.0，J 12.8，5-H)，3.35(1H，t，J 10.4，26-Hax)，3.48(1H，m，26-Heq)，3.56(1H，m，3-H)，4.41(1H，m，16-H)。

碳谱：¹³C-NMR谱存在螺甾皂苷元C-22连氧碳信号δ109.5、C-16和26位连氧碳信号δ80.6和δ67.0等特征信号。波谱数据为：36.6(C-1)，30.6(C-2)，70.5(C-3)，30.0(C-4)，56.8(C-5)，210.6(C-6)，46.7(C-7)，37.3(C-8)，53.9(C-9)，40.9(C-10)，21.3(C-11)，39.5(C-12)，40.9(C-13)，56.5(C-14)，31.5(C-15)，80.4(C-16)，62.0(C-17)，16.4(C-18)，13.2(C-19)，41.6(C-20)，14.4(C-21)，109.3(C-22)，31.3(C-23)，28.7(C-24)，30.2(C-25)，66.8(C-26)，17.1(C-27)。

Claims (1)

1.一种从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法，其特征在于：

取黑刺菝葜地下根茎1kg，干燥，研磨成粗粉，加入4L体积比为70％的乙醇溶液室温浸提4次，每次4h，合并提取液，将滤液浓缩成浸膏，将其悬浮于水，依次用等体积的石油醚、正丁醇分别萃取5次，分别减压回收溶剂得萃取物；将正丁醇萃取物用去离子水溶解，按照样品与填料1∶7比例在D-101型大孔树脂上纯化，先用去离子水洗脱除杂，直至α-萘酚反应检测洗脱液成阴性为止，然后用30％乙醇洗脱，收集该乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥得含拉肖皂苷元的总皂苷2.4g；将总皂苷溶解在12mL，浓度为2mo1/L的HC1的MeOH∶H₂O＝1∶1的溶液中，90℃热水浴回流水解2h，反应液冷却后，减压浓缩除去甲醇，再用氯仿萃取，回收溶剂，N₂干燥得拉肖皂苷元1.2g，纯度97％；或者

取粉碎干燥的黑刺菝葜块根1kg，加入5L甲醇溶剂，60℃水浴回流提取3次，每次3h，合并提取液，将浸膏用去离子水溶解，在DIAION HP-20大孔树脂上进行纯化，按照样品与填料1∶6比例上样，装柱，用体积比70％的甲醇溶液洗脱除杂后，收集80％甲醇洗脱液，干燥得2.8g总皂苷；将总皂苷溶解在15mL，浓度为1mol/L H₂SO₄的MeOH∶H₂O＝1∶1的溶液中，80℃热水浴回流水解1h，反应液冷却后，减压浓缩除去甲醇，再用环己烷萃取，回收溶剂，N₂干燥得拉肖皂苷元1.4g，纯度96.6％；或者

取粉碎干燥的黑刺菝葜茎1kg，加入4L丙酮，65℃水浴加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收丙酮，浓缩成浸膏，将浸膏用纯净水溶解，依次用等体积的石油醚、氯仿、正丁醇萃取4次，分别减压回收溶剂得萃取物；氯仿萃取物经DIAION HP-20大孔树脂纯化，先用水洗柱，收集90％甲醇溶液洗脱液，洗脱液浓缩干燥后，经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱纯化，按氯仿∶甲醇＝1∶1配置的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，干燥得拉肖皂苷元0.5g，纯度96％。