CN106800579A - 一种从王枣子中分离提取内折香茶菜苷a的方法及应用 - Google Patents

一种从王枣子中分离提取内折香茶菜苷a的方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种从王枣子中分离提取内折香茶菜苷A的方法及应用，属于植物活性成分提取分离技术及应用领域。干燥王枣子根粉末，过筛后加入乙醇，搅拌均匀，超声提取，合并后的提取液进行减压蒸馏，馏分乙醇回收再利用，浓缩液分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，馏分回收再利用，浓缩干粉得到乙酸乙酯浓缩物。浓缩物进行硅胶柱层析收集目标段馏分并浓缩，浓缩干粉用少量甲醇加热溶解后重结晶，结晶后抽滤，用甲醇多次冲洗，真空干燥后得到内折香茶菜苷A。本发明工艺操作简单，节省成本，更有利于工业化。初步细胞毒检测实验表明内折香茶菜苷A具有抗癌作用和氧化损伤作用，可以促进癌细胞的凋亡，从而开发新一代抗癌药物。

Description

一种从王枣子中分离提取内折香茶菜苷A的方法及应用
技术领域
本发明属于植物活性成分提取分离技术及生物作用领域，涉及到内折香茶菜苷A的提取分离技术及内折香茶菜苷A在细胞毒检测方面的应用。
背景技术
原发性肝癌的临床病象极不典型，其症状一般多不明显，特别是在病程早期。通常5cm以下小肝癌约70％左右无症状，无症状的亚临床肝癌亦70％左右为小肝癌。症状一旦出现，说明肿瘤已经较大，其病势的进展则一般多很迅速，通常在数周内即呈现恶病质，往往在几个月至1年内即衰竭死亡。目前，国内外研究癌症科学工作者们一直在不懈努力以探求和寻找安全、可靠、有效的治疗药物。毫无疑问，一种新药物的发现和应用，都将是对全人类的一种贡献。天然药物因其毒副作用小并且显示出了显著的治疗作用而受到人们关注。
王枣子唇形科香茶菜属多年生草本植物，是世界上稀有的名贵食用植物，集中生长在安徽宿州的一种地方草药。王枣子中含有多种有效药用成分，具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗血栓等功能，在民间被用于治疗毒蛇咬伤，红斑狼疮等疾病。王枣子中单体成分的研究以及在药物方面具有较好的应用前景，目前已发现的王枣子活性成分不过10种，而天然产物成分结构复杂，仍有大量有效成分亟待开发，因此王枣子中未知成分的提取分离及结构鉴定成为一项技术难题。王枣子活性成分的传统加热回流提取技术采用有机溶剂对大量原材料加热回流，使易挥发性有机溶剂大量消耗，普遍存在提取时间长、提取效率低、严重污染环境的问题，它影响王枣子活性成分药用的经济效益。采取大批量王枣子原材料采用加热回流的方法提取王枣子活性成分，不仅使提取不够充分而且使得部分不稳定化合物在高温下变性，不能满足活性成分的有效提取进而无法发挥其活性成分原有的药效作用，使得提取效率降低。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种从中药王枣子中提取新化合物内折香茶菜苷A的方法。
本发明的目的之二在于内折香茶菜苷A在抗肝癌细胞活性及氧化损伤活性方面的应用。
内折香茶菜苷A化学名为(1S,5S,10S,11R,13R)-1,11,13-三羟-脱氧-8-烯-7-酮1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C26H42O9，相对分子质量498.62，溶于乙醇、甲醇，不溶于氯仿。是一种二萜苷化合物。首次在王枣子植物中提取得到内折香茶菜苷A。内折香茶菜苷A具有抗肿瘤作用，对细胞产生氧化应激作用，促进氧自由基增加进而加快癌细胞的凋亡，是一种潜在的纯天然抗肿瘤药物。
本发明的技术方案：
一种从王枣子中分离提取内折香茶菜苷A的方法，步骤如下：将王枣子根粉碎，过40～60目筛，按料液比1:8加入质量百分比为80％的乙醇，搅拌均匀；在40～55℃，功率150～300W条件下超声提取20～60min后，将提取的混合物进行抽滤，除去滤渣，上清液在温度为40～48℃，压力为0.08～-0.1MPa条件下进行蒸馏，蒸出乙醇回收再利用，浓缩液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯在室温下萃取，乙酸乙酯萃取液在温度为35～40℃，压力为0.08～-0.1MPa条件下减压蒸馏，蒸出乙酸乙酯回收再利用，浓缩干粉即乙酸乙酯提取物；粗提物采用硅胶柱层析，薄层层析及重结晶方法分离得到内折香茶菜苷A。
化合物内折香茶菜苷A用于检测人肝癌细胞毒。
本发明的有益效果：
(1)利用超声技术辅助提取，能够有效提取王枣子活性成分，与传统提取方法相比，由原来的浸泡24h缩短为30min，大大减少活性成分溶出时间，节省操作时间，使得活性成分的溶出度提高，大大提高了活性成分的提取效率。工艺作简单，节省成本，更有利于工业化。
(2)新化合物在细胞毒检测方面的应用，发现一种新的潜在抗癌药物。
附图说明
图1A是MTT法检测单体一次给药对人肝癌细胞(HepG2)细胞活性的影响图，随着药物浓度的增大，HepG2细胞存活率越低，呈现剂量依赖作用。
图1B是用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测单体一次给药后对细胞内LDH泄露率的影响图，给药组HepG2细胞LDH泄漏率明显增高，表明药物对HepG2细胞膜具有破坏作用，进而促进细胞凋亡。
图1C是用活性氧检测(ROS)试剂盒检测单体一次给药后对细胞内ROS水平的影响图，给药组HepG2细胞ROS水平明显增高，表明氧自由基明显增加，进而对HepG2细胞产生氧化损伤作用，诱导细胞凋亡。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例一：内折香茶菜苷A的分离纯化
王枣子根用普通粉碎机粉碎，过60目筛，用40℃干燥箱干燥王枣子根粉末，得到王枣子根干燥粉末。精确称量2.0kg放于烧杯中，按料液比1:8加入体积分数为80％的乙醇水溶液，搅拌均匀，在温度为50℃，频率43kHz，功率250W的超声波条件下超声提取30min，提取液真空抽滤，得滤液。重复提取三次，合并提取液。在45℃，60r/min的条件下减压浓缩得浓缩液。浓缩液依次用石油醚，氯仿，乙酸乙酯按比例1:1萃取，分别萃取1次，2次，2次，得各相萃取液。减压浓缩得乙酸乙酯相萃取物固体为15.0g。
将上述乙酸乙酯浓缩物进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(3:1)，氯仿-甲醇(15:1,10:1,5:1,2:1)为洗脱剂进行梯度洗脱，500ml为一个馏分收集段，每个馏分收集六段，洗脱成分进行薄层色谱检测，氯仿-甲醇-乙酸展开，暗箱式紫外灯下观察，收集合并含相同点的馏分段，减压浓缩，收集合并氯仿-甲醇为15:1第9～11段馏分，减压浓缩得到结晶物811.2mg。将上述结晶物30℃恒温下慢慢滴加甲醇使结晶物完全溶解于甲醇，待全部溶解后置于4℃重结晶。结晶物用甲醇多次冲洗抽滤，35℃真空干燥，得到无色针晶28.5mg。
实施例二：无色针晶的结构鉴定
无色针晶，溶于甲醇，乙醇，不溶于氯仿。高分辨质谱(HR-ESI-MS)检测得：m/z521.2721[M+Na]+。核磁共振波谱数据如下：1H NMR(500MHz DMSO-d6)δH 5.06(1H,d,J＝8.8Hz,OH-13),4.94(1H,d,J＝5.5Hz,OH-11),4.90(1H,m,H-11),4.88(1H,d,J＝11.4,H-1′),4.85(1H,m,H-1),4.68(1H,m,H-6′),4.02(1H,m,H-3′),3.66(1H,m,H-4′),3.38(1H,m,H-2′),3.13(1H,m,H-5′),2.98(1H,dd,J＝11.4,5.3Hz,H-14),2.90(1H,m,H-6),2.43(1H,d,J＝2.1Hz,H-5),2.31(1H,m,H-2),2.15(1H,m,H-12),1.89(1H,m,H-3),1.55(1H,m,H-15),1.34(3H,s,H-20),0.92(3H,d,J＝6.8Hz,H-16),0.87(3H,d,J＝6.8Hz,H-17),0.85(3H,s,H-19),0.84(3H,s,H-18).
13C NMR(126MHz DMSO-d6)δC 200.35(C-7),163.20(C-9),129.26(C-8),104.91(C-1′),81.51(C-1),77.74(C-3′),77.47(C-5′),74.03(C-2′),72.27(C-13),70.66(C-4′),65.41(C-11),61.77(C-6′),44.78(C-10),43.83(C-5),37.94(C-15),35.29(C-6),34.53(C-3),33.13(C-14),32.84(C-4),32.77(C-19),23.26(C-2),22.41(C-18),20.33(C-20),17.32(C-17),17.19(C-16)。
无色针晶化学结构参见
1H–1H COSY光谱和HMBC光谱无色针晶结构相分析参见
无色针晶，化学名(1S,5S,10S,11R,13R)-1,11,13-三羟-脱氧-8-烯-7-酮1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，相对分子质量498.62分子式为C26H42O9。
实施例三：单体一次给药对人肝癌细胞(HepG2)细胞活性的影响
第七代HepG2细胞接种密度为每孔1×105个细胞接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h，给药浓度分别为0,1,2,5,10,20μmol·L-1，给药后继续培养24h，MTT法检测不同浓度下的内折香茶菜苷A对HepG2的影响效果明显，具有较好的抗癌作用，结果参见图1A，实验表明，在浓度为1μmol·L-1细胞存活率为95.87±1.46％，20μmol·L-1时，细胞存活率为7.52±2.48％，癌细胞基本全部死亡，IC50值为4.66±0.11μmol·L-1，该药物具有较好的抑制癌细胞生长作用。
在上述实验基础上，HepG2细胞接种密度为每孔1×105个细胞接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后，给药浓度分别为0,2,5μmol·L-1，给药后继续培养12h，用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测给药浓度为0,2,5μmol·L-1时，对肝癌细胞的影响。结果见图1B，表明一定浓度的药物能够增加肝癌细胞膜的破坏，进而使LDH泄露率增加，促进肝癌细胞凋亡。
实施例四：单体一次给药对HepG2细胞内活性氧的影响
HepG2细胞接种密度为每孔1×105个细胞接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后，根据活性氧检测(ROS)试剂盒装载探针，去除细胞培养液，加入200μlDCFH-DA后于二氧化碳培养箱中孵育20min，给药浓度分别为0,2,5μmol·L-1，给药后孵育40min，除去上清，用无血清培养基洗涤1次，用胰酶消化后加入培养基反复吹打转移至EP管中离心5min，吸去上清，加入200μl PBS转移至96孔板中检测。实验结果(图1C)表明显示给药组使细胞内活性氧水平显著增加，对肝癌细胞具有氧化损伤作用，促进细胞凋亡。

Claims (2)

1.一种从王枣子中分离提取内折香茶菜苷A的方法，其特征在于，步骤如下：将王枣子根粉碎，过40～60目筛，按料液比1:8加入质量百分比为80％的乙醇，搅拌均匀；在40～55℃，功率150～300W条件下超声提取20～60min后，将提取的混合物进行抽滤，除去滤渣，上清液在温度为40～48℃，压力为0.08～-0.1MPa条件下进行蒸馏，蒸出乙醇回收再利用，浓缩液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯在室温下萃取，乙酸乙酯萃取液在温度为35～40℃，压力为0.08～-0.1MPa条件下减压蒸馏，蒸出乙酸乙酯回收再利用，浓缩干粉即乙酸乙酯提取物；粗提物采用硅胶柱层析，薄层层析及重结晶方法分离得到内折香茶菜苷A。
2.一种内折香茶菜苷A用于检测人肝癌细胞毒的应用。
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