CN103536637A - 鹿草降血脂提取物的制备及分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鹿草降血脂提取物的制备及分离方法。本发明以菊科植物鹿草为原料制备含有效成分黄酮及其甙类和三萜及其皂甙类的降血脂活性提取物，其中含有结构式如下所示的矢车菊素(1)及白桦脂醇(2)。该提取物具有降血脂作用，可降低甘油三脂、总胆固醇、和低密度脂蛋白，明显增加高/低密度脂蛋白比值。本发明采用溶剂提取结合柱层析纯化、可快速常量制备分离鹿草降血脂提取物。方法实用简便，产品降血脂成分含量高，适宜作为降血脂原料药及天然血脂调节剂的开发应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种以菊科植物鹿草为原料制备具有降血脂活性的提取物及分离的方法。
背景技术
自上世纪90年代后期，心血管病已经逐渐成为我国城乡居民的第一死因，目前已占死亡人数的近40％。心血管病主要是由于动脉硬化、糖尿病、不良的脂血症、高血压和肥胖症等因素造成的。临床研究表明降低固醇可减少冠心病患者的死亡和心肌梗死发生率，质代紊乱所致的高脂血症与人类的头号杀手心脑血管疾病发生有着密切关系。因此，调节血脂药已为当今心血管疾病领域的研究热点之一。研究证实许多中药有很好的低血脂作用，其以降甘油三酯为主的降低血脂作用.与西药相比毒副作用相对较小。而在药效上各有侧重，作用机理和途径也有所不同，具有多途径综合疗效的中药往往是较好的降脂药。因此中药在治疗高脂血症疾病中有良好的开发前景。本发明根据上述市场需求和天然药物有效低毒的降血脂特点，从独特的新疆民间草药-鹿草中研究降血脂活性提取物的制备方法，对开发防治心血管疾病的中药具有积极意义。
鹿草{Rhaponticum carthamoides(Willd.)Iijin.菊科管状花亚科漏芦属的一种多年生草本植物。俗称新疆人参，花紫红色。故又称红花漏芦。在我国仅分布在新疆，民间长期入药，具补气健脑功效，主治神经衰弱、食欲不振[新疆生物土壤研究所，《新疆中草药》，新疆人民出版社，乌鲁木齐，251，1975]，在当地少数民族心目中是个宝药。前苏联学者发现鹿草具有降血脂和适应原样作用，其总黄酮可减少血脂和游离脂肪酸含量[姜晓峰等，中国药学杂志，1995，30：522]。在防治心血管疾病方面具有开发潜力，我们对新疆鹿草黄酮活性的初步活性研究结果表明其总黄酮有保护心肌和降血脂的作用[李迪明等，International SymposiumCRI，CA and DT，Sept.2001 Nanjing，China：25-27]。
为开发我国新疆这种药用植物的独特资源，挖掘其潜在的应用价值，我们以降血脂活性筛选为先导对鹿草降血脂提取物的制备工艺和有效成分鉴定进行研究，优选出了一个最佳提取分离制备工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种从菊科植物鹿草制备具有降血脂活性的提取物及分离方法。
在鹿草降血脂活性的研究中，我们发现该植物的脂溶性成与分水溶性成分均具有降血脂活性，二者都为有效部位，其大极性组分作用大于小极性组分，脂溶性成分对总胆固醇和甘油三酯有明显的降低作用，水溶性成分除具有相同作用外，尚可降低低密度脂蛋白(LDL)，并增加高/低密度脂蛋比值。鹿草降血脂提取物的化学研究显示其中主要有效成分的结构类型为五环三萜(羽扇豆烷型和齐墩果烷型)和黄酮类(黄酮醇、双氢黄酮和花青素类)类化化合物。故本发明针对以上研究所确定的降血脂活性部位，对鹿草降血脂活性提取物的制备及分离方法进行了研究，该方法实用、简便，为进一步从鹿草中开发降血脂药奠定了基础。
一种以鹿草植物为原料，制备具有降血脂活性提取物的方法，其特征在于采用溶剂提取鹿草植物得总浸膏，该浸膏(或用乙酸乙酯或乙醚-丙酮-甲醇或水-正丁醇萃取所得部位浸膏)经过硅胶柱层析(或聚酰胺柱层析或葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析)、混合溶剂梯度洗脱的方法，分离纯化得到含有总甙、总黄酮及其甙类和总三萜及其皂甙类的降血脂活性提取物，该提取物中含有以矢车菊素(化合物1)即花青素类为结构特征的水溶性降血脂成分及以白桦脂醇即羽扇豆烷型五环三萜(化合物2)为结构特征的脂溶性降血脂成分：
在上述方法中，总浸膏提取时溶剂与原料的物料比在2∶1到10∶1范围内，提取时如采用室温下浸提，则每次7天，浸提34次；亦可采用加热回流提取或煮提，每次2～3小时，提取3次；亦或采用超生提取等其它现有技术进行提取；提取或萃取溶剂可选择水、1-5％(V/V)盐酸或醋酸水、75-95％(V/V)乙醇或甲醇、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮种的一种、两种或三种，其中以制备高活性的水溶性提取物为目标所优选的提取溶剂是水或混合溶媒系统：水-正丁醇(1∶1-1∶8)。
在上述方法中，硅胶柱层析时选用的溶剂体系为石油醚和乙酸乙酯(20∶1到1∶5)或石油醚和丙酮(50∶1到1∶3)梯度洗脱。通过薄层层析检测，分别收集石油醚和丙酮(10∶1)及水-正丁醇(1∶4)展开体系下，在254nm紫外光下无荧光及暗红色荧光及无荧光及，硫酸-乙醇显紫红色及棕红色的组分；和环己烷-丙酮(3∶1)展开体系下，在254nm紫外光下有黄绿色荧光，用三氯化铝甲醇液显色荧光增强的组分，于＜50℃条件下减压浓缩。
经上述方法制备得到的提取物粗品可通过以下步骤进行分离纯化精制：通过硅胶柱层析纯化，选用石油醚和乙酸乙酯(15∶1)或石油醚和丙酮(20∶1)洗脱，纯化所得产品含20％总黄酮和15％总三萜及0.03％的化合物2；亦可进一步采用石油醚和丙酮或石油醚和乙酸乙酯以及正丁醇和水溶剂体系重结晶纯化，得到的产品为棕黄色无定形粉末，其含有25％总黄酮和18％总三萜及0.03％的化合物1；亦可用聚酰胺柱层析或葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离纯化，水和乙醇(1∶5-1∶1)洗脱得到的产品为棕黄色无定形粉末或淡黄色无定形粉末，其含有20％总黄酮或28％的总甙。
本发明的优点：
本发明提供了一种从鹿草植物中制备分离降血脂活性提取物的方法，该方法操作简便、成本低，产品降血脂有效成分含量高，适宜作为降血脂原料药及天然血脂调节剂的开发应用。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。
实施例1：降血脂活性提取物的提取分离纯化实验
①将鹿草干燥根部300g，粉碎，以用1000mL 95％乙醇加热回流提取2小时，滤出提取液；共重复提取三次，合并提取液，减压浓缩得总浸膏约40g。
②浸膏以硅胶(200～300目)1∶1拌样，挥干溶剂后，用1000g硅胶法湿装柱，上样，用石油醚-丙酮体系(50∶1～1∶3)梯度洗脱。
③通过薄层层析检测，分别收集石油醚和丙酮(10∶1)和水-正丁醇(1∶4)展开体系下，Rf值约0.35和0.26，在254nm紫外光下无荧光及暗红色荧光、硫酸-乙醇显紫红色及棕红色的组分，浓缩物分别以石油醚-丙酮混合溶剂(10∶1)和水-正丁醇(1∶4)重结晶两次，过滤即分别获得含有化合物2的粗品I(2g)、含有化合物1的粗品II(4g)；
④收集石油醚和丙酮(20∶1-10∶1)梯度洗脱液，合并醋酸-浓硫酸反应呈阳性和薄层层析检测、在石油醚和丙酮(10∶1)展开体系下，254nm紫外光下无荧光、硫酸-乙醇显红紫色的所有流份，以及石油醚-丙酮体系(10∶1～1∶3)梯度洗脱液，合并盐酸-镁粉反应呈红色以及薄层层析检测、在环己烷-丙酮(3∶1)展开体系下，254nm紫外光下有黄绿色荧光，用三氯化铝甲醇液显色荧光增强的所有流份，分别于＜50℃条件下减压蒸干溶剂。浓缩物分别以石油醚-丙酮混合溶剂(10∶1)和水-正丁醇(1∶4)重结晶两次，过滤即分别获得含三萜类混合物的粗品III(12g)及黄酮类混合物的粗品IV(8g)。
⑤上述粗品I和II分别通过硅胶柱层析和聚酰胺柱层析，以石油醚-丙酮(5∶1)和水-乙醇(5∶1)为洗脱剂进行洗脱，得到化合物1的纯品30mg及化合物2纯品35mg。
化合物1经理化鉴定及与标准品对照通过薄层层析检测，鉴定为矢车菊素；化合物2经红外光谱、核磁共振波谱和质谱结构确定为白桦脂醇。
⑥上述粗品III和IV分别通过硅胶柱层析和聚酰胺柱层析，以石油醚和丙酮(15∶1)和水-乙醇(1∶5)为洗脱剂进行洗脱，洗脱液分别于＜50℃条件下减压蒸干溶剂得到纯品III，为黄色粉末和纯品IV，为淡土色粉末。
纯品III采用CP 2005版药典芦丁测定法(UV)测定总黄酮：≥20％，黄酮总甙：≥18％，纯品IV采用醋酸-浓硫酸法(UV-VIS)法测定，总三萜类：≥18％；三萜皂甙：≥10％。
实施例2：降血脂活性提取物的乙醇冷提分离的放大实验
①鹿草干燥根部粉碎2Kg，用95％的乙醇30L冷浸提取，浸提液减压回收乙醇，共提取3次，每次7天，后共得总浸膏约98g；
②总浸膏用500mL水分散，再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液得到49g浸膏，该浸膏用50g柱层析硅胶拌样，用500g硅胶湿法装柱，石油醚和乙酸乙酯(15∶1-3∶1)梯度洗脱，合并醋酸-浓硫酸反应呈阳性以及薄层层析检测，在石油醚和丙酮(10∶1)展开体系下，254nm紫外光下无荧光、硫酸-乙醇显红紫色的所有流份，于＜50℃条件下减压蒸干溶剂，即得含18％总三萜及0.03％化合物2的粗品III约15g(灰土色粉末)；
③上述用乙酸乙酯萃取后的总浸膏水分散液，再用以1％醋酸水溶液饱和过的正丁醇反复萃取得到25g浸膏，该浸膏用25g柱层析聚酰胺拌样，用250g聚酰胺干法装柱，水和乙醇(1∶5)洗脱，合并盐酸-镁粉反应呈红色以及薄层层析检测，在水和甲醇(1∶4)展开体系下，在254nm紫外光下有黄绿色荧光，用三氯化铝甲醇液显色荧光增强的所有流份，于＜50℃条件下减压蒸干溶剂，即得含25％总黄酮及0.05％化合物1的粗品IV约9g(棕黄色粉末)；
④上述用正丁醇萃取后的总浸膏水分散液，于＜50℃条件下减压浓缩，浓缩物用30g柱层析葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)拌样，300g葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)湿法装柱，水和乙醇(1∶1)洗脱，收集Molish反应呈阳性的所有流份，于＜50℃条件下减压浓缩，冷冻干燥得即得含28％的总甙粗品V约13g(淡黄色粉末)。
实施例3：降血脂活性黄酮类提取物的水热提分离的放大实验
①鹿草干燥根部3kg，粉碎，用水煮提2小时，滤出提取液；共重复提取三次，合并提取液，减压浓缩得总流浸膏约300g。
②总流浸膏用320g柱层析聚酰胺拌样，用3000g聚酰胺干法装柱，先用0.2％HCI水洗脱，收集合并薄层层析检测，在水和甲醇(1∶4)展开体系下，在254nm紫外光下有暗红色荧光、硫酸-乙醇显棕红色的的所有流份；于＜50℃条件下减压浓缩，冷冻干燥得即得含0.05％化合物1的花青素类粗品I约10g(棕红色粉末)；
③上述聚酰胺柱再用水和乙醇(1∶5-1∶1)梯度洗脱，收集合并盐酸-镁粉反应呈红色以及薄层层析检测，在水和甲醇(1∶4)展开体系下，在254nm紫外光下有黄绿色荧光，用三氯化铝甲醇液显色荧光增强的所有流份；于＜50℃条件下减压浓缩，冷冻干燥得即得含75％总黄酮的粗品IV约80g(棕黄色粉末)。
鹿草总提取物及其不同分离部位的降血脂活性试验
①样品制备和试验方法：取上述三种实施例中总浸膏(总提取物)及采用溶剂极性梯度法和层析法所得到粗品I-V，对鹌鹑高血脂模型，口服给药二周，颈动脉取血，离出血清，测定甘油三脂(TG)、总胆固醇(TCH0)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)，与吉非罗齐为阳性对照药物。
②试验结果(表1-3)：
表1 实施例1的降血脂活性试验
*P＜0.05，**P＜0.01
表2 实施例2的降血脂活性试验
*P＜0.05，**P＜0.01
表3 实施例3的降血脂活性试验
*P＜0.05，**P＜0.01
③结论：
(1)试验结果表明从鹿草中用本发明所提供的制备分离方法得到的提取分离物具有降血脂用，除了可降低甘油三脂、总胆固醇、和低密度脂蛋白，对高/低密度脂蛋白比值也有明显的增加作用；
(2)提取分离物中黄酮、三萜及其甙类化合物均为降血脂有效成分，其中代表性单体化合物分别是花青素类化合物1：矢车菊素及羽扇豆烷型五环三萜化合物2：白桦脂醇；
(3)提取分离物中脂溶性成分对总胆固醇有明显的降低作用，水溶性成分除具有相同作用外，尚可显著降低甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)，并增加高/低密度脂蛋白比值。
Claims (7)
1.一种以菊科植物鹿草为原料，制备及分离具有降血脂活性提取物的方法，其特征在于采用以下方法制备得到含有黄酮及其甙类和三萜及其皂甙类的降血脂活性提取物，该提取物中含有以矢车菊素(化合物1)即花青素类为结构特征的水溶性降血脂成分及以白桦脂醇即羽扇豆烷型五环三萜(化合物2)为结构特征的脂溶性降血脂成分：
将鹿草植物用溶剂提取得总浸膏，该浸膏(或用乙酸乙酯或乙醚-丙酮-甲醇或水-正丁醇萃取所得部位浸膏)经过硅胶柱层析(或聚酰胺柱层析或葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析)、混合溶剂梯度洗脱的方法，分离纯化得到以上降血脂活性提取分离物。
2.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：在上述方法中，总浸膏提取时溶剂与原料的物料比在2∶1到10∶1范围内，提取时如采用室温下浸提，则每次7天，浸提3～4次；亦可采用加热回流提取或煮提，每次2～3小时，提取3次；或采用超生提取等其它现有技术进行提取；提取或萃取溶剂可选择水、1-5％(V/V)盐酸或醋酸水、75-95％(V/V)乙醇或甲醇、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮种的一种、两种或三种，其中以制备高活性的水溶性提取物为目标所优选的提取溶剂是水或混合溶媒系统：水-正丁醇(0.5-1∶0.5-8)。
3.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：硅胶柱层析时选用的溶剂体系为石油醚比乙酸乙酯(20∶1到1∶5)或石油醚比丙酮(50∶1到3∶1)梯度洗脱。
4.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：经上述方法制备得到的提取物粗品可通过以下方法采用以下A、B、C、D四种方法中任意一种进行分离纯化精制：
A通过硅胶柱层析纯化，选用石油醚和乙酸乙酯(15∶1)或石油醚和丙酮(20∶1)洗脱，纯化所得产品含20％总黄酮和15％总三萜及0.03％的化合物2；
B亦可进一步采用石油醚和丙酮或石油醚和乙酸乙酯以及正丁醇和水溶剂体系重结晶纯化，得到的产品为棕黄色无定形粉末，其含有25％总黄酮和18％总三萜及0.03％的化合物1；
C亦可用聚酰胺柱层析分离纯化，水和乙醇(1∶5-1∶1)洗脱得到的产品为含有20％总黄酮的棕黄色无定形粉末；
D葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离纯化，水和乙醇(1∶5-1∶1)洗脱得到的产品为含有28％总甙的淡黄色无定形粉末。
5.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：提取分离物中黄酮类化合物、三萜类化合物及其甙类均为降血脂有效成分，其中代表性单体化合物分别是矢车菊素及白桦脂醇。
6.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：制备得到提取分离物具有降血脂用，可降低甘油三脂、总胆固醇、和低密度脂蛋白，对高/低密度脂蛋白比值也有明显的增加作用。
7.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：提取分离物中脂溶性成分对总胆固醇有明显的降低作用，水溶性成分除具有相同作用外，尚可显著降低甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)，并增加高/低密度脂蛋白比值。
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